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硕 士 学 位 论 文
茄子黄萎病内生生防细菌筛选及其抗菌
物质的初步研究
作 者： 乔勇升 生命科学学院 陈双林 教授 院 系： 指导教师： 学科专业：
微生物学
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4、本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。
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作者签名：
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作者签名： 日 期：
目录
摘要........................................................................................................................I Abstract........................................................................................................................III 前言.. (1)
1 茄子黄萎病 (1)
1 茄子黄萎病病原菌 (1)
2 发生规律 (3)
3 致病机理 (4)
4 防治方法 (4)
2 植物内生细菌 (5)
1 植物内生菌 (5)
2 植物内生细菌的来源 (7)
3 内生细菌的生物学作用 (7)
4 内生细菌防治植物病害发生的机制 (9)
第一章、茄子内生细菌的分离与筛选 (12)
1 材料和方法 (12)
2 结果与分析 (14)
2.1 内生细菌的分离结果 (14)
2.2 内生细菌对大丽轮枝菌的拮抗力测定结果 (14)
2.3 内生细菌发酵液拮抗病原真菌能力测定结果 (16)
2.4 生长速率测定结果 (16)
3 讨论 (16)
第二章、内生细菌的防病、促生以及内生定殖研究 (19)
1 材料与方法 (19)
2 结果与分析 (21)
2.1 内生细菌对茄子黄萎病的防治效果 (21)
2.2 内生细菌对茄子的促生长作用效果 (22)
2.3 菌株29-12和22-5的内生定殖结果 (24)
3 讨论 (24)
第三章、茄子内生拮抗细菌菌株29-12的鉴定 (27)
1 材料与方法 (27)
2 结果与分析 (28)
2.1 菌种形态、生理生化鉴定结果 (28)
2.2 16S rDNA 鉴定结果 (30)
3 讨论 (33)
第四章、菌株29-12抗菌物质性质初探及分离纯化 (35)
第一节抗菌物质性质初探 (35)
1.1 材料与方法 (35)
1.2 结果与分析 (37)
1.2.1 不同培养基对菌株产生抗菌物质的影响测定结果 (37)
1.2.2 培养时间对菌株产生抗菌物质的影响测定结果 (38)
1.2.3 (NH4)2S04分级盐析结果 (39)
1.2.4 抗菌物质热稳定性测定结果 (39)
1.2.5 抗菌物质pH稳定性测定结果 (40)
1.2.6 抗菌物质酶解稳定性测定结果 (40)
1.2.7 抗菌物质抑菌谱测定结果 (41)
1.2.8 抗菌物质对大丽轮枝菌孢子萌发及菌丝生长的影响 (42)
1.3 讨论 (42)
第二节抗菌物质的分离纯化 (44)
2.1 材料和方法 (44)
2.2 结果与分析 (45)
2.2.1 凝胶过滤层析脱盐结果 (45)
2.2.2 阴离子交换层析结果 (46)
2.2.3 疏水反应层析结果 (46)
2.2.4 SDS-PAGE检测结果 (47)
2.2.5 反相层析结果 (47)
2.2.6 抗菌物质吸光值测定结果 (47)
2.2.7 氨基酸组成分析结果 (47)
2.3 讨论 (49)
结论与讨论 (52)
参考文献 (55)
致谢 (61)
摘 要
植物内生菌是近十余年来广泛受到重视的一类重要微生物资源，在长期的进化过程中它们与宿主植物形成了协调的共生关系，能够平衡植物感染的微生物种群；另一方面，认为它们能够产生与宿主植物相同的生物活性物质，因此可以用于包括生物农药在内的药物研发，这就使得植物内生菌成为人们探索进行植物生物防治的新资源。茄子黄萎病是一种土传维管束病害，是茄子的三大病害之一，在我国南北各地均危害严重，目前还没有有效的防治方法，利用内生细菌进行生物防治是防治土传维管束病害的有效途径之一。为了获取用于茄子黄萎病有效的生物防治的内生细菌资源，探索其抗菌机制而开展了本研究。
从不同地点、不同品种的茄子样品中分离内生细菌，共获得内生细菌409株。通过室内抑菌实验进行了菌种初筛，结果显示，有55株菌株对茄子黄萎病菌--大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)有抑菌活性的，占菌株总数的13.45%，其中具有强抑菌活性的（抑菌圈≥12mm）11株，占菌株总数的2.69%。对有强抑菌活性的菌株进一步进行生长速率测定，有6株菌株(18-21、22-5、22-18、22-33、29-12和29-19)对大丽轮枝菌抑制率达到或超过50%。
对上述6株菌株进行室外盆栽防病、促生长研究。实验结果显示，29-12、18-21和22-5三株菌株对茄子黄萎病有较好的防治效果，最好的一株菌株29-12在接种后14-22d内的防治效果能达到80-100%。6株菌株对茄子苗都有不同程度的促生长作用。
选取在防病促生长研究中效果突出的2株菌株29-12和22-5进行内生定殖研究。结果表明用茎部针刺的方法，菌株29-12可以在茄子体内定殖七天以上，菌株22-5可以定殖五天。
对菌株29-12进行细菌鉴定。菌种形态、生理生化鉴定送中国科学院微生物所进行检测鉴定，结果为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。分子(16S rDNA)鉴定结果认为菌株29-12为芽孢杆菌属内成员，与枯草芽孢杆菌有很近的亲缘关系。综合两个鉴定结果认为菌株29-12为枯草芽孢杆菌。
为了探索菌株29-12对大丽轮枝菌的抑菌机制，本研究对其产生的次生代谢物进行了分析，结果表明其培养液具有抑菌活性。该菌株在酵母提取物＋牛肉浸膏培养基中30℃培养84h左右产生的抗菌物质最多，并且抗菌物质可以被
硫酸铵沉淀。经硫酸铵沉淀后得到的抗菌物质粗提物对热较稳定，121℃处理30min仍能保持65%的活性；在pH值6-9时活性稳定，pH值小于4时没有活性；对蛋白酶K和胰蛋白酶都不敏感；该抗菌物质粗提物有广泛的抑菌谱；显微观察表明该抗菌物质粗提物可以使大丽轮枝菌孢子不能正常萌发，菌丝细胞异常膨大，破裂，细胞质外泄。
对抗菌物质的性质有了初步了解后，本研究又对其做了一些分离纯化工作，通过凝胶除盐，离子交换层析及疏水反应层析获得一个有活性的组分，SDS-PAGE显示其已达到电泳纯，分子量在10KD以下，反相色谱显示其尚未达到色谱纯。此组分在280nm处有最高吸收峰，确定抗菌物质可能为蛋白质或多肽。对此组分进行氨基酸组分分析，抗菌蛋白（多肽）富含谷氨酸和酪氨酸。关键词：茄子黄萎病内生细菌枯草芽孢杆菌防病促生定殖
Abstract
Endophyte is a kind of important microorganism resource received widely attention more than ten years. Endophyte has formed the mutualistic symbiosis with their host plant and balanced the microorganism population infecting host plant in the long-term evolution process. On the other hand, it could produce biological activity substance similar to their host plant. Therefore endophyte may have potential application value in biocontrol. The Verticillium wilt is one of the most important diseases of eggplant. It harms their host plant seriously in the north and south of China. At present, there is no effective solution to control eggplant Verticillium wilt. In order to gain some endophytic bacteria having remarkable control effect against the Verticillium wilt and explore their antimicrobial mechanism, we carry out this research.
409 endophytic bacteria were isolated from different eggplants varieties collected from different places，and 55 isolates were provided with in vitro inhibitory activity against Verticillium dahliae，thereinto 11 isolates were provided with stronger inhibitory activity (inhibitory zone above 12mm). The hyphae growth inhibits test showed that the inhibitory rate of 6 strains(18-21、22-5、22-18、22-33、29-12 and 29-19) against Verticillium dahliae was above 50%.
The Verticillium wilt of eggplant was found effective controlled by strain 29-12, 22-18 and 22-5. The control effect of strain 29-12 against the Verticillium wilt could reach to 80-100% in the 14-22d after inoculation. All of six strains could significantly promote the growth of eggplant separately compare to the water control.
In order to prove that bacteria isolated from eggplants could colonize in plants, two strains (29-12, 22-5) was test. The two strains tagged by the resistance to rifampicin were inoculated by needle penetrating and watering roots separately. The results showed that the strain 29-12 was able to colonize in eggplant more than 7d, and the strain 22-5 could colonize about 5d.
The Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences (IMCAS) identified strain 29-12 to be Bacillus subtilis by its cell morphological，physiological and biochemical character, and the 16S rDNA gene sequence analysis showed that strain 29-12 belong to Bacillus spp. Combining the two results, the strain 29-12 is identified to be Bacillus subtilis.
In order to explore the antimicrobial mechanism of strain 29-12 against Verticillium dahliae, the secondary metabolites of the strain was studied. The culture supernatant showed antimicrobial activity against Verticillium dahliae, and it could be precipitated by solid ammonium sulfate. The studies on the cultural conditions of strain 29-12 producing antimicrobial compound showed that the optimum cultural conditions for producing antimicrobial compound were in yeast and beef extract medium, at 30℃ for 84 hours. The antifungal compound was insensitive to heat, resistant to trypsin, proteinase K, its active pH range from 6 to 9. Microscopy studies revealed that the antimicrobial compound caused severe alterations in cell morphogenesis of Verticillium dahliae that gave rise to large swollen hyphae and the conidia germinated abnormally or could not germinate at all.
The antimicrobial compound produced by strain 29-12 was isolated and purified by SephadexG-25、Cellulose DEAE-52 and Phenyl Sepharose 6 Fast Flow column chromatography. The purified compound was demonstrated to be a single protein band by SDS-PAGE with a molecular weight below 10KD. The absorbency of the antimicrobial compound was the highest when measured on the 280nm wavelength; it was maybe protein or peptide. The amino acid analysis of the antimicrobial compound showed that it comprised of 15 kinds of amino acids including abundant Glu and Tyr.
Key word: The Verticillium wilt of eggplant, Endophytic Bacteria, Bacillus subtilis, Biological Control, Promoting plant growth, Colonization.
前 言
1 茄子黄萎病
茄子黄萎病又叫半边疯、黑心病，是一种土传维管束病害，为茄子的三大病害之首（黄萎病，绵疫病，褐纹病）。它发病快、面广、危害严重。在美国，茄子黄萎病曾使感病品种Florida Market减产62%~85%，耐病品种R4减产34.1%~42.5%[1]；欧洲、日本曾大面积发生茄子黄萎病，造成严重的损失[2]；在我国主要分布在黑龙江、吉林、辽宁、河南、河北、山东等省。哈尔滨、长春等市郊一般发病在50%以上，减产20%以上，重病田发病率90%以上，减产40%[3]。
茄子黄萎病在栽培条件差，茄科蔬菜专业化基地等地方发病率高，危害重。1954年前，茄子黄萎病仅在东北局部地区发生，近年随着茄果蔬菜面积扩大迅速蔓延，严重威胁茄子与其他作物生产，引起重大经济损失。
1 茄子黄萎病病原菌
黄萎病病原菌属半知菌亚门(Deutermycotina)淡色菌科(Mmonilaceae)轮枝菌属(Verticillium)[5]。轮枝菌属包含若干个“种”：黑白轮枝菌(Verticillium albo-atrum)、大丽轮枝菌(V.dahliae)、三体轮枝菌(V.tricorpus)、变黑轮枝菌(V.nigrescens)、云状轮枝菌(V.nubilium)和赖卡尼轮枝菌(V.lecanii)等。其中黑白轮枝菌、大丽轮枝菌是引起世界范围内寄主植物产生黄萎病害的两个常见种；三体轮枝菌、变黑轮枝菌和云状轮枝菌是较次要的致萎菌种，它们也经常以土壤腐生性菌的形式存在；赖卡尼轮枝菌是一种通过昆虫传导的致病菌[6]。
1.1 病原菌形态学鉴定
Smith (1965) 通过显微观察发现，黑白轮枝菌、大丽轮枝菌以及三体轮枝菌各自具有独特的形态学特征。（1）黑白轮枝菌：分生孢子梗较粗，并有一个黑色膨大的基部；分生孢子较大，通常为3.5~8×2~3μm；菌丝偶而有分隔，胞壁增厚的膨大黑色菌丝形成“菌丝结”，但没有微菌核。该菌能在较低温度范围内生长并具有致病力，寄主范围较窄；在20℃温度下对许多寄主较之大丽轮枝菌具有更大的致病力。（2）大丽轮枝菌：分生孢子梗较细、数量较少、完全透明；分生孢子较小，通常为3~6×1.5~2μm；富含黑色的微菌核。该菌能在较高
温度的培养基上生长并具有毒力；寄主范围广，但在许多寄主上的致病力不如黑白轮枝菌。（3）三体轮枝菌：分生孢子梗透明、具有淡黄褐色的基部；分生孢子大，大都在6~15×2.5~4μm；菌丝体胞壁增厚、黑色球状，有微菌核。该菌好高温，通常致病力弱[7]。
Robb等 (1993) 以PDA为培养基，在30℃的温度条件下观察不同黄萎病菌菌种的形态生长特征。以培养基上生长菌落的直径来判断，其中生长最好的是大丽轮枝菌，其次是变黑轮枝菌，再次是三体轮枝菌，而生长最差的是黑白轮枝菌[8]。
王立新等 (1982-1984)，从江苏、山东、辽宁、河北及内蒙古等省（区）的茄子、蚕豆、向日葵、辣根、胡核揪等16种植物的黄萎病病株上分离得到轮枝孢属(Vertlcillum)真菌的30个菌株，根据其形态特征、培养状况等鉴定认为全部为大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)[9]。张绪振等曾研究采自河北、河南、陕西、辽宁、江苏、云南、四川、新疆等8个省（区）棉花黄萎菌的23个单孢菌系，经过对菌落及休眠结构的观察和温度试验。结果表明，全部的菌种都能产生微菌核；在培养温度为30℃的PDA培养基上，所有的菌种均生长，没有发现分生孢子梗基部变黑的菌系，也没有发现不产生微菌核的黑色菌丝型。该研究显示，我国主要棉区的黄萎病菌均属大丽轮枝菌[10]。大丽轮枝菌作为我国棉区最主要的黄萎菌种，已得到越来越多实验的证实。但是，不同大丽轮枝菌系，它们在PDA培养基上产生的微菌核在形态、大小、数量、形成快慢及不同温度下生长速度和对寄主致病力等方面存在一定差异。这种差异乃是对同一菌“种”进行进一步生理小种（或亚种）分型的形态学基础。
1.2 病原菌免疫鉴定
Nachmias等 (1982) 通过对大丽轮枝菌培养产生的一种蛋白质脂多糖(PLP) 复合体进行纯化，获得一种胞外致病抗原。这种以PLP作为抗原产生的抗体不同于以菌丝体作为抗原产生的抗体，它具有较高的特异性，不会与其他黄萎病菌比如三体轮枝菌、变黑轮枝菌、云状轮枝菌等产生抗体抗原反应；而以菌丝体作为抗原产生的抗体往往会产生交叉免疫反应[11]。1985年，Nachmias 等进一步局部纯化PLP，获得一种低分子量(<3000)的毒性多肽片段。这种低分子量的多肽片段较之高分子量的毒素蛋白PLP具有类同的寄主特异性和抗原
性。免疫扩散和免疫荧光分析显示，这种低分子量的毒性多肽片段可用于番茄品种对黄萎病菌抵抗能力的检测；而且这种低分子量毒素比PLP具有更高的诊断可靠性，因为它没有象PLP产生的非特异免疫敏感性[12]。Sundaram等(1992)提出用酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immuno-sorbent assay, ELISA)检测黄萎病菌，以进一步提高免疫测定的灵敏度。ELISA法的灵敏度可高达
0.001μg/ml[13]。
1.3 宿主范围
黄萎病病原菌不仅地区分布广，且寄主范围也较广泛。据资料记载[4]，1934年Rudolph列举了大约120种寄主植物；1957年Engelhand报道为350种；目前已增加到660种寄主植物，其中包括十字花科23个种，蔷薇科54个种，豆科54个种，茄科37个种，唇形花科23个种和菊科94个种。其中农作物为84种，占28%；观赏植物323种，占49%；杂草植物为153种，占23%。茄子黄萎病一般发病率为10%~20%，重病区达80%以上；除了危害茄子以外，也为害辣椒，有些地方的番茄也有发生。
2 发生规律
2.1 侵染循环
黄萎病病菌以休眠菌丝、厚垣孢子和拟菌核随病株残体落入土壤越冬。病菌甚至可以在土壤中存活6-8年的时间。拟菌核状态下的病菌甚至可存活10年以上。有侵染条件时，第二年从根部的伤口处或从幼根的薄嫩处直接侵入寄主，通过皮层逐渐侵入维管束的导管，在导管中大量繁殖后，随水分的传输而到达植株的各器官。叶柄、叶脉、叶肉带菌率分别为20%、13.3%和6.6%，这是主要的侵染途径。另外，病菌也能以菌丝体或分生孢子状态在种子内外进行越冬，下一季随种子的发芽而侵入幼株，成为另一个初侵染源。种子带菌将导致病原的远距离扩散。田间再侵染的途径主要是风吹、雨溅、流水和田间活动。
2.2 发病条件
黄萎病的适宜发病温度为25-28℃，高于30℃或低于22℃发病缓慢，高于35℃出现隐症。在温度适宜范围内，湿度、雨日、雨量是决定该病消长的重要因素。地温高、日照时数多、雨日天数少发病轻，反之则发病重。在田间温度适宜，雨水多且均匀，月降雨量大于100mm，雨日12天左右，相对湿度80%
以上时发病重。地势低洼、粘重、土壤易板结的地块发病重；土壤中含有机质多，通水通气条件好时发病轻。茄科蔬菜连作，有利于病原菌的积累，造成发病逐年加重。
3 致病机理
茄子黄萎病致病力机理与棉花黄萎病相似，目前有很多解释，堵塞学说和毒素学说讨论得最多。
堵塞学说： Bell(1984)阐述棉花黄萎病致病机理时指出，感染黄萎病的棉株的木质部导管由于凝胶体、树胶和侵填体的结合而造成的堵塞，导管迅速堵塞似乎是抗性反应奏效的初步表现。然而，当堵塞发生太迟以致不能阻止病菌在寄主体内的再次定殖时，堵塞就会成为棉株缺水和病症出现的主导原因[4]。
毒素学说： 1952-1968年Porter等认为，轮枝菌培养液的毒素可能与多糖复合体有关。Mussell(1972)认为，棉花黄萎病菌所产生的毒素为有毒的蛋白质。1985-1987年，吕金殿等用以凝集素伴刀豆球蛋白 (con A) 作配基的Sepharose 4B 亲和层析纯化了毒素物质并分析证明这种毒素物质是一种酸性糖蛋白，其中蛋白质与糖的含量分别为85.26%和14.74%。纯化的毒素糖蛋白具有对棉苗强烈的致萎作用。并且发现，强致病力菌系糖蛋白毒素的致萎活力明显高于弱致病力菌系。从而认为，病菌致病力不仅与糖蛋白毒素的含量有关，而且也与糖蛋白毒素的化学组成差异有关[14]。
4 防治方法
4.1选育抗病品种
选育抗病品种是防治植物病害的重要措施。茄子抗黄萎病育种起步较晚，研究的深度和广度均不及番茄、辣椒、黄瓜、甘蓝等蔬菜[15]。日本抗病育种历史相对较长，60年代就己开展抗黄萎病育种，70年代育成了耐病杂交种VF茄（长冈交配），有四平血统，对黄萎病抗性很强，产量高，但农艺性状不好，主要作砧木用[16]； Gari A.(1988) 利用PEG诱导进行S.melongena×S.tervum种间体细胞杂交，获得了10株四倍体F1植株，它们均抗黄萎病，但其花粉可育度仅为5-70%，亦不能用于生产 [17]。肖蕴华等(1998)人工接种鉴定了国家种质资源库库存的1013份材料，从中筛选到4份中抗品种[18]。但对筛选所得材料均未见有进一步利用的报道。国内在棉花抗黄萎病育种上研究比较深入，茄子抗黄萎病育
种尚处于起步阶段，在已育成的品种中，王立新等报道，江苏省农科院蔬菜所育成的苏长茄对强致病力Ⅰ型菌株表现较强抗性，具有应用前景[19]。
4.2 采用嫁接技术
采用嫁接技术，将栽培的蔬菜嫁接到抗病性极强的砧木上是减轻土传性病害的有效措施。1998年，任羽中以及牛柏忠分别进行嫁接试验，各自筛选出日本野生红赤茄和野生茄子托鲁巴姆作为抗病的优良砧木[20, 21]。
4.3 药剂防治
在缺乏抗病品种且发病重的情况下，采用适当的药剂防治是目前控制茄子黄萎病的主要措施。可用多菌灵配合托布津灌根，有一定的防治效果[22]。
4.4生物防治
植物病害生物防治的科学记载是从Sanford(1926)报道土壤中某些拮抗性微生物对于土传病原菌的抑制性开始的[23]。由于化学防治所产生的农药残留、病虫害抗性、环境污染等问题，生物防治已成为植物病害防治的主要发展方向之一。在国内对茄子黄萎病的生物防治方面，朱建兰等(1998)从病田土壤中筛选出一株在平板上对大丽轮枝菌有抑制作用的拮抗细菌B1，其发酵液对大丽轮枝菌的拮抗活性也很强[24]，但随后并未见用于植株防治茄子黄萎病。本研究根据茄子黄萎病是一种土传病害，其病原菌以其休眠体—微菌核在田间长期存活，并从植物的根部侵染后在植株维管束中定殖、为害等特征，试图从植物内生细菌的角度开展生物防治的研究工作。
2 植物内生细菌
1 植物内生菌
虽然早在100多年前人们就已发现在健康植物组织的内部也有微生物存在，这类微生物在文献中后来被称为植物内生菌(endophyte)，但由于内生菌生活在没有外在感染症状的健康植物组织内部，其存在和作用长期以来一直为人们所忽视。自20世纪30年代发现造成畜牧业重大损失的牲畜中毒是由于食用了感染内生真菌的牧草，内生菌的研究才得以广泛深入地开展起来[25]。
1.1 概念
“endophyte”一词最早主要是指内生植物，后来被用来特指禾本科牧草中
那些属于麦角菌科(Clavicipitaceae)的不引起症状、系统发生、种子携带的内生真菌，以同严格附生的病原真菌种类相区别[26]。随着人们对植物内生菌研究的深入，对其的定义也有所扩展，Stone (2000) 提出了一个比较宽泛实用的概念，植物内生菌是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌或细菌，被感染的宿主植物（至少是暂时）不表现出外在病症，可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接扩增出微生物DNA的方法来证明其内生[27]。即我们可把植物内生菌理解为植物组织内的正常菌群，它们不仅包括了互惠共利的(mutualistic)和中性的(neutral)内共生微生物，也包括了那些潜伏在宿主体内的病原微生物[26]。由于采用至少两种方法证明内生菌的存在，所以内生菌不仅包括可培养内生菌，还包括非可培养内生菌。从这些方面看植物内生菌显然不是一个分类学单位，而是一个生态学概念。
1.2 分布及多样性
内生菌包括内生真菌和内生细菌，它们普遍存在于目前已研究过的各种陆生及水生植物中。最早的认识主要来自禾本科植物如牧草中系统发生的(systemic internal colonized)内生真菌。目前全世界至少已在80个属290多种禾本科植物中发现有内生真菌。近年来在甘蔗、玉米、水稻等禾本科农作物中还发现多种能固氮的内生细菌，已引起学术界的高度关注[28]。自20世纪70年代后期，内生真菌在一些重要的经济林木如针叶类的各种冷杉、云杉、红杉、紫杉、松柏等以及阔叶的栎树、桦树、桤木、桉树等植物树皮、枝叶内相继被发现并得到了广泛的研究。进而在多种灌木、草本植物以及栽培作物、果树甚至藻类、苔藓和蕨类植物中也发现了内生真菌和（或）内生细菌[28]。
大多数内生真菌都属于子囊菌类(Ascomycetes)，包括核菌纲(Pyrenomyetes)、盘菌纲(Discomyetes)和腔菌纲(Loculoascomyetes)的许多种类以及它们的一些衍生菌。内生真菌的宿主植物涉及藻类、针叶树、灌木和草本等多个类群，但禾本科植物尤为常见，现已在80多个属的几百种禾本科植物中发现有与之共生的内生真菌。内生真菌分布于叶鞘、种子、花、茎、叶片和根等的细胞间，其中叶鞘和种子中菌丝含量最多，而叶片和根中含量极微。内生真菌主要通过两种形式传播：一种是不产生孢子，而是在植物开花期间，通过菌丝生长进入植物
的胚珠，经宿主的种子传播，内生真菌通过这种无性方式由植物的母代传到子代，并不发生植物间的交叉感染；另一种是产生孢子，通过风、降水等途径传播[29]。
内生细菌也具有相似的生物多样性。目前在各种农作物及果树等经济作物中发现的内生细菌已超过129种（隶属于54个属）。这些内生细菌大多为土壤微生物种类，其中假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、肠杆菌属(Enterobacter)以及土壤杆菌属(Agrobacterium)为最常见的属[28]。
2 植物内生细菌的来源
有关内生细菌的来源有两种假说，一种是Mundt的观点，他分离了27种不同植物种子和胚珠中的内生细菌，这些内生细菌涉及19个属46个种，其中8个属，31个种分离频率很高，并认为它们来源于植物的表面；另一种假说是内生细菌来源于根际，并从此进入植物组织内部。对棉花和甜玉米的内生细菌调查也发现两种植物根部和茎部栖息着许多相同分类单位的细菌，而且根中的细菌数量大于茎中。大部分分类单位与土壤中常见的细菌相同，进一步证明这些内生细菌起源于根际，并由此进入植物组织内[30]。前面所讲的从许多种植物中发现的内生细菌大多为土壤微生物种类，也说明了内生细菌的来源与土壤微生物之间紧密的联系。
3 内生细菌的生物学作用
尽管内生细菌在植物体中的生物量似乎微不足道，但现有研究认为内生细菌可通过自身的代谢产物或借助于信号传导作用对植物体施加影响。已发现内生细菌对宿主植物至少有以下几个方面的有益作用：固氮作用、促进植物生长作用、对植物的保护作用。
3.1 固氮作用
固氮作用是人们对内生细菌十分感兴趣的原因之一。1988年从甘蔗的根茎中分离到内生固氮醋酸杆菌(Acetobacter diazotrophicus)以来，人们在水稻根的皮层和维管组织中发现许多根际固氮菌都可以进人根内，起到联合固氮作用。如粪产碱菌(A. faecalis)[31]、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)，阴沟肠杆菌(E.cloacae)[32]、固氮螺菌(Azospirillum)[33]等。在其它作物如玉米、高粱、水稻、牧草等植株体内分离到内生固氮菌草螺菌(Herbaspirillum spp.)[34]，从巴基斯坦
生长在盐碱地的一种草中分离到固氮弧菌(Azoarcus spp.)[35]。人们在研究这些内生固氮菌时发现某些菌类能提供植物高达80%的氮量。
3.2 促进植物生长作用
与植物根际促生细菌(PGPR)一样，植物内生细菌也对植物生长有促进作用。上述内生细菌的固氮作用就是其帮助植物吸收营养，促进植物生长的一个证据。还有研究表明，有些植物内生细菌能产生植物促生物质，如植物激素等。在这方面研究最多的是吲哚乙酸(IAA) ，假单胞菌属、芽孢杆菌属等都能产生分泌吲哚乙酸或赤霉素，草生欧文氏菌(Erwinia herbicola) 不仅能产生吲哚乙酸，而且还能产生细胞分裂素，这些物质都能有效地促进植物的生长 [36]。从墨西哥分离的18株重氮营养醋杆菌[37]都有产生生长素的能力，氮营养醋杆菌在与植物相互作用过程中不仅能固氮，而且还可以通过生长素的调节作用影响植物的代谢，促进植物生长。
3.3 对植物的保护作用
对植物病虫害的防治目前主要还是采用化学药剂喷施，这不仅破坏了周围的生态环境，而且还对人们的食品安全造成了极大的威胁。大量的研究表明，生物防治可能是最有潜力的防治措施，目前己从植物体表和土壤中分离筛选到大量的植物病虫害生防菌，有的已开发成商品上市。植物内生细菌对植物也有很好的保护作用，目前关于植物内生细菌防治植物病害的研究报道比较多，防治植物虫害的研究报道大多关于内生细菌作为外源杀虫基因的载体来防治植物虫害。
3.3.1 防治植物真菌性病害
Chen等 (1995) 从棉花中分离了170株内生细菌，经测定，发现有6株菌可明显减轻由尖孢镰孢萎蔫专化型引起的棉花维管束枯萎病的症状，49株菌对棉花立枯病有防治效果，25株菌对棉花炭疽病具有诱导抗性作用 [38]。Brooks 等 (1994) 报道，从橡树中分离的889株内生细菌中，有183株对栎枯萎病菌(Ceratocystis fugacearum) 有拮抗作用，用内生细菌Pseudomonas denitrificans预先接种，室内测定病害减轻率达50%[39]。夏正俊等(1996)从棉花组织内分离到294株细菌，6.8%的菌株对棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)有较强的拮抗作用，其中73a菌株对病害表现出67.21%诱导抗性作用[40]。
3.3.2防治植物细菌性病害
Van Buren等 (1993) 从马铃薯茎组织中分离到的192株内生细菌中，有61株对密执安棒状杆菌腐朽亚种(Corymebacterium michganense subsp. sepedonicum) 引起的马铃薯环腐病有防治效果，其中一株荧光假单杆菌(CICA90) 还可以在马铃薯根和茎组织的内外定殖 [41]。在巴西，由苛养木杆菌(Xylella)引起的杂色褪绿病，是当地柑桔的主要病害。Azevedo等(2000)发现，在同一甜橙品种中不同抗（感）病植株体内的内生细菌的种类数量存在较大差异，将这些细菌导入植株，可使植株的抗病性增强[42]。杨海莲等(2001) 报道，用分离自水稻苗期根内、在体外对水稻白叶枯病菌不表现拮抗作用的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae) 发酵液喷洒水稻孕穗期叶片，可明显提高水稻对白叶枯病的抗性，防治效果达38%[43]。
3.3.3 作为外源杀虫基因的载体
将某些基因导入到内生细菌中，提高植物的抗病虫能力，而植物本身的基因并未发生改变，这样可以保持植物的天然性状。Kostka将BT杀虫基因构建于内生细菌木质棍状杆菌犬齿亚种(C. xyli subsp.cyndontis)中，制成了工程杀虫细菌，进行玉米螟害虫生物防治。大田试验结果显示，玉米螟为害率可降低26%-72%[44]。Mahaffee等 (1994) 应用来自棉花的非病原性内生细菌作为BT杀虫基因载体防治棉花蚜虫(Heliothis virescens)和玉米茎蛀虫(Elasmopalpus lignosellus)[45]。刘云霞等(1997) 用水稻体内生优势细菌巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium) 为载体，构建了具有防水稻二化螟活性的工程菌 [46]。许多研究者都认为植物内生细菌是一个很好的外源基因载体。
4 内生细菌防治植物病害发生的机制
4.1 促进植物吸收营养和水分，与病原菌竞争生态位和营养物质
内生细菌的固氮作用是其促进植物吸收营养的一大证据，氮元素是植物生长所必需的，在氮肥贫瘠的土地中，某些植物中的内生固氮菌的固氮作用对植物有很大帮助。Tester(1992)利用内生细菌Clavibacter xyli subsp. Cynodontis(MDE1)和经过基因工程改造的内生细菌(MDR13)处理玉米后，发现用内生细菌处理的植物不同部分的含氮量明显高于对照处理，用MDR13处理的植物比用MDE1和缓冲液处理的保持水分要好，用内生细菌处理的叶片比用缓
冲液处理的降解速度要慢[47]。说明内生细菌帮助植物吸收营养和水分促进植物生长作用的同时也增强了植物对病菌的抵抗能力，起到了保护植物的作用。
生物的生存需要一定的空间、营养物质，微生物在植物体内也不例外。内生细菌来防治植物病害的机制之一就是内生细菌与病原菌竞争相同的生态位。这里的病原菌如果特指病原细菌，可能更容易理解一些，亲缘关系相近的内生细菌与病原细菌对环境的需要比较相近，所以竞争较易发生。如果内生细菌先定殖在植物组织内部并且占据了病原细菌所需的生态位，可能对抵抗病原细菌的侵入产生一定作用。营养物质也是内生细菌和病原菌争夺的重要资源对象，某些根际定植内生细菌能产生噬铁素与病菌竞争铁元素，而植物并不受其影响。荧光假单胞杆菌能产生一种黄绿色噬铁素与病菌竞争铁，导致病菌因得不到铁元素而死亡[48]。
4.2 产生有抗菌活性的次生代谢物
4.2.1抗生素类物质
根际内生细菌产生的抗生素物质包括双乙酰藤黄酚(Phl)，吩嗪羧酸(PCA)，藤黄绿脓素(pyoluterin)，吡咯菌素(pyrolnitrin)，HCN和一类丁酰内酯(butyrolactones)。根际内生菌Pseudomonas spp.产生的一类鼠李糖脂生物表面活性剂 (rhamnolipid biosurfactants) 物质，破坏腐霉菌(Pythium) 卵孢子的原生质膜，引起卵孢子细胞壁的水解破裂 [49]。对小麦全蚀病有防效的P. Fluorescens能产生一些吩嗪类 (phenazine) 物质。Bacillus strains就能产生一些脂多肽(lipopeptide) 类抗生素对植物根部病害有显著的抑制作用 [49]。
4.2.2 水解酶类物质
真菌细胞壁的主要组成成份是葡聚糖和几丁质，内生细菌另一个重要的生防机制就是产生水解酶类，以降解真菌的细胞壁，使细胞水解或死亡，达到防病效果。此类抗菌蛋白(PR protein) 最典型的酶就是葡聚糖酶(β-glucanses) 和几丁质酶 (chitinases) ，都具有广谱抗真菌活性。分离自橡树的内生细菌有些能产生几丁质酶抑制病菌的生长[50]。Velazhahan等(1999)用根际内生拮抗细菌Pseudomonas fluorescens防治水稻稻瘟病时发现其产生的几丁质酶和葡聚糖酶的水平与其防治效果有密切的关系[51]。
4.3 诱导植物抗病特性
诱导抗性是指植物在受到生物或非生物因子刺激后，获得了广谱的对病虫害具有抵抗能力的现象。诱导抗性概念首先是由Chester (1933) 提出的，当时他称之为生理获得性免疫(acquired physiological immunity)[52]，现该概念已有多种不同的称谓，如系统性获得抗性 (systemic acquired resistance，SAR)(Ross，1961)[53]，及植物免疫(plant immunization)(Tuzum & Kleopper，1991)[54]等。Van (1998) 认为根际定植的细菌（含内生细菌）能诱导植物产生一种不同于SAR (systemic acquired resistance) 的另一种抗性，命名为根际细菌诱导抗性即ISR (induce systematic resistance)。其表型与病菌诱导的系统获得性抗性(SAR)相似。根际细菌调控诱导的系统抗性对许多植物如拟南芥，豆类，黄瓜等上的真菌，细菌，病毒有抵抗作用[55]。SAR诱导表达的最高水平可导致寄主植物的坏死[56]，而由根际细菌诱导的ISR对寄主植物不会引起任何坏死症状[57]。
第一章、茄子内生细菌的分离与筛选 近些年来，由于大棚茄子连作较多，致使茄子黄萎病等土传植物病害有逐年加重的趋势。目前化学农药仍是防治茄子黄萎病的主要措施，但易造成残留污染、诱发病原菌抗药性等不利影响。采用生物防治可以减少农药污染，维持生态平衡，是目前国内外病害防治研究的主要方向之一。许多研究证明，健康植物体内存在大量的内生细菌，并己在多种作物体内分离筛选到具有防病或诱导抗病作用的内生细菌。由于内生细菌定殖于植物体内，不易受外界环境的影响，并且许多内生细菌具有固氮、促生等生物功能，所以它们是植物病害生物防治的重要资源菌。本实验从生物防治的角度，根据茄子黄萎病是一种维管束病害，病原菌从植株的根部侵染后在植株维管束内定殖、为害，药剂不好直接作用于病原菌等特征，从茄子植株内分离内生细菌，筛选出对茄子黄萎病有抑制作用的内生生防细菌。
1 材料和方法
1.1 供试茄子来源及品种
采集江苏省农科院内以及南京市其林镇部分地区种植的紫长茄、七叶茄、刚果茄等品种进行内生细菌分离。
1.2 供试病原真菌
大丽轮枝菌(Verticillum dahliae)由江苏省农科院植保所棉花病害组提供。1.3 分离和培养用培养基
细菌固体培养用NA，液体培养用NB；真菌固体培养及拮抗测定用PDA，液体培养用Czapek。
培养基配方：
NA：牛肉浸膏3.0 g，蛋白胨5.0 g，酵母膏1.0 g，葡萄糖10.0 g，琼脂15.0-20.0 g，蒸馏水1000mL，pH 6.8-7.0。
NB：牛肉浸膏3.0 g，蛋白胨5.0 g，酵母膏1.0 g，葡萄糖10.0 g，蒸馏水1000mL，pH 6.8-7.0。