大黄素抑制人结肠癌RKO 、
Caco －2细胞体外增殖作用的研究
左文英，陈媛媛，蔡骏，李真
（上海中医药大学附属龙华医院临床营养科，上海200032）
摘
要：目的：探讨大黄素对人结肠癌细胞株RKO 、
Caco －2的体外增殖的抑制作用。方法：MTT 比色法检测细胞活力；倒置显微镜显像观察细胞数量变化；FCM 检测细胞凋亡率及周期分布；Caspase －3分光光度法检测Caspase －3酶蛋
白活性。结果：随着作用时间的延长以及大黄素浓度的升高，大黄素对人结肠癌RKO 、
Caco －2细胞的体外增殖抑制作用增高；大黄素阻滞两种细胞于S 期，使G2/M 期细胞比率明显下降，激活Caspase －3酶蛋白；提高细胞凋亡率。结论：大黄素抑制人结肠癌细胞株RKO 、Caco －2体外增殖，其作用呈浓度、时间依赖性；大黄素能够阻滞RKO 、Caco －2细胞株细胞周期并激活Caspase －3诱导细胞凋亡。
关键词：大黄素；人结肠癌细胞；抑制增殖；细胞凋亡中图分类号：R735．35文献标志码：A 文章编号：1000－1719（2013）03－0580－03
Effects of Emodin on Proliferation and Apoptosis of Human Colon
Cancer Cell Lines RKO ，Caco －2in Vitro ZUO Wenying ，CHEN Yuanyuan ，CAI Jun ，LI Zhen
（Nutrition Department ，Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine ，Shanghai 200032，China ）
Abstract ：Objective ：To study the anti-tumor mechanisms of emodin on human colon cancer RKO and Caco －2cell lines．Methods ：RKO and Caco －2cells and culture media with different concentrations of emodin were co-incubated for 3days or 48h．Cell inhibition ratio ，cell proliferation cycle rate ，cell apoptosis and caspase －3activity were determined by MTT colorimetric as-say ，inverted microscope ，flow cytometry analysis and Caspase －3Colorimetric Assay Kit．Results ：Emodin inhibited the prolifera-tion of the two cells at S phase ，decreased the cell ratio at G2/M phase and activated the Caspase －3protein．It suppressed the growth of each tumor cells and raised the apoptotic rate in a concentration and time depending manner in a certain range．Conclu-sion ：Emodin can inhibit the proliferations of human colon cancer cell lines RKO and Caco －2in vitro in a dose-dependent and time-dependent manner ，block cell cycle ，and promote cell apoptosis through caspase －3pathway．
Key words ：emodin ；human colon cancer cell ；inhibiting proloferation ；apoptosis
收稿日期：2012－09－07
基金项目：上海市卫生局科研计划项目（2007119）
作者简介：左文英（1985－），女，江西人，医师，硕士，研究方向：中西医
结合防治消化道肿瘤。
通讯作者：蔡骏（1966－），男，上海人，教授、主任医师，硕士，研究方向：
中西医结合外科、临床营养，E-mail ：caijun509@yahoo．com．cn 。
大黄素（Emodin ，
EM ）是中药大黄的主要有效成分，是一种蒽醌类物质（6－甲基－1，3，8三羟蒽醌1，3，8－trihydroxy －6－methylanthraquinone ），可抑制肺
癌、
肝癌、胰腺癌、宫颈癌、前列腺癌等多个系统的肿瘤细胞生长，诱导多种肿瘤细胞发生凋亡［1－7］
。研究显示，大黄素通过抑制肿瘤细胞的增殖，阻滞细胞周期进程，促进肿瘤细胞的凋亡，抑制肿瘤血管生成和侵袭、转移，增加肿瘤的化疗敏感性和逆转肿瘤多药耐药，减轻化疗药物毒副反应等多种机制表现出强大的抗肿瘤
效应［8］
。本实验选择不同浓度的大黄素作用于人结肠癌细胞株RKO 、Caco －2，观察大黄素对此两种人结肠
癌细胞的体外增殖作用影响并探讨其可能机制。
1材料与方法1.1
材料
不同分化程度人结肠细胞株癌RKO 、
Caco －2购自中国科学院上海生命研究院细胞资源中心。DMEM 培养基（Invitrogen ，美国）；胎牛血清（GIBICO ，美国）；DMSO （Sigma ，美国）；MTT （Sigma ，美国）；大黄素Emodin （Sigma ，美国，纯度≥98%，以DMSO 和无血清培养基DMEM 配置成50mM 的母液，
－20?保存）；胰蛋白酶（Amresco ，美国）；其他常规试剂均为国产分析纯。台式酶标仪SpectraMax M5Microplate Reader （Molecular Devices ，日本）；倒置显微镜（Olympus ，日本）；流式细胞仪（BD FACSCalibur ，美国）；Caspase －3Colorimetric As-say Kit （GenScript ，美国）。1.2
细胞培养
用含10%胎牛血清的DMEM 完全培
养液，
置于含37?、5%CO 2、100%湿度培养箱中培养不同分化程度人结肠癌细胞株RKO 、Caco －2。0.25%胰蛋白酶消化、传代细胞。1.3
MTT 比色法检测细胞活性
取对数生长期的
RKO 、HT －29、Caco －2细胞，按每孔5?103
个细胞接
种于96孔板，
贴壁24h 后换液，随后分为对照组和实
验组（12.5、25、50、100μM大黄素），共5组。每组均设6个复孔，于37?、5%CO2孵箱中分别培养24h、48h和72h。实验终止前每孔100μL0.5MTT继续培养4h后弃去孔内液体，加入DMSO振荡10min后，用酶联免疫检测仪于490nm波长处测定每孔的OD值，求出每一组的平均OD值，计算细胞抑制率。细胞抑制率=（1－用药组OD值?对照组OD值）?100%。
1.4流式细胞术检测细胞凋亡率及细胞周期改变
取对数生长期的RKO、Caco－2细胞，按每皿7?105个细胞接种于6cm培养皿中，置于5%CO2、37?孵箱中培养24h，每细胞分为对照组和实验组（50μM大黄素）。培养48h后，收集细胞，加入预冷75%乙醇，4?冰箱内过夜保存；次日加入RNA酶（10mg/mL）10μL，30min后加碘化丙啶（PI）至终浓度为50μg/mL，避光；流式细胞仪上进行细胞周期及细胞凋亡率分析。ModFit LT软件处理结果。
1.5倒置显微镜形态学观察将1.4实验中各组细胞终止培养时，置于倒置显微镜上，10?20倍镜下成像。
1.6Caspase－3分光光度法检测Caspase－3酶活性
取对数生长期的RKO、Caco－2细胞，按每皿7?105个细胞接种于6cm培养皿中，置于5%CO2、37?孵箱中培养24h，按上述1.4方法分组加药培养48h，收集细胞，按照Caspase－3Colorimetric Assay Kit说明书检测Caspase－3酶活性。
1.7统计学方法全部统计分析采用SPSS16.0软件进行，实验数据均以珋
x?s表示，组间比较均采用Dunnet－t检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。2结果
2.1大黄素对人结肠癌RKO、Caco－2细胞株的抑制率变化各浓度培养24h、48h、72h后，RKO、Caco－2两组对照组细胞均生长迅速，各浓度大黄素对两种不同分化程度的细胞均有不同程度的抑制作用，抑制率随作用时间延长和浓度升高而增长。见表1、图1。
表1大黄素对人结肠癌
RKO、Caco－2细胞的抑制率变化（n=6，珋x?s）
组别
（大黄素）
24h48h72h RKO100μM31.89?6.401＊◇△50.74?3.337＊△57.41?4.370* 50μM13.37?6.791＊◇△29.11?6.567*32.41?3.672*
25μM 6.777?7.5309.710?5.24313.36?5.894*
12.5μM 3.589?3.440△ 4.920?1.480△9.180?3.830*
对照组0.000?0.2760.000?2.2840.000?0.494 Caco－2100μM50.79?5.688＊◇△55.92?3.429＊△78.85?2.844* 50μM30.13?5.386＊△34.54?5.789＊△43.04?4.597*
25μM13.46?4.072＊◇△24.79?7.266*28.88?6.840*
12.5μM 2.814?2.206◇△12.78?4.167*13.51?7.241*
对照组0.000?5.7440.000?3.3990.000?6.997注：与同一时间段的对照组相比，*P＜0.05；与48h相比，◇P＜0.05；与72 h相比，△P＜0.05。
2.2倒置显微镜形态学观察RKO对照组多为梭形，HT－29对照组多为类圆形成团生长，经各浓度大黄素处理后，表现细胞体积缩小、间隙变大，细胞数减少。同理可见Caco－2对照组细胞多呈不规则型片状生长，经大黄素处理后，表现细胞体积缩小、形态变圆，细胞数量下降。见图2
。
图1不同浓度大黄素对人结肠癌RKO、
Caco－2
细胞体外增殖的影响
图2倒置显微镜观察（?200）
2.3大黄素对RKO、Caco－2细胞细胞周期及细胞凋亡的影响如表2所示，50μM大黄素的培养基与对照组培养两种细胞48h后，收集全部培养细胞进行流式细胞术检测，各细胞G2/M期对照组细胞比率明显高于大黄素组（P＜0.05），而S期却低于对照组，表明大黄素阻滞人结肠癌RKO、Caco－2细胞于S期。50μM大黄素对RKO、Caco－2细胞凋亡率分别为（18.66?0.35）%、（5.20?0.07）%，明显高于对照组（P＜0.05），见表2、图3。
表250μM大黄素对RKO、Caco－2
细胞凋亡率以及细胞周期的影响（%，n=3，珋x?s）
组别细胞凋亡率G0/G1期S期G2/M期RKO，对照组063.99?0.2027.20?0.258.81?0.43 RKO，大黄素50μM18.66?0.35*65.50?1.9634.44?1.57*0.41?0.38*
Caco－2，对照组0.02?0.0256.09?1.1730.16?0.7417.74?1.91 Caco－2，大黄素50μM 5.20?0.07*51.66?0.0148.18?0.26*0.15?0.27*
注：与对照组相比，*P＜0.05。
2.4大黄素对两种细胞中Caspase－3活性的影响
50μM大黄素与对照组培养48h后，Caspase－3酶活
性表达分别为：RKO细胞大黄素组为（4.02?0.005）OD405/mg蛋白，对照组（1.05?0.003）OD405/mg蛋白；Caco－2细胞大黄素组Caspase－3活性为（2.76?0.005）OD405/mg蛋白，对照组（1.34?0.004）OD405/mg蛋白。见图4
。
图350μM大黄素对RKO、Caco－2
细胞周期及凋亡作用的影响
图450μM大黄素对RKO、Caco－2Caspas－3活性的影响
3讨论
大黄是中医常用中药之一，大黄素作为大黄中提
取的主要有效成分，属于天然蒽醌类衍生物，具有抗
炎、抗菌、抗氧化、免疫调节等多种生物活性［9］。体外
研究表明，大黄素提取物大黄素、芦荟大黄素、大黄酸
处理可诱导多种肿瘤细胞系凋亡的发生，主要有：人肺
鳞片癌细胞CH27，人肺非小细胞癌细胞H460，早幼粒
白血病细胞株HL－60，人口腔鳞癌细胞KB，人肝癌细
胞系BEL－7402、HCC、Mah/avu、PLC/PRF/5和
HepG2及Hep3B等［10］。关于大黄素抑制肿瘤细胞体
外增殖、阻滞细胞周期、诱导肿瘤细胞凋亡的作用报道
也越来越多，实验表明对于不同的细胞株，其作用机制
并不一致［1－7，11］。
目前关于大黄素对结肠癌RKO、Caco－2细胞增
殖作用及机制的研究尚未见报道。为此本实验选用两
种不同分化程度的人结肠癌细胞，观察大黄素对其抑
制作用的不同及机理研究。结果显示：大黄素浓度、时
间依赖性抑制RKO、Caco－2细胞增殖，并提示大黄素
作用机制可能与其阻滞细胞周期相关：各细胞G2/M
期对照组细胞比率明显高于大黄素组（P＜0.05），而S
期却低于对照组。表明大黄素阻止此两种人结肠癌细
胞从S期进入G2/M期。这与很多研究不同，有报道
发现［1－2］：大黄素可在G0/G1期阻滞人肺腺癌Anip973
细胞的增殖，使S期细胞比率降低并激活Caspase－3
蛋白；通过下调c－myc的表达阻止人髓系白血病细
胞株HL－60细胞进入S期，从而也阻滞于G0/G1
期［10］；抑制多种人肝癌细胞系的生长并激活P53和
P21蛋白表达，从而阻断HepG
2
/C3A细胞周期停滞于
G
2
/M期［3］。说明大黄素对不同细胞的细胞周期的作
用是不同的，这可能与细胞生物特性以及大黄素靶向
作用有关。
实验同时证实大黄素是通过诱导细胞凋亡来实现
抑制增殖的作用：48h各浓度大黄素，对RKO、Caco－
2细胞均有诱导凋亡作用。大黄素是通过激活
Caspase－3酶活性来诱导细胞发生凋亡（P＜0.05）。
大黄素呈浓度、时间依赖性抑制人结肠癌细胞株
RKO、Caco－2细胞增殖，阻滞细胞周期、激活Caspase
－3诱导细胞凋亡。这为中草药在结肠癌防治的应用
提供实验研究资料，但由于大黄素作用靶点的不同以
及细胞分化程度的不同，尚不能完全解释具体的详细
机制，还需进一步研究。
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