LAMP原理及引物设计与实例021-********-852
(2010-08-11 16:38:44)
http://primerexplorer.jp/e/v3_manual/index.html
http://www.bioask.me/html/346.html
标签：
杂谈
1．LAMP引物的设计
LAMP引物的设计主要是针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3' 端的F3c、F2c和Flc区以及5' 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。
FIP(Forward Inner Primer)：上游内部引物，由F2区和F1C区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基因5' 端的Flc区域序列相同。
F3引物：上游外部引物(Forward Outer Primer)，由F3区组成，并与靶基因的F3c区域互补。
BIP引物：下游内部引物(Backward Inner Primer )，由B1C和B2区域组成，B2区与靶基因3' 端的B2c区域互补，B1C域与靶基因5' 端的Blc区域序列相同.
B3引物：下游外部引物(Backward Outer Primer )，由B3区域组成，和靶基因的B3c区域互补。
2．扩增原理
60-65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65℃左右处于动态平衡状态。因此，DNA在此温度下合成是可能的。利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶。使得链置换DNA合成在不停地自我循环。扩增分两个阶段。
第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合，在链置换型DNA聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链。FIP上的F1c与此单链上的Fl为互补结构。自我碱基配对形成环状结构。以此链为模板。下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链。迅速以3' 末端的Fl区段为起点。以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构。该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。
第2阶段是扩增循环阶段。以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c区结合。开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3’末端的B1区段为起点，以自身为模板。进行DNA合成延伸及链置换．形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交。启动新一轮扩增。且产物DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动链置换合成，周而复始。扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物。且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。
https://www.doczj.com/doc/2b19121821.html,MP的特点
LAMP与以往的核酸扩增方法相比具有如下优点：
(1)操作简单，LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，对于中小医院只需要水浴锅即可，产物检测用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度即可判断。对于RNA 的扩增只需要在反应体系中加入逆转录酶就可同步进行(RT．LAMP)，不需要特殊的试剂及仪器。
(2)快速高效，因为不需要预先的双链DNA热变性．避免了温度循环而造成的时间损失．核酸扩增在l h内均可完成，添加环状引物后时间可以节省1／2，多数情况在20。30 rain均可检测到扩增产物。且产物可以扩增至109倍，达0.5 mg／mL．应用专门的浊度仪可以达到实时定量检测。
(3)高特异性，由于是针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物。6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增。故其特异性极高。
(4)高灵敏度，对于病毒扩增模板可达几个拷贝，比PCR高出数量级的差异。缺点：由于LAMP扩增是链置换合成，靶序列长度最好在300 bp以内。>500 bp则较难扩增。故不能进行长链DNA的扩增。由于灵敏度高。极易受到污染而产生假阳性结果。故要特别注意严谨操作，以及在产物的回收鉴定、克隆、单链分离方面均逊色于传统的PCR方法。
4.引物设计实例
LAMP引物设计的在线网站(http://primerexplorer.jp/e/)，只要导入靶基因就能自动生成成组引物。
https://www.doczj.com/doc/2b19121821.html,/index.php?Keyword=lamp&Type=ProductName&act=se arch
以某一微生物的鞭毛基因为例讲解一下LAMP相物设计的过程：
首先，单击浏览按钮选择靶基因序列文件，靶序列默认的是小于22 kbp。支持三个类型的文件，普通文本格式（仅含序列）。FASTA格式和GenBank 格式文件。
第二，从下面三个选项中选择定参数设定（引物设计条件）条件。基于GC含量的自动判断, 起始的参数是特定的：如果GC含量小于或等于45%，则选取AT丰度高的区，如果GC含量高于60%，则选取GC丰度高的区,其它情况是标准设定状态。
公司名称：上海天呈科技有限公司
网址：
https://www.doczj.com/doc/2b19121821.html,/index.php?Keyword=lamp&Type=ProductName&act=se arch
电话：许先生138******** 021-********-852
LAMP原理及引物设计与实例021-********-852
(2010-08-11 16:38:44)
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杂谈
1．LAMP引物的设计
LAMP引物的设计主要是针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3' 端的F3c、F2c和Flc区以及5' 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。
FIP(Forward Inner Primer)：上游内部引物，由F2区和F1C区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基因5' 端的Flc区域序列相同。
F3引物：上游外部引物(Forward Outer Primer)，由F3区组成，并与靶基因的F3c区域互补。
BIP引物：下游内部引物(Backward Inner Primer )，由B1C和B2区域组成，B2区与靶基因3' 端的B2c区域互补，B1C域与靶基因5' 端的Blc区域序列相同.
B3引物：下游外部引物(Backward Outer Primer )，由B3区域组成，和靶基因的B3c区域互补。
2．扩增原理
60-65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65℃左右处于动态平衡状态。因此，DNA在此温度下合成是可能的。利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶。使得链置换DNA合成在不停地自我循环。扩增分两个阶段。
第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合，在链置换型DNA聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链。FIP上的F1c与此单链上的Fl为互补结构。自我碱基配对形成环状结构。以此链为模板。下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链。迅速以3' 末端的Fl区段为起点。以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构。该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。
第2阶段是扩增循环阶段。以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c区结合。开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3’末端的B1区段为起点，以自身为模板。进行DNA合成延伸及链置换．形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交。启动新一轮扩增。且产物DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动链置换合成，周而复始。扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物。且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。
https://www.doczj.com/doc/2b19121821.html,MP的特点
LAMP与以往的核酸扩增方法相比具有如下优点：
(1)操作简单，LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，对于中小医院只需要水浴锅即可，产物检测用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度即可判断。对于RNA 的扩增只需要在反应体系中加入逆转录酶就可同步进行(RT．LAMP)，不需要特殊的试剂及仪器。
(2)快速高效，因为不需要预先的双链DNA热变性．避免了温度循环而造成的时间损失．核酸扩增在l h内均可完成，添加环状引物后时间可以节省1／2，多数情况在20。30 rain均可检测到扩增产物。且产物可以扩增至109倍，达0.5 mg／mL．应用专门的浊度仪可以达到实时定量检测。
(3)高特异性，由于是针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物。6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增。故其特异性极高。
(4)高灵敏度，对于病毒扩增模板可达几个拷贝，比PCR高出数量级的差异。缺点：由于LAMP扩增是链置换合成，靶序列长度最好在300 bp以内。>500 bp则较难扩增。故不能进行长链DNA的扩增。由于灵敏度高。极易受到污染而产生假阳性结果。故要特别注意严谨操作，以及在产物的回收鉴定、克隆、单链分离方面均逊色于传统的PCR方法。
4.引物设计实例
LAMP引物设计的在线网站(http://primerexplorer.jp/e/)，只要导入靶基因就能自动生成成组引物。
https://www.doczj.com/doc/2b19121821.html,/index.php?Keyword=lamp&Type=ProductName&act=se arch
以某一微生物的鞭毛基因为例讲解一下LAMP相物设计的过程：
首先，单击浏览按钮选择靶基因序列文件，靶序列默认的是小于22 kbp。支持三个类型的文件，普通文本格式（仅含序列）。FASTA格式和GenBank 格式文件。
第二，从下面三个选项中选择定参数设定（引物设计条件）条件。基于GC含量的自动判断, 起始的参数是特定的：如果GC含量小于或等于45%，则选取AT丰度高的区，如果GC含量高于60%，则选取GC丰度高的区,其它情况是标准设定状态。
公司名称：上海天呈科技有限公司
网址：
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核酸环介导等温扩增技术（LAMP）引物设计与实例Time：2009-12-07 PM 14:52 Author:bioer Hits:烟头整理
LAMP的特点
LAMP与以往的核酸扩增方法相比具有如下优点：
(1)操作简单
LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，对于中小医院只需要水浴锅即可，产物检测用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度即可判断。对于RNA的扩增只需要在反应体系中加入逆转录酶就可同步进行(RT-LAMP)，不需要特殊的试剂及仪器。
(2)快速高效
因为不需要预先的双链DNA热变性，避免了温度循环而造成的时间损失。核酸扩增在l h内均可完成，添加环状引物后时间可以节省1/2，多数情况在20-30 rain均可检测到扩增产物。且产物可以扩增至109倍，达0.5 mg/mL。应用专门的浊度仪可以达到实时定量检测。
(3)高特异性
由于是针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物。6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增。故其特异性极高。
(4)高灵敏度
对于病毒扩增模板可达几个拷贝，比PCR高出数量级的差异。
缺点：
由于LAMP扩增是链置换合成，靶序列长度最好在300 bp以内。>500 bp则较难扩增。故不能进行长链DNA的扩增。由于灵敏度高。极易受到污染而产生假阳性结果。故要特别注意严谨操作，以及在产物的回收鉴定、克隆、单链分离方面均逊色于传统的PCR 方法。
引物设计实例
LAMP引物设计的在线网站(http://primerexplorer.jp/e/)，只要导入靶基因就能自动生成成组引物。
以某一微生物的鞭毛基因为例讲解一下LAMP引物设计的过程：
首先单击浏览按钮选择靶基因序列文件，靶序列默认的是小于22 kbp。支持三个类型的文件，普通文本格式（仅含序列）, FASTA格式和GenBank 格式文件。
第二，从下面三个选项中选择定参数设定（引物设计条件）条件。基于GC含量的自动判断, 起始的参数是特定的：如果GC含量小于或等于45%.，则选取AT丰度高的区,如果GC含量高于60%，则选取GC丰度高的区,其它情况是标准设定状态。
设计合适的引物是进行LAMP反应的关键，通过考虑碱基组成，GC含量，二级结构的形成，Tm值等因素可以通过Pimer Explore)(一种专门设计LAMP引物的软件)来设计LAMP反应的引物。
在进行LAMP引物设计的时候有以下几个关键点需要考虑：
1. 引物之间的距离
F2区段的5’端到B2区段的5’端(LAMP反应扩增的区域)之间的距离建议是120~180bp。F3区段的3’端到F2区段的5’端之间的距离是0~20bp(同理B2和B3之间的距离是0~20bp)。F2区段的5’端到F1区段的5f端(形成环的部分)之间的距离是40~60bp。
2. 引物的Tm值
引物的Tm值采用近邻分析法(the nearest-neighbor method)来计算，这种方法是目前认为
计算值最接近真实值的一种方法。计算Tm值的时候会受到盐浓度(salt concentration)、寡核苷酸的浓度等实验条件的影响，所以最好是在确定的实验条件下来计算Tm值。
例如：寡核苷酸的浓度为0.1μmol，钠离子的浓度是50mM,镁离子的浓度4 mM等。
Tm(退火温度=△h*1000/[△S+Rln(C/4)]-273.15+16.6log[Na+]
式中，Tm为退火温度，℃；为摩尔气体常数，1. 987ca1/℃?mol ；△H为焓变；△s 为熵变；C为寡聚核苷酸的浓度；[Na+]为钠离子浓度。
对于GC含量正常或是GC含量富集的引物Tm值为60~65℃，而对于AT富集的引物Tm值为55~60℃。在设计引物的时候，F1c和B1c的Tm值大概是65℃(64~66℃), F2,B2, B31的Tm值大概是60℃(59~61℃)。
3. 引物末端的稳定性
引物的末端作为DNA合成的起点必须有一定的稳定性，自由能改变值(△G)是指反应物的自由能与产物的自由能之差，反应朝着自由能减小的方向运行。引物和目的基因之间的退火反应是一个动态平衡的反应，自由能改变值(△G)越小，引物与模板之间的退火反应越容易发生。
一般在进行引物设计的时候，F2/B2\F3/B3的3’端和F1 c/B1c的5’端的自由能改变值小于或等于-4Kcal/mol。F1C的5’端扩增以后相当于F1的3’端，所以它的稳定性很重要。
4. GC含量
引物在设计的时候使其GC含量介于40%~65%之间，但是当引物的GC含量介于50%~60%时，引物的质量相对好一些。
5. 二级结构
引物在设计的时候要防止形成二级结构，这一点是十分重要的，特别是内引物。
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