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18 zur Hausen A et al.Cancer Res,2000;60(10):2745
(2002211201 收稿)
高通量SNP基因分型技术研究进展
方唯意综述 姚开泰审阅
中南大学湘雅医学院肿瘤研究所(长沙,410078)
摘要 在后基因组时代,单核苷酸多态性研究已迅速成为了生物医学许多领域的焦点。发展可靠、敏感、经济、稳定、高通量的S NP基因分型技术已迫在眉睫。本文主要着重于高通量S NP基因分型技术的原理、利弊以及这些技术在这个领域过去几年中的进展。
关键词 高通量;单核苷酸多态性;基因分型
单核苷酸多态性(S NPs)是最普遍的遗传变异形式。通过开展具有明显表型特征的S NPs基因分型大规模相关研究,有助于鉴定许多复杂疾病原因,了解个体对各种药物的耐受性和对环境因子的反应。人类基因组测序的完成和142万个S NPs在基因组上的定位[1],为首次在全基因组水平上进行S NPs研究打开了方便大门。经典的S NPs分析方法是PCR 扩增后用凝胶电泳检测,虽然可靠性好,但缺乏效率。寡核苷酸微阵列和其他高通量筛选技术效率有了明显的提高,但临床应用绝非可靠,因此,有必要改进和发展新的可靠、敏感、高通量、经济、稳定的S NPs基因分型技术。在本文中,我们主要阐述高通量S NPs基因分型方法,包括一步均质法、焦磷酸测序、DNA芯片/阵列分析法、微球法、MA LDI2T OF质谱基因分型分析法等,讨论这些技术的目前状态和将来潜力。
1 一步均质法
T aqman、Scorpion分析和分子灯塔组成了微滴定平板荧光阅读系统。T aqman和分子灯塔都依赖于等位基因特异性寡核苷酸杂交在PCR期间对等位基因进行区分。而Scorpion分析能使用等位基因特异性PCR或是等位基因特异性杂交反应[2]来区分等位基因。它们作为一个末端分析能在一个完全均质的反应条件下进行分析。在反应起始,所有试剂和基因组DNA都混合在一起,经热循环步骤后,荧光信号能被检测到。该反应既没有单独的预扩增步骤,也没有中间的处理过程,因此它们是一种最简单的分析方法。由于没有适合这些方法的384孔荧光检测器,以及荧光标记探针的价格过高和缺乏可靠的自动化基因型呼叫软件,因此阻碍了这些方法的发展。最近,Applied Biosystems公司新开发的7900HT型高通量荧光定量PCR仪,使得进行384孔微滴定平板荧光检测成为了可能,这主要归因于高通量能力的增加和反应容积的减少。当如果要发展更高的基因分型通量时,一个可靠的自动化等位基因呼叫能力是必须的,它不只是纠正基因型呼叫信号更快,而且在处理和加工数据上必须更迅速,更准确。近来研究表明,自动化基因型呼叫在无阳性对照情况下进行聚类分析是可行的[3]。
2 焦磷酸测序Pyrosequencing
焦磷酸测序是对短到中等长度的DNA序列样品进行高通量、精确和重复性好的分析方法。其反应原理是当测序引物与PCR扩增的,单链DNA模板杂交,和各种酶包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、以及底物、荧光素一起共同孵育。4种dNTP之一被加入反应体系,如与模板配对,该dNTP与引物的末端形成共价键,dNTP 的焦磷酸基团释放出来。ATP硫酸化酶在APS存在的情况下催化焦磷酸生成ATP,ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素的转化,氧化荧光素发出的可见光信号与ATP量成正比。ATP和未掺入的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解,光信号淬灭,并再生反应体系,然后再加另一种dNTP继续反应。焦磷酸测序最初作为DNA测序方法而发展起来的,其化学反应与Sanger双脱氧二核苷酸法完全不同。它无需灌胶、毛细管电泳,也无需同位素或荧光染料
的一种测序技术。由于该法阅读侧翼序列和S NP 位点本身,以及其高度特异性(非特异性结合不产生假阳性信号)使得焦磷酸测序成为一种具有吸引力和准确的S NP基因分型方法。焦磷酸测序除了提供高准确性、灵活性以及并行处理过程外,焦磷酸测序很容易实现全自动化的基因分型。目前,Pyrose2 quencing AB公司已开发了适合于96孔中通量和384孔全自动化高通量的仪器,后者有能力每天进行数万个基因分型。焦磷酸测序与一些标准基因分型方法相比,还有一些不利方面,即PCR反应时生物素标记引物价格较高,以及这种分析需要特殊仪器。目前新研发了几种技术,旨在减少焦磷酸测序前的费用,主要是在模板制备方面,包括标准固相模板制备、三引物的固相模板制备和酶解模板制备[4]。Pyrosequencing AB公司发展、制造和销售研究产品,这使得生命科学研究者能更有效地得到大规模基因组信息[5]。
3 DNA芯片/阵列分析
当DNA芯片的技术开始出现时,它通过使用一个简单的等位基因特异性杂交检测技术为高度并行基因分型带来了巨大的希望。然而到目前为此,以等位基因特异性杂交为基础的DNA芯片使用数量受到了一定的限制,主要是因为等位基因特异性杂交很难获得良好的信噪比。在杂交反应中,完全匹配和非完全匹配的寡核苷酸区分的特异性受到了一定的限制,与DNA聚合酶或连接酶参与的区分反应相比,其特异性更低。当许多不同的寡核苷酸如在同一条件下进行杂交反应时,这种特异性问题将变得更加突出。尽管过去几年里想了很多的方法,其中包括高冗余芯片技术,但解决特异性这个问题一直并非易事。由美国A ffymetrix公司研发的寡核苷酸S NP芯片就是利用寡核苷酸与DNA完全和不完全互补所造成的这种杂交在热稳定性上的差异来分析S NP。近年来在Nature和Science发表的一些文章,就采用了这一芯片。但这种芯片最大的缺点就是可靠性较差,对S NP位点较少分析时,该芯片可使误差小于1%,位点较多时,仅假阳性便可高达40%,这样的误差在临床应用时是绝对不允许的[6]。鉴于目前S NP芯片研究状况和理论上对S NP芯片的需求,Zhang和Li[7]开发了一种新的技术,即3′末端标记引物延伸法。它主要是利用聚合酶式反应原理,应用碱基特异性引物3′末端标记PCR的设计方案研发了一种进行S NP分析的芯片,这一技术的原理是将不配对的碱基置于3′末端或次3′末端。这一
设计的巧妙之处在于标记物或者说可检测信号,永远只会来源于完全配对的引物。
单碱基延伸与固相结合的寡核苷酸联合现已成功运用于微阵列S NP并行分析[8]。该方法与等位基因特异性杂交平台相比,由于DNA聚合酶在结合互补反应中高保真性作用,其特异性信号更强。这种方法的一个变化是在引物3′末端结合变异等位基因去检测等位基因特异性延伸。基因标记分型法不断的发展,并能克服固相反应中对它的一些限制。在这个系统中,一个高度多重单碱基延伸反应使用5′端标记序列、荧光标记的双脱氧二核苷酸的引物在溶液中进行。引物中的标记序列本身并没有参与单碱基延伸反应,而是随后参与了与DNA芯片中的寡核苷酸结合。以固相单碱基延伸为基础的标记阵列分析方法有如下优点:①由于价格的降低和它在不同S NP基因分型分析中使用相同DNA芯片的能力,普通DNA芯片也能够使用。②在溶液中可进行酶学反应。③因在寡核苷酸末端没有3′OH残基的存在,故在DNA芯片中应用时很少受到限制。总之,标记阵列和单碱基延伸或基于连接酶解反应的联合运用提供了超高通量分析潜力的基因分型平台。一些公司如A ffmetrix等一直致力于开发标记阵列基因分型系统。
4 微球(B ead-B ased)法
这种分析方法是非常类似于DNA芯片分析方法,其区别在于微球法寡核苷酸粘附于直径3～5μm的微球体上,而不同于DNA芯片,固定在表面。微球法能与用于DNA芯片标记阵列的大部分等位基因区分反应相结合,如单碱基延伸反应和寡核苷酸连接反应。它在多重性和S NP联合上有着巨大的灵活性。在微球法分析中,每一个微球体的身份都需要被确定,而且,这种信息将与来自于微球体的基因型信号相结合后指派一个基因呼叫信号到一个S NP中去。因此,有必要对每个微球体进行分子鉴定和分类。
一个使用荧光编码的微球体基因分型平台已由Luminex公司开发出来。这些微球体由两种不同的染料(红色和绿色)所包被,能基于微球体表面上两种染料的量多少,能通过流式细胞仪鉴定和分离。如果有100不同信号比(红色/桔黄色)类型的微球体,那么有可能在一个反应管中做100次检测。反应后,这些微球体被荧光检测器区分,而且,每一组的微球体的基因分型信号都受到单独的检测。实质上,每一根反应管相当于DNA芯片上的100个位
点。现在,由于96孔流式荧光检测器的出现,在技术上有可能于96孔格式反应中对数千个基因型进行记分。这种以微球体平台为基础的技术已经开始与寡核苷酸连接反应[9]、等位基因特异性杂交[10]、单碱基延伸法[11]和等位基因特异性引物延伸[12]联合应用。尽管这种分析系统已经获得了合理高通量,但是,仍有一些因素限制了该系统向更高通量发展。目前用于微球体检测的染料数目联合被设定在1002plex。另外的限制因素是能够使用于基因分型信号染料的数量。
由Illumina公司开发的多种商业化柱子平台,它是由光学纤维制造出来的,微球体在固体孔中被捕获[13]。每一个孔只适合一个微球体。当微球体固定在这些孔中,这个系统便可作为一张高密度微阵列来对待。在某种意义上说,Illumina微球体系统更象DNA芯片平台。使用这种方法,50000个微球体能装配成一张微阵列片上。这些特征使得光学纤维微球体阵列系统有一个非常高的多重性潜力。
5 质谱基因分型分析
这种方法的原理是使用质谱直接或间接检测等位基因特异性延伸区分反应产物[14]。各种等位基因区分反应如单碱基延伸及其变化形式[15]、等位基因特异性肽核酸(PNA)、Invader、碱基特异性裂解[16]和等位基因特异性PCR已成功的和质谱检测法联合应用。单碱基延伸或其修饰形式与基质辅助激光吸收/离子飞行时间(MA LDI2T OF)质谱结合已被广泛的应用,并已被一些公司(Sequenom)发展为商业性产品。MA LDI2T OF质谱检测的优点在于其速度和多重性能力。例如一个中等质谱检测器1d能记录4万个光谱,理论上52plex检测格式能对20万基因型进行记分。然而,它们的限速步骤不是质谱仪的检测过程,而是酶学反应之前和反应后样品处理过程。在大部分质谱分析方法中,52plex反应或许是为获得多重性可靠信号现实的制约,部分是由于检测质谱的范围以及质谱区分的敏感性所致。反应后样品处理过程比其它基因分型格式更复杂,因为质谱检测仪对分析样品的纯度要求非常高。Se2 quenom的MassArray自动化系统是利用离子交换树脂于对样品进行固相纯化,而Applied Biosystems是通过微型逆相液化层析进行样品纯化的。另一个分析系统即“G OOD分析系统[17]”在反应中涉及到使用化学修饰引物,然后酶解去掉未延伸的引物以及修饰产物烷化,这样使得用于质谱检测的样品制备简单、经济和有效。另外,烷化产物也能增加质谱检测分析的敏感性。
由于质谱分析内在本质使得基因分型准确性非常高是它又一个优点。质谱分析的敏感性、每个反应产物的高特异性以及对一些类型的反应来说,每个反应都有内部的校正标准,所有这些都归因于质谱分析的准确性。特别是当直接检测等位基因区分产物时,质谱分析法背景很少,允许精确的自动化基因呼叫。
在当今所有商业化可得到的基因分型系统中,质谱基因分型分析通量是最高的,它是将来在整个基因组相关研究中超高通量基因分型的主要竞争者。
6 温控高效液相色谱法TmHP LC
1995年,Oefner等用温控高效液相色谱法(T mHP LC)即(DHP LC)筛选DNA序列多态性。T mH2 P LC用于基因突变筛检的主要工作原理是通过离子反相HP LC检测不完全匹配的杂合双螺旋PCR产物。发生突变的基因片段在变性温度下与野生型片段发生不完全配对,从而形成完全配对的野生型、完全配对的突变型和不完全配对的杂合型PCR扩增片段。在部分变性温度(T m)下,通过一定的梯度洗脱使不同类型的片段在分离柱中得到分离。出现突变的PCR片段用紫外检测器检测时出现多峰型信号,而野生型表现为单峰型。目前,T mHP LC技术发展包括改善检测信号强度与质量、选择更好的分离介质以及提高预测突变性质的能力。随着分离柱专利技术仪器和方法不断改进,T mHP LC形成了独特的技术优势。总之,T mHP LC通过比较异源双链与同源双链,可以敏感而准确地发现DNA变异,只是新发现的变异需进一步测序鉴定。但它能明显减少测序工作量,尤其对鉴别稀少的变异型,可明显降低成本,并加快获取数据的速度。另外,它还具有快速、检出率高(可达95%～100%)、适合大片段、PCR 产物无需纯化,自动化操作等优点。Huang等[18]等利用T mHP LC在6p21.3进行鼻咽癌相关基因S NP 筛选,结果在5个片段中,鉴定了4个新的S NP,另外也证实了4个已知S NP位点和基因型。目前,该技术在基因突变分析、单核苷酸多态性筛选等许多领域里得到了广泛的应用。该技术是一种很有前途的高通量基因分型技术。
7 小结和展望
今天,至少约有20种不同的S NP基因分型方法,其中包含了各种不同的等位基因区分反应和信
号检测方法的联合。它们中的许多已经发展为384孔板格式和自动化商业产品。基于质谱分析法、标记阵列分析法和一步均质法在高通量基因分型中都有其显著的优点,它们将是前沿领跑者以带动整个基因组相关研究。一些其它方法如焦磷酸测序等也快速发展以获得更高通量基因分型。然而,由于与质谱分析方法、标记阵列分析法相比较缺乏高度多重性,以及与一步均质法相比缺少额外处理步骤潜力,因此,对于这些分析方法而言要获得更高通量仍是一个挑战。另外,还有一些其它新出现的方法,如动态等位基因特异性杂交,这种分析是在全自动化的微滴定板中,通过便利的荧光信号检测进行的。该法简单,经济,但它还必须进一步发展装备去参与竞争性高通量平台。
人类基因组计划的实施,产生了大量的S NP,生物信息学资源爆炸性的积累,随之推动了S NP基因分型新技术的发展。由于高通量基因分型技术的发展,这就使得我们进行大规模的基因组相关研究以及药物遗传学研究成为可能,并将使得现代医学的诊断和治疗发生革命性的变化。在不久的将来,临床医师能根据病人的遗传图谱,具体的给每一位患者作出正确的诊断,最终给予病人最有效和最方便的药物。
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18 黄 华等.第一军医大学学报,2002;22(7):602
(2003204204 收稿)
肝细胞生成素家族的分子生物学特性及作用机制研究进展
李英贤 贺福初
军事医学科学院放射医学研究所(北京,100850)
摘要 人们对肝细胞生成素(HPO)及其家族的认识起源于对肝再生现象的研究。越来越多的证据表明,在自然界中存在一个HPO家族。近年来,人们对该家族的分子:E10R、ERV、9G L、HPO等进行了系统的分子生物学研究,该家族的分子具有巯基氧化还原酶的功能,在细胞质内参与二硫键的形成,对细胞的生长、增殖及凋亡具有重要的调控作用。
关键词 肝脏再生; 巯基氧化酶; 信号转导
人们对HPO及其超家族的认识过程起源于对肝再生现象的研究。在1975年,LaRrecque等首次证实了在断乳乳鼠的肝脏和肝部分切除后的大鼠再生肝脏中,存在一种能特异刺激肝细胞DNA合成的物质,命名为HSS[1]。1994年Hagiya等发表了大鼠肝再生增强因子(A LR)的分离、纯化与分子克隆的研究结果[2]。杨晓明等根据大鼠A LR的cDNA序列从人胎肝cDNA文库中获得了人A LR(HPO)全长cDNA,与大鼠A LR cDNA有87%的同源性,氨基酸序列有84.4%的同源性[3]。Lis owsky在1992年从酵母中克隆到了一种与线粒体呼吸链的氧化磷酸化及细胞分裂周期调节有关的基因,称其为ERV1[4]。最近又从酵母中克隆到了与ERV1同源的基因ERV2。二者氨基酸水平上的同源性达到了42%[5]。HPO 分子晶体结构的研究表明,在体内是以FAD作为辅基的巯基氧化酶[6],该家族分子内保守的CXXC结构域是酶的活性中心。其病毒同源物E10R参与细胞内蛋白二硫键的形成[7]。越来越多的数据表明, ERV1/A LR同源物在自然界中广泛分布,在病毒、原生动物、昆虫、蛔虫、高等植物、高等动物中都存在
高通量测序基础知识简介 陆桂 什么是高通量测序？ 高通量测序技术（High-throughput sequencing，HTS）是对传统Sanger测序（称为一代测序技术）革命性的改变,一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定, 因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing，NGS )足见其划时代的改变, 同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能, 所以又被称为深度测序(Deep sequencing)。 什么是Sanger法测序（一代测序） Sanger法测序利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。 什么是基因组重测序（Genome Re-sequencing） 全基因组重测序是对基因组序列已知的个体进行基因组测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。随着基因组测序成本的不断降低，人类疾病的致病突变研究由外显子区域扩大到全基因组范围。通过构建不同长度的插入片段文库和短序列、双末端测序相结合的策略进行高通量测序，实现在全基因组水平上检测疾病关联的常见、低频、甚至是罕见的突变位点，以及结构变异等，具有重大的科研和产业价值。 什么是de novo测序 de novo测序也称为从头测序：其不需要任何现有的序列资料就可以对某个物种进行测序，利用生物信息学分析手段对序列进行拼接，组装，从而获得该物种的基因组图谱。获得一个物种的全基因组序列是加快对此物种了解的重要捷径。随着新一代测序技术的飞速发展，基因组测序所需的成本和时间较传统技术都大大降低，大规模基因组测序渐入佳境，基因组学研究也迎来新的发展契机和革命性突破。利用新一代高通量、高效率测序技术以及强大的生物信息分析能力，可以高效、低成本地测定并分析所有生物的基因组序列。 什么是外显子测序（whole exon sequencing） 外显子组测序是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。外显子测序相对于基因组重测序成本较低，对研究已知基因的SNP、Indel等具有较大的优势，但无法研究基因组结构变异如染色体断裂重组等。
转录组测序（RNA-seq）技术 转录组是某个物种或者特定细胞类型产生的所有转录本的集合。转录组研究能够从整体水平研究基因功能以及基因结构，揭示特定生物学过程以及疾病发生过程中的分子机理，已广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。基于Illumina高通量测序平台的转录组测序技术使能够在单核苷酸水平对任意物种的整体转录活动进行检测，在分析转录本的结构和表达水平的同时，还能发现未知转录本和稀有转录本，精确地识别可变剪切位点以及cSNP（编码序列单核苷酸多态性），提供最全面的转录组信息。相对于传统的芯片杂交平台，转录组测序无需预先针对已知序列设计探针，即可对任意物种的整体转录活动进行检测，提供更精确的数字化信号，更高的检测通量以及更广泛的检测范围，是目前深入研究转录组复杂性的强大工具。 技术优势： ?数字化信号：直接测定每个转录本片段序列，单核苷酸分辨率的精确度，同时不存在传统微阵列杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题。 ?高灵敏度：能够检测到细胞中少至几个拷贝的稀有转录本。 ?任意物种的全基因组分析：无需预先设计特异性探针，因此无需了解物种基因信息，能够直接对任何物种进行转录组分析。同时能够检测未知基因，发现新的转录本，并精确地识别可变剪切位点及cSNP，UTR区域。 ?更广的检测范围：高于6个数量级的动态检测范围，能够同时鉴定和定量稀有转录本和正常转录本。 应用领域：转录本结构研究（基因边界鉴定、可变剪切研究等），转录本变异研究（如基因融合、编码区SNP研究），非编码区域功能研究（Non-coding RNA研究、microRNA前体研究等），基因表达水平研究以及全新转录本发现。 图1 RNA-seq获得的数据能够进行全面的数据挖掘，既能够进行基因结构分析，鉴定UTR、可变剪切位点，也能够发现新的转录本及非编码RNA，比较样本间的表达水平差异
蛋白芯片技术与肿瘤筛查 2a 1b 2c 5d 蛋白芯片上固定的探针是（）d 肿瘤标志物最早是在（）首次提出a 病理组织学在诊断恶性肿瘤中的缺点不包括（）d 免疫芯片是一种特殊的（）b 蛋白芯片的特点不包括（）d 使肿瘤标志物的研究从分子水平提高到基因水平的是（）a 肿瘤蛋白芯片的不足不包括（）c 理想的肿瘤标志物应该具备（）d 临床诊断肿瘤的主要方法不包括（）d 关于肿瘤标志物的描述错误的是（）c 基因芯片技术与HPV检测 1a 2b 1c 6d HPV基因分型检测的适用人群不包括（）a 关于基因芯片技术的特点描述错误的是（）b 生殖道恶性肿瘤第一位的是（）c 目前唯一病因明确的癌症是（）b 以下哪一项不是基因芯片检测HPV的优点（）d 关于基因分型检测指导HPV疫苗的研究及使用说法错误的是（）d 关于人乳头瘤病毒的描述错误的是（）d HPV检测宫颈病变的特点不包括（）d 与宫颈癌相关的HPV分型是（）d 宫颈癌的发病高峰年龄为（）d
微流控技术与临床 3a 4b 1c 2d 目前常用的免疫检测方法ELISA，其特点描述错误的是（）b 称为芯片实验室的芯片是（）c 微流控技术最明显的特征是（）a 软光刻法加工微流控芯片的特点是（）d 模塑法加工微流控芯片的特点是（）b 以高聚物材料为基片加工微流控芯片，最常用的方法是（）b 微流控芯片分析的特点错误的是（）b 以下不能作为微流控芯片载体的材料是（）a 微流控芯片的优势不包括（）d 热压法加工微流控芯片的特点是（）a 液体芯片技术 3a 2b 2c 3d 生物芯片的特点不包括（）a 国内发病率最高的肿瘤是（）b 妇芯中卵巢癌的最佳指标是（）c 唯一被FDA批准用于临床诊断的生物芯片是（）a 涵盖中国人群高发肿瘤的85％的芯片是（）d 液体芯片与普通芯片相比，最大的优势是（）d 关于液态芯片的描述错误的是（）c 肺芯中肺癌的最佳检测指标是（）b 由生物材料微阵列构成的芯片是（）d 生物芯片技术的提出是在（）a
转录组高通量测序 2010-11-22 09:48 （第二代高通量测序技术-454） 转录组即特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA的总和，是研究细胞表型和功能的一个重要手段。与基因组不同的是，转录组的定义中包含了时间和空间的限定。同一细胞在不同的生长时期及生长环境下，其基因表达情况是不完全相同的。罗氏GS-FLX-Titanium第二代高通量测序仪平均读长超过 400bp，在测序读长上遥遥领先于其它第二代高通量测序仪，使其成为转录组学研究的首选测序平台，已被广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。 一、罗氏454测序技术在环境微生物生态多样性研究中的突出优势体现在：（1）测序序列长，便于聚类拼接，可以对转录本进行从头组装（de novo assembly）。 （2）测序通量高，可以检测到低丰度转录本信息。 （3）可以对无基因组参考序列的新物种进行转录组测序，发现新的转录本和亚型。 （4）实验操作简单、结果稳定，可重复性强。无需进行克隆的文库构建，双链cDNA连接454接头后可以直接进行测序，实验周期短。 （5）测序数据便于进行生物信息分析，可以进行基因差异表达分析、鉴定基因的可变剪切以及预测新基因。 二、美吉公司在环境微生物生态多样性研究中的突出优势体现在： （1）拥有自主实验室和高通量测序平台，可以根据客户要求灵活安排实验，实验周期短，取样方便，质量可靠。 （2）技术人员经验丰富，可以稳定地进行总RNA的提取和双链cDNA的合成，可以根据顾客要求第一时间提供实验方案。 （3）有专业的生物信息团队和大型计算机，可以为客户提供个性化的生物信息分析服务。 （4）开放式实验室，参与式服务。客户不但可以参与整个实验过程，而且可以参与生物信息分析，提供最为增值的售后服务。 三、服务流程 （1）客户提供样本背景信息、实验目的和实验预期。 （2）美吉公司设计实验方案，提供测序深度建议和生物信息分析建议。 （3）客户认可实验方案，双方签订项目合作协议。 （4）项目开始运作，美吉公司指定专人和客户保持无障碍沟通。 （5）项目结束，美吉公司提供标准结题报告。 （6）客户可以和美吉公司签订长期合作协议，享受折扣和VIP服务。 四、送样要求 （1）动物、植物、微生物组织： > 请提供足量的新鲜样品，样品量≥5g；植物材料应避免过老的组织，尽量用柔嫩部位。 > 新鲜程度要求：采样后将样品立即液氮速冻－80℃保存（保存期不超过1个月），干冰运输，运输时间不超过72h。 > 样本保存期间切忌反复冻融。
10 Sheng W et al.J Virol,2003;77(6):3859 11 C ohen J I,et al.J Virol,1999;73(9):7627 12 Wei MX et al.Cancer Res,1994;54(7):1843 13 G ao Y et al.Oncogene,2002;21(5):825 14 T anner J E et al.J In fect Dis,1997;175(1):3815 Decaussin G et al.Cancer Res,2000;60(19):5584 16 Brink AA et al.J Clin M icrobiol,1998;36(11):3164 17 Hayes DP et al.M ol Pathol,1999;52(2):97 18 zur Hausen A et al.Cancer Res,2000;60(10):2745 (2002211201 收稿) 高通量SNP基因分型技术研究进展 方唯意综述 姚开泰审阅 中南大学湘雅医学院肿瘤研究所(长沙,410078) 摘要 在后基因组时代,单核苷酸多态性研究已迅速成为了生物医学许多领域的焦点。发展可靠、敏感、经济、稳定、高通量的S NP基因分型技术已迫在眉睫。本文主要着重于高通量S NP基因分型技术的原理、利弊以及这些技术在这个领域过去几年中的进展。 关键词 高通量;单核苷酸多态性;基因分型 单核苷酸多态性(S NPs)是最普遍的遗传变异形式。通过开展具有明显表型特征的S NPs基因分型大规模相关研究,有助于鉴定许多复杂疾病原因,了解个体对各种药物的耐受性和对环境因子的反应。人类基因组测序的完成和142万个S NPs在基因组上的定位[1],为首次在全基因组水平上进行S NPs研究打开了方便大门。经典的S NPs分析方法是PCR 扩增后用凝胶电泳检测,虽然可靠性好,但缺乏效率。寡核苷酸微阵列和其他高通量筛选技术效率有了明显的提高,但临床应用绝非可靠,因此,有必要改进和发展新的可靠、敏感、高通量、经济、稳定的S NPs基因分型技术。在本文中,我们主要阐述高通量S NPs基因分型方法,包括一步均质法、焦磷酸测序、DNA芯片/阵列分析法、微球法、MA LDI2T OF质谱基因分型分析法等,讨论这些技术的目前状态和将来潜力。 1 一步均质法 T aqman、Scorpion分析和分子灯塔组成了微滴定平板荧光阅读系统。T aqman和分子灯塔都依赖于等位基因特异性寡核苷酸杂交在PCR期间对等位基因进行区分。而Scorpion分析能使用等位基因特异性PCR或是等位基因特异性杂交反应[2]来区分等位基因。它们作为一个末端分析能在一个完全均质的反应条件下进行分析。在反应起始,所有试剂和基因组DNA都混合在一起,经热循环步骤后,荧光信号能被检测到。该反应既没有单独的预扩增步骤,也没有中间的处理过程,因此它们是一种最简单的分析方法。由于没有适合这些方法的384孔荧光检测器,以及荧光标记探针的价格过高和缺乏可靠的自动化基因型呼叫软件,因此阻碍了这些方法的发展。最近,Applied Biosystems公司新开发的7900HT型高通量荧光定量PCR仪,使得进行384孔微滴定平板荧光检测成为了可能,这主要归因于高通量能力的增加和反应容积的减少。当如果要发展更高的基因分型通量时,一个可靠的自动化等位基因呼叫能力是必须的,它不只是纠正基因型呼叫信号更快,而且在处理和加工数据上必须更迅速,更准确。近来研究表明,自动化基因型呼叫在无阳性对照情况下进行聚类分析是可行的[3]。 2 焦磷酸测序Pyrosequencing 焦磷酸测序是对短到中等长度的DNA序列样品进行高通量、精确和重复性好的分析方法。其反应原理是当测序引物与PCR扩增的,单链DNA模板杂交,和各种酶包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、以及底物、荧光素一起共同孵育。4种dNTP之一被加入反应体系,如与模板配对,该dNTP与引物的末端形成共价键,dNTP 的焦磷酸基团释放出来。ATP硫酸化酶在APS存在的情况下催化焦磷酸生成ATP,ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素的转化,氧化荧光素发出的可见光信号与ATP量成正比。ATP和未掺入的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解,光信号淬灭,并再生反应体系,然后再加另一种dNTP继续反应。焦磷酸测序最初作为DNA测序方法而发展起来的,其化学反应与Sanger双脱氧二核苷酸法完全不同。它无需灌胶、毛细管电泳,也无需同位素或荧光染料
高通量测序基础知识汇总 一代测序技术：即传统的Sanger测序法，Sanger法是根据核苷酸在待定序列模板上的引物点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH 基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，通过检测得到DNA碱基序列。 二代测序技术：next generation sequencing（NGS）又称为高通量测序技术，与传统测序相比，二代测序技术可以一次对几十万到几百万条核酸分子同时进行序列测定，从而使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序（Deep sequencing）。NGS主要的平台有Roche（454 & 454+），Illumina（HiSeq 2000/2500、GA IIx、MiSeq），ABI SOLiD等。 基因：Gene，是遗传的物质基础，是DNA或RNA分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列。基因通过复制把遗传信息传递给下一代，使后代出现与亲代相似的性状。 DNA：Deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸，一个脱氧核苷酸分子由三部分组成：含氮碱基、脱氧核糖、磷酸。脱氧核糖核酸通过3',5'-磷酸二酯键按一定的顺序彼此相连构成长链，即DNA链，DNA链上特定的核苷酸序列包含有生物的遗传信息，是绝大部分生物遗传信息的载体。
综述 超广谱β-内酰胺酶的基因分型及研究进展超广谱β-内酰胺酶（Extended spectrum beta-lactamases, ESBLs）是由质粒介导的能水解青霉素类、头孢菌素类、单环内酰胺类抗生素的耐药性酶，由于作用底物广泛而称之，并可在菌株间转移和传播[1、2]。ESBLs主要由革兰氏阴性杆菌产生，尤其以肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌为代表。肺炎克雷伯菌是呼吸道感染最常见的病原菌，由产ESBLs肺炎克雷伯菌引起的医院感染爆发流行时有发生[3]。自1983年在德国首次报道分离出SHV-2型ESBLs以来，全世界许多地方不断有新的ESBLs检出[4]。目前，产ESBLs细菌在临床标本中的分离率有增加的趋势，产ESBLs菌对氨基糖苷类、喹诺酮类和磺胺类交叉耐药也呈逐年上升趋势，这给临床感染的治疗带来了新的难题。 1.ESBLs的定义 超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）是由质粒介导的能水解青霉素类、头孢菌素类、单环酰胺类抗生素的耐药性酶，由于作用底物广泛而称之[5]。有人将ESBLs 理解为以下几条：主要由肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌等肠杆菌科细菌产生；在体外试验中可使三代头孢菌素和氨曲南的抑菌圈缩小，但并不一定在耐药范围；加入克拉维酸可使其抑菌圈扩大；临床对β-内酰胺类药物（包括青霉素和头孢类）耐药，但对碳青霉素类药物敏感；由质粒介导，往往由普通的β-内酰胺基因（TEM-1、TEM-2、SHV-1）突变而来。 2.ESBLs的耐药机制 细菌对抗生素的耐药机制可分为以下几点：细胞膜通透性的改变，使抗生素不能或很少透入细菌体内到达作用靶位;灭活酶或钝化酶的产生，如β-内酰胺酶使抗生素的作用下降；与抗生素结合靶位（亲和力）的改变，使抗生素的作用下降；其他，如主动外排系统等。对于ESBLs的近年来发现，其多种耐药性的产生与其质粒编码的ESBLs有直接关系。随着第三代头孢菌素及其他β-内酰胺类抗生素的广泛使用，产ESBLs菌增加很快。世界上许多国家和地区都有ESBLs菌流行的报道，国内也有许多地区产ESBLs菌的报道[6]。因此国内外专家一致认为广谱头孢菌素类尤其是第三代头孢菌素的广泛使用产生的选择性压力是导致产生ESBL革兰阴性杆菌增加的主要原因。由于ESBLs是质粒编码的，能通过接合、转化和转导形式，使耐药基因在菌间扩散，使敏感菌变成耐药菌
转录组测序技术的应用及发展综述 摘要：转录组测序（RNA-Seq）作为一种新的高效、快捷的转录组研究手段正在改变着人们对转录组的认识。RNA-Seq利用高通量测序技术对组织或细胞中所有RNA 反转录而成cDNA文库进行测序，通过统计相关读段(reads)数计算出不同RNA的表达量，发现新的转录本；如果有基因组参考序列，可以把转录本映射回基因组，确定转录本位置、剪切情况等更为全面的遗传信息，已广泛应用于生物学研究、医学研究、临床研究和药物研发等。文章主要比较近年来转录组研究的几种方法和几种RNA-Seq的研究平台，着重介绍RNA-Seq的原理、用途、步骤和生物信息学分析，并就RNA-Seq技术面临的挑战和未来发展前景进行了讨论及在相关领域的应用等内容，为今后该技术的研究与应用提供参考。 关键词: RNA-Seq；原理应用；方法；挑战；发展前景 Abstract：Transcriptome sequencing (RNA-Seq) is a kind of high efficiency, quick transcriptome research methods are changing our understanding of transcriptome. RNA-Seq to use high-throughput sequencing of tissues or cells of all RNA reverse transcription into cDNA library were sequenced, through statistical correlation read paragraph (reads) numbers were calculated from the expression of different RNA transcripts, find new; if the genome reference sequence, the transcripts mapped to genomic, determine the position of the transcription shear condition, more genetic information, has been widely used in biological research, medical research, clinical research and drug development. This paper compared several methods of platform transcriptome studies and several kinds of RNA-Seq in recent years, RNA-Seq focuses on the principle, purpose, steps and bioinformatics analysis, and discusses the RNA-Seq technology challenges and future development prospect and the application in related field and other content, provide the reference for the research and application of the technology future. Key word：RNA-Seq ;application; principle; method; challenge; development prospects
高通量测序：第二代测序技 术详细介绍 -标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII
在过去几年里，新一代DNA 测序技术平台在那些大型测序实验室中迅猛发展，各种新技术犹如雨后春笋般涌现。之所以将它们称之为新一代测序技术（next-generation sequencing），是相对于传统Sanger 测序而言的。Sanger 测序法一直以来因可靠、准确，可以产生长的读长而被广泛应用，但是它的致命缺陷是相当慢。十三年，一个人类基因组，这显然不是理想的速度，我们需要更高通量的测序平台。此时，新一代测序技术应运而生，它们利用大量并行处理的能力读取多个短DNA 片段，然后拼接成一幅完整的图画。 Sanger 测序大家都比较了解，是先将基因组DNA 片断化，然后克隆到质粒载体上，再转化大肠杆菌。对于每个测序反应，挑出单克隆，并纯化质粒DNA。每个循环测序反应产生以ddNTP 终止的，荧光标记的产物梯度，在测序仪的96 或384 毛细管中进行高分辨率的电泳分离。当不同分子量的荧光标记片断通过检测器时，四通道发射光谱就构成了测序轨迹。 在新一代测序技术中，片断化的基因组DNA 两侧连上接头，随后运用不同的步骤来产生几百万个空间固定的PCR 克隆阵列（polony）。每个克隆由单个文库片段的多个拷贝组成。之后进行引物杂交和酶延伸反应。由于所有的克隆都是系在同一平面上，这些反应就能够大规模平行进行。同样地，每个延伸所掺入的荧光标记的成像检测也能同时进行，来获取测序数据。酶拷问和成像的持续反复构成了相邻的测序阅读片段。
Solexa 高通量测序原理 --采用大规模并行合成测序法(SBS, Sequencing-By-Synthesis)和可逆性末端终结技术（Reversible Terminator Chemistry） --可减少因二级结构造成的一段区域的缺失。 --具有高精确度、高通量、高灵敏度和低成本等突出优势 --可以同时完成传统基因组学研究（测序和注释）以及功能基因组学（基因表达及调控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究 ----将接头连接到片段上，经 PCR 扩增后制成 Library 。 ----随后在含有接头（单链引物）的芯片（ flow cell ）上将已加入接头的 DNA 片段变成单链后通过与单链引物互补配对绑定在芯片上，另一端和附近的另外一个引物互补也被固定，形成“桥” ----经30伦扩增反应，形成单克隆DNA簇 ----边合成边测序（Sequencing By Synthesis）的原理，加入改造过的DNA 聚合酶和带有4 种荧光标记的dNTP。这些dNTP是“可逆终止子”，其3’羟基末端带有可化学切割的基团，使得每个循环只能掺入单个碱基。此时，用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类。之后，将这些基团化学切割，恢复3'端粘性，继续聚合第二个核苷酸。如此继续下去，直到每条模板序列都完全被聚合为双链。这样，统计每轮收集到的荧光信号结果，就可以得知每个模板DNA 片段的序列。目前的配对末端读长可达到2×50 bp，更长的读长也能实现，但错误率会增高。读长会受到多个引起信号衰减的因素所影响，如荧光标记的不完全切割。 Roche 454 测序技术 “一个片段 = 一个磁珠 = 一条读长（One fragment =One bead = One read）”
10Sheng W et al.J Viro l,2003;77(6):3859 11Co hen JI,et al.J Viro l,1999;73(9):7627 12Wei MX et al.Cancer Res,1994;54(7):1843 13Gao Y et al.Oncogene,2002;21(5):825 14Tanner JE et al.J Infect Dis,1997;175(1):3815Decaussin G et al.Cancer Res,2000;60(19):5584 16Brink AA et al.J Clin Micro biol,1998;36(11):3164 17Hayes DP et al.Mol Patho l,1999;52(2):97 18zur Hausen A et al.Cancer Res,2000;60(10):2745 (2002211201收稿) 高通量SNP基因分型技术研究进展 方唯意综述姚开泰审阅 中南大学湘雅医学院肿瘤研究所(长沙,410078) 摘要在后基因组时代,单核苷酸多态性研究已迅速成为了生物医学许多领域的焦点。发展可靠、敏感、经济、稳定、高通量的S NP基因分型技术已迫在眉睫。本文主要着重于高通量SN P基因分型技术的原理、利弊以及这些技术在这个领域过去几年中的进展。 关键词高通量;单核苷酸多态性;基因分型 单核苷酸多态性(S NPs)是最普遍的遗传变异形式。通过开展具有明显表型特征的S NPs基因分型大规模相关研究,有助于鉴定许多复杂疾病原因,了解个体对各种药物的耐受性和对环境因子的反应。人类基因组测序的完成和142万个S NPs在基因组上的定位[1],为首次在全基因组水平上进行S NPs研究打开了方便大门。经典的S NPs分析方法是PCR 扩增后用凝胶电泳检测,虽然可靠性好,但缺乏效率。寡核苷酸微阵列和其他高通量筛选技术效率有了明显的提高,但临床应用绝非可靠,因此,有必要改进和发展新的可靠、敏感、高通量、经济、稳定的SNPs基因分型技术。在本文中,我们主要阐述高通量SN Ps基因分型方法,包括一步均质法、焦磷酸测序、D N A芯片/阵列分析法、微球法、M A LDI2TO F质谱基因分型分析法等,讨论这些技术的目前状态和将来潜力。 1一步均质法 Taqman、Sc orpion分析和分子灯塔组成了微滴定平板荧光阅读系统。Taqman和分子灯塔都依赖于等位基因特异性寡核苷酸杂交在PCR期间对等位基因进行区分。而Scorpion分析能使用等位基因特异性PCR或是等位基因特异性杂交反应[2]来区分等位基因。它们作为一个末端分析能在一个完全均质的反应条件下进行分析。在反应起始,所有试剂和基因组D NA都混合在一起,经热循环步骤后,荧光信号能被检测到。该反应既没有单独的预扩增步骤,也没有中间的处理过程,因此它们是一种最简单的分析方法。由于没有适合这些方法的384孔荧光检测器,以及荧光标记探针的价格过高和缺乏可靠的自动化基因型呼叫软件,因此阻碍了这些方法的发展。最近,Applied Biosystems公司新开发的7900HT型高通量荧光定量PCR仪,使得进行384孔微滴定平板荧光检测成为了可能,这主要归因于高通量能力的增加和反应容积的减少。当如果要发展更高的基因分型通量时,一个可靠的自动化等位基因呼叫能力是必须的,它不只是纠正基因型呼叫信号更快,而且在处理和加工数据上必须更迅速,更准确。近来研究表明,自动化基因型呼叫在无阳性对照情况下进行聚类分析是可行的[3]。 2焦磷酸测序Pyrosequencing 焦磷酸测序是对短到中等长度的D NA序列样品进行高通量、精确和重复性好的分析方法。其反应原理是当测序引物与PCR扩增的,单链D NA模板杂交,和各种酶包括D NA聚合酶、A TP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、以及底物、荧光素一起共同孵育。4种dN TP之一被加入反应体系,如与模板配对,该dNT P与引物的末端形成共价键,dN TP 的焦磷酸基团释放出来。A TP硫酸化酶在APS存在的情况下催化焦磷酸生成A TP,ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素的转化,氧化荧光素发出的可见光信号与ATP量成正比。A TP和未掺入的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解,光信号淬灭,并再生反应体系,然后再加另一种dN TP继续反应。焦磷酸测序最初作为D N A测序方法而发展起来的,其化学反应与Sanger双脱氧二核苷酸法完全不同。它无需灌胶、毛细管电泳,也无需同位素或荧光染料
什麼是高通量藥物篩選技術 現代藥品開發是一個非常複雜以及多科目牽涉的過程，其活動核心是辨別分子標靶( 研究對象) 的各類生物活性化合物。高通量藥物篩選技術越來越受到重視，它是結合藥理實驗、樣品管理、高靈敏度檢測以及數據採集和處理的一套自動化操作系統，確保能夠同時進行大量化合物檢索。在生物機制、細胞功能和基因研究方面，早已被廣泛應用，能夠解構有關化學組成與生物活動之間的關係。 在競爭激烈的藥業界，由藥物開發至臨床測試的時間越來越緊迫，傳統的藥物研究方法，即通過醫學方法和實驗動物進行藥物篩選，已不能滿足現代製藥的時間表。高通量藥物篩選技術運用實驗室自動化系統，搜集大量藥理學數據，例如，酵素活動，免疫分析(ELISA)以及生物活動幅度等，並整合成為一個龐大化學資料庫。 依據化學資料庫與自動化生物檢定方式，系統可於二十四小時內合成及測試過百甚至千種化合物。透過這套篩選技術，研究員可快捷而有效地認證一些具有特定生物活性的化合物、抗體或基因。因此，大大地增加藥品開發的成功率，並節省時間及成本。更重要的是，這套龐大的細胞生物及化學資料庫，可大大提高有關藥物臨床效用的預測。 頁頂利用高通量藥物篩選技術發展西藥 篩選新型藥品包括三大要素：生物標靶( 研究對象)、化合物及生物檢定法。由於基因研究及組合化學的發展，可供篩選的生物標靶和化合物已使一般生物檢定法不勝負苛。因此研究員專注於研發各種檢定方法，目的是為了增加篩選量，減少所需樣本量和增強檢測各項生物現象的靈敏度。 在50、60 年代，藥品的開發仍大多是意外發現的。至80 年代，新型藥品則透過系統地研究藥物的拮抗與受體間的相互作用而來。目前藥品開發方向，則朝向針對各類疾病為本，科學家試圖進一步了解疾病與它們的成因，利用這些知識來篩選某些合適的化合物。 高通量藥物篩選技術常用於藥品的初期開發，特別是當生物標靶被確認後，利用這項技術能有效節省篩選候選化合物所需的時間。因此，高通量藥物篩選技術已被各大醫藥發展研究公司廣泛應用。 頁頂高通量藥物篩選技術於中醫藥的應用 高通量藥物篩選技術亦用於傳統中草藥天然成分的分類及鑑定。首先將各類藥材初步提
高通量测序技术（High-throughput sequencing）又称“下一代”测序技术 （"Next-generation" sequencing technology），以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。 根据发展历史、影响力、测序原理和技术不同等，主要有以下几种：大规模平行签名测序（Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS)、聚合酶克隆（Polony Sequencing）、454焦磷酸测序（454 pyrosequencing）、Illumina (Solexa) sequencing、ABI SOLiD sequencing、离子半导体测序（Ion semiconductor sequencing）、DNA 纳米球测序（DNA nanoball sequencing）等。 高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing)足见其划时代的改变，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deep sequencing)。 实验过程 1.样本准备(sample fragmentation) 2.文库构建(library preparation) 3.测序反应(sequencing reaction) 4.数据分析(data analysis) 测序平台 自从2005年454 Life Sciences公司(2007年该公司被Roche正式收购)推出了454 FLX焦磷酸测序平台(454 FLX pyrosequencing platform)以来，因为他们的拳头产品毛细管阵列电泳测序仪系列(series capillary array electrophoresis sequencing machines)遇到了两个强有力的竞争对手，曾推出过3730xl DNA测序仪(3730xl DNA Analyzer)的Applied BioSystem(ABI)这家一直占据着测序市场最大份额的公司的领先地位就开始动摇了，一个就是罗氏公司(Roche)的454 测序仪(Roch GS FLX sequencer)，，另一个就是2006年美国Illumina公司推出的Solexa基因组分析平台(Genome Analyzer platform)，为此，2007年ABI公司推出了自主研发的SOLiD 测序仪(ABI SOLiD sequencer)。这三个测序平台即为目前高通量测序平台的代表。(见表一) 公司名称技术原理技术开发者 Apply Biosystems(ABI) 基于磁珠的大规模并行克隆连接 DNA测序法 美国Agencourt私人基因组学公司(APG) Illumina 合成测序法英国Solexa公司首席科学家David Bentley Roche 大规模并行焦磷酸合成测序法 美国454 Life Sciences公司的创始人Jonathan Rothberg Helicos 大规模并行单分子合成测序法美国斯坦福大学生物工程学家Stephen Quake Complete Genomics DNA纳米阵列与组合探针锚定连接 测序法 美国Complete Genomics公司首席科学家radoje drmanac 表一:主流测序平台一览 Roche 454焦磷酸测序 (pyrophosphate sequencing) Illumina Solexa 合成测序 (sequence by synthesize) Illumina Genome AnalyzerIIx测序原理 Illumina公司的新一代测序仪Hiseq 2000和Hiseq 2500具有高准确性，高通量，高灵敏度，和低运行成本等突出优势，可以同时完成传统基因组学研究(测序和注释)以及功能基因组学(基因表达及调控，基因功能，蛋白/核酸相互作用)研究。Hiseq是一种基于单分子簇的边合成边测序技术，基于专有的可逆终止化学反应原理。测序时将基因组DNA的随机片段附着到光学透明
高通量筛选技术 高通量筛选(high—throughout screening)是近年来迅速发展起来的药物筛选技术。高通量药物筛选就是应用分子细胞水平的药物活性评价方法（模型），通过自动化手段，对大量样品进行生物活性或药理作用的检测，发现新药的过程。高通量药物筛选的规模至少为每日筛选数千个样品。同时它通过运用基因科学、蛋白质科学、分子药理学、细胞药理学、微电子技术等多学科理论和技术，以及与疾病相关的酶和受体为作用靶点。对天然或合成化合物进行活性测试，并在此基础上进行筛选。高通量筛选具有快速、高效、经济、高特异性等优点，其中所用的样品量甚少的特点尤其适用于天然化合物的活性筛选。 高通量筛选可以根据待测样品的种类分为非细胞相筛选、细胞相筛选、生物表型筛选。其中非细胞相筛选常用的方法有Microbead—FCM 联合筛选、放射免疫性检测、荧光检测(FA)、闪烁接近检测、酶连接的免疫吸附检测(ELISA)等；细胞相筛选常用的方法有选择性杀死策略、离子通道检测、报告基因检测等；生物表型筛选可以有目的敲除或屏蔽掉某些未知功能的基因等等。 高通量筛选在抗病毒药物筛选中有很大的应用，介绍一些抗病毒药物筛选方法：利用亲合闪烁分析对HIV逆转录酶活性测定、HCV NS5B 活性测定、HCV NS3(nonstructural protein 3，NS3)解旋酶活性的测定；利用荧光共振能量转移对SARS—CoV病毒3CL 蛋白酶活性测定；
抗病毒药物的其它高通量筛选模型如病毒与宿丰细胞结合的细 胞模型、HCV NS3／4A蛋白酶活性测定、HIV整合酶(integrase，IN)活性的测定等等。 高通量筛选体内药动学模型中传统的药动学研究以测定药物在 体内的浓度及分布为主要手段。高通量筛选体外药动学模型中常用的筛选模型建立在组织、器官水平和细胞及亚细胞水平，观察的是药物与分子靶点的相互作用，能够直接体现药物的基本作用机制。高通量筛选的体内和体外筛选模型是互为补充、相辅相成的。体内药动学筛选模型可以很好地预测药物在体内的吸收、分布、代谢等药动学性质，但存在样品需求量大、筛选费用高、较难达到高通量筛选水平等缺陷。体外筛选模型可以对大量的候选化合物进行筛选，但它却忽略了生物的整体性，有时用其预测体内药动学参数并不一定理想，必须借助于体内筛选模型。 高通量筛选技术极大地提高了对目标分子、活性物质以及前导药物的筛选速度，当前HTS技术进一步向着高内涵筛选(HCS)技术发展。HCS技术是生物学、分析软件、自动化控制以及显微观测技术最新发展的综合运用，HCS的出现彻底改变了以细胞为基础的靶目标的确认、二次筛选、前导化合物优化和结构活性分析的传统方法引。随着科技的发展，HTS／HCS技术将不断向着微型化、自动化、高效化、低廉化和微量化方向发展。
在过去几年里，新一代DNA 测序技术平台在那些大型测序实验室中迅猛发展，各种新技术犹如雨后春笋般涌现。之所以将它们称之为新一代测序技术（next-generation sequencing），是相对于传统Sanger 测序而言的。Sanger 测序法一直以来因可靠、准确，可以产生长的读长而被广泛应用，但是它的致命缺陷是相当慢。十三年，一个人类基因组，这显然不是理想的速度，我们需要更高通量的测序平台。此时，新一代测序技术应运而生，它们利用大量并行处理的能力读取多个短DNA 片段，然后拼接成一幅完整的图画。 Sanger 测序大家都比较了解，是先将基因组DNA 片断化，然后克隆到质粒载体上，再转化大肠杆菌。对于每个测序反应，挑出单克隆，并纯化质粒DNA。每个循环测序反应产生以ddNTP 终止的，荧光标记的产物梯度，在测序仪的96或384 毛细管中进行高分辨率的电泳分离。当不同分子量的荧光标记片断通过检测器时，四通道发射光谱就构成了测序轨迹。 在新一代测序技术中，片断化的基因组DNA 两侧连上接头，随后运用不同的步骤来产生几百万个空间固定的PCR 克隆阵列（polony）。每个克隆由单个文库片段的多个拷贝组成。之后进行引物杂交和酶延伸反应。由于所有的克隆都是系在同一平面上，这些反应就能够大规模平行进行。同样地，每个延伸所掺入的荧光标记的成像检测也能同时进行，来获取测序数据。酶拷问和成像的持续反复构成了相邻的测序阅读片段。
Solexa高通量测序原理 --采用大规模并行合成测序法(SBS,Sequencing-By-Synthesis)和可逆性末端终结技术（ReversibleTerminatorChemistry） --可减少因二级结构造成的一段区域的缺失。 --具有高精确度、高通量、高灵敏度和低成本等突出优势 --可以同时完成传统基因组学研究（测序和注释）以及功能基因组学（基因表达及调控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究 ----将接头连接到片段上，经PCR扩增后制成Library。 ----随后在含有接头（单链引物）的芯片（flowcell）上将已加入接头的DNA片段变成单链后通过与单链引物互补配对绑定在芯片上，另一端和附近的另外一个引物互补也被固定，形成“桥” ----经30伦扩增反应，形成单克隆DNA簇 ----边合成边测序（Sequencing By Synthesis）的原理，加入改造过的DNA 聚合酶和带有4 种荧光标记的dNTP。这些dNTP是“可逆终止子”，其3’羟基末端带有可化学切割的基团，使得每个循环只能掺入单个碱基。此时，用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类。之后，将这些基团化学切割，恢复3'端粘性，继续聚合第二个核苷酸。如此继续下去，直到每条模板序列都完全被聚合为双链。这样，统计每轮收集到的荧光信号结果，就可以得知每个模板DNA 片段的序列。目前的配对末端读长可达到2×50 bp，更长的读长也能实现，但错误率会增高。读长会受到多个引起信号衰减的因素所影响，如荧光标记的不完全切割。 Roche 454 测序技术 “一个片段= 一个磁珠= 一条读长（One fragment =One bead = One read）”
高通量基因测序植入前胚胎遗传学诊断和筛查技术规范 根据国家卫生和计划生育委员会发布的《关于辅助生殖机构开展高通量基因测序植入前胚胎遗传学诊断临床应用试点工作的通知》要求，特制定《高通量基因测序植入前胚胎遗传学诊断技术规范（试行）》（以下简称“本规范”）。本规范针对“高通量基因测序技术在人类胚胎植入前遗传学诊断(pre-im-plantation genetic diagnosis,PGD)和植入前遗传学筛查(pre-implantation genetic screening,PGS)的临床应用”（以下简称“本项技术”），明确开展本项技术的基本条件、组织管理、临床流程与质量控制等方面的基本要求。在人类PGD/PGS 的临床应用中采用高通量基因测序技术（以下称本项检测）的机构须遵守本规范。 基本条件 一、机构设置条件 １．本项技术须在医疗机构实施； ２．该医疗机构必须是经省级医疗行政管理部门批准正式并规范运行体外受精－胚胎移植技术、卵胞浆内单精子注射技术和植入前遗传学
诊断技术且是实施本项技术的试点或正式运行单位（以下简称“机构”）； ３．机构须具有省级临床检验行政管理部门审批核发的临床基因扩增检验实验室资质，相关工作开展符合《临床基因扩增检验实验室工作规范》的规定。 二、设备条件 机构须具备细胞遗传学实验诊断的设备和上述第一部分第一条第３款所要求的相应设备。在此基础上，机构应同时具备专业的高通量测序技术相应的核心设备（如与第三方合作可由第三方提供），该设备由经卫生行政管理部门批准试点或正式开展高通量测序技术临床应用的单位生产。各种设备的种类、数量须与实际开展的项目及工作规模相匹配。 三、人员条件 １．实施本项技术的医疗机构必须建立与本项检测工作相适应的专业技术人员团队。其中包括：具备从事产前诊断技术资质的副高职称以上的临床医师2名以上（含2名，下同）；具备临床检验资质的中级职称以上的实验室技术人员１名以上；具备医学、生物学或遗传学本科及以上学历的专业技术人员3名以上；