什么是引物二聚体？怎样消除引物二聚体?
是引物的3'端间相互错配扩增形成的。引物二聚体的出现是必然的，只是或多或少的问题，电泳时看不到引物二聚体带也不代表没有二聚体出现，只是含量低我们的肉眼看不到而已。提高PCR严谨性(包括提高退火温度，降低引物浓度等)可大大降低二聚体的浓度。
减少PCR产物中引物二聚体的方法:
1从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法;
2.可能模板有问题;模板浓度过小，适当加大模板量;
3.Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度;
4.取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的;理由:引物可能会发生发夹结构,自身环化等结构,在100摄氏度下的沸水中煮5分钟可使引物变为单链，以减少二聚体。不过有人认为在PCR仪上95度变性5min也同样达到目的，而且成功试过通过延长退火时间也可以消除引物二聚体。
5.所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO，可以增强特异性;
6.PCR反应体系的配制在冰上进行，最后加TAq酶，PCR结束后，产物勿放置在室温下过长时间，有人认为室温下有些TAQ酶会将多余的引物合成为二聚体。
7.增加循环数;
8.降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，若提高温度的同时产物量减少，则考虑增加镁离子浓度(根据扩增片断长度而定，片段长则相应镁离子浓度应该高一些);
9.若降低退火温度，发现还是只有引物二聚体，而且镁离子的浓度在20-25mmol/l 没有区别，则考虑Buffer等试剂没有完全融解、混匀，导致吸取的试剂浓度不对。
10. 以上次的PCR产物作模板二次PCR，可以提高引物与模板的特异性，减少引物二聚体，如果两次时间间隔短的话，可以把原产物稀释100－1000倍，如果间隔较长可以稀释50－100倍。
反应成分问题：
反应条件问题：
如何区分引物二聚体与PCR产物（100kb）
（1）．PCR产物的电泳检测可能出现那些问题：
一般为48h以，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。
假阴性，不出现扩增条带
PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。
靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
假阳性
出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪或溅出离心管外。②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。
出现非特异性扩增带
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：①必要时重新设计引物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。
出现片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓度。④增加模板量，减少循环次数。
（2）。怎么鉴别引物二聚体和产物：
1．实时定量PCR
PCR可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增。在扩增反应结束之后，我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通过对光密度扫描来进半定量的分析。无论定性还是半定量分析，分析的都是PCR终产物。但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经PCR信号放大之前的起始模板量。例如我们想知道某一特定基因在特定组织中的表达量。早期定量PCR技术需要特别的训练，严格的测试和特别准确的加样。早期定量PCR技术的难点主要在于：如何确定PCR正处于线性扩增围（只有在此围PCR产物信号才与初始模板的拷贝数成比例），为了保证线性，研究者要扩增一系列梯度稀释的cDNA或者对每个基因的扩增循环数作适当的调整；在这种需求下荧光定量PCR技术应运而生。所谓的实时荧光定量PCR，其反应体系中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线（如图1）。
一般而言，荧光扩增曲线可以分三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量PCR技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和CT值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。每个反应管的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值（threshold value）（如图2所示）。
定量荧光扩增曲线是荧光量与循环数的图表。荧光阈值线的位置一般事实上位于减去本底的位置上，这时的荧光信号超过了荧光背景信号并且开始增加。对某一样品的C（t）值就定义为荧光量与荧光阈值线交叉时的循环数。
CT值与起始模板的关系研究表明，每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表CT值，纵坐标代表起始拷贝数的对数（如图3所示）。因些只要获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
SYBR Green Ⅰ荧光染料
目前荧光实时定量PCR所使用的荧光化学方法主要有五种，分别是：嵌染料（SYBR Green Ⅰ）、双标记探针、FRET探针、分子信标和Ampliflor。其中SYBR Green Ⅰ染料法不需要设计合成序列特异性探针和新的引物对，是一种简便，性价比较高的实时监测方法，常常被用于进行RNA表达相对定量以及DNA定量研究中。
SYBR Green Ⅰ是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料。与双链DNA结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBR Green Ⅰ的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射强荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子仅有微弱荧光信号背景，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加同步。
SYBR GreenⅠ在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链DNA相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此通用性好，且价格相对较低。利用荧光染料可以指示双链DNA熔点的性质，通过熔点曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚体，因而可以区分非特异扩增。此外，由于一个PCR产物可以与多个分子的染料结合，因此SYBR GreenⅠ的检测灵敏度很高。但是，由于SYBR GreenⅠ与所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响。由熔解曲线来分析产物的均一性有助于更准确地分析SYBR GreenⅠReal-Time PCR定量结果。
在PCR结束后，我们可以根据变性过程中的荧光值变化绘出每个样品的熔解曲线。绘制熔解曲线时，Real-Time PCR 仪连续监测每个样品在从双链完全配对到完全解链的升温过和中荧光值的变化过程。不同的扩增产物因为其长度和GC含量不同而在不一样的温度下解链，当产物解链时，SYBR GreenⅠ的荧光值将降低并被仪器监测到。由此绘制出荧光强度随温度变化的负一次倒数图。荧光强度变化的拐点（熔点，Tm）即为熔解峰值。熔解曲线是扩增反应的质控途径，当图中没有出现杂峰，也未出现主峰的异常增宽，表明实验中未出现污染、引物二聚体和非特异性扩增。
荧光定量PCR技术的应用
实时荧光定量PCR技术是DNA定量技术的一次飞跃。运用该项技术，我们可以对DNA、RNA样品进行定量和定性分析。定量分析包括绝对定量分析和相对定是量分析。前者可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度；后者可以对不同方式处理的两个样本中的基因表达水平进行比较。除此之外我们不定期可以对PCR产物或样品进行定性分析：例如利用熔解曲线分析识别扩增产物和引物二聚体。以区分非特异扩增；利用特异性探针进行基因型分析及SNP检测等。目前实时荧光PCR技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域。其中最主要的应用集中在以下几个方面：
1、比较经过不处理样本之间特定基因的表达差异（如药物处理、物理处理、化学处理等），及特定基因在不同相的表达差异。
2、比较正常组织与病理组织中各种mRNA 表达量差异。
3、验证基因芯片实验结果。
4、验证RNA干扰实验结果。
2． DXY上的建议：
1．可以用非变性PAGE胶电泳，应该能分开的，理论上说分辨率达到1个碱基。可以用非变性丙烯酰胺凝胶电泳进行分离鉴定NA在丙烯酰胺凝胶中的有效分离围:
丙烯酰胺(W/V):12% 有效分离围(bp):40-200
15% 25-150
电压一般是1-8V/cm, 6个小时后银染即可分辨你的两个片段
2．可以用1.3%TAE的长胶，在30伏的电压下（中号电泳槽），跑16-20小时是应该可以分开的。
3．用2.5%的琼脂糖就能分开，我们实验室经常用它来分开相差28bp的片段，效果很好，看的很清楚，但有几点要注意，缓冲液要是新配的，电压100v跑10分钟，接着50v跑一个半小时，到两个小时。
4．理论上用1.5或者2.5琼脂糖应该都可以分开，在电泳的时候电压不适宜太大，用40-50v 跑上2小时左右应该就可以了。电压加大到80v或者100v的时候虽然节省实验时间，但是有时条带的效果看起来就不是很好。还有就是似乎你的Marker选择的不好，即使电泳能够分开两条带，这个Marker也很难来说明你的目的条带和参带的大小。
5．用聚丙烯酰胺跑垂直电泳。
1。需要单独的垂直电泳槽，及配置聚丙烯酰胺凝胶。
2，具体的做法可以到生物谷，有详细的说明。
3，你可以用5%的琼脂糖跑一下。
6．建议你跑PCR的时候做个阴性对照，只加引物，电泳时看阴性对照引物二聚体的位置，
以区分拟订目的片段71bp条带，或是电泳时直接加一空引物做对照
1材料与方法
1．1标本
人单核细胞系U937，细胞密度2×108/L，分对照组(N)、处理Ⅰ组(T1)、处理Ⅱ组(T 2)，N用1640培养基及10％胎牛血清培养，T1用IFN-γ104U/L LPS 1μg/L、T2用IFN- γ10 U/L LPS l0μg/L分别刺激7 h。
1．2主要试剂与仪器
TRIzol试剂(GIBCO BRL)、Fluoro DD试剂盒(Genomyx)、Supersript Ⅱ逆转录酶(GIBCO BRL)、Ampli Taq DNA聚合酶(GIBCO BRL)、RNase-free
DNaseI(Promega);Genomyx LR 、Genomyx SC、DNAThermal Cycler(Perkin Elmer) 1．3总RNA的制备
按试剂盒提供的方法分别提取三种细胞的总RNA，以RNase-free DNase I(终浓度80 000 U/L)除去其中污染的DNA，经甲醛变性凝胶电冰鉴定其完整性，并以紫外分光光度计检测其纯度
1．4mRNA差异显示
1.4．1逆转录反应选择锚定引物［T7(dT12)AP(anchored prime rs，AP)，序列为
5′ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTMN3′，其中M＝A／G／C．N＝A /G/C/T］，以总RNA为模板进行逆转录反应，每管反应体系如下：总RNA l．0μg,AP 4 pmol ,70℃5 min,加入50 mmol/L Tris-HCl(pH8.3),75 mmol/L KCl,3 mmol/L MgCl2,10mmol /L
DTT,25μmol/L，dNTPmix(1∶1∶1∶1)，SuperScriptⅡ60 Units，总反应体系20 μl 。42℃5 min，50℃50 min，70℃15 min。
1．4．2荧光标记差异显示PCR选取与逆转录引物序列相同的带荧光物质标记的锚定引物［TMR-T7(dT12)AP］，随机引物(5'ACAATTTCACACAGGAACGCTAGTTG 3')，以逆转录产物为模板，进行PCR反应。反应体系包括：20 mmol/L Tris-HCl(pH8．4) ，50 mmol/L KCl，3．75 mmol/L MgCl2，逆转录产物3．0 μl，50 μ mol/L dNTP mi x(1∶1∶1)，0．35 μmol/L 5'-随机引物,0．35 μmol/L 3-锚定引物,Ampli Taq 0.5 U nits，总反应体系10 μl。95℃2 min。94℃15 s，50℃30 s，72℃2 min，4个循环；94℃15 s，60℃30 s，72℃2 min，25个循环；72℃延伸7 min。
1．4．3分离差异显示片段配制5．6％变性聚丙烯酰胺凝胶，胶厚0．2 5 mm，大小61×33 cm。将PCR产物加4．0 μl上样缓冲液，95℃变性后上样。3000V、100 W 、55℃电泳4．5 h。干胶后置于Genomyx SC扫描，用系统所带的AcquireSC program软件分析处理扫描结果。
1．4．4回收差异条带用AcquireSC软件将差异条带定位，用一次性手术刀片切割下所需条带，置于30 μl去离子水中，37℃水浴30～60 min，备用。
1．4．5差异条带的再扩增以经上述处理的回收条带为模板，T7启动子
22-mer(5'GTAATACGACTCACTATAGGGC3')、反
M13(-48)24-mer(5’AGCGGATAACAATTTCACACA GGA3')为引物,进行再扩增反应：模板2.0 μl,20 mmol/L Tris-HCl(pH8．4)，50 mmol/L KCl，1．5 mmol/L MgCl2,20 μmol／L dNTP mix(1∶1∶1∶1)，0．2 μmol／L T7、0 ．2 μmol/L M13-r，AmpliTaq 1．0 U nits，总反应体系20 μl。反应条件同差异显示PC R。
2结果
2．1总RNA的质量
引物的原理 引物是短的寡核苷酸片段，充当DNA复制的起点。因为几乎所有DNA聚合酶都不能从头合成，所以它们需要一个3’-羟基作为DNA合成的起始点。这个3’-羟基由相配的引物提供。在体内，由于DNA聚合酶的忠实性，不能从头合成DNA，因此只能由RNA聚合酶（称为引物酶）生成，采用RNA引物来延伸，在延伸过程中，RNA引物降解并由DNA 取代。在体外PCR反应中所用到的DNA引物，是根据不同的要求及模板序列设计，然后用化学法人工合成的，与模板形成双链后在DNA聚合酶的作用下就可以继续链的延伸；对于大多数PCR反应，决定整个反应成功与否的最重要因素是引物的序列和质量。 1. 不同实验要求的引物选择 在开始设计引物之前，必须弄清以下几点： （1）明确PCR的目的（例如克隆、SNP检测、定量检测等） （2）确定样品材料（基因组DNA、RNA、微小RNA） （3）确定PCR的类型（普通的、定量PCR、RT-PCR、长片段PCR)，在查找序列的时候还需要考虑可能存在的问题（如假基因等） 2.引物设计的重要因素 有一些不同的软件工具可用于引物设计和引物分析。引物设计的软件如Oligo 6.22 ，Premier 5.0，Primer Express 3。引物分析常用Primer 5，Oligo 6.22，Primer-Blast。目前生工生物给客户提供的引物设计服务引物用的是在线软件Primer 3 plus， 引物长度和专一性 ?常见的引物长度为18-30个碱基。短的引物（≤15碱基）能非常高效地结合, 但是它们的专一性不够。较长的引物能提高专一性，然而退火效率低，从而导致PCR产量低下。同时应避免编码单一序列和重复序列的引物。 平衡GC含量，避免GC-和AT-富集区域 ?引物的GC含量应介于40%～60%之间。应避免聚-（dC）-或聚（dG）-区域，因为它们会降低退火反应的专一性。聚-（dA）-和聚（dT）-也应避免，因为这样会形成不稳定的引物-模板复合物，从而降低扩增效率。 3’-序列
引物之间两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3’端，即使无法避免，其3’端互补碱基也不应大于2个碱基，否则易生成引物二聚体Primer dimer。所谓引物二聚体实质上是在DNA聚合酶作用下，一条引物在另一条引物序列上进行延伸所形成的与二条引物长度相近的双链DNA的片段，是PCR常见的副产品，有时甚至成为主要产物。 形成引物二聚体原因 1, 最根本的原因是引物之间或者自身存在互补序列。 2，模板量过低; 3, 引物浓度多大; 4, 退火时间过长. 可以通过下面的方法来减少引物二聚体： 1. 适度减少引物的浓度（0.1－0.5pm）对于30轮放大足够 2. 检查引物的自身结构，有无复杂的2级结构和FORWARD/REVERSE之间的配对，尤其是3'端互补结构 3. PCR反应体系的配制在冰上进行，最后加TAq酶，PCR结束后，产物勿放置在室温下过长时间，有认为室温下有些TAQ酶会将多余的引物合成为二聚体。我试过，的确如此。 4. 可以考虑加DMSO,甘油，BSA以及其他添加剂，解除引物二聚体。 5. 如果PCR产物跑胶足够亮，可以考虑减少上样量，以及胶内显色物质（如减少EB的量）一般PCR体系的引物和ｄＮＴＰ的量是过量的，产物浓度不够可以适当增加模板量，而不是引物和ＮＴＰ。 PCR时，引物不要加太多，退火温度适当调高一点。 减少PCR产物中引物二聚体的方法: 1从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法； 2.可能模板有问题；模板浓度过小，适当加大模板量； 3.Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度； 4.取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的；这点我试过,效果还不错 5.所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO，可以增强特异性； 6.PCR反应体系的配制在冰上进行，最后加TAq酶，PCR结束后，产物勿放置在室温下过长时间，有人认为室温下有些TAQ酶会将多余的引物合成为二聚体。 7.增加循环数； 8.降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，若提高温度的同时产物量减少，则考虑增加镁离子浓度（根据扩增片断长度而定，片段长则相应镁离子浓度应该高一些）； 9.若降低退火温度，发现还是只有引物二聚体，而且镁离子的浓度在20-25mmol/l没有区别，则考虑Buffer等试剂没有完全融解、混匀，导致吸取的试剂浓度不对。 10.以上次的pcr产物作模板二次pcr，可以提高引物与模板的特异性，减少引物二聚体，如果两次时间间隔短的话，可以把原产物稀释100－1000倍，如果间隔较长可以稀释50－100倍； 不管是引物的哪一端形成了二聚体都会随着温度的上升而解开. 而与延伸的时间和温度是
引物设计 首先引物与模板的序列要紧密互补， 其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构， 再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。 引物设计应注意如下要点： 1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 (22)bp，但不应大于 38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 2. 碱基要随机分布。 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，如GGG或CCC，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。 3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同 的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。 非配对结构最好出现在引物中间。 另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败，3’端尽量不含互补碱基。 5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。 4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。 上下游引物的GC含量不能相差太大。 5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。 Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo 软件中使用的是最邻近法。 6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱 基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。 7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过 4.5kcal/mol）易导致产 生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。
引物设计 一.引物设计原则 首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。 二.引物设计注意的要点 1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高 的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。 3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不 同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。 5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。 4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反 应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。 Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在
Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。 6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部 碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。 7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生 引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。 8. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要 插入PCR产物的载体的相应序列而确定。 三.引物设计的步骤 1.打开NCBI的主页，选择UniSTS,填写目的基因，选择符合要求的引物，导入blast和primer5检测是否符合要求，如果不符合要求再自己重新设计。 2.打开NCBI页面，选择Gene,填写需要查找的基因及源种（例如小鼠mus）,找到mRNA的序列号，点击打开，找到相应的mRNA，把序列或者mRNA的accession序号导出到word里面，找出含有内含子的位置，做好标记(从进入Gene页面后，点击Genbank,可以了解这个基因的大小，以及内含子与外显子的大小)或者把mRNA的accession序号导入priemer Designing tool里面，扩增产物是200-250（100-250），TM 58-62（60±3），至少包含一个内含子，内含子长度可慢慢调试，最终要求
我做的RT-PCR电泳后发现有引物二聚体和杂带，请问是什么原因？应该怎样处理才能解决这个问题？ 1、引物二聚体的产生原因比较多，其中很重要的一个就是引物自身的原因，也就是设计的引物特异性不好，不能有效的和模板进行结合，而出现引物自身配对结合的情况导致二聚提的出现；其次还可能是PCR体系及反应条件的问题，如果PCR体系中引物、镁离子以及酶浓度过高等，都容易产生二聚体，这时要适当降低浓度，比如20uLPCR体系中，一般10pmol/ul 的引物，加0.2ul就可以了；还有可能是退火温度的问题，可以做个梯度PCR或降落PCR，来摸索一个合适的退火温度，也可有效地减少二聚提的出现。 2、杂带的出现在很大程度上来源于两个方面：一是引物的特异性问题，包括引物的长度和与模板的匹配度等。二就是退火温度的问题，一般适当提高退火温度可有效地减少非特异性扩增，从而减少杂带的出现。 一般来说减少杂带的方法有：热启动PCR(加热启动酶或先把PCR仪预热）、提高退火温度、做降落PCR(每个循环降低0.5度）、降低底物浓度、降低镁离子浓度、减少循环次数等；其次，有些共溶剂（甲酰胺，DMSO）和添加剂（氯化四甲铵，谷氨酸钾，硫酸铵）能够降低高水平的错误引导与提高富含G+C模板的扩增效率。另外还需要注意一些细节问题，如PCR反应体系的最好在冰上配制，TAq酶最后加，PCR结束后产物勿放置在室温下过长时间等。 你的问题RT-PCR有：杂带和引物二聚体 RT中非特异性条带的产生和解决 1.首先，要排除污染。建议用RT阴性对照检测是否被基因组DNA污染。如果RT阴性对照的PCR结果也显示同样条带，则需要用DNase I重新处理样品。 2.在PCR反应中，非特异的起始扩增将导致产生非特异性结果。在低于引物Tm 2至5℃的温度下进行退火，降低镁离子或是目的DNA的量将减少非特异性结果的产生。 3.由于mRNA剪切方式的不同，根据选择引物的不同将导致产生不同的RT-PCR结果。 引物二聚体 1. 从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法； 2. 可能模板有问题（可能cDNA有降解，这里我考虑你用的2步法）； 3. 模板浓度过小，适当加大模板量； 4. 降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，若提高温度的同时产物量减少，则考虑增加镁离子浓度（根据扩增片断长度而定，片段长则相应镁离子浓度应该高一些）； 5. 若降低退火温度，发现还是只有引物二聚体，而且镁离子的浓度在20-25mmol/l没有区别，则考虑Buffer等试剂没有完全融解、混匀，导致吸取的试剂浓度不对。 ＰＣＲ时出现较明显引物二聚体，但无所要目地带，或部分有较亮目地带仍伴较明显引物二聚体，我该如何处理？引物二聚体的形成对目地带的产生及产量有多大影响？另在ＰＣＲ时，我所需目地带应为２７０bp,但多次ＰＣＲ产物跑胶时在约５００bp处可见很亮带，而２７０bp处仅有很淡条带或无目地带，Ｗhy?我该如何处理，恳请各大侠．高手指点，在下万份感激，急盼佳音，多谢！ 你可以少加点引物或者提高些退火温度，如果还不行可以考虑换一种引物 500bp的带很可能是污染了，出现假阳性
什么是引物二聚体？怎样消除引物二聚体? 是引物的3'端间相互错配扩增形成的。引物二聚体的出现是必然的，只是或多或少的问题，电泳时看不到引物二聚体带也不代表没有二聚体出现，只是含量低我们的肉眼看不到而已。提高PCR严谨性(包括提高退火温度，降低引物浓度等)可大大降低二聚体的浓度。 减少PCR产物中引物二聚体的方法: 1从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法; 2.可能模板有问题;模板浓度过小，适当加大模板量; 3.Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度; 4.取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的;理由:引物可能会发生发夹结构,自身环化等结构,在100摄氏度下的沸水中煮5分钟可使引物变为单链，以减少二聚体。不过有人认为在PCR仪上95度变性5min也同样达到目的，而且成功试过通过延长退火时间也可以消除引物二聚体。 5.所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO，可以增强特异性; 6.PCR反应体系的配制在冰上进行，最后加TAq酶，PCR结束后，产物勿放置在室温下过长时间，有人认为室温下有些TAQ酶会将多余的引物合成为二聚体。 7.增加循环数; 8.降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，若提高温度的同时产物量减少，则考虑增加镁离子浓度(根据扩增片断长度而定，片段长则相应镁离子浓度应该高一些); 9.若降低退火温度，发现还是只有引物二聚体，而且镁离子的浓度在20-25mmol/l 没有区别，则考虑Buffer等试剂没有完全融解、混匀，导致吸取的试剂浓度不对。 10. 以上次的PCR产物作模板二次PCR，可以提高引物与模板的特异性，减少引物二聚体，如果两次时间间隔短的话，可以把原产物稀释100－1000倍，如果间隔较长可以稀释50－100倍。 反应成分问题：
PCR引物设计的原理及方法 阎振鑫S111666(四川大学生命科学学院细胞生物学成都610014) 摘要：自20世纪后期发展了PCR技术以来，PCR已经改变了整个生物学研究的进程。而PCR反应的第一步就是设计引物，引物设计的好坏直接关系到PCR的成败。PCR引物设计有许多的原则必须要遵循：引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，引物与模板的序列要紧密互补。引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应等。另外，引物的设计方法也越来越多，出现了许多专门的设计软件和网站，如：PrimerPremier5.0等。 关键词：PCR 引物原理方法NCBI PrimerPremier5.0 PCR primer design principle and method YanZhenxin (sichuan Univercity, Life science college cell biology chengdu 610014 ) Abstract: When PCR technology was find, PCR has changed all of the program in research of biology. The design of primer is the frist step of PCR. It is relation to the fate of PCR. There are some principals must be obey: dipolymer and hairpin structure must be avoid between different primers. The DNA polymerization reaction should not be triggered at the wrong site. Therefore, there are more and more methods of design primer, include the professional softwares and professional web site. Key word: PCR primer principle NCBI PrimerPremier5.0 聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction。PCR)是20世纪后期发展起来的一种体外扩增特异DNA片断的技术。具有快速、简便及高度敏感等优点，能极大地缩短目的基因扩增时间[1]。因此，其一直是生物学者们致力于构建cDNA文库、基因克隆以及表达调控研究的必要前提和基础[2]。PCR的第一步就是引物设计。引物设计的好坏，直接影响了PCR的结果，因此这一步很关键。成功的PCR反应既要高效，又要特异性扩增产物，因此对引物设计提出了较高的要求。引物设计需要注意的地方很多，在大多数情况下，我们都是在知道已知模板序列时进行PCR扩增的。在某些情况比如构建文库的时候也会在不知道模板序列的情况下进行设计。这个时候随机核苷酸序列就与模板不是完全匹配。我们通常指的设计引物都是在已知模板序列的情况下进行。设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。
一、引物设计step by step 1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。 2、用Primer Premier5搜索引物 ①打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence,出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。点击Primer,进入引物窗口。 ②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。在Search Parameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择300～500bp. ③点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。 ④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。此窗口中需要着重查看的包括：T m应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的T m值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo 来完成，Oligo自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5. ⑤在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单栏，选择File-Print-Current pair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文档，里面有该引物的详细信息。 3、用Oligo验证评估引物 ①在Oligo软件界面，File菜单下，选择Open，定位到目的cDNA序列（在primer中，该序列已经被保存为Seq文件），会跳出来两个窗口，分别为Internal Stability（Delta G）窗口和Tm窗口。在Tm窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置（Primer5已经给出）即可，而引物长度可以通过点击Change－Current oligo length来改变。定位后，点击Tm 窗口的Upper按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击Lower按钮，确定下游引物。引物确定后，即可以充分利用Analyze菜单中各种强大的引物分析功能了。 ②Analyze中，第一项为Key info，点击Selected primers，会给出两条引物的概括性信息，其中包括引物的T m值，此值Oligo是采用nearest neighbor method计算，会比Primer5中引物的Tm值略高，此窗口中还给出引物的Delta G和3’端的Delta G.3’端的Delta G过高，会在错配位点形成双链结构并引起DNA聚合反应,因此此项绝对值应该小些，最好不要超过9。 ③Analyze中第二项为Duplex Formation，即二聚体形成分析，可以选择上游引物或下游引物，分析上游引物间二聚体形成情况和下游引物间的二聚体情况，还可以选择Upper/Lower ，即上下游引物之间的二聚体形成情况。引物二聚体是影响PCR反应异常的重要因素，因此应该避免设计的引物存在二聚体，至少也要使设计的引物形成的二聚体是不稳定的，即其Delta G值应该偏低，一般不要使其超过4.5kcal/mol，结合碱基对不要超过3个。Oligo此项的分析窗口中分别给出了3’端和整个引物的二聚体图示和Delta G值。 ④Analyze中第三项为Hairpin Formation，即发夹结构分析。可以选择上游或者下游引物，同样，Delta G值不要超过4.5kcal/mol，碱基对不要超过3个。 Analyze中第四项为Composition and T m，会给出上游引物、下游引物和产物的各个碱基的组成比例和Tm值。上下游引物的GC％需要控制在40％～60％，而且上下游引物之间的GC％不要相差太大。Tm值共有3个，分别采用三种方法计算出来，包括nearest neighbor method、％GC method和2(A＋T)＋4(G＋C)method，最后一种应该是Primer5所采用的方法，T m值可以控制在50～70度之间。 第五项为False Priming Sites，即错误引发位点，在Primer5中虽然也有False priming分析，但不如oligo详细，并且oligo会给我正确引发效率和错误引发效率，一般的原则要使误引发效率在100以
引物设计 一、软件使用： ●推荐软件：Primer Premier 5.0 ●优点：操作简单、显示各种参数改变和可能的二聚体、异二聚体、发夹结构等 ●缺点：没有明显缺点 ●本地同类软件：DNAClub；Oligo 6.22；Vector NTI Suit；Dnasis；Omiga；Dnastar； DNAMAN (Lynnon Biosoft, Quebec, Canada). ●网上同类软件：Primer3（Whitehead Institute 开发）；JaMBW（European Molecular Biology Laboratory of Heidelberg 开发）。http://210.72.11.60网站已引进并调试好 这两种软件。独特之处在于：对全基因组PCR的引物设计，可以将设计好的引物 对后台核酸数据库进行比对，发现并排除引发错配的引物。因此建议经常做全基 因组PCR的用户试用。 二、推荐操作： ●引物搜索：Primer Premier 5.0 ●引物评价：Oligo 6.22 三、引物设计的原则: 首先引物要跟模板紧密结合，其次引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在，再次引物不能在别的非目的位点引起DNA聚合反应（即错配）。围绕这几条基本原则，设计引物需要考虑诸多因素，如引物长度（primer length）、产物长度（product length）、序列Tm值(melting temperature)、ΔG值(internal stability)、引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin）、错误引发位点（false priming site）、引物及产物GC 含量（composition），有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。以使用Oligo 软件分析设计引物为例，笔者总结出以下的要点：
Primer 5.0搜索引物： 1.Primer Length我常设置在18－30bp,短了特异性不好，长了没有必要。当然有特殊要求的除外，如加个酶切位点什么的。 2.PCR Product size最好是100－500bp之间，小于100bp的PCR产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。 3.Search parameters还是选Manual吧，Search stringency应选High，GC含量一般是40－60％。其它参数默认就可以了。 4.搜索出来的引物，按Rating排序，逐个送Oligo软件里评估。当然，搜索出的引物，其扩增产物很短，你可以不选择它，或是引物3端≥2个A或T,或引物内部连续的G或C太多,或引物3端≥2个G或C，这样的引物应作为次选，没得选了就选它。对于这样的引物，如果其它各项指标还可以，我喜欢在引物末端去掉一个不满意的或加上一个碱基，看看引物的评估参数有没有变好点。 Oligo 6.0评估引物： 1.在analyze里,Duplex Formation不管是上游引物、下游引物还是上下游引物之间，The most stable 3’-Dimer绝对值应小于4.5kcal/mol, The most stable Dimer overall绝对值一般应小于多少kcal/mol跟PCR退火温度有关，我几次实验感觉在PCR退火温度在65°的时候，The most stable Dimer overall 6.7kcal/mol没有问题。 2.Hairpin Formation根据黄金法则 3.False priming sites: Primer的priming efficiency应该是错配地方的4倍左右，更多当然更好。 4.在PCR栏，个人感觉其所显示的optimal annealing temperature数值值得参考。在PCR摸索条件的时候，退火温度为其数值加减2的范围就可以了。 5.Internal stability很重要：我们希望引物的内部稳定性是中间高、两边低的弧形，最起码保证3端不要过于稳定。下图1引物3端过于稳定，很容易导致不适当扩增。△G参照黄金法则，这其实很好理解：把一滴水放到大海里，这滴水就会不停的扩散分布，扩散的越厉害越稳定，所以△G绝对值越大结构越稳定。PCR引物设计的11条黄金法则 1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。 2.引物长度一般在15~30碱基之间。 引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。 3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。 GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物
如何避免或减少引物二聚体汇总 引物之间两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3’端，即使无法避免，其3’端互补碱基也不应大于2个碱基，否则易生成引物二聚体Primer dimer。所谓引物二聚体实质上是在DNA聚合酶作用下，一条引物在另一条引物序列上进行延伸所形成的与二条引物长度相近的双链DNA的片段，是PCR常见的副产品，有时甚至成为主要产物。 形成引物二聚体原因 1, 最根本的原因是引物之间或者自身存在互补序列。 2，模板量过低; 3, 引物浓度多大; 4, 退火时间过长. 可以通过下面的方法来减少引物二聚体： 1. 适度减少引物的浓度（0.1－0.5pm）对于30轮放大足够 2. 检查引物的自身结构，有无复杂的2级结构和FORWARD/REVERSE之间的配对，尤其是3'端互补结构 3. PCR反应体系的配制在冰上进行，最后加TAq酶，PCR结束后，产物勿放置在室温下过长时间，有认为室温下有些TAQ酶会将多余的引物合成为二聚体。我试过，的确如此。 4. 可以考虑加DMSO,甘油，BSA以及其他添加剂，解除引物二聚体。 5. 如果PCR产物跑胶足够亮，可以考虑减少上样量，以及胶内显色物质（如减少EB的量） 一般PCR体系的引物和ｄＮＴＰ的量是过量的，产物浓度不够可以适当增加模板量，而不是引物和ＮＴＰ。 PCR时，引物不要加太多，退火温度适当调高一点。 减少PCR产物中引物二聚体的方法: 1从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法； 2.可能模板有问题；模板浓度过小，适当加大模板量； 3.Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度；
4.取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的；这点我试过,效果还不错 5.所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO，可以增强特异性； 6.PCR反应体系的配制在冰上进行，最后加TAq酶，PCR结束后，产物勿放置在室温下过长时间，有人认为室温下有些TAQ酶会将多余的引物合成为二聚体。 7.增加循环数； 8.降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，若提高温度的同时产物量减少，则考虑增加镁离子浓度（根据扩增片断长度而定，片段长则相应镁离子浓度应该高一些）； 9.若降低退火温度，发现还是只有引物二聚体，而且镁离子的浓度在20-25mmol/l 没有区别，则考虑Buffer等试剂没有完全融解、混匀，导致吸取的试剂浓度不对。 10.以上次的pcr产物作模板二次pcr，可以提高引物与模板的特异性，减少引物二聚体，如果两次时间间隔短的话，可以把原产物稀释100－1000倍，如果间隔较长可以稀释50－100倍； 不管是引物的哪一端形成了二聚体都会随着温度的上升而解开. 而与延伸的时间和温度是没有关系的, 解开后它们就和其他单链一样有着平等的与模板结合的机会. 而且这些半拉子产物比引物更容易与模板结合,首先完成了合成全长单链(酶的催化速率不变,此时所需要的时间当然短). 也就是说到30个循环后,绝大部分都已经完成了全长链的合成,只有少部分形成了长短不一的单链. (这已经不是引物二聚体了) 普通的PCR体系来说，30和34个循环的引物和dNTP的量没什么差别，一般来说这两个都是过量的，循环数多了容易发生错配以及酶效率下降的现象，不过一般来说40以内没有什么大问题。 看你的片段是600bp左右吗？如果是600bp那就用普通酶扩增即可，因为普通Taq酶在500bp左右得到的片段是完全可信的，较大的片段可以用带有校正功能的酶来PCR。 如果你实验室经济条件较好的话，建议你选用高保真酶，或HotStart酶；还有个可选的方法，就是直接把目的片段切胶回收，以回收得到的片段再做为模板进行
1．3，端不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或 CCC，否则容易引起错配。 2．3，端的△G不宜过高，过高会在错配位点形成双链结构并引起DNA聚合反应，其绝对值应该小一些，最好不要超过9。 3．发夹结构（Hairpin Formation）△G绝对值不要超过4.5kcal/mol，碱基对不要超过3个。 4．上下游引物的GC％需要控制在40％～60％，而且上下游引物之间的GC％不要相差太大。 5．Tm 值可以控制在50～70度之间。 6．错配（False priming）一般的原则要使错误引发效率在100以下。 7. 等级评定（rating）搜索出的引物，其扩增产物很短，你可以不选择它，或是引物3端≥2个A或T,或引物内部连续的G或C太多，或引物3端≥2个G或C，这样的引物应作为次选，没得选了就选它。 8. 内部稳定性（Internal stability）一般引物的内部稳定性是中间高、两边低的弧形，最起码保证3端不要过于稳定。△G绝对值越大结构越稳定。 9. 3端的二聚体应该避免，这个要看退火温度决定，一个50°的退火温度肯定和65°对二聚体的影响不一样了，一般来讲尽量控制在－4.5kcal/mol以下。10. GC含量在40%—60%，一般50%左右比较合适，它直接影响引物各端稳定性，3端来两个G或C,稳定性就上去了，粘在模板上很牢。 11. GC钳（GC Clamp）一条理想的引物应该有一个稳定性较强的5 末端和相对稳定性较弱的3 末端。这一段有较强稳定性的5 末端称为GC钳。选择有合适稳定性的引物能在确保不产生非特异性条带的前提下尽量降低退火温度。而 3 末端稳定性低的引物较好的原因是在引物发生错配时，由于 3 末端不太稳定引物结合不稳定而难以延伸。 12. 二聚体（Dimer）3 末端配对很容易引起引物二聚体扩增。 13. 如果期待的产物长度等于或小于500 bp，选用短的（16～18 mer）的引物：若产物长5 kb，则用20～23 mer的引物。为了优化PCR反应，使用确保退火温度不低于54℃的最短的引物可获得最好的效率和特异性。
如何在pubmed上查找一个蛋白质的基因序列 （1）打开https://www.doczj.com/doc/3a6369219.html,网址（百度上搜索NCBI也可找到此网址）。 （2）在搜索框中输入你要查找的蛋白名称或者序列号 （3）在搜索的选择范围下拉菜单中选择all database，然后点击搜索。 （4）在其中nucleiotide中可以查找你需要的蛋白，的核苷酸序列。 我在NCBI上找到很多C-myc的氨基酸序列，大小不一，不知道你说的C-myc标签的序列的氨基酸个数和具体序列，不知道多少KD. 其中我查到c-myc protein 氨基酸有419个，其mRNA序列为1307个核苷酸。20种氨基酸的平均分子量为128，所以419*128=53632Dalton=54KD。如种属不对，或序列数不对，你可以重新再NCBI上查找或者将你已知的C-MYC蛋白质序列输入到生物分析软件中计算也可以。 primer5和Oligo结合设计引物步骤及心得 一、引物设计step by step 1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。 2、用Primer Premier5搜索引物 ①打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。点击Primer，进入引物窗口。 ②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。在Search Parameters里面，可以设定相应参数。
引物末端自由能必须<-4kcal/mol，是-2、-3呢还是-5 -6？ 您的问题可以在下述内容中找到答案，愿您实验顺利： 在一个双链结构中，碱基对的相对稳定性是由其邻近碱基决定的。在热动力学中，这样的性质以双链形成时的自由能(ΔG)来表示。现在，大多采用Breslauer等人提出的，以最接近的相邻核苷酸的动力学数值(自由能)来预测双链稳定性的方法。为简化起见，所有的计算都在25 ℃条件下进行。此时，最接近的相邻核苷酸的自由能是： 第一个(5′)核苷酸第二个核苷酸 dA dC dG dT dA －1.9 －1.3 －1.6 －1.5 dC －1.9 －3.1 －3.6 －1.6 dG －1.6 －3.1 －3.1 －1.3 dT －1.0 －1.6 －1.9 －1.9 ΔG(kcal/mol) 例如，双链d(ACGG／CCGT)的ΔG是： ΔG(ACGG)＝ΔG(AC)＋ΔG(CG)＋ΔG(GG)＝－(1.3＋3.6＋3.1)＝－8.0 kcal/mol 此计算方法特别适用于测定其3′末端会形成双链的引物的相容性。也可以用来计算发夹环结构的ΔG。不过，这时需要根据环区内核苷酸的数量添加一定的数值。如3个核苷酸时为5.2 kcal/mol；4个时为4.5；5个为4.4；6个是4.3；7和8个为4.1 kcal／mo1。 选择引物的一般规则 设计和选择引物时有5个要素必需注意。 1 引物的3′末端不互补引物的3′末端一定不能有很大的互补性，因为它们的互补会形成引物二聚体，这就会带来很大的问题，例如合成出非专一的产物，极大地减少所期望产物的得量。有实验表明，3′末端双链的ΔG是0～－ 2 kcal/mol时，PCR 产量几乎达到百分之百，随着其绝对值的增加产量逐渐下降，在－6时只有40%，到－8时少于20%，而－10时，接近于0。虽然产量还取决于其他参数，如退火温度、引物的专一性等等，但是用Taq聚合酶操作时，由于它的工作能力很强，能够在很短的时间内就识别3′末端互补的双链区并发动聚合反应，即使3′末端双链的稳定性很差也不能阻碍它的作用，所以这时产量对二聚体的形成就有很大的依赖性。 2 引物分子内不互补应当尽量不用会通过释放能量而形成分子内双链结构的寡核苷酸。虽然有些带有发夹环，其ΔG为－ 3 kcal/mol的自身互补引物也可以得到不错的结果，但是如果它的3′末端被发夹环占据时就很麻烦，即会引发引物内部的延伸反应，减少了参与正式反应引物的数量。当然，如果发夹环在5′末端对反应就没有多大的影响了。 3 引物的组分、解链温度和长度普遍认为PCR引物应当有50%的GC/AT比率。其实，这是不对的。以人基因组DNA为模板，用81% AT的引物可以产生单一的，专一的，长250 bp，含有70% AT的产物。完全没有必要复杂地去计算产物和引物的解链温度，PCR引物的GC/AT比率应当等于或高于所要放大的模板的GC/AT比。 要知道，更重要的因素是模板与稳定性较小的引物之间解链温度的差异。差异越小，PCR的效率越高。因为DNA的解链温度也取决于它的长度，所以有的研究者喜欢设计很长，而不求它很稳定的引物。可是，引物太长就难以避免形成二聚体和自身互补，因此，一般还是不用为好。如果期待的产物长度等于或小于500 bp，选用短的(16～18 mer)的引物：若产物长5 kb，则用24 mer的引物。有人用20～23 mer引物得到40 kb的产物。但是，引物较长时，如果不借助引物选择的计算机软件帮助，就很难确定一对引物是否会形成二聚体，是否有自身互补性以及专一性如何。于是，用眼睛选出来的寡核苷酸放大长片段DNA时就会使引物彼此引发而不是延伸模板，得出非专一产物。通过下述的观察内部稳定性原理可以极大地减少这种问题。 4 引物的内部稳定性在DNA测序和PCR中最好用5′末端稳定(如GC含量较多)，而3′末端不太稳定(如AT含量较多)的引物，这种引物的结构可以有效地消除假引发反应。这就是基于引物内部稳定性的经验之谈。其3′末端稳定性低的引物在这些反应中能起好作用的原因在于，接近或在3′末端上的碱基与非靶位点碱基所形成的配对的稳定程度还不足以引发DNA合成，所以不会产生假产物。因此，为了有效地引发反应，引物的5′末端和中央部分必须与靶DNA也形成双链。与此相反，带有稳定的、GC丰富的3′末端的寡核苷酸不需要其所有的核苷酸序列都与靶序列配对，只凭借其3′末端与靶序列任何位点的牢固配合就可以引发反应，产生非专一产物。 如果用3′末端低稳定性的引物，反应的最适退火温度范围会不寻常的宽。这就可以不经过事先的最佳化实验就能在最佳条件下进行反应。还要注意的是PCR反应产物的质量还取决于模板(底物的复杂性、Tm、产物长度)和退火的温度与时间。 所以，有时3′末端稳定的引物也可以满意地进行反应。但是，无论如何，寡核苷酸3′末端最后5个核苷酸的稳定性小于－9 kcal/mol的，通常就是专一性的探针或引物。寡核苷酸3′末端越不稳定，假引发的可能性越低。 5 引物的唯一性为了放大单个的、专一性DNA片段，选用的引物序列就应当是唯一的，即在模板中没有重复序列。虽然不会整个引物序列都偏好于和模板中的一个以上位点匹配，但是，通常见到的引物的3′末端往往都有6～7个没有什么个性的核苷酸。如果假引发的位点正好在放大区的内部，那麻烦就大了。由于短的DNA片段有更高的PCR或杂交效率，就容易产生非专一产物。 如果用哺乳动物基因组序列作为模板，可以用Alu序列或其他短重复元件来核对想用的引物的互补性。由此也可知，应当避免使用同寡聚物(如—AAAAAA—)和二核苷酸重复(如—ATATAT—)。 可以这样理解：在引物模板中所谓自由能是指引物同模板结合后形成稳定结构所释放的能量，二者越稳定释放能量越多，自由能负值越高（绝对值越大），要分开二者就得吸收更多能量。在引物设计中，要求3’末端不要太稳定，防止错误引发的几率增加，因此要求自由能低于<-9kcal/mol。综合上述：你所谓<-4kcal/mol，应为2、3非5、6看绝对值。从能量转移角度解释就明白了。请高手指正，谢谢。 引物设计时自由能（△G°）表示什么呢？它的绝对值越大是不是表示双链结构内部碱基对的相对稳定性越大呢？恳请各位指点
RT-PCR引物设计原则和方法 在NCBI上搜索到该基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。 打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence，出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。点击Primer，进入引物窗口。 此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search 按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。在Search Parameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100~200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择300~500bp。 点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。 对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3‘端不要以A结尾，最好是G或者C，T也可以；3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。 此窗口中需要着重查看的包括：Tm应该在55~70度之间，GC%应该在45%~55%间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。 但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo来完成，Oligo自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5。 在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单栏，选择File-Print-Current pair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文档，里面有该引物的详细信息。 在Oligo软件界面，File菜单下，选择Open，定位到目的cDNA序列（在primer中，该序列已经被保存为Seq文件），会跳出来两个窗口，分别为Internal Stability（Delta G）窗口和Tm窗口。在Tm窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置（Primer5已经给出）即可，而引物长度可以通过点击Change-Current oligo length来改变。定位后，点击Tm窗口的Upper按钮，确定上游引物，同样方法定位下