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药理实验方法学

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第一章现代药理学实验方法与技术简介

第一节分子生物学试验方法与技术

分子生物技术在药理学实验中应用较为广泛,包括核酸分子探针的标记、核酸分子杂交、多聚酶链反应、蛋白印迹杂交技术、cDNA文库、随机分子库技术、外核基因在真核细胞中的表达、转基因动物、人类基因治疗等。现将更为常用的技术介绍如下:

一、核酸分子探针的标记标记核酸分子探针(nucleic acid probe)是进行核杂交的基础,根据核酸分子探针的来源及性质进行选择,选择的基本原则是具有高度的特异性,探针选择直接影响杂交结果的分析。根据检测对象和目的不同,,可选择不同的探针种类及标记方法。

㈠探针种类

1.基因组DNA探针是克隆化的各种基因片断,也是最常用的核酸探针,探针应尽可能选用基因编码(外显子),避免使用内含子及其它非编码序列。

2.cDNA探针与mRNA互补的DNA链称cDNA,是一种较为理想的核酸探针,特异性较高。

3.RNA探针RNA与RNA或DNA杂交体的探针稳定性,特异性高。

4.寡核苷酸探针人工合成寡核苷酸片段做探针,可根据需要合成相应序列。

㈡标记物

常用的探针标记物有两类:放射性同位素和非放射性同位素。标记物的检测具有高度灵敏性和特异性。标记和探针结合不影响杂交的特异性和稳定性。其中放射性同位素是应用最多的探针标记物,但易造成放射性污染,多数同位素的半衰期短,不能长期存放。常用的放射性同位素有32P?3P?35S,有时也用14C,125I或131I。

二、核酸分子杂交(nucleic acid hybridiazation )是指具有一定同源序列的两条核酸单链在一定的条件下,按碱基互补配对原则形成异质双链的过程。核酸分子杂交是分子生物学领域应用最广泛的技术,灵敏度高、特异性强,主要用于特异DNA或RNA的定性定量检测。

三、聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)是一种体外酶促扩增特异DNA片段的方法。传统的DNA扩增法是分子克隆法,需经过DNA 酶切、链接、转化等步骤构建含有目的基因的载体。然后导入细胞中进行扩增,再用同位素标记的探针进行筛选,操作复杂,耗时。PCR技术灵敏度

高,特异性强,操作简便。PCR是本世纪分子生物学研究领域中最重要的发明之一。

四、cDNA文库是指以mRNA为模板,在反转录酶的作用下形成的互补DNA(complementary DNA,cDNA)。cDNA文库是指一群含重组DNA 细菌或嗜菌体克隆。每一个克隆只含一种mRNA的信息,足够数目克隆的总和则含细胞的全部mRNA信息,此种克隆群体叫cDNA文库。

五.随机分子库技术(random moleculer library)采用不同技术手段和在不同的分子水平有效地实现分子的多样性。其技术路线,一是利用化学合成的方法生成已知结构的化合物,以某种特定方式和一定规律组合在一起,只要确定某一化合物具有活性,即可根据建库的组合方式确定其结构,围绕此技术发展的随机分子库总称为化学合成库(synthetic chemical library)。二是利用基因工程方法直接合成的DNA或RNA的核酸库(nucleic acid library ),由DNA随即编码表达的小分子和大分子的混合群体而表达物的表面显露又提供了可从庞大的复杂的群体中快速筛选到目的物,这就是近几年发展起来的极富有应用潜力的核酸编码分子肽库(oligonucleotide-encoded peptide library )。

六.真核基因的表达调控技术真核细胞具有比原核细胞更为庞大的和复杂的基因组。高等真核细胞基因组编码成千上万个基因,基因内遗传信息从DNA到蛋白质的传递过程,即基因表达过程受不同层次调节机制精密调控,此调控既决定着基因表达的量,又决定基因表达的时空顺序。调控过程精密复杂,涉及到转录前染色质的活化;转录水平的调节;转录后的加工;翻译水平的调节及翻译后的修饰等。基因表达的调控主要发生在转录水平。

七.转基因动物是用实验方法导入的外源基因在其染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。此种方法可建立转基因动物模型,以研究外源基因在整体动物中的表达调控率;能改变动物基因使其表现更符合人类需要;也可用转基因动物产生人类所需要的生物活性物质。

第二节细胞生物学实验方法与技术

细胞生物学是生命科学中的重要分支,它以生命基本单位细胞为研究对象,应用近代物理、化学和实验生物学方法,从显微、亚显微和分子水平来揭示细胞生命活动及规律,其中包括细胞的生长、发育、分裂、分化、遗传、变异(包括癌变)、兴奋、运动、代谢、衰老与死亡等基本生命现象,并且利用与调控细胞的行为活动,已达到为生产实践尤其为医药卫生事业服务。当前细胞生物学与医药保健事业联系的较为紧密的热点问题主要有以下几

种:1)真核细胞基因结构及其表达调控;2)细胞膜、膜系、受体与信号传递研究;3)细胞生长、分化、衰老、癌变、死亡,尤其是程序性细胞死亡的研究;4) 细胞工程,包括基因工程及体细胞核移植的研究。

一、细胞培养常用方法

1、细胞原代培养(primay culture)又称初代培养,即直接从机体取下细胞、组织、或器官、让他们在体外维持与生长。原代细胞的特点是细胞或组织刚离开机体,他们的生物状态尚未发生很大的改变,一定程度上可反映他们在体内的状态,表现出来源组织或细胞的特性,因此用于药物实验尤其是药物对细胞活动、结构、代谢、有无毒性或杀伤作用等研究是极好工具。常用的原代培养方法有组织快培养法及消化培养法。前者方法简单,细胞也较易生长,尤其是培养心肌有时能观察到心肌组织块的搏动。细胞从组织块外长并铺满培养皿或培养瓶后即可进行传代。

2、细胞的传代培养当细胞生长至单层汇合时,便需要进行分离培养否则会因无繁殖空间、营养耗竭而影响生长,甚至整片细胞脱离基质悬浮起来直至死亡。为此当细胞达到一定密度时必须传代或再次培养,目的是借此繁殖更多的细胞,另一方面是防止细胞的退化死亡。

二、器官培养方法

器官培养(organ culture)是指用特殊的装置使器官、器官原基或它们的一部分在体外存活,幷保持其原有的结构和功能。器官培养可模拟体内的三维结构,用于观察组织间的相互反应、组织与细胞的分化以及外界因子包括药物对组织细胞的作用。

器官培养方法很多,最经典的方法即表玻皿器官培养法;一种最常用的方法是不锈钢金属网格法及Wolff培养法和扩散盒培养法,实验者可根据情况选择采用。

三、放射自显影术测定

放射自显影术(autoradiography)是利用放射性同位素电离辐射对核子乳胶的感光作用,显示标本或样品中放射物的分布、定量以及定位的方法。放射性同位素能在紧密接触的感光乳胶中记录下它存在的部位和强度,准确显示出形态与功能的定位关系。现已可将放射自显影术与电镜以及生物分子结合起来。不但可以研究放射性物质在组织和细胞内的分布代谢,而且可以揭示核酸合成及其损伤等改变,目前已在生命科学各领域被广泛应用。

四、染色体分析技术

染色质或染色体是遗传物质在细胞水平的形态特征。前者是指当细胞处于合成期时遗传物质经碱性染料着色后,呈现出细丝状弥漫结构;当细胞进入分裂期时,染色质细丝高度螺旋化凝聚为形态有特征的染色体。特别是在分裂中期,复制后的染色体达到最高程度的凝聚,称为中期染色,是进行染色体形态观察分析的最佳时期。染色体分析应用领域越来越广,主要用于以下几方面:1)为临床诊断提供新手段;2)研究不育和习惯性流产发生的遗

传基础;3) 通过检查胎儿的染色体,预防有染色体异常患儿出生(先天愚型);4)根据染色体的多肽性进行亲子和异型配子的起源研究;结合DNA 重组技术可以将基因定位于染色体的具体区带上。

五、电镜技术

早在1940年,英国剑桥大学首先试制成功扫描电子显微镜,但因分辨率低无实用价值。1965年英国剑桥科学仪器有限公司开始生产出商品扫描电镜,其以显著优点广泛用于生物学、医学、物理学、化学、电子学及勘探、冶金、国防、公安、机械与轻工业等诸多领域,并已成为非常有用的研究工具。

电镜主要特点:1)景深大,较光学显微镜大几百倍;2)图像富有立体感,是一个具有真实感的三维结构立体图象;3)图像放大范围大,光学显微镜有效放大倍数为1000倍左右,透视电镜的放大倍数为几百倍至100万倍,扫描电镜可放大十几倍至几十万倍;4)分辨率高,扫描电镜可达6-3nm;5)样品可在三度空间平移和旋转,聚焦后可以任意放大倍数,而不需调整重新聚焦。

六、细胞、细胞器、及细胞间质的分离技术、

1、细胞的分离分离不同的细胞及亚细胞组分在现代生物学研究中起着重要的作用。如研究某种药物治疗白血病的机理,需要分离培养人或动物的骨髓细胞,观察药物的细胞作用;研究与细胞生长分化有关的生长因子的作用,需将与此类因子有关的细胞分离出来;分离细胞膜,线粒体等细胞的亚组分,对于研究信号传递,某些遗传疾病,也都是必不可少的手段。

2、细胞膜的分离细胞内的膜系统与细胞质膜统称为生物膜(biomembrane),他们都有共同结构和特征。首先要分离出形状完整的、具有生物活性的、高纯度的细胞膜,用于研究细胞膜的结构和功能,以利于观察膜在细胞与环境进行能量交换及信息传递的过程。

3、细胞核的分离细胞核作为一个功能单位,完整的保存遗传物质,幷指导RNA合成,后者为蛋白质及其它细胞组分合成所必需。因此细胞核分离是研究基因表达及细胞核形态结构的首要步骤。不同组织来源的细胞经匀浆后,用分级离心或超声波处理等方法进行纯化。

4、溶酶体的分离溶酶体是处理细胞吞噬物的细胞器,含有高浓度的各种水解酶类,调控细胞内的消化过程。溶酶体的分离常用于研究因溶酶体功能缺陷而引起的多种疾病。

5、线粒体的分离线粒体是细胞呼吸的主要场所,细胞活动所需要的能量,主要由在线粒体内进行氧化所产生的能量供给。制备线粒体关键是保持其完整性及高纯度。

6、细胞DNA、RNA分离与纯化核酸是遗传信息及基因表达的物质基础。核酸的提取与纯化关键是保持核酸的完整性,但较困难,主要因为:一是细胞内有活性很高的核糖核酸酶;二是酸碱等化学因素;三是高温机械

损伤等物理因素,需严格遵守操作规程。

七、细胞凋亡研究方法

细胞凋亡(apoptosis),又称为程序性死亡(programmed cell death,PCD)指的是有核细胞在一定条件下,通过激活其自身内部机制,尤其是开启与关闭某些基因以及内源性DNA内切酶活化,导致产生细胞自然性死亡的过程。可以认为细胞死亡的这种方式是一种生理性的自发过程。为此有人也称其为细胞自杀。

目前认为程序性死亡几乎和细胞的增殖同样重要,如果没有细胞凋亡,个体不能形成与存活,或者发生疾病。只有通过细胞凋亡的发生,使特定细胞群体在特定的时间和特定的部位死亡。从而使机体在总体上保障其细胞数量,以及形态与功能的平衡。近年来如何用药物诱导癌细胞死亡也成为细胞凋亡的热点之一。透视电镜观察是研究细胞凋亡的首选方法。

八、原位杂交

原位杂交技术是将分子杂交与组织化学相结合,用标记的DNA或RNA 为探针,在原位检测组织细胞内特异互补的DNA或RNA序列。它分为三类:DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA。已广泛用于生物学的各个领域。原位DNA末端标记可以用于细胞凋亡的定量研究。原位杂交技术和PCR 技术结合用于检测人乳头瘤病毒(HPV)

九、单克隆抗体

是1975年被描述的一种可产生无限量,并可预测其性质的抗体制备技术。该技术的关键步骤在于淋巴细胞之间的融合,所以称为“淋巴细胞杂交瘤技术”;由于杂交瘤经过筛选可产生针对单一抗原决定簇抗体的细胞克隆,故称为单克隆抗体技术。该技术的问世使得免疫学研究与实践发生了革命性的改观,同时还为生物学和医药学的许多领域提供了前所未有的研究工具。人们利用其可精确地识别出极为复杂的分子,测定出无法测定的物质,识别出新的细胞群体,揭示了以往未曾了解的细胞分化途径,为肿瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病等的诊断和治疗创造出令人兴奋的前景。

十、神经细胞培养神经细胞培养是指从体内取出某一种神经组织,在无菌、适当温度和一定营养条件下模拟在体生理环境,使之存活和生长,幷保持其结构和功能。

神经细胞培养按培养前切割程度分为器官培养、组织快培养和细胞分离培养。

1、器官培养(organ culture )是切割最少型的培养。全器官或器官大片放在保温的营养液中可保存数日。这类培养切断了正常的血供,器官的营养交换取决于简单的灌流。

2、组织块培养(explant culture)是真正最小器官培养。组织块通常厚度为0.5-1mm,一个或几个组织块放在一个培养皿内存活数周。实验在其组织块周围生长出的边缘细胞上进行。

3、细胞分离培养(dissciated cell culture )是由分散其原始组织至其组成的细胞。常用酶进行消化。

第三节信息传递的研究方法与技术

一、受体与配基结合试验技术

受体与配基结合试验是一种在体外直接观察受体的实验手段。随着各种高比活度的特异性受体配基的合成,此方法已成为药理学的基本技术之一,幷广泛用于生理、生化、细胞生物等许多相关学科。

二、G蛋白的纯化分离技术

G蛋白是细胞膜上一类结构和功能都非常相似的蛋白质。其主要功能是偶联受体及其效应器。受体与激动剂结合并被激活时,先激活其相应的G 蛋白,然后G蛋白再与相应的效应器(酶离子通道等)发生反应,改变效应器的活性。与G蛋白偶联的受体种类繁多,受G蛋白调控的效应器包括腺苷酸环化酶,磷脂酶C,cGMP磷酸二酯酶,离子通道等。因此,G蛋白的研究对阐明跨膜信息传递机理有非常重要的意义。

三、环核苷酸测定技术

环核苷酸是重要的细胞内信使物质,参与调控各种激素、神经递质和调质所导致的各种细胞生命活动。常用的测定方法有:cAMP蛋白质竞争结合法;cGMP放射免疫测定技术;腺苷酸环化酶测定技术等。

四、花生四烯酸代谢产物测定技术

细胞内磷脂、甘油三酯及胆固醇经酰基水解酶的作用释放出花生四烯酸(arachidonic acid ,AA)。而AA通过环加氧酶和脂加氧酶途径分别代谢转化为一系列活性物质,如前列腺素、前列环素、血栓素、白三烯等。这些物质在体内含量少,但有极强的生物活性。能调节多种系统(神经、内分泌、消化、呼吸、生殖、血液、心血管、肾等),并在炎症、免疫、过敏、凝血、肿瘤和心血管等一系列的病理过程中发挥作用而具有重要的临床意义。常用的检测方法:生物测定法、高效液相测定法、放射免疫分析法、酶免疫测定法、放免配基受体结合法。

五、肌醇磷脂及其代谢产物的测定技术

肌醇磷脂是细胞膜中的一种脂质,能被磷脂酶C水解生成三种重要的细胞内信使物质,都已成为药理学和生物化学等学科中研究的热点。常用实验方法有:肌醇磷脂的测定、磷酸肌醇的分离及测定、甘油二酯的测定、同位素标记测定肌醇磷脂等。

六、蛋白激酶C的纯化和测定

蛋白激酶C是一种普遍存在于生物体内的磷脂依赖的激酶家族。在细胞的信息传递和生长调节中起到重要作用。蛋白激酶C参与多种激素、神经递质及生长因子调控过程。测定蛋白激酶C活性及纯化该酶成为跨膜信息传递研究的重要技术。

七、离体器官受体生物测定

使用某些离体器官进行受体激动剂、拮抗剂的生物检定,是一项目前仍在广泛应用的经典的药理学方法。可以测定药物对受体的亲和力,对特定亚型的选择,能决定药物是激动剂还是拮抗剂,并能分析药物与受体的构效关系,反映的是药物在器官水平上的作用,因此,与细胞或分子水平上的实验结果可以互相印证,有其不可替代的意义。

第四节钙研究方法与技术简介

钙是人体内极其重要的金属离子,广泛存在于细胞和体液中。它在细胞活动乃至生命过程和疾病的发生、发展中扮演重要角色,已成为化学、生物学、基础和临床医学及其它许多科学研究的一个重要领域。

一、细胞内游离钙研究方法与技术

(一)钙指示剂

钙指示剂是近十多年来发展起来的一类离子指示剂,也称离子探针或染料,已成为观察细胞内游离离子浓度及其动态变化和空间分布极有价值的工具。目前常用钙指示剂根据其物理特性一般可分为两类

1、钙荧光指示剂:是指在一定波长的激发光照射下,钙指示剂复合物可发出荧光。属于此类的指示剂有Fura-2 、Quin-

2、Fiuo-

3、Indo-1等。

2、光吸收指示剂:是指它们与钙离子结合后,其吸收光谱峰值随Ca2+——指示剂复合物浓度的不同而变化,据此便可观察细胞内游离钙的动态变化并测定细胞内钙浓度。属于此类指示剂的有Purpurate diacetic acid (PDAA)、AntipyrylazoⅢ等。光吸收指示剂一般属于低钙亲和力指示剂。(二)双波长荧光分光光度计测定方法

应用双波长荧光分光光度法不仅可以检测细胞悬液,单层培养细胞及单个细胞内游离钙浓度的变化,也可以测定细胞内瞬间平均钙浓度的变化及亚细胞水平钙离子的梯度分布等。各种细胞测定方法差异在于标本的制备过程,其余步骤基本相同。基本方法为制备标本的细胞悬液,加入荧光指示剂,用双光束荧光分光光度计测定荧光。测定条件:激发光光栅5nm,发射光光栅10nm,以300-420nm扫描激发光谱,然后固定激发波长在高峰波长,观察不同实验条件下荧光强度的变化,由公式计算游离钙浓度。

二、钙结合蛋白的研究方法

钙结合蛋白的研究方法包括钙调素的纯化及测定、钙调素的表达与突变的研究方法、钙调素结合蛋白检测方法及钙依赖性磷脂结合蛋白的研究方法。

三、细胞内钙释放研究方法

1、放射性标记法测定钙释放:

将分离的内质网或线粒体囊胞用放射性标记的钙离子负载,负载后的囊胞置于一滤器上,通过过滤与负载液分离。在滤器中加入各种促钙释放介质后,定时测定滤器中残留的放射活性即可推断内钙释放情况。

2、三磷酸肌醇刺激内钙释放的研究方法

制备细胞或细胞器悬液,加入钙离子荧光指示剂负载,再加入一定浓度的三磷酸肌醇(IP3)刺激内钙释放,观察荧光强度的变化即可反应钙释放情况。

四、钙离子受体测定方法

从牛或人甲状旁腺细胞的cDNA文库中筛选出编码钙离子受体的cDNA,将其mRNA注入爪蟾卵细胞,使其表达,在细胞膜上形成具有天然活性的钙离子受体。当细胞培养液中存在一定浓度的钙或其它阳离子时,激活钙受体,使胞内钙离子浓度增加,打开氯离子通道,测定氯离子通道电流的变化,便可用于筛选钙离子受体激动剂或拮抗剂。

第五节放射配体受体结合实验方法与技术

一、基本概念

1、受体(receptor)一类介导细胞信号转导的功能蛋白质,可与周围环境中微量化学物质发生特异性结合,通过信息放大系统,触发后续的生理或药理效应。

2、配体(ligand)能与受体特异结合的物质,如神经递质、药物或激素等。

3、判断受体的标准真正的受体必须具备:饱和性、特异性、可逆性、高亲和性、结构专一性、立体选择性、区域分布性、亚细胞或分子特征、有内源性配体等。

4、受体的基本分类化学门控离子通道受体;G蛋白耦联受体。

5、受体调节的方式

1)共价调节(covalent modification)尤其是蛋白磷酸化反应在受体的脱敏过程中起了非常重要的调节作用。以乙酰胆碱受体为例,细胞内c AMP 升高所引起的蛋白磷酸化可使乙酰胆碱受体对乙酰胆碱的脱敏速度增加

8~10倍。

2)非共价调节(non-covalent modification)影响受体功能的非共价调节机制包括①膜电位的变化;②机械性改变受体的分布(斑片钳技术);③受体和其他膜蛋白(如G蛋白)或某些小配体(阴离子,阳离子,核苷酸)之间的变构影响;④膜脂质环境的改变等。

3)协同性调节(coordinate regulation)已知不同受体可含有同源受体区如胰岛素受体和上皮生长因子-抗溃疡素受体中的酪氨酸激酶区。由此可推测一种受体被激活后可能通过一共同密码(code)来调节同一细胞上的其他许多受体。

4)链锁反应(receptor cascades)另外一种可能的调控机制,即一个受体被激活之后,可能会释放一种细胞外信使,激活第二个细胞表面受体。称之为放大性的链锁反应。

二、放射配体结合法的应用领域

1、阐明药物作用机制;

2、新药设计和药物筛选;

3、探讨疾病的病因、发病机理,提高临床合理用药和诊断水平;

4、测定组织或血液中药物浓度;

5、探寻新的受体、受体亚型和内源性配体。

三、放射受体结合实验技术简介

1、放射配体的选择需要非常高的选择性,并要求与靶受体有很高的亲和性,解离常数最好小于10nmol/L,还要考虑配体的生物学以及生物化学特征。拮抗剂性配体必须能阻断激动剂与靶受体结合引起的生物学效应。放射性受体结合试验中,最常用的放射性同位素是氚,[3H]配体的主要优点是氚化过程不影响配体的生物活性,使用较安全,其信号必须用闪烁技术加以放大。放射配体的另一个重要特性是特异性结合与非特异性结合的比率,理想的配体应有不少于99%的特异性结合。

2、组织的选择和制备用于放射受体结合试验的理想的组织应含有高密度的靶受体和低密度的与配体非特异结合的受体。用于放射受体结合试验的组织可取自脑、外周组织、天然表达或移植受体的细胞株等。

3、缓冲液最常用的缓冲液是50mmol/L,PH为7.4的Tris-Cl的缓冲液;重碳酸盐、磷酸盐和HEPES缓冲液亦可用于结合试验。

4、非特异性结合的测定非特异性结合的测定原理是加入大量的对靶受体具有药理活性的并可使受体饱和的非放射性配体。特异性结合量是指配体与靶受体结合量,可由总结合量中减去非特异性结合量求出。

5、孵育条件结合实验应该用能产生最大特异结合和适宜的孵育条件。需要经过大量的实验才可摸索出最佳的测定条件。

6、放射配体-受体复合体与游离放射配体的分离

最常用的最有效的分离方法是过滤,结合试验中最常用的滤纸是玻璃纤维滤纸。通常用2~5ml冷缓冲液冲洗2~3次就足够了。过滤完成后,滤纸置于盛有闪烁液的闪烁瓶中进行液闪测定。当放射配体解离较快时,可用离

心的方法将放射配体-受体复合物从游离配体中分离出来。其它方法还有:

凝胶过滤色谱法、凝胶过滤透析术、免疫沉淀法等。

第六节免疫药理学实验方法与技术简介

免疫药理学是介于免疫学和药理学间的边缘学科,主要研究药物对机体免疫系统和免疫功能的作用及其机制,为某些疾病药物治疗提供理论基础。

免疫药理学方法一般是采用体外的试管内研究和体内的整体研究相结合,体外试验研究可澄清药物对免疫应答某一特定环节如T细胞增殖、细胞因子等产生的具体影响,而整体研究则可探讨药物对抗原介导的的免疫应答、正常的体液免疫及细胞免疫功能、同种异体移植排斥反应、异常免疫应答如超敏反应和自身免疫病以及初次及再次免疫应答等的影响。在未来免疫药理学的研究领域中,基因工程、基因治疗、细胞因子治疗以及其它各种生物治疗的研究和应用将是研究的热点和前沿区域。

一、免疫细胞的分离与纯化

体内外的免疫药理学实验研究都需要从动物或人的血液或淋巴组织中分离免疫细胞,获得高纯度的免疫细胞是进行本研究的最基本的前提条件。

外周血中白细胞的分离常用自然沉降法和高分子聚合物沉降法;外周血单个核细胞(peripheral mononuclear cells,PMNC)分离多采用密度梯度离心法。

从淋巴组织中分离淋巴细胞悬液---制备脾细胞悬液、淋巴结细胞悬液、胸腺细胞悬液。

淋巴细胞的分离纯化包括:①分离PMNC中的淋巴细胞和巨噬细胞常用方法有玻璃粘附法、磁铁吸引法、羰基铁乳胶分层液法、补体溶解法及葡聚糖凝胶过滤法等。②T细胞、B细胞及T细胞亚群的分离纯化常用技术:E 花结分离法、Percoll非连续性密度梯度离心分离法、洗淘法(panning)、补体细胞毒法、尼龙毛分离法、磁性激活细胞分离器(magnetic activated cell sorter,MACS)分离技术及流式细胞术(flow cytometry,FCM)。

二、药物对免疫系统功能影响的实验技术简介

1、对免疫细胞表面抗原分子的影响对细胞表面的CD(cluster of differentiation,分化簇)抗原的检测与分析可通过细胞毒法、葡萄菌体蛋白A 法、免疫细胞化学法和免疫荧光染色分析法等,借助流式细胞仪进行的免疫荧光染色分析法使该项技术的标准化、定量化和自动化水平大大提高,体内外药理试验均可采用之。

2、对免疫细胞功能的影响常用:3H-TdR掺入试验、固相抗CD3单克隆抗体诱导细胞增殖的检测、混合淋巴细胞反应、抗原刺激的T细胞增殖反应、预激淋巴细胞对抗原的增殖反应等。

3、淋巴细胞功能的体内实验小鼠接触性超敏反应、移植物抗宿主反应(graft-versus-host disease,GVHD)、迟发性超敏反应(delayed-type hypersensitivity,DTH)、体内检测T H细胞活性。

4、对B细胞影响的体内外实验血清中IgG、IgA、IgM的测定(单向免疫扩散法、散射比浊法);抗体生成细胞检测(溶血空斑试验、溶血分光光度法)。

5、对单核巨噬细胞功能的影响实验巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验、白色念珠菌3H葡萄糖掺入实验、单核巨噬细胞对肿瘤细胞的细胞毒反应测定、单核因子测定等。

6、对超敏反应影响的体内外实验总IgE水平测定:酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、放射免疫单扩散法(radioactive single radial diffusion,RSRD)、免疫斑点法(dot immunobinding assay,DIBA)、反向被动血凝法(reversed passive hemagllutination assay,RPHA)、纸片放射免疫吸附试验(paper radio immunosorbent test,PRIST)。特异性IgE抗体测定:ELISA、放射过敏原吸附试验(radioallergosorbent test,RAST)、P-K试验、被动皮肤过敏反应(passive cutaneous anaphylaxis,PCA)、皮内试验(intradermal test)。人外周血单个核细胞体外合成IgE的测定:微量固相放射免疫测定法(microtiter solid-phase radioimmunoassay,MSPRIA)和ELISA法。参与I型超敏反应介质的测定:相应介质试剂盒测定,如LTs试剂盒。动物模型:如过敏性哮喘模型等。

三、影响免疫功能的药物药效学研究原则

根据药物对免疫功能的影响进行分类,可分为免疫增强剂、免疫调节剂和免疫抑制剂。

1、免疫增强剂和免疫调节剂的免疫药理学研究

免疫增强剂和免疫调节剂可分为两大类:生物类和化学合成化合物类。生物制品类包括菌苗、细菌的某些成分如脂多糖、真菌产物、免疫细胞的产物如细胞因子和免疫球蛋白、免疫细菌如LAK细胞、自然化合物及中草药及其单体成分等。化学合成化合物类包括含硫化合物、多聚核苷酸等。这些药物的药理作用因用药方案不同,如给药途径、用药剂量和用药时间等,会导致不同的药效;另外,药物本身的纯度和药物受试对象的种系、年龄、疾病类型与程度及遗传背景亦会对药效产生一定的影响,因此,在进行实验设计时要全面考虑这些因素。

临床上免疫增强剂和免疫调节剂主要用于原发性和继发性免疫缺陷病、自身免疫病、肿瘤及慢性微生物感染的治疗,故选择实验动物模型时,

应考虑采用免疫缺陷模型动物、荷瘤动物、自身免疫病模型及相应病原体感

染动物模型。

2、免疫抑制剂的免疫药理学研究

免疫抑制剂的筛选程序一般是先进行体外实验,然后进行体内实验。动物

的体内实验多采用实验性过敏性脑脊髓炎和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎的病理模型和新西兰NZB小鼠。在动物实验时,应考虑动物的品系、对免疫应答所影响的环节、治疗指数、给药途径、最佳治疗方案等。在免疫药理学研究之后,还应进行基础药理学研究、药物的急性和慢性毒性研究、药物的动力学研究等。

第七节肿瘤药理实验方法与技术

肿瘤药理实验方法无外乎体内和体外实验两种。从实验目的上看,又可

以分成抗癌作用和抗癌作用机制研究两种。

一、抗癌作用研究

(一)体外实验法:用培养的肿瘤细胞系进行。

1、噻唑蓝(MTT)法在培养的活细胞线粒体中与NADP相关的脱氢

酶可将黄色的四氮唑(MTT)催化成不溶性的蓝紫色的甲替,将甲替用二

甲基亚砜(DMSO)溶解后,利用酶标仪(试验波长570nm,参比波长450nm)

测定光密度值,按照公式

实验组光密度值

肿瘤细胞生长抑制率(%)=(1 - )×100%

对照组光密度值

计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率。用系列浓度的药物可制作肿瘤细胞

生长抑制率的量效曲线。

2、染料排斥法本方法是根据活细胞具有排斥某些染料的功能,而死

细胞因胞膜破坏而易于被染料着色的原理,在培养的对数生长期的细胞悬液

中加入伊红、台盼蓝、或苯胺黑等染料,在室温下放置5分钟后,在15分

钟用血球计数板计数200个细胞。根据公式

未染细胞数

活细胞率(%)= ×100%

细胞总数

3、生长曲线法本方法是根据肿瘤的Gompertzian生长曲线而设计。

培养的肿瘤细胞在初期为指数增殖期,随着细胞密度的增加,因代谢产物的

积聚和营养物质的消耗,增殖趋于减缓乃至停止,进入所谓的平台期。在培

养后的的即刻、1、2、3、4、5、7天的细胞,用台盼蓝染色,细胞计数,然后取细胞对数对培养时间作图可获细胞生长曲线。1)将生长曲线外延至Y 轴可获得截距No`,用公式

%100No No`-No ?=对增殖细胞的杀伤力

计算药物对增殖细胞的杀伤力(No`是对照组的的截距)

2)用Nt 代表接种后t 小时的细胞数, 用公式

TD = 0.301t / logNt - LogNo

计算药物对细胞增增时间(TD )的影响。

3)取平台期每毫升的细胞均数,比较细胞生长的饱合密度(Ns )。

4、集落形成法 本方法利用分裂≥6代以上的克隆原单细胞子细胞可形成集落成簇(每簇细胞数>50)的能力,比较药物对单个肿瘤细胞增殖能力的影响。本方法有贴壁法和半固体培养法两种。

1)贴壁法 需要选用贴壁生长的细胞, 按500细胞/ml 的浓度接种到35mm 培养皿中,培养后弃去培养基,用瑞氏-姬姆萨染色后,在20×解剖显微镜下计数含有50个细胞的细胞集落。

2)半固体软琼脂培养法 取对数生长的细胞,用含小牛血清的培养液稀释成1000细胞/ml 的悬液;溶化5%的琼脂液,并按1:9的比例与含小牛血清的新鲜培养液混合,倒入35mm 培养皿(1ml/皿),室温下待琼脂凝固,取0.94ml 的细胞悬液,加0.04ml 的5%琼脂, 加到已制备的琼脂平皿中,室温下凝固。移入培养箱培养。在16×解剖显微镜下计数直径大于75μm 的细胞集落。以集落形成抑制百分率对对数剂量作图,可得“S ”型曲线,从曲线上求取半数抑制浓度IC 50;以集落的存活分数与剂量作图,可获得克隆原细胞存活曲线,方程为S=1-(1-e-D/Do)n ,S 为存活分数, D 为剂量, Do 为存活分数每下降1/ e 时所需的药物剂量, n 为外推值。Do 越小, 药物的杀伤力越大,N 越大杀死细胞的药物剂量越大。

5、硫化若丹明B 法(SRB )法 硫化若丹明(sulforhamine B )呈粉红色,溶于水,可与生物大分子的碱性氨基酸结合,这种结合物在波长515nm 时的读数与细胞表现出良好的线性关系,可用于细胞的定量。测试的细胞先用TCA 固定,去除固定液,加入SRB , 室温下静置, 然后去除未结合的SRB , 用非缓冲tris 碱液溶解结合的SRB ,在自动化分光光度平板读数仪(515nm 波长)测定OD 值。可根据下述公式计算:

T - T 0

生长率(%)= ×100%

C - T 0

C、T和To分别为对照组细胞,为给药组细胞,另外的对照平板加药时的细胞的OD值。

T - T0

杀伤率(%) = ×100%

T

T - T0

50%生长抑制所需的药物浓度(GI50) = ×100%

C - T0

T - T0

杀死50%细胞所需的药物浓度(LC50)= ×100%

T0

(二) 在体试验法

1、小鼠白血病L1210 系用甲基胆蒽诱发DBA/2小鼠而得。取接种于DBA/2小鼠第6~7天之腹水,制成细胞悬液,每只小鼠(DBF1或CDF1)腹腔接种活细胞1×105,观察体重变化,计算平均存活时间T/C(T--治疗组存活时间,C--对照组存活时间)。T/C大于125%,并可重复,认为有抗癌活性,T/C大于150%,并可重复,认为具有显著活性。

2、大鼠Walker-256瘤本瘤细胞接种在皮下或肌肉成为实体瘤,接种于腹腔则成为腹水瘤。取Walker-256瘤体制成瘤细胞悬液,按106个细胞接

种于大鼠大腿肌肉。计算瘤重和T/C。重复实验T/C≤42%,认为有活性。

3、Lewis 肺癌是一个在C57BL/6小鼠上发现的自发性肺内未分化的上皮样癌。该癌细胞恶性程度高,皮下、肌肉接种对药物的敏感性低,但可向肺转移,静脉接种可在肺形成瘤集落。方法是取接种于C57BL/6小鼠肌肉或腋窝皮下的13~15天的Lewis肺癌,制成细胞悬液接种2×106个细胞于BDF1小鼠皮下或腹腔内,12天后处死动物,作皮下接种者直接摘取肿瘤称重,作腹腔接种者,将双侧后肢从髋关节处剪下,荷瘤肢重减去正常肢重即为瘤重。重复实验T/C≤42%为有活性。

二、抗癌作用机制研究

(一)药物作用周期特异性研究

进行药物作用细胞周期性实验必须首先制备同步化的细胞,常用的体外培养细胞同步化的方法有机械振荡法、双胸苷同步法、含羞草氨酸俘获法和离心洗脱法。

1、机械振荡法机械振荡法分离同步化细胞是基于单层贴壁生长的细胞在进入有丝分裂期时, 胞形变圆,松散地附在支持物上,利用摇晃或拍击培养瓶可以剥离出这些细胞,利用此方法可以得到较纯的M 期细胞。双胸苷同步法的原理是先以高浓度的TdR处理细胞,使细胞内的dTTP升高,后者抑制CDP 向dCDP的转变,DNA复制受阻,S期细胞停滞在S 期,其它期细胞积聚在G1/S边界;撤TdR,让原处于S期的细胞完全越过S期,再给予TdR,让越过S期的细胞进入G1/S边界,然后撤去TdR,让细胞重新生长,同时进入S期。因此,本方法可以得到较纯的S期细胞。

2、含羞草氨酸俘获法含羞草氨酸可将细胞集结于G1/S边界,阻止细胞进入S期。在撤除含羞草氨酸后,细胞可同步进入S 期。

3、离心洗脱法离心洗脱法的原理是进入细胞周期的的体积呈线性增加。G1期细胞体积最小,离出口最近而被最先洗出。G2/M细胞体积最大离进气口最近而被后洗出。

在上述同步化处理尚需配合以同步化程度的检测,检查的方法有两种:流式细胞光度技术和放射性同位素技术。前者通过测定细胞的荧光强度来定量细胞的DNA量;后者则利用测定掺入到DNA中的3H-胸苷(3H-TdR)或溴脱氧尿苷(BrdU)的量来获知处于S 期的细胞量。

(二)药物抗微管作用利用微管蛋白在37℃聚合,在冰浴上解聚的特点,测定微管蛋白或微管液的OD值,分别获得S型的聚合曲线和倒S 型的解聚曲线,比较药物对曲线的影响,用下式计算抑制率。

实验组光密度值

抑制率(%)=(1 - )×100%

对照组光密度值

(三)药物与DNA结合能力检查

吸收光谱移动法原理是DNA与药物形成复合物后吸收光谱发生改变,吸收峰产生位移,位移波长随DNA/ 药物复合物的量增加而增加。利用紫外分光光度计进行紫外吸收光谱扫描,可观察到这些改变。

荧光光谱移动法原理是在激发光的激发下,DNA-药物复合物的荧光发射光谱发生改变,谱峰向短波方向移动,荧光强度增强,同时激发光谱说发生改变。用荧光分光光度计测定激发光谱和发射光谱可观察到这些变化。

(四)药物造成的DNA损伤

彗星(Comet)微凝胶单细胞电泳法正常的DNA为负超螺旋结构,在pH<9.0时以双链形式存在, 在pH>12.0时则完全解链。DNA受损后链断裂, 成为一个松散的结构, 在电场的作用下,松散的DNA离开细胞核向正极移动, 形成彗星似的拖尾,变换不同pH缓冲液可检测断裂的是双链还是单链。

碱洗脱法收集细胞于滤膜上,用细胞溶解液裂解细胞并洗去RNA 和蛋白质,暴露DNA,用洗脱液进行洗脱,若DNA发生链断裂,则易于经滤膜洗出。

(五)药物对DNA拓扑异构酶的影响

DNA拓扑异构酶是调节DNA空间结构的动态变化的关键性核酶,分成拓扑异构酶I和II,抑制拓扑异构酶I可以造成DNA的单链断裂,抑制拓扑异构酶II,可造成双链断裂,进而干扰DNA的复制、重组和基因表达。实验的原理是用从肿瘤细胞核提取的拓扑异构酶II处理PBR322DNA,后者是一种质粒DNA,主要存在有超螺旋、缺口状和线性DNA三种形式,琼脂糖电泳上显示出三条带,在拓扑异构酶的作用下超螺旋DNA解旋、断裂,电泳时超螺旋带减弱或消失,相应的缺口环状或线性DNA增加。如果药物对拓扑异构酶具有抑制作用,则可见超螺旋带保留。此方法亦可改进为观察药物对拓扑异构酶功能的促进和抑制作用。方法是选定不能使一定量DNA 完全断裂量的拓扑异构酶处理PBR322DNA后电泳可见超螺旋带,同时加入不同浓度的药物,如果药物抑制拓扑异构酶,则超螺旋带增强,若药物增强拓扑异构酶活性,则见螺旋带减弱或消失。

(六)药物对细胞核酸代谢的影响DNA和RNA合成均需要特殊氨基酸,用同位素标记前体物如3H-TdR,3H-UR可分别掺入到细胞DNA 和RNA 中去,用液闪法测定其同位素活性则可知细胞DNA和RNA 的合成情况。

(七)药物对肿瘤细胞凋亡的诱导作用

细胞凋亡是一种受基因调控的细胞程序性死亡过程,细胞凋亡时表现为细胞体缩小,染色质浓缩成大小不等的块状,并裂解为小片段。DNA断裂长度为核小体核苷酸长度(180~200碱基对)的整倍数,提取后普通的琼脂糖电泳表现为特殊的云梯状,凋亡小体形成。检查细胞凋亡的方法有:

1、荧光显微镜的形态学检查该方法是利用凋亡细胞染色质浓缩,DNA广泛裂解的特征和荧光化合物可嵌入DNA分子或以静电相互作用与DNA分子结合的原理,建立DNA的荧光探针。常用的方法是用Hoechst33342和PI联合染色,然后在荧光显微下用紫外光激发。凋亡的细胞对Hoechst33342具有高摄取比,加之染色质的高度浓缩,呈强蓝色荧光;正常细胞呈微弱荧光,坏死细胞则呈红色荧光(被PI染色)。

2、流式细胞光度术该方法的原理是用DNA结合性的荧光染料标记DNA,因为细胞发生凋亡时,内源性核酸内切酶降解、断裂DNA,断裂生成的小分子量DNA溢出细胞外,细胞内DNA总量降低,利用流式细胞光度术可以检测出DNA的这种结构和量的变化。

3、琼脂糖电泳分析法利用该方法可检测出呈云梯状的寡聚核小体。

第八节心脑血管药理学实验方法与技术简介

心脑血管药物实验方法很多,择其要者简介如下:

一、血压测定及相关模型

血压测定法大体分为直接和间接测压法。直接测压可选用颈动脉或股动脉插管,通过压力换能器记录血压变化,一般用麻醉动物作急性实验。常用的间接测压法主要有大鼠尾容积测压及尾动脉脉搏测压法。实验性高血压模型有:1、肾血管性高血压模型(肾动脉狭窄性高血压模型),分为2肾1夹型(两侧肾完整,一侧肾动脉狭窄)、1肾1夹型(一侧肾切除,另一侧肾动脉狭窄)和2肾2夹型(两侧肾完整,两侧肾动脉狭窄),常用动物是狗和大鼠。2、内分泌性高血压模型常用大鼠,包括DOC盐性高血压模型、肾上腺再生性高血压模型。3、神经原性高血压模型。4、遗传性高血压模型,根据采用的遗传学方法进行分类:①选择性近亲繁殖高血压模型(如自发性高血压大鼠SHR、Dahl盐敏感大鼠DS、米兰种高血压大鼠 MHS、遗传性高血压大鼠 GH、以色列种高血压大鼠 SBH、里昂种高血压大鼠 LH)②基因工程高血压模型高血压转基因动物(transgenic animals of hypertension)、高血压基因敲除动物(geneknockout animals of hypertension)。

研究降压药作用机理的实验方法包括:中枢降压(毁髓猫或大鼠模型、减弱神经反射性调节实验等);外周降压(神经节阻断、对传出神经递质及受体的影响、对在体血管阻力或离体血管平滑肌作用实验等)。

二、心脏与血管实验法简介

心脏实验可用在位心脏和离体心脏进行。离体心脏实验最常用的方法是Straub法、八木-Hartung法与Langendorff法。前两种方法主要观察药物直接对心脏收缩力、传导与心输出量的影响,适用于两栖类动物如青蛙、蟾蜍等离体心脏;后者适用于哺乳类动物兔、豚鼠、大鼠等,不仅可观察药物对心肌的直接作用,还可观察药物对冠脉流量的影响。本法虽然排除了神经体液的调控作用,但不能同时控制前、后负荷和心率,故又建立了离体工作心脏实验法。在位心脏实验法有Bülbring法、家兔不破坏胸膜记录心收缩力法、狗心肺装置实验法等。

冠脉血管及冠脉血流量实验法离体实验主要有冠状动脉条实验、Langendorff离体心脏测定冠脉灌流量法;在位心脏测定冠脉血流量及心肌耗氧量、测定区域性心肌血流量、86Rb测定心肌营养血流量法。

心血管药理实验方法中的技术手段还有:清醒大鼠心功能及血流动力学实验、动物心电图、心导管技术等。

三、抗心肌缺血与再灌注损伤药物实验法简介

首先介绍心肌缺血与再灌注损伤模型的制备:①整体动物结扎冠脉后再灌注模型(常用犬、兔、大鼠进行);②离体心脏缺氧造成全心缺氧和其

后的在给氧损伤,亦可结扎离体心脏的冠脉,然后松结产生局部心肌再灌注损伤;③体外心肌培养缺糖缺氧与再给糖给氧产生再灌注损伤。

心肌缺血与梗塞范围测定:组织学检查;NBT或TTC标本染色法;心肌酶活性测定(如CK、LDH);心表面NADH荧光照相法。

还可应用心肌代谢测定法观察药物的影响,如测定血或组织中的乳酸、游离脂肪酸(FFA)、丙二醛(MDA)等,一般用试剂盒检测。

四、脑缺血和脑血流实验法简介

阻断支配脑组织的血管,可模拟与人脑卒中相近似的病理模型,实验性脑缺血模型制备的方法主要有:1、全脑缺血:结扎大鼠双侧颈总动脉和椎动脉;结扎大鼠双侧颈总动脉合并血压下降法;沙土鼠双侧颈总动脉阻断;结扎大鼠一侧颈总动脉合并低氧环境处理等。2、局灶性脑缺血:阻断大鼠大脑中动脉(MCAO)法;沙土鼠一侧颈动脉结扎;光化学法致大鼠局部脑血栓和颈动脉内注入血栓法等。3、自发性高血压大鼠阻断大脑中动脉致脑卒中模型。

评价脑缺血程度的方法:⑴脑功能改变(神经症状评分、脑电图改变等);

⑵测定脑血流(放射微球法、放射自显影法和氢清除法等);⑶组织学检查(脑切片染色法、病理切片);⑷脑代谢测定(如SOD、MDA等)。

测定脑血流是评价脑缺血程度和药物作用的重要方法,目前常用的方法主要有:①开颅窗显微镜下直接观察;②流量计测定法;③示踪技术常用H2清除法;④脑组织同位素标记法;⑤大鼠脑血管在位灌流法等。

五、抗心功能不全药与抗心律失常药物实验简介

㈠抗心功能不全药实验法在心功能不全动物模型上观察药物作用,制备模型至关重要,方法主要有:1、心脏压力超负荷模型:主动脉狭窄法(结扎或用特制动脉夹致腹主动脉狭窄、缩窄肾动脉、单侧或双侧肾切除等);肺动脉狭窄法。2、心脏血容量超负荷模型:动静脉短路法、腔静脉缩窄法、主动脉瓣与二尖瓣关闭不全法等。3、化学因素致心功能不全模型:抑制心脏的药物(普萘洛尔、维拉帕米、戊巴比妥钠等)诱发心衰;阿霉素致心肌损害;氧自由基损伤心功能;心肌梗死加快速起搏造成CHF;拟似冠心病高血压的CHF等。

㈡抗心律失常药实验法制备实验性心律失常通常以心电图II导联记录以观察心律失常类型、发生时间和持续时间等,进行药物研究可预防给药和治疗给药。主要方法简介如下:

1、药物诱发心律失常:氯仿致小鼠室颤;氯仿-肾上腺素致兔室性心律失常;哇巴因、乌头碱、氯化钡等诱发室性心律失常;乙酰胆碱诱发房颤等。

2、电刺激诱发心律失常:电刺激下丘脑或直接刺激心脏。

3、冠脉结扎诱发心律失常。

4、产生窦房结功能低下及房室传导阻滞模型:阻塞窦房结动脉和房室

结动脉法;缺氧营养液灌流离体窦房结和房室结标本法;维拉帕米致窦房结、房室结功能低下等。

第九节行为药理学实验方法与技术简介

行为药理学主要研究药物对大脑学习、记忆功能及情绪活动(如焦虑、抑郁等)的影响,也包括药物依赖性的实验评价。

一、学习、记忆实验法和记忆障碍动物模型简介

学习和记忆是脑的重要功能之一。学习是指新行为(经验)获得和发展,记忆就是使获得的经验保持和再现。人类记忆区可分为三种存贮系统,即感

觉记录系统,短时存贮系统和长时存贮系统。目前关于学习记忆的机制,认

为“感觉记忆”即感知事物后在极短时间内的记忆,与脑的电活动有关;“短

时记忆”和“长时记忆”可能与脑的神经细胞的突触效能或脑的化学变化有关,即学习、记忆有赖于全脑的整合功能,完成记忆的过程离不开知觉、情绪、注意、意图等心理功能,也离不开早已贮存的知识和经验。

(一)动物学习、记忆实验方法及模型:

1、跳台法(step down test)简便易行,有较高的敏感性,尤适合于

初筛药物。可同时观察药物对记忆过程及对学习的影响。

2、避暗法(step through test)利用鼠类的嗜暗习性而设计。简便易行,对记忆过程特别是对记忆再现有较高的敏感性。

3、穿梭箱(shuttle box)可同时观察被动和主动回避性反应。

4、爬杆法(pole-jump text)适用于大鼠或小鼠。观察非条件刺激和条

件刺激对动物逃避行为的影响。

5、迷津(maze) 学习、记忆的经典实验,至今仍经常采用。常用的装

置有Y型迷路、水迷路和Morris水迷津。

6、小鸡的一次性味觉----回避学习行为的动物模型Cherkin等人(1969)在前人研究的基础上,根据小鸡在自然环境中先天性的自发啄食行

为而建立的小鸡一次性味觉-回避学习行为(one-trial-avoidance task)的实验

模型。其优点:建立模型快,记忆保持良好;脑内注射方便;实验重复性好;实验成本低等。

7、操作式条件反射(operant conditioned reflex)在巴甫洛夫经典的条

件反射的基础上创立的一种实验方法,通过动物完成压杆或按键反应的特定

活动来研究动物的学习行为。

(二)记忆障碍动物模型

1、记忆获得障碍模型应用抗胆碱药物制备,常用东莨菪碱、樟柳碱。

2、记忆巩固障碍模型如电休克、缺氧、使用蛋白质合成抑制剂(如

环己酰亚胺、氯霉素等)。

3、记忆再现缺失模型如乙醇可明显干扰记忆再现。

4、其他小鼠脑缺血-再灌注模型;大鼠中脑动脉结扎-再灌注模型;脑栓塞模型;基底神经核-胆碱系统损伤模型及应激引起的学习、记忆障碍模型等。

二、抗焦虑实验方法及动物模型简介

焦虑以恐惧、忧虑、紧张不安等精神障碍为主要表现,一般认为,焦虑模型至少必须符合三个要求:①对临床有效的抗焦虑药敏感并呈剂量依赖性;②不同抗焦虑剂的相对强度应与在人体观察到的结果类似;③能够区别抗焦虑剂与非抗焦虑剂的不同效应。现有的焦虑模型包括二大类:一类是基于动物非条件反射的模型,根据其行为特点又可分为:⑴探究行为模型:大鼠高架十字迷宫(the elevated plus-mazetest, EPM)、小鼠明暗穿箱(light-dark transitions)、小鼠爬梯实验(the staircase test)、孔板实验(the holiboard test)、大鼠开场实验(the open field test)等;⑵社会行为模型:大鼠群居接触实验(the social interaction test)、分离发声实验(separation vocalization)。另一类是基于条件反射(传统学习模式)的模型,主要有Geller-Seifter冲突实验(Geller-Seifter conflict test )、安全信号撤除实验(the safety signal withdrawal test)、V ogel冲突模型(the V ogel’s conflict test)等。这些焦虑模型虽然并非人类焦虑情绪的精确复制,但对于抗焦虑药物的评筛及探讨焦虑的生化机制发挥了重要作用。

三、抗抑郁实验方法及动物模型简介

1、药物之间相互作用模型一般作为抗抑郁药初筛手段。主要有:利血平拮抗(reserpine reversal);高剂量阿朴吗啡的拮抗(antagonism of high dose of apomorphine);5-HT诱导的甩头行为(5-HT induced head-twitches);小鼠育亨宾增强模型(yohimbine potentiation model in mice)。

2、应激模型包括:“行为绝望”及其衍生(“behavioural despair”and derivatives),如强迫游泳实验、悬尾实验等;获得性无助(learned helplessness);未预知的长期应激刺激(chronic unpredictable stress);未预知的长期温和应激刺激(chronic unpredictable mild stress)等。

3、脑损伤模型嗅球切除模型(olfactory bulbectomy model)。

4、72s低频率差式强化程序(differential reinforcement of low rate 72-s schedule)。

四、药物依赖性动物实验方法简介

药物依赖性包括机体依赖性和精神依赖性。机体依赖性的试验评价以阿片类药物为代表,通用的实验方法主要有三种:自然戒断实验(spontaneous withdrawal test)、催促戒断实验(precipitation withdrawal test)和替代实验(substitution test)。常用动物:小鼠、大鼠、狗、猴。目前还发展了用离体组织标本进行评价,其方法主要为:①已形成阿片依赖性的整体动物身上取其离体组织进行试验;②直接将离体组织放在含阿片类药物的Krebs液中共

药理实验指导

药理学实验指导

实验一药物的作用方式 【实验目的】理解药物的局部作用和全身作用,并了解兴奋作用、抑制作用及拮抗作用。 【实验原理】普鲁卡因为局部麻醉药,抑制中枢神经元,首先抑制对药物敏感的中枢抑制性神经,引起脱抑制而出现兴奋现象,表现为不安、震颤,甚至惊厥。而戊巴比妥钠为镇静催眠、抗惊厥药,随着药物剂量的增加,对中枢的抑制作用逐渐增强,分别产生镇静、催眠、麻醉和抗惊厥的作用。 【实验对象】小白鼠(体重20g左右) 【实验材料】 1.器材:1ml注射器、钟罩、镊子 2.药品:3%普鲁卡因溶液、0.5%戊巴比妥钠溶液 【实验步骤】 1.取小白鼠1只,称重标记,并观察一般活动情况及痛觉反应。 2.在小白鼠一后肢股骨粗隆下端坐骨神经周围,注射3%普鲁卡因溶液0.1ml/10g,随即观察小白鼠左右后肢的活动情况及全身情况。 3.待小白鼠抽搐明显时,立即腹腔注射0.5%戊巴比妥钠溶液0.1ml/10g并继续观察小白鼠全身情况。 4.填表 小白鼠用普鲁卡因后表现用戊巴比妥钠后表现 左后肢全身左后肢全身 【注意事项】 1.要求注射部位要正确。 2.注意抢救时间。 【思考题】 1.小白鼠的那些表现各属于局部、全身、兴奋、抑制和拮抗作用? 2.本次试验队临床用药有何指导意义?

实验二药物剂量对药物作用的影响 【实验目的】掌握药物剂量与药物作用的关系 【实验原理】戊巴比妥钠为镇静催眠、抗惊厥药,随着药物剂量的增加,药物作用越明显,对中枢的抑制作用逐渐增强,分别产生镇静、催眠、麻醉和抗惊厥的作用。 【实验对象】小白鼠(体重20g左右) 【实验材料】 1.器材:1ml注射器、钟罩、镊子 2.药品:0.1%,1%,2%戊巴比妥钠溶液 【实验步骤】 1.取性别相同,体重相近小白鼠3只,分别称重、记号(1、2、3号),观察精神状态、痛觉反射及翻正反射。 2.给1号小白鼠腹腔注射0.1%戊巴比妥钠溶液0.1ml/ 10g 给2号小白鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液0.1ml/10g 给3号小白鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠溶液0.1ml/10g 3.用大烧杯罩住小白鼠,并随时观察用药后各小鼠的精神状态、痛觉反射、翻正反射。 4.填表 小白鼠号用药用药后的表现(3′6′9′12′15′) 精神状态痛觉反射翻正反射1号 2号 3号 【注意事项】 1.更换药物要冲洗注射器。 2.小白鼠体重相差应小于两克。 【思考题】 1.药物剂量和药物作用的关系? 2.讨论3只小白鼠用药以后表现为何不同?

(整理)《药理学》实验讲义.

《药理学》实验讲义

实验一药理学实验的基本知识和基本技术 一、目的 1. 掌握基本操作,锻炼动手、动脑能力; 2. 更好地掌握药理学基本理论知识; 3. 培养科学思维 二、基本要求 1. 实验前:预习实验内容并复习相关理论知识; 2. 实验时 ⑴实验器材要妥善保管; ⑵实验操作按步骤进行,仔细观察实验中出现的现象,实事求是地做好记录; ⑶注意节约实验药品; ⑷维持良好的课堂纪律。 3. 实验后 ⑴各组同学将实验动物处死,实验台擦干净,将实验方盘送回准备室; ⑵值日生搞好实验室卫生,将死亡动物送至指定场所; ⑶书写实验报告。 三、实验报告的书写 1. 题目 2. 目的 3. 原理 4. 材料:实验动物,器材,药品 5. 方法:用自己的语言简单扼要描述出来; 6. 结果:要求真实、清楚; 7. 讨论:将实验结果进行比较、分析;实验中有哪些不足之处;结果异常或失败的原因; 8. 结论:将实验结果进行归纳总结,应带有提示性质。 四、药理学实验实验设计原则 1.随机原则 按照机遇均等的原则进行分组。其目的是使一切干扰因素造成的实验误差减少,而不受实验者主观因素或其他偏性误差的影响。 2.对照原则 空白对照(指在不加任何处理的条件下进行观察对照);阴性对照也称假处理对照(给予生理盐水或不含药物的溶媒);阳性对照也称标准对照(指以已知经典药物在标准条件下与实验药进行对照)。 3.重复原则 能在类似的条件下,把实验结果重复出来,才能算是可靠的实验,重复实验除增加可靠性外,也可以了解实验变异情况。 五、实验动物

1. 动物的选择 (1)小白鼠:适用于需大量动物的实验,如某些药物的筛选,半数致死量的测定。也较适用于避孕药实验、抗炎镇痛药实验、中枢神经系统药实验、抗肿瘤药及抗衰老药实验等。 (2)大白鼠:比较适用于抗炎药物实验,血压测定、利胆、利尿药实验,也可用于进行亚急性和慢性毒性实验。 (3)豚鼠:因其对组胺敏感,并易于致敏,故常被选用于抗过敏药、平喘药和抗组胺药的实验。也常用于离体心脏、心房、肠管实验。又因它对结核敏感,常用于抗结核病药的实验。 (4)家兔:常用于观察研究脑电生理作用,药物对小肠的作用。由于家兔体温变化敏感,也常用于体温实验,用于热原检查。 (5)狗:狗是记录血压,呼吸最常用的大动物。还可利用狗做成胃瘘、肠瘘,以观察药物对胃肠蠕动和分泌的影响。在进行慢性毒性实验时,也常采用狗。2. 实验动物的编号 狗、兔等较大的动物可用特制的铝质号码牌固定在颈部或耳上。大鼠、小鼠如为白色可用黄色苦味酸在不同的体表标志上标记。 3. 动物固定及给药 (1)小鼠捉拿 小鼠性情较温顺,一般不会咬人,比较容易抓取固定。通常用右手提起小鼠尾巴将其放在鼠笼盖或其它粗糙表面上,在小鼠向前挣扎爬行时,用左手拇指和食指捏住其双耳及颈部皮肤,将小鼠置于左手掌心、无名指和小指夹其背部皮肤和尾部,即可将小鼠完全固定。在一些特殊的实验中,如进行尾静脉注射时,可使用特殊的固定装置进行固定,如尾静脉注射架或专用小鼠固定筒。如要进行手术或心脏采血应先行麻醉再操作,如进行解剖实验则必须先行无痛处死后再进行。 (2)小鼠灌胃 用左手固定鼠,右手持灌胃器,将灌胃针从鼠的口腔插入,压迫鼠的头部,使口腔与食道成一直线,将灌胃针沿咽后壁慢慢插入食道,可感到轻微的阻力,此时可略改变一下灌胃针方向,以刺激引起吞咽动作,顺势将药液注入。一般灌胃针插入小鼠深度为3~4cm,大鼠或豚鼠为4~6cm。常用灌胃量小鼠为0.2~1ml,大鼠1~4ml,豚鼠1~5ml。 (3)小鼠腹腔注射 先将动物固定,腹部用酒精棉球擦试消毒,然后在左或右侧腹部将针头刺入皮下,沿皮下向前推进约0.5 厘米,再使针头与皮肤呈45 度角方向穿过腹肌刺入腹腔,此时有落空感,回抽无肠液、尿液后,缓缓推入药液。此法大小鼠用的较多。 (4)皮下注射 注射时用左手拇指及食指轻轻捏起皮肤,右手持注射器将针头刺入,固定后

中药药理实验方法学06试题答案

二、简答题 1.小鼠正规的LD50实验对给药途径、给药容量和观察内容有何要求? 答:与临床给药途径一致、口服每次不超过40ml/kg,皮下、腹腔、静注不超过0.5ml/只。 观察动物各方面的反应,包括动物体重变化、饮食、外观、行为、分泌物、排泄物、死亡情况及中毒反应等。对濒死及死亡动物应及时进行大体解剖,其他动物在观察期结束后进行大体解剖,必要时,对病变的器官应进行组织病理学检查。观察期限一般为14天,如果毒性反应出现较慢,应适当延长观察时间。 2.对中药新药进行药效实验时,对受试药有何要求? 答:所用的中药材要经过生药学鉴定,确定中药品种、产地及药用部位。加工炮制品种,炮制方法应合理。受试药物的提取工艺应基本稳定,处方固定,质量稳定、工艺、质控指标恒定后的中试产品。 3.有15只小鼠,请根据下例随机数列将其随机分成3组。 58,71 ,96,30,24,18,46,23 ,34,27, 85,13,99,24,44,48,18,09,79,49 答:A: 1, 7, 9, 11, 12 B: 2, 8, 15, C: 3, 4, 5, 6, 10, 13, 14 48/7=6 18/6=0 调整后: A: 1, 7, 9, 11, 12 B: 2, 8, 15, 13, 14 C: 3, 4, 5, 6, 10 3.请列举两种过氧化损伤涉及的疾病,三种检测过氧化损伤的指标(不必说明具体测试方法)? 答:动脉粥样硬化;缺血再灌注损伤。指标:组织脂褐质。超氧化物歧化酶SOD活性; 谷胱甘肽过氧化酶(GSHPx)活性。 5.理想的动物“证”的模型应具备哪些要素?应用现有“证”的动物模型应注意哪些问题? 答:1.症状、病理变化与临床证型相似。2.病因相似。3.代表方药治疗后可纠正上述病理生理变化。4. 有客观指标指标的敏感性、重现性、定量或半定量。用两种以上模型,互补欠缺,下结论避免片面。 三、计算问答题 1.下例两组资料是否可用“t”检验分析组间差异?如不行请说明理由,如行,请说明差异是否显著。(10分) 资料1: A: 126,135,182,145,137,178,156,153 151.5±20.1 B: 130, 132, 142,141,120, 148,129,146 136.0±9.7 不能,方差不齐 资料2: A:18.50, 10.85, 19.50, 11.21, 9.15, 11.63, 11.30, 10.70, 11.05, 10.25, 6.62 11.89±3.79 B: 7.58, 6.67, 7.85, 14.42, 6.92, 15.51, 7.87, 6.89, 7.52, 5.85, 6.35 8.49±3.27 不能,偏态 5.某中药提取物剂量按80mg/kg给重180-220g/只大鼠口服有降血压作用,现要用重12kg 左右犬进行相同的药效实验,请计算其等效剂量。(8分) 答:80mg/kg/5=16mg/只大鼠 16mg/只×17.8=284.8mg/犬 (284.8mg/犬)/(12kg/犬)=23.7mg/kg

药理学实验方案

药理学实验方案

元胡止痛片对小鼠镇痛抗炎镇痛活性研究 ——药理实验设计 设计人:级药学一班 张礼杰 515010 信盼 515024 陈茂琴 515026 何朵朵 515028 药学四班 杨森 515101 冯禹 515110 王同月 515102

元胡止痛片中抗炎和镇痛作用研究 1.实验目的:探讨元胡止痛片的镇痛和抗炎作用 2.实验原理:(1)元胡止痛片收载于《元胡止痛片收载于《中国药典》是由元胡、白芷两味药组成的中药复方制剂为行气活血止痛剂临床用于治疗气滞血瘀胃痛、胁痛、头痛及月经痛等症疗效确切。本实验是为验证元胡止痛片的镇痛和抗炎作用进行验证。实验对四川禾邦阳光制药厂家生产元胡止痛片不同剂量进行了药效学研究采用小鼠醋酸扭体法、小鼠热板法和耳肿胀法实验分别测定小鼠扭体反应抑制率、小鼠痛阂值提高率和肿胀率从而确定不同剂量的镇痛和抗炎作用效果。 在基础医学研究中筛选镇痛药的常见致痛方法概括有物理法(热、电、机械)和化学法。动物的疼痛反应常表现出嘶叫、舔足、翘尾、蹦跳及皮肤、肌肉抽搐。化学法,即将某些化学物质,如强酸、强碱、钾离子、缓激肽等,涂布于动物的的某些敏感部位或腹腔注射。腹腔注射损伤物质引起受试动物腹痛,动物表现出“扭体反应”(即腹部内凹、躯干与后肢伸张、臀部高起)。 3.实验方法 :使用小鼠热板法、醋酸扭体法、耳肿胀法 ,并分别建立小鼠疼痛和炎症模型 ,灌胃给予不同剂量元胡止痛片配成的溶液,观察对动物的镇痛和抗炎作用。 4.实验过程: 1.内容

4.1 药品与试剂 元胡止痛片:四川禾邦阳光制药股份有限公司,国药准字z51021658,规格:片芯重0.25g,12片 阿司匹林: 浙江金华市第三制药厂, 国药准字: H13023716, 临用前用蒸馏水配制为适当浓度的混悬液。 4.2动物:健康昆明种小白鼠,雌性,32只 4.3 器材:数控超级恒温槽,烧杯、1ml 注射器、电子秤 4.4分组: 空白对照组 (灌胃0.9%生理盐水 10 mL/kg) 元胡止痛片高、低剂量组 (0.2,0.4mg /10g) 阳性药阿司匹林对照组 (灌胃阿司匹林 0. 4 g/kg) 4.5人和动物剂量换算公式 小白鼠=20 0026 .0?人/g 2 方法 (1)热板法 1.动物筛选:致痛潜伏期 (痛阈值)为 5~30s 之间的合格雌性小鼠。32只,热板法镇痛试验筛选痛阈值合格的小鼠,取♀小鼠于给药前先用热板仪于55 ± 0. 5 ℃分别测定每只小鼠的正常痛阈值[将小鼠放于智能热板仪上至出现舔后足的所需时间作为痛阈值( s) ,连续 2 次,间隔30 s ,测定平均值即为正常痛阈值]。将舔后足时间< 5 s 或>30 s ,或跳跃者不用于此实验

药理实验指导

药理学实验指导 实验一药物的作用方式 实验目的】理解药物的局部作用和全身作用,并了解兴奋作用、抑制作用及拮抗作用。实验原理】普鲁卡因为局部麻醉药,抑制中枢神经元,首先抑制对药物敏感的中枢抑制性神经,引起脱抑制而出现兴奋现象,表现为不安、震颤,甚至惊 厥。而戊巴比妥钠为镇静催眠、抗惊厥药,随着药物剂量的增加,对中枢的抑制作用逐渐增强,分别产生镇静、催眠、麻醉和抗惊厥的作用。 实验对象】小白鼠(体重20g左右) 实验材料】 1?器材:1ml注射器、钟罩、镊子 2.药品:3%普鲁卡因溶液、0.5%戊巴比妥钠溶液 实验步骤】 1.取小白鼠1只,称重标记,并观察一般活动情况及痛觉反应。

2 .在小白鼠一后肢股骨粗隆下端坐骨神经周围,注射3%普鲁卡因溶液0.1ml/10g,随即观察小白鼠左右后肢的活动情况及全身情况。

3?待小白鼠抽搐明显时,立即腹腔注射0.5%戊巴比妥钠溶液0.1ml/10g并继续观察小白鼠全身情况。 4.填表 小白鼠用普鲁卡因后表现用戊巴比妥钠后表现 左后肢全身左后肢全身 注意事项】 1.要求注射部位要正确。 2.注意抢救时间。 思考题】 1.小白鼠的那些表现各属于局部、全身、兴奋、抑制和拮抗作用? 2.本次试验队临床用药有何指导意义? 实验二药物剂量对药物作用的影响 实验目的】掌握药物剂量与药物作用的关系 实验原理】戊巴比妥钠为镇静催眠、抗惊厥药,随着药物剂量的增加,药物作用越明显,对中枢的抑制作用逐渐增强,分别产生镇静、催眠、麻醉和抗惊厥的作用。 实验对象】小白鼠(体重20g左右) 实验材料】 1.器材:1ml注射器、钟罩、镊子

2.药品:0.1%, 1% , 2%戊巴比妥钠溶液 实验步骤】 1.取性别相同,体重相近小白鼠3只,分别称重、记号(1、2、3号),观察精神状态、痛觉反射及翻正反射。 2.给1号小白鼠腹腔注射0.1%戊巴比妥钠溶液0.1ml/ 10g 给2号小白鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液0.1ml/10g 给3号小白鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠溶液0.1ml/10g 3.用大烧杯罩住小白鼠,并随时观察用药后各小鼠的精神状态、痛觉反射、翻正反射。 4.填表 注意事项】 1.更换药物要冲洗注射器。 2 ?小白鼠体重相差应小于两克。 思考题】 1.药物剂量和药物作用的关系? 2.讨论3只小白鼠用药以后表现为何不同? 实验三给药途径对药物作用的影响及药物的拮抗作用 实验目的】观察不同给药途径对药物作用的影响及药物的拮抗作用

药理学设计性实验

药理学设计性实验 实验一、石菖蒲的镇静作用 【目的】 1应用小动物自主活动学习镇静药物的实验方法。 2、应用小动物自主活动仪,研究地西泮、石菖蒲对小鼠自发活动的影响。 【原理】小动物自主活动仪的原理:在活动箱内,将一束或几束光线照射到对侧光电感应器上,动物在箱内每活动一次,感应电流发生改变,经过放大装置,使电脉冲驱使继电器启动, 通过记录器记录动物活动次数。 地西泮是镇静催眠的代表药。石菖蒲具有宁心安神作用,其挥发油对中枢有广泛的抑制作用。本实验以小鼠自发活动次数为指标,观察药物的镇静作用。 【动物】小鼠6只,实验前禁食12h o 【药品】0.05%地西泮溶液,石菖蒲水煎液,生理盐水 【主要器材】动物自主活动仪1台,电子称1台,1ml注射器2支,烧杯2杯。 【方法】将6只动物随机分为甲乙丙组,甲组灌胃生理盐水,乙组灌胃石菖蒲水煎液(连续 两天),丙组灌胃地西泮1次,0.2ml/10。给药后1小时各组动物放入小动物自主仪,先适应2分钟,再记录5分钟内小鼠自主活动次数。 【结果】地西泮、石菖蒲对小鼠自主活动的影响。(结果见表1) 表1地西泮、石菖蒲对小鼠自主活动的影响 参考文献: [1] 胡锦官,顾健,王志旺?石菖蒲及其有效成分对神经系统作用的药理研究[J].中药药药理 与临床.1999.15 (30: 19 [2] 刘新民.石菖蒲的研究现状J].中医药研究.1992. (4): 57 [3] 吴启端,吴清和,石菖蒲的药理学研究进展[J].2006,17 (6) :477-480 实验二、石菖蒲对记忆障碍小鼠模型的改善作用 【目的】 1、学习小鼠跳台原理和操作,正确运用跳台实验仪器对小鼠进行学习记忆能力行为学测试。 2、观察石菖蒲对小鼠记忆获得障碍的疗效作用。 【原理】鼠跳台实验装置由DT-200小鼠跳台测试箱和DT-200小鼠跳台测试仪组成。测试箱由6个小房间构成,一次可同时试验6只动物,每个小房间有一橡皮台,箱底是可通电的 铜栅,在训练期通电小鼠跳下平台在箱底不断被电击,这个过程中小鼠获得记忆,24 h后测 试时观察小鼠第一次跳下平台的时间和 5 min内跳下平台的次数,比较各组老鼠记忆保持的 能力。 戊巴比妥钠能造成小鼠学习记忆障碍。石菖蒲具有开窍醒神,宁心安神的作用,能够促进学习记忆。本实验以小鼠跳下潜伏期及5min内错误次数作为指标,观察药物对小鼠学习

药理实验指导

实验二给药途径对药物作用的影响 【目的】观察不同的给药途径对药物作用的影响 【原理】回苏灵为中枢兴奋药 【材料】小鼠3只,体重18~22g,同一性别。 0.04%回苏灵溶液 【方法与步骤】 动物称重,标记。每鼠给药剂量均为8mg/kg。甲鼠灌胃给药,乙鼠皮下注射,丙鼠则为腹腔注射。仔细观察动物反应,记录下各鼠的潜伏期和最终结果。 【结果处理】将上述观察到的结果填入下表2-4,并结合全班的试验结果,比较三种给药途与药物反应的出现时间和作用程度,最好能进行统计分析。 实验三肝脏功能对药物作用的影响 【目的】观察肝脏病理功能状态对药物作用的影响。 【原理】四氯化碳是一种肝脏毒药,其中毒动物常被作为中毒性肝炎的动物模型,用于筛选保肝药物。 【材料】小鼠2只,四氯化碳原液,0.36%戊巴比妥钠。 【方法与步骤】 1.取性别相同、体重相近的2只小鼠,在试验前24h,分别皮下注射四氯化碳原液和生理盐水0.1ml/只。 2.2只小鼠分别ip戊巴比妥钠30ml/kg。 3.观察动物的翻正反射消失情况,记录药物作用的潜伏期和持续时间。 4.试验结束后,解剖小鼠,比较2只小鼠的肝脏外观有何不同。 【结果处理】将上述观察到的结果填入下表2-5,并结合全班的试验结果,比较不同肝脏状态对药物作用影响,最好能进行分析。 实验四药物的抗电惊厥作用 【目的】观察苯妥英钠和苯巴比妥对电惊厥的保护作用。 【原理】以一强电流刺激小鼠头颅可引起全身强直性惊厥,若药物预防强直性惊厥发生,可初步推测该药有抗癫痫大发作的作用。 【材料】小鼠3-4,体重18~22g,雌雄不限。钟罩、天平、注射器,药理生理多用仪。 0.5%苯妥英钠溶液,0.5%苯巴比妥钠溶液。

药理学实验方法

第一章现代药理学实验方法与技术简介 第一节分子生物学试验方法与技术 分子生物技术在药理学实验中应用较为广泛,包括核酸分子探针的标记、核酸分子杂交、多聚酶链反应、蛋白印迹杂交技术、cDNA文库、随机分子库技术、外核基因在真核细胞中的表达、转基因动物、人类基因治疗等。现将更为常用的技术介绍如下: 一、核酸分子探针的标记标记核酸分子探针(nucleic acid probe)是进行核杂交的基础,根据核酸分子探针的来源及性质进行选择,选择的基本原则是具有高度的特异性,探针选择直接影响杂交结果的分析。根据检测对象和目的不同,,可选择不同的探针种类及标记方法。 ㈠探针种类 1.基因组DNA探针是克隆化的各种基因片断,也是最常用的核酸探针,探针应尽可能选用基因编码(外显子),避免使用内含子及其它非编码序列。 2.cDNA探针与mRNA互补的DNA链称cDNA,是一种较为理想的核酸探针,特异性较高。 3.RNA探针RNA与RNA或DNA杂交体的探针稳定性,特异性高。 4.寡核苷酸探针人工合成寡核苷酸片段做探针,可根据需要合成相应序列。 ㈡标记物 常用的探针标记物有两类:放射性同位素和非放射性同位素。标记物的检测具有高度灵敏性和特异性。标记和探针结合不影响杂交的特异性和稳定性。其中放射性同位素是应用最多的探针标记物,但易造成放射性污染,多数同位素的半衰期短,不能长期存放。常用的放射性同位素有32P?3P?35S,有时也用14C,125I或131I。 二、核酸分子杂交(nucleic acid hybridiazation )是指具有一定同源序列的两条核酸单链在一定的条件下,按碱基互补配对原则形成异质双链的过程。核酸分子杂交是分子生物学领域应用最广泛的技术,灵敏度高、特异性强,主要用于特异DNA或RNA的定性定量检测。 三、聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)是一种体外酶促扩增特异DNA片段的方法。传统的DNA扩增法是分子克隆法,需经过DNA 酶切、链接、转化等步骤构建含有目的基因的载体。然后导入细胞中进行扩增,再用同位素标记的探针进行筛选,操作复杂,耗时。PCR技术灵敏度

《药学大实验》实验指导药理学部分

药学实验(药理学实验) 实验五不同给药途径、给药剂量对药物作用的影响 (一)不同给药途径对药物作用的影响 实验目的 观察不同给药途径对药物(硫酸镁)作用的影响,了解核酸镁不同给药途径产生不同作用的原因; 掌握硫酸镁的作用以及小鼠灌胃、腹腔注射方法 实验原理 硫酸镁为一种容积性泻药(此外还有刺激性和润滑性泻药),口服在肠道难吸收,在肠内形成高渗压而阻止肠内水分的吸收,从而扩张肠道、刺激肠壁、促进肠道蠕动,产生泻下作用。注射给药可使血中Mg2+增加,由于Ca2+和Mg2+化学结构相似,Ca2+和Mg2+间存在相互拮抗作用,Ca2+参与运动神经末梢Ach释放,而Mg2+拮抗Ca2+这种作用,结果使神经肌肉接头处Ach减少,骨骼肌紧张性降低,肌肉松弛。同时对中枢神经及心血管系统产生抑制作用。因此产生抗惊厥及降压效果。本实验观察不同给药途径对硫酸镁作用性质的影响。 大多数药物需进入血液分布到作用部位才能发生作用。药物自给药部位进入全身血液循环的过程为吸收(absorption),吸收速度的快慢及吸收数量的多少直接影响药物的起效时间及强度。其中给药途径是决定药物起效时间及强度的重要因素之一。给药途径不同,则药物吸收快慢亦不同,其吸收快慢顺序除静脉注射外是:腹腔注射>吸入>舌下>直肠>肌内注射>皮下注射>口服>皮肤。给药途径不同,其吸收程度又不同,由此使药物作用强度不同。药物经不同给药途径所致的吸收程度是:吸入、舌下、直肠、肌内注射较为完全,口服次之,皮下较差;皮肤表面吸收程度最差,一定要脂溶性特别高的药物才能通过此途径较好地吸收。而胃肠道给药,影响因素较多,包括有首关

消除的影响等,使药物吸收程度有所不同。 首关消除(first pass elimination):从胃肠道吸收入门静脉系统的药物在到达全身血循环前必先通过肝脏,如果肝脏对其代谢能力很强或由胆汁排泄的量大,则使进入全身血循环内的有效药物量明显减少,这种作用称为首关消除。有的药物在被吸收进入肠壁细胞内而被代谢一部分也属首关消除。首关消除也称首关代谢(first pass metabolism)或首关效应(first pass effect)。注射、舌下和直肠给药可避免肝代谢。 实验学时 2学时 实验对象 小白鼠,体重18-22g,雌雄不限 实验器材 1ml注射器2支、小白鼠灌胃针头1个、5号针头1个、250ml烧杯2个 药品与试剂 10%硫酸镁溶液,苦味酸 实验内容 1.小鼠腹腔注射硫酸镁的症状。 2.小鼠灌胃给予硫酸镁的症状。 实验步骤 1.取健康小白鼠2只,称体重后,分别作标记(1,2号),然后观察正常活动情况。2.1号小白鼠从腹腔注射10%硫酸镁溶液0.1ml/10g体重,给2号小白鼠以同样剂量

《药理学实验》课程教学活动大纲

《药理学实验》课程教学大纲 (执笔人:尹艳艳审核人:周兰兰教学院长:陈志武)一、课程简介 (一)课程代码: (二)课程名称(含英文名称): 药理学实验(pharmacology experiments) (三)课程类别: 专业基础课 (四)修读对象: 药学专业 (五)总学时与学分: 其中实验54学时,3学分。 (六)相关课程: 药理学 (七)内容提要 本课程涵盖了药理学部分的模拟实验及经典实验项目,以大量的实验尤其是动物实验为基础,复制疾病动物模型,研究用药后的生物体功能活动变化及其规律,以巩固药理学及相关基础理论知识,进一步强化实验操作技术,提高动手能力,培养分析问题和解决问题的能力。 二、教学目的和教学方法 (一)教学目的 1.加强学生的药理学基本理论、基本知识和基本技能的训练,培养理论联系实际和独立开展科学研究的能力。药理学实验可以帮助学生验证药理学理论知识,巩固和加强对药理学理论的掌握;促进学生对药理学一些抽象概念的理解;了解药理学研究的一些基本方法,培养学生药理学实验设计和科研能力;初步掌握药物研究的基本技能,并且通过科研模拟实验加强学生的创新思维能力的培养。

2.药理学实验主要以学生在教师指导下自己动手操作为主,少量示教实验为辅,并且配合课堂讨论和多媒体等方法,达到既验证理论,巩固和加强药理学理论知识学习的目的,又要做到培养学生科研能力和创新思维的开发。 (二)教学方法 采用课堂讲授、现场指导、模拟实验、双语教学、自主设计、病例讨论和课外训练等多种教学手段相结合的教学方法。 三、实践教学学时分配 四、选用教材和主要教学参考书

1.陈志武,董六一,《药理学实验指导》,中国协和医科大学出版社,2013年10月 2.孔德虎,《医学机能学实验教程》,科学出版社,2009年2月。 五、实验教学内容 实验一、动物捉拿及各种药方法(录像) 主要讲授内容:介绍动物捉拿及各种给药方法 教学时数:3学时 重点与难点: 1.小鼠、大鼠和家兔的捉拿方法。 2.小鼠、大鼠和家兔常见的给药方法 实验二、小鼠戊巴比妥钠LD50和ED50的测定 主要讲授内容:ED50及LD50的概念,其测定方法和小鼠腹腔注射的方法 教学时数:4学时 重点与难点: 1.小鼠腹腔注射的方法。 2.LD50和ED50的计算方法。 思考题或练习题: 1. 半数有效量(ED50)和半数致死量(LD50)测定的目的意义如何? 2. 药物的剂量与药物作用有何关系? 3. 治疗指数和安全范围之间有何联系? 实验三、吗啡的镇痛作用(小鼠热板法和小鼠扭体法) 主要讲授内容: 1.镇痛药物的热板实验方法测定,观察镇痛药的镇痛作用,熟练掌握小鼠皮下注射的方法; 2.镇痛药物的扭体实验方法测定,观察镇痛药的镇痛作用,熟练掌握小鼠腹腔注射的

药理学实验指导

药理学实验指导 (供自学助考班用) 实验一药理学实验基础知识与常用动物捉拿、给药 【目的】1、学习药理学实验基础知识; 2、掌握药理学实验常用动物捉拿、给药方法。 【器材】1ml、5ml、20ml注射器,大、小鼠灌胃针头,4号、6号注射针头,250ml烧杯、鼠笼(或铁丝笼),天平秤、砝码。 【药品】0.9%生理盐水。 【动物】小白鼠、大鼠、家兔。 【内容】 一、实验动物的捉拿方法 1、蛙和蟾蜍左手握持蛙或蟾蜍,食指和中指夹住左前肢,拇指压住右前肢;右手将双下肢拉直,左手无名指及小指将其压住而固定。此法用于淋巴囊注射。毁脑和毁脊髓则用左手食指和中指夹持蛙或蟾蜍的头部,拇指和无名指小指握持双下肢,右手持刺针进行操作。 2、小白鼠可采取双手法和单手法两种形式。 双手法:右手提起鼠尾,放在鼠笼盖或其他粗糙面上,向后方轻拉,小白鼠则将前肢固定于粗糙面上。此时迅速用左手拇指和食指捏住小白鼠颈背部皮肤,并以小指与手掌尺侧夹持其尾根部,固定于手中。 单手法:小白鼠置于笼盖上,先用左手食指与拇指抓住鼠尾,手掌尺侧及小指夹住尾根部,然后用左手拇指与食指捏住颈部皮肤。 3、大白鼠大白鼠容易激怒咬人,捉持时左手应戴防护手套或用厚布盖住大鼠,先用右手抓住鼠尾,再用左手拇指和食指握住头部,其余手指与手掌握住背部和腹部。不要用力过大,切勿捏其颈部,以免窒息致死。 4、家兔用左手抓住颈背部皮肤(抓的面积越大,其吃重点越分散)。将兔提起,以左手托住其臀部,使兔呈坐位。 二、实验动物的给药途径与方法 1、小白鼠给药途径与方法 灌胃(ig):左手固定小鼠,右手持灌胃器,灌胃针头自口角进入口腔,紧贴上腭插入食道。如遇阻力,将灌胃针头抽回重插,以防损伤。 常用灌胃量为0.1~0.2ml/10g。 皮下注射(ih):可用腹部、背部、腹股沟的皮下,此处皮肤比较松弛,也可由助手协助。注药量一般为0.1~0.2ml/10g。 肌肉注射(im):一人抓住小鼠头部皮肤和尾巴,另一人持连4号针头的注射器,将针头

药理实验指导43252

药理实验指导 总论、链霉素毒性、肝脏在药物代谢中的作用 一、药理学实验课的目的和要求: (一)目的: (1)使学生掌握进行药理学实验的基本方法,了解获得药理学知识的科学途径 (2)验证药理学中的重要基本理论,更牢固地掌握药理学的基本概念。(3)培养对科学工作的严肃的态度、严格的要求、严密的工作方法和实事求是的作风,并初步具备客观地对事物进行观察、比较、分析、综合和解决问题的能力。 (二)要求: (1)实验前做好预习工作,结合实验内容,复习有关药理学、生理学和生物化学等方面的理论知识,并领会实验设计的原理。 (2)实验时认真操作,仔细观察,并做好实验记录。 (3)实验后整理实验结果,并进行分析思考,认真书写实验报告,并做好实验室的清洁卫生,关好水、电。 二、实验设计的基本原则 (1)重复性 (2)对照性 (3)随机性 三、药理学实验的一般方法和技术 (一)实验动物选择的原则和方法 1、首先要根据实验的目的选择实验动物 2、选用来源清楚、遗传背景明确的实验动物 3、选用容易获得、价格便宜、易于饲养与管理的实验动物 4、必须注意实验动物种类、品系的质量及健康状况是否良好 5、选用人畜共患疾病的实验物物和传统应用的实验动物 (二)实验动物的选择: 常用的实验动物有蛙、蟾蜍、小白鼠、大白鼠、豚鼠、家兔、猫、狗。常根据不同的实验目的和要求选用不同的实验动物,所选用的动物必须能较好地反映试验药物的选择性作用并符合节约的 原则。 蛙和蟾蜍:离体心肌,观察药物对心脏的作用。坐骨神经和腓肠肌,观察药物对周围神经肌肉或横纹肌的作用。 小白鼠: 1.小鼠属于脊椎动物门,哺乳纲,啮齿目,鼠科,小鼠属动物。 2.成熟早,繁殖力强。 3.体形小,易于饲养管理。 4.性情温顺, 胆小怕惊。 5.对外来刺激极为敏感。6.便于提供同胎和不同品 系动物。7.喜居于光线较暗的安静环境,习于昼伏夜动,喜欢啃咬。8.体小娇嫩,不耐饥饿,不耐冷热,对环境的适应性差。9. 成年雌鼠在动情周期不同阶段阴道粘膜可发生典型变化。适用于需要大量动物的实验,如药物筛选,半数致死量,药物效价。

药理学实验教程资料

药理学实验教程 (中、英文版) 主编 叶春玲 钟玲 暨暨南南大大学学药药学学院院药药理理教教研研室室 22000077年年55月月

药理学实验教程 目目 录录 第一篇 药理学实验基本知识 第一章 药理学实验须知 一、药理学实验课的目的和要求 二、实验结果的整理和实验报告的撰写 第二章 药理学实验设计的基本知识 一、实验设计的基本原则 二、药理实验设计中的剂量问题 三、药理实验设计中的预试问题 第三章 药理学实验的统计处理原则 一、计量资料的统计分析 二、计数资料的统计分析 三、药效和剂量依赖关系(相关性)的统计分析 四、两药药效的等效性分析 第四章 常用实验动物的基本操作 一、实验动物的选择及捉拿固定 二、实验动物的编号 三、实验动物的给药方法 四、实验动物的麻醉和取血 第五章 药理学实验常用仪器操作技术 BL-410生物机能实验系统 第六章 药物剂型与处方学 一、药物剂型 二、处方学 第二篇 药理学总论实验 第一章 药动学实验 实验一 磺胺类药物静脉给药后的药时曲线 实验二 磺胺类药物非血管内给药后的药时曲线 实验三 3P87 计算药物动力学参数

实验四磺胺类药物在体内的分布 实验五磺胺嘧啶的血浆蛋白结合率测定 实验六磺胺类药物在麻醉大鼠体内经胆汁和尿排泄的实验 第二章药效学总论实验 实验一不同给药途径对药物作用的影响 实验二肝功能状态对药物作用的影响 实验三量效关系曲线和有关药效学参数测定 第三章安全性试验 实验一药物急性半数致死量(LD50)的测定 实验二最大耐受量(MTD)测定 第三篇药理学各论实验 第一章传出神经系统药物实验 实验一药物对麻醉动物血压的影响 实验二药物对麻醉动物血流动力学的影响 实验三药物对离体兔主动脉环的作用 第二章中枢神经系统药物实验 实验一药物对小鼠自发活动的影响 实验二药物对益智作用的影响 实验三抗癫痫药和抗惊厥实验 实验四镇痛药实验 第三章心血管系统药物实验 实验一利多卡因对哇巴因诱发心律失常的拮抗作用 实验二强心苷对家兔在体衰竭心脏的作用 实验三药物对垂体后叶素所致的急性心肌缺血心电图变化的影响第四章内脏系统药物实验 实验一呋塞米对小鼠尿量及电解质的影响 实验二药物对组胺诱发豚鼠哮喘的作用 实验三药物对大鼠的利胆作用 第五章激素类及抗炎药物实验 实验一糖皮质激素对毛细血管通透性的影响

药理实验方法学重点

一.1.首过效应:口服给药后,药物在到达体循环之前,经肠道、肠壁和肝脏的代谢分解使进入生物体内的相对药量降低。2,判断方法:尾静脉给药AUC和门静脉给药AUC—比较判断肝首过—是—尾静脉》门静脉;门静脉给药和十二指肠给药AUC—比较判断肠首过—是—门静脉》十二指肠十二指肠和灌胃给药AUC—比较判断胃首过—是—十二指肠AUC》灌胃AUC 二.简述肾外包扎性高血压模型制备的基本原理和注意事项?答:原理:肾外异物包扎,可致肾周围炎,肾外形成一层纤维性鞘膜,压迫肾实质,造成肾组织缺血,使肾素形成增加,进而使血管紧张素含量增加,血压上升。属肾性高血压模型。注意事项:1)肾外包扎材料除自制双层孔胶薄膜和玻璃纸外,还可用绸布、乳胶、火棉胶等材料。肾外包扎应足够紧,但不能勒破组织。2) 如果要制造2肾1扎型,则一侧肾包扎后无需切除另一侧肾,术后3~6个月10%~20%动物形成高血压;如果要制造2肾2扎型,则一侧肾包扎后同法包扎另一侧肾,术后3~4周70%以上动物形成高血压。三、(一)佐剂性关节炎1.大鼠AA的制备:选用雄性Lewis、Wistar或SD大鼠,体重200g左右,将每鼠右后足趾皮内注射完全弗氏佐剂(CFA)0.1ml致炎。CFA是将卡介苗或死结合分枝杆菌加入已经高压灭菌的液体石蜡中,浓度为10mg/ml。原发病变主要表现为早起致炎局部的炎症反应,致炎后18h右后足的肿胀达峰值,持续3d后逐渐减轻,8d后再度肿胀;继发病变一般出现于致炎后10d左右,表现为对侧和前肢的肿胀,耳和尾部出现“关节炎”小结,变应性角膜翳以及体重下降等等。2.小鼠AA 的制备:选用雄性C57BL/6小鼠,8周龄,4%氟烷吸入麻醉,左侧胫-跗关节皮下两点皮下注射100ulCFA,CFA浓度为5ug/ul,对照组同方法注射液状石蜡。造模后22d处死。造模24h 内原发侧关节出现急性肿胀,第9天肿胀较严重。模型组穿格子数和活动度明显降低。造模后小鼠对于机械异常性疼痛和热痛出现明显退缩反应。(二)II型胶原诱导的关节炎 1.小鼠CIA的制备:将鸡或牛II型胶原(CII)溶解于0.01mol/L的醋酸后与同等容积的含有低浓度卡介苗的液体石蜡油(ALCB)充分乳化,CII和ALCB的计量均为4mg/mL.,乳化在冰浴中进行。在小鼠(18g左右)根部多点皮内注射乳化剂0.1ml,第21d在尾根部加强注射。加强注射后,由第三者检查关节炎的发生情况。2.大鼠CIA的制备:CII溶解于0.01mol/L 的醋酸中(CII终浓度为4mg/ml),充分研磨,4度过夜,讲CII溶液滴加至冷的不完全弗氏佐剂(IFA)中,等体积混合,充分乳化。大鼠(体重150g左右)尾根部和背部分多点皮内注射0.1mLCII乳化剂。7d后同法再坚强注射一次。对照组注射0.01mol/L醋酸和IFA的乳化液。从第20d后开始,用组织测量仪测定后足趾的容积。评价指标:足趾肿胀度、全身表现评分、关节肿胀数、关节炎指数、X线评分、关节炎病理评分。四、祛痰药的药理试验方法 1).呼吸道分泌液量测定法小鼠酚红实验法,基本原理:利用酚红小鼠腹腔注射后部分从气道排泄的特点,测定小鼠气道酚红排泄量,以判断受试药对气道通透性和分泌液量的影响.操作步骤:小鼠饥饿16-18h--注射酚红前30min受试药物灌胃--腹腔注射酚红药 物,30min 后处死--血凝后,分离气管、气管插管并与注射器相连--用5% NaHco3 0.8ml 洗气管,反复三次--合并洗液,放置,得透明红色上清液,用分光光度计波长545nm比色,根据酚红标准曲线计算出酚红量。注意事项:1.待小鼠体内血液凝固后,再切开颈部,以免血液中酚红影响。2.气道内注入NaHco3溶液后吸出时要轻轻进行,一旦用力过度,肺泡会破裂液体流入胸腔。2)呼吸道纤毛运动实验法---鸽纤毛运动实验法原理:利用气管纤毛运动带动颗粒物从气管内固定的向口腔方向的速度,测定药物祛痰药物,一般测运动2cm所需的时间.操作步骤:鸽气管分离,做2cm的标记---切开气管,将软木屑放在2cm向心端--记录2cm所需时间,观察给药前后0.5h的速度,正常是3-4min。注意事项:鸽气管暴露实验注意温度,等待时颈部用生理盐水湿润纱布防治干燥.3)豚鼠气道黏液黏蛋白的测定.原理:气道黏液主要由杯细胞和黏液性腺细胞产生和分泌,内含黏蛋白,为黏多糖和蛋白质。无机酸存在下,己糖醛酸从黏多糖中释放与咔唑起缩合反应,形成有色物,在530nm比色测定.操作:豚鼠麻醉处死,取气管称重----剪开气管用棉棒取黏液--水洗,离心,取上清液

中药药理与药理实验方法

中药实验遵循原则:以中医理论为指导,按中药新制剂功能与主治的现代医学概念,选择药理试验方法中药新药的药理毒理研究:包括主要药效学、一般药理学、药代动力学及毒理学研究 主要药效1观察指标(1)择特异性强、(2)敏感性高、(3)重现性好、(4)客观、(5)定量或半定量 2给药剂量及途径 1.各种试验至少应设3个剂量组<高,中,底>,2对照组;正常动物空白对照组、模型动物对照组、阳性药物对照组 一般药理研究(一)神经系统(二)心血管系统(三)呼吸系统 毒理研究一急性毒性试验1,最大给药量试验2,LD50测定:二长期毒性试验1动物;啮齿类(大鼠,每组20~40只,最长6个月),,非啮齿类(狗,猴..每组至少6只,,不超过9个月)2.剂量:一般应设三个剂量组+空白(对照组) 治疗胸痹心痛证中药的药效学试验 1.药理作用:(1)扩张冠状动脉,增加心肌营养性血流量及抗心肌缺血性损伤。(2)降低心肌耗氧量和改善心肌代谢。3)影响血流动力学,降低心脏负担。 2.心肌缺血动物模型(1)脑垂体后叶素所致心肌缺血模型:(2)结扎(犬、猪)左冠状动脉降支(LAD)造成急性心肌缺血模型。 3,观测指标:心电图缺血性改变 治疗厥脱证中药的药效学试验 1七个休克类型:失血性休克(狗、猫).中毒性休克、心源性休克(结扎冠状动脉前降支根部.猫“脉微欲绝模型”。)、、过敏性休克(小鼠)、神经性休克。创伤性休克,..闭性休克 2 观察指标,,,血压高低,,动物死亡率 治疗高血压病中药的药效学试验 动物模型自发性高血压大鼠(SHR)、肾动脉狭窄型高血压、DOCA(去氧皮质酮)盐型高血压、 治疗中风病中药的药效学试验 I.治疗脑出血中药的药效学试验 1.降低颅内压试验,橄榄油导致的家兔脑水肿模型 2.治疗脑出血试验,(1)SHR/SP自发性大鼠脑出血模型:(2)胶原酶诱发大鼠脑出血模型:(3)动物脑血肿模型 Ⅱ治疗脑缺血中药的药效学试验 (1)四脑动脉阻断致全脑缺血模型:(2)三脑动脉阻断致全脑缺血模型:(3)阻断双侧颈总动脉合并放血致全脑缺血模型:(4)小鼠断头缺血法:(5)局灶性脑缺血(阻断大脑中动脉)模型: 治疗慢性支气管炎中药的药效学试验 主要药理作用:镇咳、祛痰、平喘、抑菌,抗病毒、抗炎,解热及增强机体免疫功能等。 1.镇咳作用试验:(1)化学刺激致咳法:如小鼠氨水喷雾引咳法、小鼠二氧化硫引咳法。(2)电刺激引咳法:猫狗电刺激喉上神经引咳法 2.祛痰作用试验(1)气管内酚红排泌量法、(2)大鼠气管排痰量法(毛细玻管法)。 3.平喘作用试验(1)整体动物平喘试验:用豚鼠(2)离体气管试验:用豚鼠 治疗痛经中药的药效学试验 1.对痛经动物模型:(1)大鼠痛经模型:(2)小鼠痛经模型:雌性小鼠。催产素.观察扭体反应次数。(3)MPGF2α致大鼠离体子宫痉挛模型: 2.对子宫影响的试验:(1)离体子宫试验;(2)在体子宫试验。 3.镇痛试验; 4.抗炎试验; 5.大鼠子宫微循环试验。 治疗脾虚证中药的药效学试验 一.消化、吸收及运动机能试验: (1)胃液分泌试验:(2)肠道葡萄糖吸收试验(3)碳末胃肠推进运动试验: 观察指标;耐寒机能试验,抗寒冷实验;耐缺氧实验;抗疲劳试验 常用药物;大黄,玄明粉,番泻叶,甘兰,猪油治疗消化性溃疡中药的药效学试验 1.急性胃溃疡动物模型(1)水浸应激性胃溃疡模型 (2)幽门结扎性胃溃疡模型:(3)利血平性胃溃疡模型:(4)消炎痛致溃疡模型:(5)盐酸性胃溃疡模型:(6)胃粘膜损伤模型:(7)阿司匹林致胃溃疡模型:2.慢性胃溃疡动物模型(1)乙酸灼烧型胃溃疡模型:(2)乙酸注射法致胃溃疡模型:(3)乙醇所致胃粘膜损伤模型: 观察指标;出血点,出血面积, 治疗水肿(急性肾炎)中药的药效学试验 观察指标:(1)蛋白尿;(2)血尿素氮、肌酐;(3) 肾脏病理形态。 治疗肾功能衰竭中药的药效学试验 1.急性肾功能衰竭动物模型的造型方法:(1)甘油所致ARF(急性肾功能衰竭)模型:(2)庆大霉素所致ARF模型: 2.慢性肾功能衰竭(CRF)动物模型的造型方法(1)肾脏大部分切除法致大鼠慢性肾衰模型(4)冷冻引起的大鼠慢性肾衰(CRF)模型:(5)电灼引起的大鼠慢性肾衰(CRF)模型: 3观察指标:血尿素氮、肌酐; 治疗骨折中药的药效学试验 1.建立骨折动物模型,观察指标:(1)X-线检查,(2)抗折强度检查。(3)组织学和组织化学检查,(4)3H-TdR放射自显影检查, 2.鸡胚股骨的培养试验:观察指标:(1)股骨的长度(mm),计算增长值及重量。 治疗痹证中药的药效学试验 (1)大鼠佐剂性多发性关节炎模型:给药时间及观察指标: ①观察药物对原发病变的影响:②观察药物对继发性病变的预防作用:③观察药物对继发病变的治疗作用: 治疗消渴证(糖尿病)中药的药效学试验 2.糖尿病动物模型的降血糖试验(1)四氧嘧啶诱发的高血糖动物模型:(2)链脲霉素诱发的高血糖动物模型:(3)链佐霉素诱发大鼠高血糖模型:(4)肾上腺素性高血糖动物模型:(5)氨基葡萄糖性高血糖动物模型:6)胰腺次全切除法致大鼠高血糖模型7遗传性自发性高血糖模型 常用实验动物的特点及其主要用途 小鼠:小鼠是实验室最常用的。小鼠适合用于需要用大量动物的试验。 大鼠:药物的长期毒性试验;大鼠无胆囊,利胆作用;降压药及检测升压物质;发热病理模型;踝关节肿模型。 豚鼠:研究平喘药和抗组织胺药;抗过敏反应药物;地鼠:肿瘤学研究;中国地鼠的真性糖尿病。 家兔:高脂血症;动脉粥样硬化症;角膜炎症模型及角膜瘢痕模型;解热药物和检查热原。 猫:血压稳定,研究降压药;研究镇咳物。 狗:高血压的实验治疗;药物长期毒性;失血性休克;急性心肌梗塞、狗和猫都是研究降压药物较理想的动物。 青蛙和蟾蜍:研究药物对心脏的作用;腓肠肌和坐骨神经可用来观察药物作用。 猴:研究避孕药;镇痛药的依赖性及戒断症状。 树鼬:现已用于化学致癌、乙型肝炎病毒感染。猪:烧伤和烫伤;研究降血糖药物。 鸡、鸽、鹌鹑:动脉粥样硬化模型;鸽和猫是检测强心甙作用强度;鹌鹑作高脂血症造型。

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