膜片钳技术原理与基本操作
1976 年Neher 和Sakmann 建立了膜片钳技术（Patch clamp technique），这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜上单一的或多数的离子通道分子活动的技术。1981 年Hamill, Neher 等人又对膜片钳实验方法和电子线路进行了改进，形成了当今广泛应用的膜片钳实验技术。该技术可应用于许多细胞系的研究，也是目前唯一可记录一个蛋白分子电活动的方法，膜片钳技术和克隆技术并驾齐驱给生命科学研究带来了巨大的前进动力，这一伟大的贡献，使Neher 和Sakmann 获得1991 年诺贝尔医学与生理学奖。
一、膜片钳技术的基本原理
用一个尖端直径在1.5~3.0μm 的玻璃微电极接触细胞膜表面，通过负压吸引使电极尖端与细胞膜之间形成千兆欧姆以上的阻抗封接，此时电极尖端下的细胞膜小区域（膜片，patch）与其周围在电学上分隔，在此基础上固定（钳制，Clamp）电位，对此膜片上的离子通道的离子电流进行监测及记录。
基本的仪器设备有膜片钳放大器、计算机、倒置显微镜、示波器、双步电极拉制器、三轴液压显微操纵器、屏蔽防震实验台、恒温标本灌流槽、玻璃微电极研磨器。膜片钳放大器是离子单通道测定和全细胞记录的关键设备，具有高灵敏度、高增益、低噪音及高输入阻抗。膜片钳放大器是通过单根电极对细胞或膜片进行钳制的同时记录离子流经通道所产生的电流。膜片钳放大器的核心部分是以运算放大器和反馈电阻构成的电流-电压（I-V）转换器，运算放大器作为电压控制器自动控制，使钳制电位稳定在一定的水平上。
二、操作步骤
1.膜片钳微电极制作
(1) 玻璃毛细管的选择：有二种玻璃类型，一是软质的苏打玻璃，另一是硬质的硼硅酸盐玻璃。软质玻璃在拉制和抛光成弹头形尖端时锥度陡直，可降低电极的串联电阻，对膜片钳的全细胞记录模式很有利；硬质玻璃的噪声低，在单通道记录时多选用。玻璃毛细管的直径应符合电极支架的规格，一般外部直径在
1.1~1.2mm。内径1mm。
(2) 电极的拉制：分二步拉制。第一部是使玻璃管中间拉长成一窄细状，第二次拉制窄细部位断成二根，其尖端直径一般在1~5μm，充入电极内液后电极电阻在1~5MΩ为宜。调节第一步和第二步拉制时加热线圈的电流强度，即可得到所需要的电极尖端直径。电极必须保持干净，应现用现拉制。
(3) 涂硅酮树酯：记录单通道电流时，为了克服热噪声、封接阻抗噪声及电极浸入溶液产生的浮游电容性噪声，需要在电极尖颈部（距离微电极尖端50mm）的表面薄薄地涂一层硅酮树酯（sylgard），它具有疏水性、与玻璃交融密切、非导
电性的特性。涂完硅酮树酯的玻璃微电极须通过加热的镍铬电阻线圈烘干变固，以防硅酮树酯顺着电极流向尖端而影响千兆封接。烘干后才能进行热磨光。(4) 热磨光(heat polish)：一般在玻璃研磨器下对电极尖端进行热磨光，磨光后可使电极尖平滑并烧去过多的硅酮树酯薄膜，有利于千兆封接的形成。目前大多数实验室在作全细胞模式记录时，不涂硅酮树酯也不进行热磨光，也可形成很好的千兆封接。
(5) 电极液的充灌：目前最常应用的是用注射器反向充灌。用细长的注射器针头或拉细的聚乙烯胶管从电极尾端插入到电极尖端，再进行灌注。灌注后电极尖端有少许气泡，排除气泡的方法是用左手拿住电极，尖端向下，用右手轻轻弹击电极，可见气泡徐徐上升直至排除。电极液不要充灌太满，能与探头的银丝接触上即可，溶液过多会浸入探头支持架致使潮湿而影响实验记录。
2.溶液的组成
(1) 电极液：根据记录的电流不同电极液的成分也不同。基本要求是等张的KCI 溶液，Ca2+浓度为10~100nmol (pCa 7~8)，pH 值7~7.4。这里介绍一个在全细胞记录模式时，通过改变保持电位，能分别记录到Na+、K+、Ca2+电流的电极液成分(mmol/L)：K Aspartic 49.89，KCI 30.37，KH2PO4 25，HEPES 20.12，EGTA 0.999，KOH 29.95，MgCl2 1，CaCl2 0.2，ATPNa2 6.8。用KOH 调pH 至7.4。如果要记录纯的Na+、K+、Ca2+电流，则需要使用相应的工具药。
HEPES（N-2-hydroxyethyopiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid，羟乙基哌嗪乙烷磺酸）
(2) 细胞外液（浴槽液）：分离细胞和记录电流时应用。分离神经细胞主要用人工脑脊液（artificial cerebrospinal fluid solution，ACSF），成分（mmol/L）：NaCl 124，KCl 2.5，NaH2PO4 1.25，MgSO4 2.0，CaCl2 2，NaHCO3 26，glucose 10。该液体需要通以95%O2＋5%CO2混合气体。如果用HEPES 作缓冲系，则ACSF 的成分如下（mmol/L）：NaCl 140，KCl 2.5，MgCl2 1，CaCl2 1，glucose 25，HEPES 10。上述溶液的配制均使用去离子水。
3.神经细胞的分离
运用膜片钳技术进行电生理学研究需要制备合适的单个细胞作标本，细胞制备的好坏直接影响实验的成功率。膜片钳实验要求细胞标本具有呼吸活性、耐钙、细胞膜完整、平滑、清洁度高的条件，以利于微电极与细胞膜进行高阻封接。活性好的细胞在形成全细胞模式后可以保持活性很长时间，足以保证实验的顺利进行。因此制备好的细胞标本是膜片钳实验的关键第一步。
七十年代以来，出现了许多分离各类细胞的分离技术，但是进行电生理学研究尤其是膜片钳实验多应用酶解分离细胞的方法。我们实验室曾分离过豚鼠心室肌细胞、大鼠肝脏细胞、大鼠脑皮层神经细胞、家兔肺动脉平滑肌细胞和人脑皮
层神经细胞及人心房肌细胞。
这里重点介绍大鼠脑皮层神经细胞的分离技术。
(1) 用30mg/kg 戊巴比妥钠ip 麻醉后，断头开颅取出大脑半球放入冷的人工脑脊液中，轻轻剥离脑膜和血管等纤维组织，然后取脑皮层在人工脑脊液中剪成2mm×2mm 的组织块静止1小时，并通以氧气。
(2) 将脑组织块放入含有protease 16unit/ml ( type Ⅹ, sigma )和protease 2unit/ml (type ⅩⅣ, sigma)的人工脑脊液中，在36℃恒温震荡(60 次/min)水浴中孵育60 分钟左右。
(3) 将组织块取出，反复用人工脑脊液冲洗５次，以彻底清除消化酶，于室温下静止60 分钟并继续通氧，实验前将组织块轻柔吹打后即可分离出单一的神经细胞供实验使用。
4.千兆欧姆封接
取一滴细胞液，滴入浴槽中，用人工脑脊液进行灌流，将浮游的死细胞冲走，待细胞贴壁后即可进行封接吸引。通过PCLAMP 软件或电子刺激器，给予一个20mV，10~50ms的矩形波刺激，当电极进入浴槽溶液时，记录电流的直线变成与矩形波电压脉冲相对应的矩形波曲线，将电极尖轻轻压在细胞膜表面，此时电流曲线的高度变低，给电极以负压吸引，由于电极尖与细胞膜逐渐密接，细胞膜与电极间的电阻逐渐增加，电流曲线逐渐减小
直至变成一条直线，则形成了千兆欧姆封接。
5．记录模式
根据研究目的选择记录模式，主要有下面叙述的前４种，后３种是依据前４种变更而来的。(1) 细胞贴附式(cell-attached 或on-cell mode)：千兆欧姆封接后的状态即为细胞贴附式模式，是在细胞内成分保持不变的情况下研究离子通道的活动，进行单通道电流记录。即使改变细胞外液对电极膜片也没有影响。
(2) 膜内面向外式(inside-out mode)：在细胞贴附式状态下将电极向上提，电极尖端的膜片被撕下与细胞分离，形成细胞膜内面向外模式。此时膜片内面直接接触浴槽液，灌流液成分的改变则相当于细胞内液的改变。可进行单通道电流记录。此模式下细胞质容易渗漏(washout)，影响通道电流的变化，如Ca2+通道的run-down 现象。
(3) 全细胞式(whole-cell mode) 记录：在细胞贴附式状态下增加负压吸引或者给予电压脉冲刺激(zapping)，使电极尖端膜片在管口内破裂，即形成全细胞记录模式。此时电极内液与细胞内液相通成为和细胞内电极记录同样的状态，不仅能记录一个整体细胞产生的电活动，并且通过电极进行膜电位固定，也可记录到全细胞膜离子电流。这种方式可研究直径小于20μm 以下的小细胞的电活动；也可在电流钳制(current clamp)下测定细胞内电位。目前将这种方法形成的全细胞
式记录称作常规全细胞模式(conventional whole-cell
mode 或hole cell mode)。
(4) 膜外面向外式(outside-out mode)：在全细胞模式状态下将电极向上提，使电极尖端的膜片与细胞分离后又粘合在一起，此时膜内面对电极内液，膜外接触的是灌流液。可在改变细胞外液的情况下记录单通道电流。
(5) 开放细胞贴附膜内面向外式(open cell-attached inside-out mode)：在细胞贴附式状态下，用机械方法将电极膜片以外的细胞膜破坏，从这个破坏孔调控细胞内液并在细胞贴附式状态下进行单通道电流记录。用这种方法时，细胞越大，破坏孔越小，距电极膜片越远，细胞因子的流出越慢。
(6)穿孔膜片式(perforated patch mode) 或缓慢全细胞式(slow whole-cell mode)：在全细胞式记录时由于电极液与细胞内液相通，胞内可动小分子能从细胞内渗漏到电极液中。为克服此缺点，可在膜片电极内注入制霉菌素(nystatin) 或二性霉素Ｂ(amphotericin 使电极膜片形成多数导电性小孔，进行全细胞膜电流记录，故被称为穿孔膜片式或制霉菌素膜片式(nystatin-patch mode)。又因胞质渗漏极慢，局部串联阻抗较常规全细胞记录模式高，钳制速度慢，故也称为缓慢全细胞式。
(7) 穿孔囊泡膜外面向外式(perforated vesicle outside-out mode)：在穿孔膜片式基础上，将电极向上提，使电极尖端的膜片与细胞分离后又粘合在一起形成一个膜囊泡。如果条件很好，在囊泡内可保留细胞质和线粒体等，能在比较接近正常的细胞内信号转导和代谢的条件下进行单通道记录。
6. 细胞内灌流方法：
细胞内灌流是在全细胞式状态下利用电极内灌流法形成的。电极内灌流法的装置是由电极固定部、灌流液槽、注入管、流出管、电极记录用琼脂桥所组成。注入管是用直径2.5 mm 的塑料管经加热拉细制成，使其尖端能插到接近电极的尖顶部。灌流液槽注满实验用溶液，插入注入管，当千兆封接形成后，由于负压吸引的作用电极内液从流出管流入排液槽的同时，实验用溶液由流入管注入到电极内，电极充满实验用溶液后关闭注入管，完成了液体的交换。这种方法应用在“内面向外式”时，可同时改变细胞内液和细胞外液的组成；应用在“全细胞式”时就形成了细胞内灌流方法，直接改变了细胞内液。
7. 全细胞记录模式离子通道电流记录
(1) 钠通道电流(INa)：灌流液即细胞外液同人工脑脊液液，也可加入CoCl23 mmol/L或nifidipine 10μmol/L 以阻断钙电流。电极液成分(mmol/L)：CsCl 150, EGTA 11, CaCl2 1,MgCl2 1, HEPES 10, 用CsOH 调pH 至7.4。
电压钳制方案，通常设保持电位(holding potential) 为-80 mV，去极化电压为-10~+40mV，步阶电压10 mV，去极化的保持时间（刺激脉冲宽度或钳制时间）
10~40 ms。当全细胞记录方式形成后，利用上述电压钳制方案，即可记录出INa。根据实验数据制作电流-电压(current-voltage, I-V) 关系曲线，从中找到Na+电流的激活电位、反转电位和最大电流的电压区域。
(2) 钙通道电流(ICa)：灌流液有两种方案，一是人工脑脊液中加入TTX 10μmol/L，另一是将人工脑脊液中的NaCl 换成N-methyl-D-glucamine 130μmol/L, pH 用CsOH 调至7.4。电极液的组成(mmol/L)：Aspartic acid 60, CsOH 60, MgCl2 4, HEPES 10, EGTA 10, Na2ATP 3。用CsOH 调pH 至7.4。通常使用的电压钳制方案是设保持电位为-40 mV，去极化电压为10~110 mV，步阶电压10 mV, 钳制时间300 ms，此方案记录的是L 型Ca2+通道电流；但在此保持电位下记录到的Ca2+ 电流尚含有Na+通道电流或尚有T 型Ca2+ 通道电流。记录由于没有特异的T 型Ca2+ 通道阻滞剂，若想获得较纯净的L 型Ca2+通道电流，将保持电位抬高到-30 mV 即可。记录T 型Ca2+通道电流的电压钳制方案是设保持电位为-80 mV，仍以10 mV 的步阶电压去极，去极化电压为10~170 mV，应用L 型Ca2+通道阻滞剂，如：nitrendipine、nisodipine、nifedipine 等，即可得到较纯净的T 型Ca2+通道电流。两种方案得出的膜电流峰值，均可绘制I-V 曲线。
(3) 钾通道电流：神经细胞上亦存在多种K+通道，其研究也很复杂，通常最直观最容易观察和记录得到的K+通道电流不外乎几种。这里仅就延迟整流通道、内向整流通道及瞬间外向电流通道的电流记录加以介绍。
基本液体灌流液的组成(mmol/L)：N-methyl-D-glucamine 135, KCl 5.4, CaCl 1.8,
MgCl20.5, HEPES 10, Glucose 5.5。用HCl 调pH 至7.4。也可在灌流液中加入TTX
(10-6mol/L)和Cd+ (0.2~0.5mmol/L)，以阻断Na+ 和Ca2+通道。电极溶液为通常的细胞内液。①延迟外向整流电流(delayed rectifier outward current, Ikr)：设保持电位为–80 mV，去极化电压为-20~+170 mV，步阶电压10 mV, 钳制时间可这在100~400 ms，时间间隔为2~3ms 以上。有时可将保持电位设在–30 mV 或–40 mV，这样不仅可以使T 型Ca2+通道失活，记录出Ikr，而且也可以同时记录到尾电流(Itail)，尾电流也是延迟外向整流电流的一种表现形式，当钳制方波从+70 mV 或+90 mV 复极到保持电位时，这个电流并不紧随，而是延迟于复极的钳制方波，以指数衰减方式，逐渐回至电流基线。现认为Itail 和Ikr 使用同一通道。Ikr 值的表示，通常是测定钳制方波就要结束时的外向电流幅值；Itail 的测定是在钳制初期上升的幅值。
②内向整流电流(inward rectifier current, Ikir)：在膜超极化时内向整流通道开放，K＋流入细胞内，当膜电位近于静息电位或更正时，该通道趋于关闭。一般情况下保持电位的设置与细胞的静息电位相当，设在–80 mV，在这个电位下，
膜电位为“零”，保持电位是“零”电流电位。然后令钳制电位从正于保持电位的方向，向超极化方向复极，超极化可达-140 mV 到–160 mV，过度超极化可能会损伤细胞，步阶电压仍为10 mV
在神经细胞，Ikir 于钳制初期可表现出一个瞬间内向电流，很快衰减，之后趋于平衡，形成时间不依赖性或称为持续性电流。测量电流幅度是测瞬间电流峰值和持续性电流峰值。分别绘制其I-V 曲线，再做分析。
③瞬间外向电流(transient outward current, IA 或Ito)：用于记录Ito 的电压钳制方案与延迟整流电流的方案基本一样，通常将保持电位设在–80 mV，但这种电压钳制方案在记录到的Ito 中，一定混有Ikir。目前可用两种方法将其分开。第一，设置两个电压钳制方案，
即：第一个方案中的保持电位为–80 mV，钳制电位为+50 mV 或更高，时间为80~100ms，目的在于最大程度地记录到Ito。第二，如用改变保持电位的方法仍不能分开Ito 和Ikir，则可用某些阻断剂(如E-4031、TEA 等) 阻断Ikir，然后利用方案一记录Ito。然而，实际上要得到较纯净的Ito 是相当不容易的，这其中包括：在某些细胞Ito 和Ikir 对膜电位的依赖性太接近，以及到目前为止尚未有十分特异的Ikir 阻断剂。由于TEA 这类阻断剂的特异性差，
所有应用时要格外小心，应使用特异性较好的阻断剂。在K+通道的研究中，也可应用斜坡(ramp) 钳制方案。其基本要点是膜电位斜坡除极
的速度不要太快。通常将膜电位从–110 mV 斜坡除极到+70 mV 或更高，旨在使这一钳制方案覆盖整个生理电位活动范围。在神经细胞，斜坡钳制所得到的K+电流包含几种类型K+通道电流，其中有Ikr、Ito 、Ikir 等，也就是记录到的应是一条多类型的K+电流组成的电流轨迹。不同类型的K+通道阻滞剂可以分别阻断这一电流轨迹的不同部分。实验者可在上述原则基础上设计适用于不同K+ 通道研究的斜坡钳制方案。
8. 单通道电流记录
(1) 钠通道电流(INa)：用“细胞贴附式”膜片时，细胞外液为人工脑脊液，电极液为无钙的人工脑脊液(Na+140mmol/L) 保持电位与去极化电压的设置同全细胞记录方式，施加50ms 的去极化脉冲，可记录到单通道INa。为便于观察，使通道开闭的速度变慢，实验需在较低的温度(22~24℃)下进行。INa 表现为内向（向下）的矩形波状的变化。将保持电位从静息电位钳制到–130 mV，处于超极化状态下，给予10 mV 步阶电压的去极化脉冲，钠通道开放数逐渐增多，可得到一个近似于用全细胞模式记录出现的INa 波形。
(2) 钙通道电流(ICa)：为准确控制膜电位，在记录Ca2+电流时，应将灌流液换成高钾(K+浓度130mmol/L) 溶液，此时细胞静息电位约为0 mV，通过保持电位的设置可以较准确的控制细胞膜电位；也可用人工脑脊液灌流，但此时细胞
的静息电位约为–80 mV，设置保持电位时应考虑到这一点。电极液与全细胞记录时应用的细胞外液类似。电压条件与全细胞记录相同。
用细胞贴附式或膜内面向外式记录单通道ICa 时，常用的高钾灌流液的组成（mmol/L）：
K-aspartate 90，KCl 30，KH2PO4 10，EGTA 1，MgCl2 0.5，CaCl2 0.5。用KOH 调pH 至7.4。电极液组成(mmol/L)：BaCl2 50, Choline Cl 或TEA Cl 70, HEPES 10, EGTA 0.5。用CsOH 调pH 至7.4。
应注意的是，并不是每次去极化都能使钙通道开放，常常见到钙通道全部不开的情况(blank trace)，肾上腺素能神经激动剂、钙通道激动剂如Bay K 8644 能延长通道开放时间。
(3) 钾通道电流：细胞K+在正常生理浓度时，钾通道的电导很小，K+电流也非常小，测定很困难，因此在记录钾通道电流时，应将电极内（膜片外）液的K+浓度增加到140~150mmol/L。电压条件与全细胞模式记录时相同。
单通道电流记录的主要观察指标包括：单通道电导(conductance)，开放概率(open probability)，平均开放时间(mean open time)，平均关闭时间(mean close time)。一般说来，单通道记录和分析均较全细胞电流的记录和分析的难度大且更复杂．
膜片钳技术原理 可兴奋膜的电学模型 细胞膜由脂类双分子层和和蛋白质构成。脂质层的电导很低，由于双分子层的结构特点，形成了细胞的膜电容，通道蛋白的开闭状况主要决定了膜电导的数值。在细胞膜的电学模型中，膜电容和膜电导构成了一个并联回路。在细胞膜的电兴奋过程中，脂质层膜电容的反应是被动的，其电流电压曲线是线性的；而由通道蛋白介导的膜电导构成了膜反应的主动成分，它的电流电压关系是非线性的。 当改变跨膜电位时，膜电容和膜电导分别引发被动和主动电流：Im=Ii＋CdV/dt，其中Im是流过膜的总电流，Ii是通道电流，CdV/dt是由膜电容介导的电容电流。为了考察通道电流就必须消除电容电流的影响，此时可以令dV/dt＝0，即将膜电位钳制在一固定数值，使其不随时间变化，这就是电压钳技术的实质所在。 电压钳技术 离子通道的近代观念源于Hodgkin、Huxley、Katz等人在20世纪30—50年代的开创性研究。在1902年，Bernstein创造性地将Nernst的理论应用到生物膜上，提出了“膜学说”。他认为在静息状态下，细胞膜只对钾离子具有通透性；而当细胞兴奋的瞬间，膜的破裂使其丧失了选择通透性，所有的离子都可以自由通过。Cole等人在1939年进行的高频交变电流测量实验表明，当动作电位被触发时，虽然细胞的膜电导大为增加，但膜电容却只略有下降，这个事实表明膜学说所宣称的膜破裂的观点是不可靠的。1949年Cole在玻璃微电极技术的基础上发明了电压钳位（voltage clamp technique）技术，基本原理如下： 电压钳技术的核心在于将膜电位固定在指令电压的水平，这样才能研究在给定膜电位下膜电流随时间的变化关系。在上图中，膜电位Vm由高输入阻抗的电压跟随器所测量。钳制放大器在比较了膜电位和指令电位E之后，通过电阻Ra将电流注入膜内以控制膜电位。钳制放大器的输出：Vo=A（E－Vm），因为这个输出由电阻Ra和膜所分压，所以输出电流：I=（Vo－Vm）/Ra。由这两个关系可推出：Vm=EA/(1+A)-RaI/（1+A）。因此若钳制放大器的增益A极大，膜电位Vm和指令电位E之间的差别就可以忽略，即实现了电压钳制。 Hodgkin、Huxley和Katz应用电压钳技术研究枪乌贼巨轴突，结合同位素示踪和胞内灌流等技术发现：动作电位的初期，细胞膜主要对钠离子的通透性发生改变，胞外的钠离子迅速内流，并产生所谓的“超射”现象（overshoot）；随后对钠的通透性的急剧减少并且对钾离子的通透性增加。兴奋期的膜电位存在“超射”现象也是膜学说所不能解释的。 根据这些实验，Hodgkin、Huxley和Katz在其1949—1952年的一系列论文中提出了“离子学说”或“钠学说”。认为当膜的去极化超过一个临界值时，就会触发动作电位的产生。在此期间，钠电导迅速上升，钠离子大量内流，使得膜电位接近钠的平衡电位；随后钠电导迅速失活，钾电导逐渐增加，引起膜电位的复极化。 Hodgkin和Huxley通过对电压钳位实验数据的分析，给出了所谓的Hodgkin—Huxley方程。他们将膜电位钳制在不同的水平，观察钾电导或钠电导随时间的变化，然后用一个常微分方程去逼近所得到的实验曲线，而这些微分方程中的参数则假定跟离子通道上的“粒子”相关。根据H—H方程，能够推导出动作电位的阈值、形状、幅度等性质。并且在去除电压钳制的条件下，可以得到一个以电压和时间为变量的偏微分方程，由它可以给出和真实状况相符合的神经冲动的传导。 膜噪声和噪声分析 Katz等人在1970年代初期研究了蛙神经肌肉接头处肌纤维膜电位的波动。他们根据对这种膜电位“噪声”的分析，提出了量子释放的概念，认为神经递质是以囊泡的形式从突触前膜释放到突触间隙中。并且Katz等人借助这种新的“噪声分析”方法（fluctuation analysis），能从突触后膜电位的“噪声”中推测出单位事件的幅度和时程。Anderson、Stevens、Colquhoun和Sigworth等人进一步发展了“噪声分析”。 “噪声分析”的实质在于二项分布期望和方差之间的关系。假定通道只有开和关两个状态，并且各个通道的开关是独立的。若N是通道的总数，p是通道的开放概率，i是单通道电流，I是膜电流的期望值。则有：I=Npi，var(I)=Np(1-p)i2,即：var(I)=iI-I2/N。用var(I)对I作图，这显然是一个开口朝下的抛物线。微分这个二次方程得到曲线的斜率：dvar(I)/dI=i-2I/N,当I=0时的斜率就是单通道电流，根据钳制电位和反转电位之间的差就可以算出单通道电导；在抛物线的顶点即当：dvar(I)/dI=0时，I=Ni/2，由此可算出
基础操作 操作步骤 GEMCOM国际软件公司SURPAC中国办事处
第1章简介 目录 GEMCOM国际软件公司 (1) 第1章简介 (3) 1.1 必要的准备 (3) 1.2 目标 (3) 第2章软件的安装与运行 (4) 2.1 安装Surpac软件 (4) 2.2 Surpac的注册运行 (5) 2.3 设置工作目录 (6) 2.4 文件的打开和保存 (7) 小结和练习 (7) 第3章Surpac基本概念 (8) 3.1 Surpac 数据类型 (8) 3.2 基于功能与基于数据的操作方式 (8) 第4章图形用户界面 (9) 小结和练习 (11) 第5章获取帮助 (12) 第6章线文件 (13) 6.1 线文件的结构 (13) 6.2 编辑查看线文件的内容 (13) 6.3 线的显示风格 (14) 6.4 线的类型 (15) 6.5 线的方向 (15) 6.6 线文件命名 (15) 6.7 数据范围的表示 (15) 小结和练习 (16) 第7章编辑数据 (17) 小结和练习 (20) 第8章创建数据 (21) 小结和练习 (24) 第9章DTM文件及表面模型 (25) 小结和练习 (29)
第1章简介 第1章简介 1.1 必要的准备 在使用该视频学习时，要具备以下条件： 1．安装并运行Surpac 6.1.3。[计算机满足配置要求（见基础指南）]。 2. 本文档中涉及的练习数据在相应的下载文件包中。 1.2 目标 通过该视频的学习，掌握以下内容： 软件的安装及运行； 熟悉Surpac数据类型和操作方式； 熟悉Surpac界面的基本组成； 获取帮助； 理解线文件的概念； 查看和保存不同类型的SURPAC数据； 编辑数据； 数字化创建数据； 熟悉DTM表面和实体模型的概念和DTM的一些常用操作。
膜片钳的发展和应用 1．背景 细胞是生物的基本组成单元，细胞外围有一层薄膜，彼此分离又互相联系，细胞间与细胞内的通信、信号传递依靠其膜上的离子通道来进行，离子和离子通道是细胞兴奋性的基础，亦是产生生物电的基础。生物电信号通常是用电学或电子学的方法进行测量。早期多采用双电极电压钳技术作胞内记录，近年来逐渐被膜片钳所取代，这项技术为从细胞和分子水平了解生物膜离子单通道“开启”和“关闭”的门控动力学及各种不同离子通道的通透性和选择性等膜信息提供了最直接的手段。 膜片钳记录(patch clamp recording)是利用玻璃微电极吸引封接面积仅为几个um2的细胞膜片，在10-12A水平，记录单个或几个通道的离子电流，已达到当今电子测量的极限。此技术广泛用于细胞膜离子通道电流的测量和细胞分泌、药理学、病理生理学、神经科学、脑科学、植物细胞的生殖生理等领域的研究。从而点燃了细胞和分子水平的生理学研究的生命之火，并取得了丰硕的成果。 2．膜片钳技术简介 2.1 基本原理和记录方法 电压钳(V oltage-clamp)是由英国学者Huxley和Katz最先应用的[1]。其实质是通过负反馈微电流放大器在兴奋性细胞膜上外加电流，保持细胞跨膜电位不变，并迅速控制其数值，以观察在不同膜电位条件下膜电流的情况。膜电流的改变反映了膜电阻和膜电容的变化，因此电压钳可用来研究整个细胞膜或一大块细胞膜上所有离子通道的活动，但该技术由于在细胞内插人两根电扳，对细胞损伤很大，在小细胞中难以实现，又因细胞形态复杂，很难保持细胞膜各处生物特性的一致，而逐渐被膜片钳所取代。 膜片钳技术(patch-clamp)是在电压钳基础上发展起来一种新技术，与电压钳的主要区别有二：一是钳制膜电位的方法不同；二是电位固定的细胞膜面积不同，即所研究的离子通道数目不同。与电压钳一样，膜片钳也是利用负反馈电子线路，将微电板尖端所吸附的一个至几个平方微米的细胞膜电位固定在一定水平，观察流过通道的离子电流。其实现膜电位固定的关键是在玻璃微电极尖端边缘与细胞膜之间形成高阻封接，使电极尖开口处与相接的细胞膜小区域(膜片)形成无论是从机械上还是电学上都极为紧密地封接，从而可反映细胞上单一(或多数)离子通道的分子活动[2]。1976年，德国科学家Neher和Sakmann首先用此技术对蛙胸皮肌细胞膜上的己酰胆碱受体通道进行了研究，记录出了量值在皮安级(10-12 A)的微弱电流[3,4]。1981年，经Hamill等[5]后人的进一步完善，其电流测量灵敏度已达1pA，时间和空间分辨率达10 us和1 um。 随着膜片钳技术的出现，目前有几种不同的记录方式： (1)细胞吸附式(cell-attached patch)将两次拉制后，经热抛光的微管电极置于清洁的细胞膜表面, 形成高阻封接，在细胞膜表面隔离出一小片膜，即通过微管电极对膜片进行电压钳制，从而测量膜电流。 (2)内面向外模式(inside-out patch)高阻封接形成后，将微管电极轻轻提起，使其与细胞分离，电极端形成密封小泡，在空气中短暂暴露几秒钟后，小泡破裂再回到溶液中，使小泡的外半部分破裂即得。
EDI SACS5.2 pressCAD PARADIGM EPOS3.0 地球物理数据处理应用软件 Excess Plus5.8模具设计 ATLAS.ti5.0 StruCAD*3D应力分析有限元软件 PAM STAMP 2G v2005(世界首屈一指的冲压模拟软件) JmatPro4.1 材料性能模拟软件 Space-E v4.6 KD-RTI和KD-FRMC软件 E-Prime2.0 心理软件 GENESIS2000V9.0a5 SpeedCAD for electric motor desing Crystal Report 11开发版 Crystal Report 11开发版 Crystal Reports 10 Advanced Developer(水晶报表10高级开发版) Green Hills 3.0/3.5/3.6/4.0.7/4.2.3 GreenHills Multi for ARM v4.2.3 GreenHils Multi For MIPS V4.2.3 Metrowerks CodeWarrior 6.0/8.1 Metrowerks CodeWarrior HC05/HC08 WindRiver Diab 4.3/4.4/5.0/5.2 北京灵图VRMAP3.0软件 中视典VR-Platform7.0企业版 FLAC3D/FLAC2D SPSS 14/SPSS 15/SPSS 16统计软件 MAGMA压注模流分析软件 SURPAC5.2矿山工程软件 surpac vision LandMark 地震处理解释系统软件 流体计算软件FLUENT 6.3 Fluid Plan气动/液压设计工程软件 热力学计算软件THERMCAL 电子散热软件icepak4.3 Flomerics flotherm 7.0(电子电器设备空气流和热传导分析的专用CFD软件) Fluent Icepak v4.3（专用的热控分析CFD软件） 质的研究软件QSR NVivo 7.0 流体动力仿真软件HyPneu 汽车仿真软件Avl advisor2004 Avl Cruise4.0汽车性能仿真软件 韩国铸造分析软件AnyCasting9.2 anyPRE 前处理模块 anyPOST 后处理模块 anySOLVER 求解器模块 anyDBASE 数据库模块
内容简介 本书系统分析了目前国内外地质体三维模拟技术和应用软件开发的现状，由此提出了不同领域地质体 三维建模的数据需求、技术流程和主要建模软件的数据接口；详细阐述了Micmmine、surpac、Mapgis、3D-Grid等三维地质体模拟软件在矿山、地下水、城市地质等领域的应用实践和示范工作，以及提交的相 应三维模型成果；并对今后如何展开相关工作提出了建议。 本书可作为开展三维地质建模工作的指导用书，同时亦可作为地质及相关专业学生的专业参考书。 【节选】 (一)地下水三维地质建模所需数据类型 在地下水三维地质建模中，会涉及的地质现象主要有：地貌(或地形)、地层、褶 皱、断裂、透镜体及侵人体等，为刻画这些地质现象，就需要用到地表数字高程模型数据 (DEM)、遥感影像数据、地理信息数据、钻孔数据及剖面数据等。具体来说，为刻画三 维模型中的各种地质现象，需要的相关数据包括以下几种： 1．地表数字高程模型(DEM)数据 地表数学高程模型数据用于生成三维地质结构模型顶面(地表面)，此部分数据可以 从测绘主管部门获取或向国家测绘局基础地理信息中心购买，从基础地理信息中心购买的 数据属于标准数据，数据以ARCINFO数据格式存放。DEM数据比例尺有多种，其中，全 国的1：25万数据库在空间上包含816幅地形图数据，覆盖整个国土范围，国外部分沿国 界外延25公里采集数据。地貌统一在TERLK层中存放，包括等高线、等深线、冲沟等， DEM等高线的等高距，在全国范围内共分40 m、50 m、100 m三种，使用时可参照等分 布图确定。对于标准数据，可以根据需要进行数据格式转换、比例变换、投影变换等多种 处理。 另外，如果不能获取现成的DEM数据，也可以自己使用专门的地理信息系统软件用 地形图生产。即把纸质地形图数字化及几何纠正校准，然后进行高程信息的提取——对等 高线进行屏幕矢量跟踪并对等高线标赋高程值，同时编辑、检查、拼接以生成各种拓扑关 系，最后用软件进行内插值、裁剪生成DEM数据。 2．遥感影像数据
膜片钳使用规则 一、工作原理： 1.膜片钳是一种可以直接观察单一的离子通道蛋白质分子对相应离子通透难易程度等特性的一种实验技术。其基本原理是用一个尖端光洁，直径约为0.5~3um 的玻璃微电极同神经或肌细胞的膜接触而不刺入，然后在微电极另一端开口处施加适当的负压，将与电极尖端接触的那一小片膜轻度吸入电极尖端的纤细开口，这样在这一小片膜周边与微电极开口处的玻璃边沿之间，会形成紧密的封接，其电阻可达数个或数十个千兆欧，这实际上把吸附在微电极尖端开口处的那一片膜同其余部分的膜在化学上完全隔离出来，由微电极记录到的电流变化只同该膜片中通道分子的功能状态有关。如果在这一小片膜中只包含了一个或少数几个通道蛋白分子，那么通过微电极测量出的电流，就是某种带电离子经由开放的单一通道蛋白质分子进行跨膜移动的结果。 二、操作步骤： 1.打开总电源。 2.依次打开电脑、显微镜、监视器、微操、放大器。 3.打开PULSE软件，在E盘建立自己的文件夹。 4.灌注玻璃电极并排空气体。 5.装上玻璃电极，浸入液面并调至视野范围。 6.点击set-up，将增益调为0.5，点Auto，记录电极电阻。
7.封接细胞，若上G，提起或吸破细胞。 8.依次点击on-cell，whole-cell补偿。 9.选定In-out或whole-cell模式进行实验。 10.用毕请关闭仪器，并切断总电源。 三、注意事项： 1.每天做实验前请用清水拖地，以防尘埃、静电伤害机器。 2.拉制仪使用前需预热15-30min。 3.银丝电极及地线发白时，请先用砂纸轻微打磨，再浸入新鲜的次 氯酸钠溶液镀氯化银，如果银丝电极30min未变黑，则考虑更换 次氯酸钠。 4.先开放大器，后开软件；先关软件，后关放大器。 5.非必须用到汞灯时请不要打开汞灯电源，打开后至少需1个小时 才可关闭。 6.在放大器打开时绝对不能用手、金属物品或其它导电的物品接触 电极丝（包括地线），在取放细胞片时请关闭放大器。 7.向玻璃微电极灌注内液时切勿灌太多（1cm左右为适），以防液 体进入银丝底部增加噪声。 8.安装玻璃微电极时，电极应与银丝平行，防止刮蹭银丝电极。 9.玻璃微电极需先用甲醇浸泡，再用酒精灯微烧两端，使其平滑。 10.换液时应时刻观察浴槽，防止液面过低或液体溢出污染镜头，最 适液面为微高于出液口。
膜片钳记录和分析技术 2010-12-15 16:41 来源：美国分子仪器点击次数：2186 关键词：膜片钳细胞信号 分享到： ?收藏夹 ?腾讯微博 ?新浪微博 ?开心网 细胞是动物和人体的基本组成单元，细胞与细胞内的通信,是依靠其膜上的离子通道进行的，离子和离子通道是细胞兴奋的基础，亦即产生生物电信号的基础，生物电信号通常用电学或电子学方法进行测量。由此形成了一门细胞学科-电生理学（electrophysiology），即是用电生理的方法来记录和分析细胞产生电的大小和规律的科学。 早期的研究多使用双电极电压钳技术作细胞内电活动的记录。现代膜片钳技术是在电压钳技术的基础上发展起来的。 1976年德国马普生物物理研究所Neher和Sakmann创建了膜片钳技术（patch clamp recording technique）。这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的（或多个的离子通道分子活动的技术）。以后由于吉欧姆阻抗封接(gigaohm seal, 109W)方法的确立和几种方法的创建。这种技术点燃了细胞和分子水平的生理学研究的革命之火，它和基因克隆技术（gene cloning）并架齐驱，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。 这一伟大的贡献，使Neher和Sakmann获得1991年度的诺贝尔生理学与医学奖。 一、膜片钳技术发展历史 1976年德国马普生物物理化学研究所Neher和Sakmann首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位
的同时，记录到ACh激活的单通道离子电流，从而产生了膜片钳技术。 1980年Sigworth等在记录电极内施加5-50 cmH2O的负压吸引，得到10-100GW10-100G?的高阻封接（Giga-seal），大大降低了记录时的噪声实现了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电流的突破。 1981年Hamill和Neher等对该技术进行了改进，引进了膜片游离技术和全细胞记录技术，从而使该技术更趋完善，具有1pA的电流灵敏度、1μm的空间分辨率和10μs的时间分辨率。 1983年10月，《Single-Channel Recording》一书问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。Sakmann 和Neher也因其杰出的工作和突出贡献，荣获1991年诺贝尔医学和生理学奖。 二、膜片钳技术原理 膜片钳技术是用玻璃微电极吸管把只含1-3个离子通道、面积为几个平方微米的细胞膜通过负压吸引封接起来（见下图），由于电极尖端与细胞膜的高阻封接，在电极尖端笼罩下的那片膜事实上与膜的其他部分从电学上隔离，因此，此片膜内开放所产生的电流流进玻璃吸管，用一个极为敏感的电流监视器（膜片钳放大器）测量此电流强度，就代表单一离子通道电流。 膜片钳技术的建立，对生物学科学特别是神经科学是一资有重大意义的变革。这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的（或多个的离子通道分子活动的技术。些技术的出现自然将细胞水平和分子水平的生理学研究联系在一起，同时又将神经科学的不同分野必然地融汇在一起，改变了既往各个分野互不联系、互不渗透，阻碍人们全面认识能力的弊端。
膜片钳技术在药学研究中的应用 前言 德国物理学家Neher和Sakmann[1.2]建立的膜片钳技术（patch clamp technique）是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞上单一的（或多数的）离子通道活动的技术，已被广泛应用。作为先进的细胞电生理技术，它一直被奉为研究离子通道的“金标准”。应用膜片钳技术可以证实细胞膜上离子通道的存在，并能对其电生理特性、分子结构、药物作用机制等进行深入的研究。基因组学、蛋白质组学研究表明，以离子通道为靶标的药物研究在未来具有很大的发展空间。 关键词膜片钳技术；药学研究；应用 Abstract [ ]The patch-clamp technique , a dominant technique in cellular electrophysiology , is always being regarded as the gold standard for ion channel research.. Application of the patch-clamp technique can demonstrate the existences of ion channels and provide valuable information for ion channels, including their electrophysiological properties , molecular structures and the mechanism of drug action .Genomics and proteomics research has showed that the development of drugs for ion channel target would be very promising in future. Key words Patch-clamp technique ; Study on Medicinal chemistry ; Application 80年代初发展起来的膜片钳技术（patch clamp technique）为了解生物膜离子单通道的门控动力学特征及通透性、选择性膜信息提供了最直接的手段，该技术的兴起与应用，使人们不仅对生物体的电现象和其它生物现象有更进一步的了解，而且基因组学、蛋白质组学研究表明，以离子通道为靶标的药物研究在未来具有很大的发展空间。为了突破由于筛选技术所造成的对离子通道为靶标的药物开发的瓶颈，近年来，对膜片钳技术进行了改进以适合药物高通量筛选的要求，由此产生了一些技术。 一、膜片钳技术原理及特点
膜片钳技术原理与基本操作 1976 年Neher 和Sakmann 建立了膜片钳技术（Patch clamp technique），这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜上单一的或多数的离子通道分子活动的技术。1981 年Hamill, Neher 等人又对膜片钳实验方法和电子线路进行了改进，形成了当今广泛应用的膜片钳实验技术。该技术可应用于许多细胞系的研究，也是目前唯一可记录一个蛋白分子电活动的方法，膜片钳技术和克隆技术并驾齐驱给生命科学研究带来了巨大的前进动力，这一伟大的贡献，使Neher 和Sakmann 获得1991 年诺贝尔医学与生理学奖。 一、膜片钳技术的基本原理 用一个尖端直径在1.5~3.0μm 的玻璃微电极接触细胞膜表面，通过负压吸引使电极尖端与细胞膜之间形成千兆欧姆以上的阻抗封接，此时电极尖端下的细胞膜小区域（膜片，patch）与其周围在电学上分隔，在此基础上固定（钳制，Clamp）电位，对此膜片上的离子通道的离子电流进行监测及记录。 基本的仪器设备有膜片钳放大器、计算机、倒置显微镜、示波器、双步电极拉制器、三轴液压显微操纵器、屏蔽防震实验台、恒温标本灌流槽、玻璃微电极研磨器。膜片钳放大器是离子单通道测定和全细胞记录的关键设备，具有高灵敏度、高增益、低噪音及高输入阻抗。膜片钳放大器是通过单根电极对细胞或膜片进行钳制的同时记录离子流经通道所产生的电流。膜片钳放大器的核心部分是以运算放大器和反馈电阻构成的电流-电压（I-V）转换器，运算放大器作为电压控制器自动控制，使钳制电位稳定在一定的水平上。 二、操作步骤 1.膜片钳微电极制作 (1) 玻璃毛细管的选择：有二种玻璃类型，一是软质的苏打玻璃，另一是硬质的硼硅酸盐玻璃。软质玻璃在拉制和抛光成弹头形尖端时锥度陡直，可降低电极的串联电阻，对膜片钳的全细胞记录模式很有利；硬质玻璃的噪声低，在单通道记录时多选用。玻璃毛细管的直径应符合电极支架的规格，一般外部直径在 1.1~1.2mm。内径1mm。 (2) 电极的拉制：分二步拉制。第一部是使玻璃管中间拉长成一窄细状，第二次拉制窄细部位断成二根，其尖端直径一般在1~5μm，充入电极内液后电极电阻在1~5MΩ为宜。调节第一步和第二步拉制时加热线圈的电流强度，即可得到所需要的电极尖端直径。电极必须保持干净，应现用现拉制。 (3) 涂硅酮树酯：记录单通道电流时，为了克服热噪声、封接阻抗噪声及电极浸入溶液产生的浮游电容性噪声，需要在电极尖颈部（距离微电极尖端50mm）的表面薄薄地涂一层硅酮树酯（sylgard），它具有疏水性、与玻璃交融密切、非导
膜片钳技术SOP 关键词：膜片钳 目的： 研究膜片上几个甚至一个离子通道的电流，对单个离子通道在各种电位状态及每种电位状态下对产生电流的离子作出定性、定量的分析，来反映细胞膜上离子通道活动，为研究离子通道结构与功能关系提供关于生物电特性的新资料。基本原理： 膜片钳制技术（patch clamp technique)是对一块单独的细胞膜片（或整个细胞）的电位进行钳制的一项电生理技术。 通过对膜电位的钳制可以观察通过离子通道的电流，膜片钳放大器正是通过维持电压的恒定而测出这种电流。运用膜片钳技术记到的最小电流可达到pA级(10-12 A)。膜片钳的本质属于电压钳范畴，其基本工作原理是：采用经典的负反馈放大技术作电压固定，但改用细胞外微吸管作电极，将微电极管尖端与细胞膜表面接触，经负压抽吸，形成具极高阻抗的紧密封接，其电阻值高达10-100千欧（即GΩ=109Ω）。只有在这种封接存在时，通过膜电极引导记录的电流才是通过该膜的离子通道电流。 膜片钳技术原理示意图 Rs是膜片阻抗相串联的局部串联电阻（输入阻抗），Rseal是封接阻抗。Rs通常为1～5MΩ，如果Rseal高达10GΩ（1010Ω）以上时，IP/I=Rseal/(Rs+ Rseal)-1。此Ip可为在I－V转换器（点线）内的高阻抗负反馈电阻(Rf)的电压降而被检测出。
药品和试剂： 根据不同的实验设计选择不同的药品和试剂。 主要仪器设备与材料： ①屏蔽防震实验台(TMC 63-544) ②数字式超级恒渐浴槽（HSS-1 CHENDU INSTRUMENT China） ③微管电极拉制器（PP-83 NARISHIGE Japan） ④微管电极抛光仪（ME-83 NAEISHIFE Japan） ⑤电子刺激器（SEN-2030, NIHON KOHDEN, Japan） ⑥膜片钳放大器（AXOPATCH 200B Axon Instruments U.S.A） ⑦倒置相差显微镜（AXIOVERT 135 ZEISS Germany） ⑧计算机（PⅢ 800） ⑨A/D、D/A转换器（DIGIDATA-1200 Axon Instruments U.S.A） ⑩pClamp软件（10.0）Axon Instruments U.S.A ) 实验对象： 兔、大鼠、猪、和人的组织细胞（直径小于30μm的细胞），都可用于膜片钳实验。动物由泸州医学院（许可证号：SYXK（川）2008-063）提供；人体组织来源于临床手术丢弃物。本SOP以猪冠状动脉平滑肌细胞为例，选取体重约120～150 Kg的猪，雌雄不拘，猪心脏购自泸州市屠宰场。 实验环境： 常温（22o C）下进行, 湿度（70-80%） 操作步骤： 1.液体配制 主要根据研究通道的不同，所用细胞的不同，配制相应的液体，可参考相应的文献进行调整。包括：电极液；细胞外液等。基本原则是保持2个平衡，渗透压平衡和酸碱平衡。另外，所有液体在使用前必须过滤，以保持液体洁净。（详见细胞的分离与培养SOP：L Y-XJD-SYJS-014/015） 2.标本制备 膜片钳实验一般是在单个细胞上进行。实验用单细胞主要来自培养细胞或急性酶分离的细胞，也可来自脑片细胞中的原位细胞。常用的酶是胶原酶和蛋白酶，
第四章Block Modeling 块体模型
综述 这一节将介绍在 Surpac块体模型中使用的术语和基本概念。 什么是Surpac块体模型？ 当前矿业软件中通行的概念是将块体模型与地质统计学相结合，是应用数学方法对品位分布进行建模，由于品位分布是在资源中受地质因素控制而明显存在的，从而形成一定约束条件下的品位模型。块体模型的精度取决于块体模型的结构和属性。在资源储量估算中，利用块体模型可以准确地进行资源量和品级报告。 Surpac 块体模型是数据库的一种格式，意味着其结构不仅可以存储和操作数据，还能修补来自于数据中的信息，这是和传统的数据库不同的地方，存储数据的时候更像内插替换一个值，而不是度量一个值。另外一个主要的不同在于这个值具有空间参照性。第三个不同在于块模型在打开的时候完全放在了内存中，实现了动态操作，如画等值线等属性，当然同时对内存也提出了较高的要求。 例如在地质数据库中，特征值都是和空间位置相联系的，然而，空间位置却不是和特征值有必要关系的。 块模型的部分空间是块的组成部分，每一个都和一个记录相联，这个记录是以空间为参照的，每个点的信息可以通过空间点来修改而并不仅仅是取决于其精确测量，空间参照就是一些额外的操作，对数据库的容量进行操作和查询，空间操作的方式是 INSIDE 和 ABOVE,在实体和表面文件中可以用，对于外部和下部空间的操作使用非逻辑操作，例如 NOT INSIDE 或者 NOT ABOVE。 块模型包含了一些组件： 模型空间Model Space 模型空间是指立体体积，在块模型术语里其中什么都不存在。
在建立的模型空间属性都是有条件的属性，这些属性可以是指定的，有序的，间隔的，可以是比率，也可以是字符，是数值，特征值可以通过别的属性值由计算得出，这些属性值都可以进行报告输出和可视化浏览。 ?约束 限制就是对空间操作符和物体的逻辑组合，可以用来控制对块的选择，对信息加以修复，或者对其进行内插值。最后这个约束可以保存为约束文件，这个文件的扩展名为 .CON. 模型本身在模型空间内是一个二进制的图形结构，通过存在的块和不存在块定义模型，模型文件的扩展名为 .MDL 块模型可以在任何位置应用，通过空间值的分布建立空间模型。 块模型的概念: 下面的术语是 Surpac2000 模型定义中的术语： ?原点 模型的原点也就是左下角的最小的那个坐标点，坐标都使用笛卡尔坐标，原点是一些其它参数，如方位、倾角、插入的参照点。 ?范围 模型的范围包括了x, y, z方向的范围。 例如，如果模型覆盖了下面这个区域： 3000mN to 3650mN 1500mE to 2100mE 120mEl to 270mEl 它的原点就应该是： Y=3000 X=1500 Z=120 模型的范围应该是: Y=650 X=600 Z=150 ?方位 模型的方位是指模型主轴与水平方向的角度，方位为0表示模型没有旋转，仍然是南北方向的。
2008级硕士研究生膜片钳技术试题 请用A4纸书面手写，严禁抄袭。下学期开学后两周内交于先知楼2002室陆巍老师处，过期不侯！ 问答题（共100分） 1、什么是膜片钳技术？它的基本工作原理是什么？ 答：膜片钳技术是以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞上单一的（或多个的）离子通道分子活动的技术，具体说来就是利用微玻管（膜片电极或膜片吸管）接触细胞膜，以吉欧姆（GΩ）以上的阻抗使之封接，使与电极尖开口处相接的细胞膜的小区域（膜片）与其周围在电学上绝缘，在此基础上固定电位，对此膜片上的离子通道的离子电流（pA级）(10-12A)进行监测记录的方法。 膜片箝的基本原理是：用一个尖端光洁、直径约0.5-3um的玻璃微电极同神经或肌细胞的膜接触而不刺入，然后在微电极的另一段开口施加适当的负压，将与电极尖端接触的那一小片膜轻度吸入电极尖端的纤细开口，这样在小片膜周边与微电极开口的玻璃之间形成紧密封接，在理想状态下电阻可达数十兆欧。实际上把吸附在微电极尖端开口的那小片膜同其余部分的膜在电学上完全分开，如果这小片膜上只含一个或几个通道分子，那么微电极就可以测量出单一开放的离子电流或电导，对离子通道的其他功能进行研究。 2、膜片钳记录方法分为四类？各有何特点？ 答：膜片箝有四种分类： （1）单通道记录法-细胞吸附模式（Cell-attached Mode） 微电极在显微镜下贴近细胞后，给微电极施加一负压，形成高阻抗封接。此时可看到背景噪音明显减少，通常选取电极下仅有一个通道的膜片进行分析，即单通道记录，以利于不失真的观察一个通道的活动状态。该方法的优点是对细胞膜结构和调制系统干扰最小，能准确反映通道的活动状态并对此进行客观分析。但缺点是电流小，分辨率地，对技术要求高，难度较大，且工作量大而成功率又较低。 (2)全细胞记录法(Whole-cell recording) 在高阻抗封接做好后，再给一个很小的负压，将电极覆盖的膜吸破，使电极内与整个细胞内相通，用这个方法可记录进出整个细胞的电流。该方法的优点是电流大，信噪比好，既可以做电流钳制又可以做电压钳制，且可以改变细胞内容物。但此法只能用于直径小于3μ的细胞，且仅能观察膜电流的变化，不能分析变化的产生机制。 (3)膜内面向外式（Inside-out） 按照细胞密着式将电极封接好之后，再将电极拉开，使之与胞体脱离即可，也是用以记录封在电极尖端口下的膜片中的离子通道电流。是在细胞吸附式的基础上改进而成。其优点是可以观察化学因素对细胞膜内侧面结构的影响，但其操作难度较高。 (4)膜外面向外（Outside-out）在全息胞记录式的基础上，拉开电极使之与胞体脱离，这是附在电极尖端的膜片又可自动地将电极尖端口封住。此膜片的外侧面向外其是在全细胞记录的基础上改进而成，优点是可以分别观察化学因素对细胞膜外侧面结构的影响。 3、膜片钳技术的应用范围有哪些？ 答：应用膜片钳技术可以直接观察和分辨单离子通道电流及其开闭时程、区分离子通道的离子选择性,同时可发现新的离子通道及亚型,并能在记录单细胞电流和全细胞电流
丁香园膜片钳技术讨论区 资料汇编 整理人：xiaoxuanzi 发起人：tianx775 2006年6月
目录 第一节膜片钳技术介绍 (1) 应用 (1) 基本概念 (2) 第二节仪器操作和维护 (3) 仪器的使用 (3) 噪声 (4) 玻璃微电极的制备 (5) 第三节 实验操作 (7) 1.细胞的分离、培养 (7) (1)心肌细胞 (7) (2)平滑肌细胞 (17) (3)其他细胞 (19) 2.电极的拉制与电镀 (23) 3.电极内外液与渗透压 (25) 4.串联、封接、电极电阻 (28) 5.补偿 (37) 6.刺激方案 (40) 7.动作电位记录 (42) 8.电流记录 (42) (1)钙电流 (42) (2)钾电流 (45) (3)钠电流 (47) (4)其他电流 (48) 9.穿孔 (50) 10.单通道记录 (51) 11.脑片 (54) 12.数据分析与处理 (55) 第四节 相关电子文献及书籍 (61)
第一节 膜片钳技术介绍 一、应用 1.全细胞记录技术的应用 [Cactuswzw]（1）离子通道宏观性质的分析，例如，离子通道的性质和分类(电压门控通道、膜受体激活通道、配体门控通道、胞内第二信使激活通道等) （2）离子通道微观性质分析，例如单一离子通道活动的测定的测定，离子通道的构造，分布和机能的分析等。 （3）膜电容的测量及其对细胞分泌活动的研究。 （4）胞内钙离子浓度和钙通道电流的同时定量检测。 （5）组织切片的全细胞记录。 (6)植物细胞的电生理研究。 二、基本概念 1.刚刚接触patch，有些概念都很模糊 holding potential与command potential？ Axon200B的放大器控制面板上有ext. command，又是什么东东？ 都分别什么时候给予？ 在我理解，pipette capacity compesation就是快电容补偿，而Cm补 偿为慢电容补偿，那为何Axon200B的面板上在pipette capacitance compensation下面列了FAST和SLOW的magnitude以及时间常数的调节 扭？ [baxiansheng]Holding potential 是钳制电压，这是实验中从头至尾 通过电极用于钳制细胞的一个电压，和膜电位的关系取决于采用的实验 模式。而command voltage是在holding potential基础上施加的刺激 方案，比如全细胞实验中可以设置Holding potential在-80mV，然后 去极化至+10mV 400ms，那么这个去极化至+10mV的方波就是command voltage，当然command voltage的设置可以根据实验设置得更复杂。 Axon200B放大器控制面板的ext. command是用于接外接刺激器的，通 过外接刺激器来施加command voltage，当然现在完全由计算机代替了。 pipette capacity是电极电容，因为时间常数小，所以称快电容，而 Cm是膜电容，因为时间常数大，所以称为慢电容。Axon200B的面板上 在pipette capacitance compensation下面列了FAST和SLOW的 magnitude以及时间常数的调节扭，那是对电极电容的补偿方式。实际 上电极电容中也有一些时间常数较大的成分，单纯补偿FAST效果并不 完美，需要再稍稍调节一下SLOW。 2.我的课题是关于心血管系统中离子通道方面的研究。离子通道一般有备 用关闭状态（close），激活状态（active）和失活状态（inavtive）。但 最近我看文献有去激活状态,英文为deactivation,我想跟失活肯定不是 一个概念，但又找不到确切的含义，有谁能帮我解释一下这几种通道状 态个代表什么含义？ [coolworm]C<----->O<------->I
地质体三维建模方法与技术 指南 -标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII
内容简介 本书系统分析了目前国内外地质体三维模拟技术和应用软件开发的现状，由此提出了不同领域地质体 三维建模的数据需求、技术流程和主要建模软件的数据接口；详细阐述了Micmmine、surpac、Mapgis、 3D-Grid等三维地质体模拟软件在矿山、地下水、城市地质等领域的应用实践和示范工作，以及提交的相 应三维模型成果；并对今后如何展开相关工作提出了建议。 本书可作为开展三维地质建模工作的指导用书，同时亦可作为地质及相关专业学生的专业参考书。 【节选】 (一)地下水三维地质建模所需数据类型 在地下水三维地质建模中，会涉及的地质现象主要有：地貌(或地形)、地层、褶 皱、断裂、透镜体及侵人体等，为刻画这些地质现象，就需要用到地表数字高程模型数据(DEM)、遥感影像数据、地理信息数据、钻孔数据及剖面数据等。具体来说，为刻画三 维模型中的各种地质现象，需要的相关数据包括以下几种： 1．地表数字高程模型(DEM)数据 地表数学高程模型数据用于生成三维地质结构模型顶面(地表面)，此部分数据可以 从测绘主管部门获取或向国家测绘局基础地理信息中心购买，从基础地理信息中心购买的 数据属于标准数据，数据以ARCINFO数据格式存放。DEM数据比例尺有多种，其中，全
国的1：25万数据库在空间上包含816幅地形图数据，覆盖整个国土范围，国外部分沿国界外延25公里采集数据。地貌统一在TERLK层中存放，包括等高线、等深线、冲沟等，DEM等高线的等高距，在全国范围内共分40 m、50 m、100 m三种，使用时可参照等分布图确定。对于标准数据，可以根据需要进行数据格式转换、比例变换、投影变换等多种处理。 另外，如果不能获取现成的DEM数据，也可以自己使用专门的地理信息系统软件用 地形图生产。即把纸质地形图数字化及几何纠正校准，然后进行高程信息的提取——对等高线进行屏幕矢量跟踪并对等高线标赋高程值，同时编辑、检查、拼接以生成各种拓扑关系，最后用软件进行内插值、裁剪生成DEM数据。 2．遥感影像数据 遥感影像是地球空问数据最直接、时效性最强的数据形式，模型的表面需要用影像数 据进行贴图，来表达真实的地表景观。由于影像数据的容量大，为了能够快速、高质量地进行显示，需要根据显示的范围、显示的比例选择分辨率最合适的影像进行纹理映射。一个模型可以有不同分辨率的多套卫星／航测影像数据，某些影像数据有可能只局限于某个局部。因此，在显示时，所有的影像数据都需要读入内存，以实现多分辨显示。这就需要在技术上做一些处理，比如图像格式的转换，根据显示分辨率和比例的不同，转换为不同分辨率的图像如BMP、TIFF、GIF等图像格式。 对遥感影像数据的处理主要包括对遥感影像的几何精纠正和不同分辨率影像数据的融合。一般使用遥感处理软件ERDAS和ENVI软件进行处理。遥感影像几何精纠正的目的
1976年[1]德国马普生物物理研究所Neher和Sakmann创建了膜片钳技术（patch clamp reco rding technique）。这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的或多个的离子通道分子活动的技术。它和基因克隆技术（gene cloning）并架齐驱，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。 这一伟大的贡献，使Neher和Sakmann获得1991年度的诺贝尔生理学与医学奖。 [编辑本段] 一、膜片钳技术发展历史 1976年德国马普生物物理化学研究所Neher和Sakmann首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位的同时，记录到ACh激活的单通道离子电流，从而产生了膜片钳技术。 1980年Sigworth等在记录电极内施加5-50 cmH2O的负压吸引，得到10-100GΩ的高阻封接（Giga-seal），大大降低了记录时的噪声实现了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电流的突破。 1981年Hamill和Neher等对该技术进行了改进，引进了膜片游离技术和全细胞记录技术，从而使该技术更趋完善，具有1pA的电流灵敏度、1μm的空间分辨率和10μs的时间分辨率。 1983年10月，《Single-Channel Recording》一书问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。Sak mann 和Neher也因其杰出的工作和突出贡献，荣获1991年诺贝尔医学和生理学奖。 [编辑本段] 二：膜片钳技术原理 膜片钳技术是用玻璃微电极吸管把只含1-3个离子通道、面积为几个平方微米的细胞膜通过负压吸引封接起来，由于电极尖端与细胞膜的高阻封接，在电极尖端笼罩下的那片膜事实上与膜的其他部分从电学上隔离，因此，此片膜内开放所产生的电流流进玻璃吸管，用一个极为敏感的电流监视器（膜片钳放大器）测量此电流强度，就代表单一离子通道电流。 膜片钳技术的建立，对生物学科学特别是神经科学是一资有重大意义的变革。这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的（或多个的离子通道分子活动的技术。些技术的出现自然将细胞水平和分子水平的生理学研究联系在一起，同时又将神经科学的不同分野必然地融汇在一起，改变了既往各个分野互不联系、互不渗透，阻碍人们全面认识能力的弊端。 [编辑本段] 三：全自动膜片钳技术 膜片钳技术被称为研究离子通道的“金标准”。是研究离子通道的最重要的技术。目前膜片钳技术已从常规膜片钳技术（Conventional patch clamp technique）发展到全自动膜片钳技术（Aut omated patch clamp technique）。 传统膜片钳技术每次只能记录一个细胞（或一对细胞），对实验人员来说是一项耗时耗力的工作，它不适合在药物开发初期和中期进行大量化合物的筛选，也不适合需要记录大量细胞的基础实验研究。全自动膜片钳技术的出现在很大程度上解决了这些问题，它不仅通量高，一次能记录几个甚至几十个细胞，而且从找细胞、形成封接、破膜等整个实验操作实现了自动化，免除了这些操作的复杂与困难。这两个优点使得膜片钳技术的工作效率大大提高了！签于全自动膜片钳技术的这些优点，目前已经广泛的用于药物筛选。 [编辑本段]