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n 中国人类遗传资源
人体组织核糖核酸的提取和纯化
技术规程
Technical Specification
for Extraction and Purification of Human Tissue RNA
（讨论稿）
中国人类遗传资源平台项目组
2007年1月
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n 前言
提取核糖核酸的方法很多，但大多是借助于国外的经验。本规则充分考虑了中国的国情，在遵守分子生物学准则前提下，制定了核糖核酸从多种组织中的提取方法。使提取纯化的核糖核酸能够有相关国家标准和行业标准，为有效保护和合理利用生物资源，提供一套符合我国实验室条件的可以遵循的规程。
本规程的编排格式遵从GB/T 1.1—2000《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写规则》。
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n 目次
前言....................................................................................................................................................II
1 范围 (1)
2 术语和定义 (1)
3 RNA提取的原理 (1)
4 RNA提取的步骤和方法 (1)
4.1 主要的RNA酶污染源及预防 (1)
4.2 RNA酶的抑制剂 (2)
4.3 破碎细胞和灭活RNA酶同步进行的方法 (3)
4.4 哺乳动物细胞总RNA的分离 (4)
4.5 提取步骤 (5)
4.6 用异硫氰酸胍和有机溶剂提取细胞中RNA (6)
4.7 石蜡组织RNA提取方法 (7)
5 mRNA的分离 (9)
5.1 分离原理和意义 (9)
5.2 分离步骤 (10)
6 RNA提取的注意事项 (12)
参 考 文 献 (13)
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人体组织核糖核酸的提取和纯化技术规程
1 范围
本规程适用于实验室较大批量的提纯分离RNA并对样本进行长期保存。对实验的原理，方法和注意事项进行了详尽的描述和讨论。每一个实验室的具体操作可以根据实际情况进行修改。
2 术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。
核糖核酸 ribonucleic acid，RNA
由脱氧核糖核酸（DNA）为模板转录合成的核糖核酸的片断。
3 RNA提取的原理
为了快速从细胞中分离完整的RNA，许多方法都用到了强变性剂如盐酸胍或硫氰酸胍使细胞裂解，同时溶解和变性内源性的RNA酶。这种用硫氰酸胍提取RNA的方法是首先由Ullrich等简要提出的。培养好的组织或细胞用硫氰酸胍溶解，所得的匀浆铺在氯化铯浓溶液上。由于RNA在氯化铯中的浮密度比其他细胞组分的浮密度大得多，在超速离心过程中rRNA和mRNA沉到管底。蛋白将保留在胍基盐裂解液中而DNA悬浮在氯化铯上层液体中。
4 RNA提取的步骤和方法
为了获得高质量的真核细胞mRNA，必须使用RNA酶的抑制剂或采用下述的破碎细胞和灭活RNA酶同步进行的方法，最大限度地降低细胞破碎过程中所释放的RNA酶的活性。同时，避免偶然引入实验室内其他潜在的痕量RNA酶也很重要。下面列举避免RNA酶污染问题的一些注意事项。大多数有经验的研究者并不拘泥于这些注意事项，只是在遇到问题时可能采用其中的一种或几种方法加以解决。
4.1 主要的RNA酶污染源及预防
4.1.1 主要的RNA酶污染源
如不谨慎操作，外源性RNA酶可以通过玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员和溶液等
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途径污染RNA制品。
4.1.2 防止RNA酶污染的方法
a) 灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无RNA酶,可不经预处理直接用于制备和贮存RNA。
b) 实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品经常有RNA酶污染，使用前必须于180℃干烤8小时或更长时间（玻璃器皿）或用氯仿冲洗（塑料制品）。
另一种方法是用RNA酶的抑制剂焦碳酸二乙酯（DEPC）处理，但其作用并不是绝对的（Fedorcsak和Ehrenberg，1966）。通常是以0.1 %的DEPC水溶液浸泡用于制备RNA的烧杯，试管和其他用品。灌满DEPC的玻璃或塑料器皿在37℃放置2小时，并于100℃干烤15分钟（Kumar 和Lindberg，1972）或在15lbf/in2（1.034x105Pa）高压蒸汽灭菌15分钟。上述处理可以除去器具上痕量的DEPC，以防DEPC通过羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰。
c) 电泳设备的处理
用于RNA电泳的电泳槽应用去污剂洗干净，再用水冲洗，用乙醇干燥，然后灌满3%的H2O2溶液，于室温放置10分钟，然后用0.1%DEPC（见下文）处理过的水彻底冲洗电泳槽。最好能留出一些玻璃器皿、塑料制品和电泳槽作上特殊标记，存放在指定地点，为RNA实验专用。
d) 预防研究人员造成的污染
RNA酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。因此，在准备分离的和分析RNA的材料和溶液时，主要涉及RNA的一切操作过程中，都应戴一次性手套，接触“脏的”玻璃器皿和其他物品以后，手套就可能沾染上RNA酶，因此进行RNA实验时应勤换手套。
e) 防止溶液的污染
用高压灭菌的水和RNA研究专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药匙称取试剂，将溶液装入无RNA酶的玻璃器皿。可能的话溶液均应用0.1%DEPC于37℃至少处理12小时，然后于100℃加热15分钟或在15lbf/in2（1.034x105Pa）的高压下蒸汽灭菌15分钟。
注：DEPC可与胺类迅速发生化学反应，因此不能用来处理含有Tris一类的缓冲液。可存几瓶新的未开封的Tris晶体以制备无RNA酶的溶液。
4.2 RNA酶的抑制剂
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4.2.1 RNA酶的蛋白质抑制剂
它是从人胎盘分离的一种蛋白质可与多种RNA酶紧密结合（K i≈3x1010）形成非共价结合的等摩尔复合物，使RNA酶失活。该蛋白质抑制剂在体内可能是血管生成素的抑制剂（血管生成素是氨基酸序列和推测的三级结构与胰RNA酶类似的一种血管生成因子）。几个厂家以不同的商品名出售这种抑制剂，该蛋白质应置于含5mmol/L二硫苏糖醇（DTT）的50%甘油中，贮存于－20℃。抑制剂制品冻融数次后或放置在氧化条件下即应弃之不用，因为上述处理会使蛋白质变性从而释放出所结合的RNA酶。因此，在使用变性剂裂解哺乳动物细胞以提取RNA的初始步骤中不应使用这种蛋白抑制剂。然而只有在用较温和的裂解方法时应使用这种抑制剂，并且在后续的所有RNA纯化步骤中均应加入该抑制剂。由于酚抽提可以除蛋白质抑制剂，故应在纯化过程中补加几次抑制剂。其最大抑制作用需要有巯基试剂存在，而且它并不干扰反转录或mRNA在无细胞体系中的翻译。
4.2.2 氧钒核糖核苷复合物（IV）
这种由氧钒离子和4种核糖核苷之中的任意一种所形成的复合物，是一种过渡态类似物，它能与多种RNA酶结合并几乎百分之百地抑制RNA酶的活性。这4种氧钒核糖核苷复合物可加入完整细胞中，在RNA提取和纯化的所有过程中，其使用浓度都是10mmol/L。然而氧钒核糖核苷复合物强烈抑制mRNA在无细胞体系中的翻译，因此必须用含0.1%羟基喹淋的苯酚「用0.01mol/LTrisCl（pH7.8）平衡」多次抽提以去除之。有几家公司出售氧钒核糖核苷复合物。
4.2.3 硅藻土（Macaloid）
很多年前就发现硅藻土能吸附RNA酶，用缓冲液将其制成浆液，以0.015%（W/V）的终浓度溶解细胞。 这种粘土随同它所吸附的RNA酶可在后续的RNA纯化过程中（如酚抽提后）经离心去除。
4.3 破碎细胞和灭活RNA酶同步进行的方法
用强烈变性如盐酸胍或硫氰酸胍溶液能迅速溶解蛋白质， 导致细胞结构破碎，核蛋白由于其二级结构的破坏而从核酸上解离下来。RNA酶可耐受多种处理等，因此可联用上述试剂，从组织中，如富含RNA酶的胰腺中，提取完整无损的RNA。下述实验程序系列利用RNA酶抑制剂
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和（或）能迅速灭活RNA酶的有关方法从组织或细胞培养物中分离总RNA、核内RNA和胞质内RNA。
4.4 哺乳动物细胞总RNA的分离
从培养的单层哺乳动物细胞中分离RNA的实验程序系为Favaloro 等（1980）所介绍方法的改良。该方法同样适用于从悬浮培养的哺乳动物细胞中或从易于分散成单个细胞的哺乳动物组织中分离RNA。但不适用于从固体组织中提取RNA，因为用这种裂解细胞的方法（在SDS存在的条件下用蛋白酶K消化）去消化组织速度很慢，导致内源性RNA酶在被蛋白酶Ｋ消化或被抑制剂灭活前仍有时间起作用。原方法中（Favaloro等，1980）采用的裂解缓冲液含有0.015 %（W/V）的硅藻土（Macaloid），用于吸附并灭活RNA酶，但氧钒核糖核苷复合物和RNA酶的蛋白质抑制剂更常用。下述程序的优点是速度快，并能同时处理很多样品。
4.4.1 细胞的裂解
4.4.1.1 单层细胞的裂解
（1）吸出培养液，以７ml用冰预冷的无钙镁离子磷酸缓冲盐溶液ＰＢＳ（8克NaCl，0.2克KCl，1.44克Na2HPO4，0.24克KH2PO4溶于水，调pH7.4，终体积1 000ml）冲洗细胞培养皿内的单层细胞，重复1次，将平板置于冰上直至所有单层细胞冲洗完毕。也可将平板放在一块铝板上，再将铝板置于冰盘上。直径为90mm的培养皿需加0.5ml RNA提取缓冲液， 并使之遍布整个平板的表面。
RNA提取缓液：
0.14mol/L NaCl
1.5mmol/L MgCl2
10mmol/L TrisCl（pH8.6）
0.5%NP-40
1mmol/L二硫苏糖醇（DTT）
100单位/ml RNA酶的胎盘蛋白质抑制剂或20mmol/L氧钒核糖核苷复合物
（2）加0.5ml蛋白酶消化缓冲液，用刮棒混匀粘稠状裂解物并将其刮到平板的边缘。
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蛋白酶消化缓冲液：
0.2mol/L TrisCl（pH8.0）
25mmol/L EDTA（pH8.0）
0.3mol/L NaCl
2% SDS
（3）用装有21号针头的皮下注射器抽吸细胞裂解物，再将其注入聚丙烯管内。重复3－4次，剪切DNA。
（4）加蛋白酶K至终浓度为200μg/ml，充分混匀后置于37℃温育30分钟。蛋白酶K以贮存液的形式保存，贮存液浓度为20mg/ml。
4.4.4.2 悬浮培养的细胞或组织单细胞悬液的裂解
（1）于4℃以2 000g离心5分钟收集细胞，以10倍体积用冰预冷的无钙镁离子磷酸缓冲液悬沉淀，洗涤细胞3次，每次均用大口径的吸管轻轻吹打细胞沉淀，使其彻底分散。
（2）估计细胞沉淀的体积，用10-20倍体积的RNA提取缓冲液重悬之。
（3）加入与步骤（2）所加RNA提取缓冲液体积相同的蛋白酶消化缓冲液，用振荡器迅速混匀。用装有21号针头的皮下注射器抽吸细胞裂解物，再将其注入聚丙烯管内。重复3－4次，剪切DNA。
（4）加蛋白酶K至终浓度为200μg/ml,充分混匀后置于37℃温育30分钟。蛋白酶K以贮存的形式保存，贮存液浓度为20μg/ml。
4.5 提取步骤
a) 取细胞的裂解液约500ml，用等体积酚：氯仿抽提1次，以去除蛋白质。
b) 用吊桶式转头于室温以5000g离心10分钟使水相与有机相分相， 将水相吸至一个新的离心管内，加2.5倍体积用冰预冷的乙醇，充分混匀，于0℃放置1小时。
c) 于0℃以5000g离心10分钟沉淀RNA，弃上清，用含0.1mol/L 乙酸钠（pH5.2）的70%乙酸洗涤沉淀，用自动微量移液器尽可能将乙醇吸尽， 随后于室温放置几分钟，晾干沉淀。切勿抽干沉淀，因为干的核酸沉淀很难溶解。
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d) 每个直径为90mm的培养皿或每107细胞加200μl 50mmol/L TrisCl（pH7.8） EDTA（1 mmol/L pH8.0）溶液重溶沉淀。
e) 分别按10mmol/L和0.1mmol/L的终浓度加MgCl2和二硫苏糖醇（DTT），然后分别按1 000单位/或10mmol/L 的终浓度加RNA酶胎盘蛋白质抑制剂或氧钒核苷复合物。
f) 加入无RNA酶的胰DNA酶I至终浓度为2μg/ml，混匀，于37℃温育60分钟。
g) 分别按10mmol/L和0.2%的终浓度加EDTA和SDS。
h) 用等体积酚：氯仿抽提1次。
i) 于室温以5 000g离心10分钟使水相与有机相分相， 将水相吸至另一个离心管内，加3mol/L乙酸钠（pH5.2）至终浓度为0.3mol/L，加2.5倍体积用冰预冷的乙醇，充分混匀，冰浴放置2小时。
j) 用微量离心机于4℃以12 000g离心5分钟沉淀RNA。
k) 吸出所有的乙醇，将打开管盖的离心管在实验台放置几分钟，让最后残存的痕量乙醇挥发干净。
l) 用200μl TE（pH7.6）重溶沉淀，加500μl乙醇，于－70℃贮存备用。回收RNA时，只须取出1小份贮存液，加入3mol/L乙酸钠（pH5.2）至终浓度为0.3mol/L，充分混匀，用微量离心机于5℃以12 000g离心5分钟即可。
4.6 用异硫氰酸胍和有机溶剂提取细胞中RNA
a) 离心收集细胞：5 000r/min，5分钟，弃上清。加入异硫氰酸胍变性液（异硫氰酸胍4mol/L；柠檬酸钠25mmol/L，Sarkosy10.5%，β－巯基乙醇0.1mol/L）500μl，混匀，振荡10秒。
b) 加2 mol/L醋酸钠50μl，水饱和酚500μl和氯仿/异戊醇（49：1）100μl颠倒混合数秒钟，冰浴15分钟。
c) 4℃离心10 000 r/min，15分钟，
d) 吸取上清，加入等体积异丙醇或2倍体积无水乙醇，4℃离心10 000 r/min，10分钟。
e) 弃上清，70%酒精洗涤一次，抽干。
f) 加35μlDEPC处理水溶解，取5μl经稀释后紫外测定RNA提取量，其余30μl分装，
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-20℃保存备用。
4.7 石蜡组织RNA提取方法
由于石蜡组织在组织固定、脱水、包埋的过程中，各种生化试剂以及环境中无处不存在的RNA酶污染对组织RNA的破坏严重，以上介绍的传统的RNA提取方法难以得到满意数量以及质量的RNA，因此限制了很多领域的研究范围。目前采用Ambion RNA Isolation kit提取RNA效果较好。步骤如下：
（1）组织直径5mm左右的石蜡组织4-5μm厚的切片5～8片放入塑料离心管（AP管）中，根据实际情况增减。
（2）加入1ml二甲苯/AP管，室温放置20分钟，期间进行旋涡混匀。
（3） 室温高速离心14 000rpm×5min，弃上层的二甲苯。并补充离心14 000rpm×2min，用移液器移走上层剩余的二甲苯。
（4）加入100%乙醇1ml/AP管，洗3×3min，每次离心14 000rpm×5min，去上清。最后一次补充离心14 000rpm×2min，尽量移去剩余的乙醇，并将组织移至AP管的中部，以便于干燥。
（5）打开AP管，室温空气干燥5～10min左右（要组织彻底干燥）。
（6） 1：20稀释蛋白酶K，105μl/AP管（蛋白酶K稀释缓冲液100μl +PK 5ul），45℃水浴120min（不能超过2个小时）。
（7）加入600μlRNA提取缓冲液/AP管，旋涡混合器混匀（5×5Sec Vertex），室温孵育5min。
（8）加入700μl酸性酚：氯仿进行提取。加入后高速旋涡混合（5×5Sec Vertex），室温放置5min，高速离心＞13 000rpm×5min，移上清至一新的AP管里。
（9）加入1μl丙烯酰胺（Linear Acrylamide）/AP管，混合，加入等体积的异丙醇，倒置混匀，-20℃孵育过夜。
（10）4℃高速离心14 000rpm×15min，移出上层物，补充离心一次，移出上层物，加入500μl 75%乙醇洗涤沉淀，4℃高速离心13000rpm×5min，移出乙醇，补充离心一次，移出乙
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醇。空气干燥5min。
（11）用20μl RNA保存液溶解，保存在-70℃。
4.7.12 影响实验的因素
（1）首先是组织固定时间。要求福尔马林固定的时间不能过长，否则对RNA的破坏较为严重。一般不能超过24小时。
（2）石蜡组织脱蜡以后，在蛋白酶K消化以前要彻底干燥，经验表明残留的少量乙醇仍会影响RNA的提取质量。
（3）组织蛋白酶K消化的时间不能过长，否则RNA将可能破解成一些过小的片段，不能用于RT-PCR。说明书规定消化的时间不能超过2小时。我们借鉴国外实验室的经验，消化时间可以达到1小时50分钟，仍可得到满足要求的RNA。
（4）实验过程中补充离心的问题。在实验过程中每一步处理时都需要补充离心一次，以保证移尽残存的试剂，从而减轻对下一步实验的影响。
4.7.13 RNA的质量的检测
4.7.13.1 检测标准
评价RNA质量的标准是RNA的均一性和完整性。均一性的RNA取决于有效的去除RNA提取物中的DNA、蛋白质和其他杂质；完整的RNA取决于最大限度地避免纯化过程中内源性及外源性RNase对RNA的降解。通常采用紫光分光光度法测定RNA地浓度和纯度，纯的RNA A260/A280＝2.0，但由于所用标本不同，此比值有一定的变化，一般在1.7～2.0之间，低于该值说明有蛋白污染，需进一步酚/氯仿抽提。有时样本A260/A280可能大于2.0，如重复读数无误，并不表示纯度有问题。此外，测定A260/A230>2.0 可除外酚和有机物污染。
RNA的完整性可通过变性琼脂糖电泳进行鉴定。完整的RNA电泳时，28S（约4.8kb）和18S （约1.9kb）rRNA经EB染色后，两条电泳带的显色强度近似比为2比1。
4.7.13.2 检测步骤
（1）RNA的OD值的检测：取5ulRNA溶解液，稀释至500ul。260nm和280nm测OD值。
（2）RNA甲醛变性电泳
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① 配胶
琼脂糖 1g
10×MOPS 10ml
0.1%DEPC水 72ml
微波加热2分钟，使溶解；冷却至60℃左右加入
37%甲醛 18ml
灌胶
② 样品的处理
甲酰胺 10ul
37%甲醛 3.5ul
10×MOPS 2ul
RNA溶液 14.5ul
混匀，68℃ 15分钟，冰浴15分钟
10×上样液 2ul
混匀
③ 电泳
在电泳槽中加入1×MOPS至恰好浸没凝胶约4mm左右，每个孔加入10～20ul样品，
80V电泳1.5小时。EB溶液中浸泡20分钟，DEPC水中浸泡0.5～4小时，紫外光
灯下观察RNA分离的情况，比较28SrRNA和18SrRNA的含量。
5 mRNA的分离
5.1 分离原理和意义
与rRNA和tRNA不同的是，哺乳动物细胞的绝大部分mRNA在其3’端均有一poly（A）尾，因此可以用Oligo（dT）－纤维素亲和层析法从大量的细胞RNA中分离mRNA（At Leder，1972）。在构建cDNA文库时， 必须经上述纯化步骤制备mRNA模板。
进行Northern杂交或Sl核酸酶作用图分析时，与总RNA相比，采用poly（A）+ RNA能获
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得更为满意的结果。 可以按照Gilham（1964）所述方法制备Oligo（dT）－纤维素层析填料，也可以购买预制好的产品。
5.2 分离步骤
a) 用0.1mol/L NaOH悬浮0.5～1.0g Oligo（dT）－纤维素。
b) 将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱或装入填有经用DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴期德吸管中， 柱床体积为0.5～1.0ml,用3倍柱床体积灭菌水冲洗柱床。柱床体积为1m的Oligo（dT）－纤维素最大量为10mg总RNA，如果总RNA的量较少，则应减少Oligo（dT）－纤维素的使用量以防止poly（A）+RNA在过柱以及后续步骤中损失。
c) 用无菌的1×层析柱加样缓冲液冲洗柱床直至流出液的pH值小于8.0。
1×层析柱加样缓冲液：
20mmol/L Tris.Cl（pH7.6）
0.5mol/L NaCl
1mmol/L EDTA（pH8.0）
0.1%SDS
可按以下方法制备灭菌的层析柱加样缓冲液；将适量无RNA酶的TrisCl（pH7.6）、氯化钠和EDTA贮存液混合在15lbf/in2（1.034x105Pa）高压下蒸气灭菌，待其冷却至65℃左右时加入已在65℃预热30分钟的10%SDS贮存液。也可以用0.05mol/L柠檬酸钠代替TrisCl 然后用DEPC处理的柠檬钠－NaCl－EDTA和SDS的混合溶液。
d) 用灭菌水溶解RNA，于65℃温育5分钟后使迅速冷却至室温，加等体积的2×层析柱加样缓冲液，上样，立即用灭菌的试管收集流出液。 当所有的RNA溶液均进入柱床后，加1倍体积的1×层析柱加样缓充液，继续收集流出液。加热RNA可以破坏可能涉及poly（A）尾的二级结构。
e) 当全部溶液流出后，将收集液置于65℃温育5分钟，重新上样，并收集流出液。
f) 用5～10倍柱床体积的1×层析柱加样缓冲液洗柱，分部收集洗出液，测定每一收集管的OD260。追补由于不带poly（A）的RNA洗柱床， OD260会很高，后来OD260值则很小或为
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零。在某些方案中，上述步骤后还用5倍柱床体积的含0.1mol/L NaCl的1×层析柱加样缓冲液洗柱床，然而由于洗出的不带poly（A）的RNA很少甚至没有，因此这一步骤可以省略。
g) 用2～3倍柱床体积的经灭菌且无RNA酶的洗脱缓冲液洗脱mRNA，以1/3～1/2柱床体积分部收集洗脱液。
洗脱缓冲液：
10mmol/L TrisCl（pH7.6）
1mmol/L EDTA（pH8.0）
0.05%SDS
用于配制洗脱缓冲液的TrisCl 和EDTA贮存液应为新近高压的溶液，可用适量的灭菌水稀释上述贮存液配制洗脱缓冲液。洗脱缓冲液不能高压处理，因高压会使溶液产生大量气泡。
h) 收集液置于透明的小容器内，测定OD260，使用前比色杯须用浓盐酸：甲醇（1：1）浸泡1小时，再用经DEPC处理并高压处理过的水彻底冲洗合并含有RNA的洗脱组分。经上述一轮Oligo（dT）－纤维素亲和层析后得到的RNA中，带与不带poly（A）的RNA，其含量近乎相等。如欲进一步纯化mRNA,可将洗脱液于65℃温育3分钟，迅速冷却至室温，加入NaCl至终浓度为
0.5mol/L，用同一Oligo（dT）纤维素柱进行第二轮层析。
i) 收集Oligo（dT）－纤维素柱层析的洗脱液，在mRNA溶液中加入3mol/L乙酸钠（pH5.2）至终深度为0.3mol/L并混匀。加2.5倍体积用冰预冷的乙醇，混匀，冰浴至少30分钟。
j) 于4℃以10 000g离心15分钟回收poly（A）+RNA，小心弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀（通常看不见沉淀），离心片刻，在空气中晾干核酸沉淀。
k) 用少量水重溶RNA，置于比色杯内，测定OD260， 使用前比色杯须用浓盐酸：甲醇（1：1）浸泡1小时，再用经DEPC处理并高压处理过的水彻底冲洗
l) 将mRNA溶液由比色杯移至聚丙烯离心管内，加3倍体积乙醇， 混匀，于－70℃保存备用。回收RNA时，只需取出一小份贮存液，加3mol/L乙酸钠（pH5.2）至终浓度为0.3mol/L, 混匀，用微量离心机于4℃以12 000g离心5分钟即可。
① OD260＝1的溶液其RNA含量约为40μg/ml。
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② 从107个哺乳动物培养细胞中可获得1～5μg mRNA，所得mRNA通常只占上柱的总RNA的1～2%。
③ 现可直接从公司购买纯化试剂盒。
6 RNA提取的注意事项
a) 测定最终所得溶液的OD260值可以确定RNA的浓度。取10μl乙醇/TE混合液[步骤
4.7.13]离心沉淀RNA，以400水重溶， 测定OD260 值， OD260＝1的RNA溶液每毫升约含40μg RNA。
b) 如果需要，可用Oligo（dT）－纤维素层析法从所制备的细胞总RNA中纯化无寡脱氧核糖核苷酸污染的mRNA或购买试剂盒进行mRNA的纯化。
c) 某些情况下（例如从感染了DNA病毒或用DNA转染的细胞中制备RNA时），必须从细胞总RNA中去除寡脱氧核核苷酸。否则，当用这种RNA构建cDNA库或进行引物延伸反应时应会出问题， 反转录过程中污染的模板DNA片段可能会与RNA杂交而充当引物，从而导致特定mRNA5'末端定位的错误或产生截短的cDNA克隆。
d) 回收RNA时，只需取出1小份贮存液，加3mol乙酸钠（pH5.2）至终浓度为0.3mol/L 充分混匀，用微量离心机于4℃以12 000g离心5分钟即可。如需去除氧钒核糖核苷复合物，用含0.1%羟喹啉的苯酚[用0.01mol/L TrisCl（pH7.8）平衡]将RNA终溶液抽提数次即可。
e) 对大多数细胞株来说，一个直径90mm 培养皿中培养的RNA收率为100～200μg。
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n 参 考 文 献
[1] [美] J.萨姆布鲁克, D.W.拉塞尔著. 黄培堂译. 《分子克隆——实验指南（第三版）》
北京: 科学出版社. 2002年8月第一版