作者简介
梁锦锋（１９７６－），男，浙江临海人，在读博士，讲师，从事植物
药物化学和分子生物学研究。
收稿日期２００７!０４!０２
２０世纪７０年代，基因工程的出现使人们在分子水平
上对目的基因进行克隆成为可能，并引起了研究者广泛的兴趣。至今，各种植物抗性基因以及提高植物品质的相关基因克隆已取得较好结果并部分商品化，涉及植物发育遗传调控与信号转导如导致合子形成和胚胎发育、调控花粉管生长、控制叶片发育和根发育、营养细胞和生殖器官细胞分化等相关基因的克隆也取得巨大进展。模式植物结构基因组的相继阐明，多种植物高密度分子标记连锁图谱的构建、大片段ＤＮＡ克隆系统的建立，序列测定技术和基因遗传转化技术的发展，使得更多未知基因的克隆成为可能。随着
ｇｅｎｅｂａｎｋ中数据的急剧增加，分子操作技术的日渐完备以
及研究基因差异性表达的重大意义，表达序列标签技术、同源序列技术、图位克隆和差异表达基因分离等技术将越来越受重视。为此，笔者对植物新克隆策略和技术发展进行了综述。
１基于表达序列标签（ＥＳＴ）的基因克隆
ＥＳＴ是一段长约１５０￣５００ｂｐ的基因表达的外元序列片
段，是完整基因上能特异性标记基因的一段序列，通常包含了基因足够的结构信息区。随着基因组作图技术和大规模测序技术的发展和日渐成熟，植物基因组研究，如遗传图谱、物理图谱、全基因组测序以及功能基因组学等将全面展开，通过数据库查询、ｃＤＮＡ文库直接测序、ｍＲＮＡ差别显示（ＤＤＲＴ!ＰＣＲ）、代表性差示分析（ＲＤＡ）和抑制差减杂交（ＳＳＨ）等方法获得的ＥＳＴ数据也必将呈加速度增长。因此，在现代基因工程研究中如何借用现代生物信息学手段充分利用ＥＳＴ克隆新基因也越来越为重要。１９９１年，美国国立卫生研究院生物学家Ｖｅｎｔｅｒ首先提出了发现表达基因的新战略，即用表达序列标签（ＥｘｐｒｅｓｓｅｄＳｅｑｕｅｎｃｅＴａｇ，ＥＳＴ）克隆和定位新基因。这一构想的具体过程是将ｍＲＮＡ在体外反转录成ｃＤＮＡ后克隆到载体上，构建ｃＤＮＡ文库，再从ｃＤＮＡ文库中大规模随机挑选ｃＤＮＡ克隆，对其３′端或５′端进行一步法测序获得ＥＳＴ。利用ＥＳＴ克隆基因和分析基因表达使得克隆和定位新基因的策略发生了革命性的变革。近年来，三大国际一级生物信息数据库ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ、ＧｅｎＢａｎｋ新收录的核酸序列数据中，ＥＳＴ占６５％以上。ＧｅｎＢａｎｋ数据库中收录的ＥＳＴ序列有数百万个之多，如拟南芥的ＥＳＴ有
１０万余个，水稻有４万余个，玉米有７万余个。我国也计划
在未来的几年中获得水稻的ＥＳＴ１０万个。由于ＥＳＴ代表着
一段表达基因序列，这就可用ＥＳＴ或多个ＥＳＴ序列组装的基序与公共数据库的基因进行“电子杂交”，进而可以从理论上推测其所代表的基因的功能。经电子杂交基因筛选后的ＥＳＴ及其延伸基序可作为某一基因标签，结合ＰＣＲ技术克隆新基因，其过程如下：首先以该标签序列提供的信息设计合成基因特异引物（ＧＳＰ），再用Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）对ｍＲＮＡ进行反转录的同时加上锚定引物，然后在总ＲＮＡ中，采用ｃＤＮＡ末端快速扩增（ＲＡＣＥ）技术，获得目的基因的全长序列；或者是用该标签序列提供的信息设计引物，合成探针对ｃＤＮＡ文库进行筛选，挑取最长的阳性克隆进行测序，以期获目的基因。
基于ＥＳＴ电子杂交的基因克隆为预测基因序列和功能提供了经济快捷的手段和大量信息，但由于ｍＲＮＡ在不同时空的丰度差异、反转录酶的误配、同功密码子的存在、物种间的特异性、电子杂交对错误碱基的敏感性等，常造成预测的精度较低。因此，在序列分析时应用多种综合软件如
ＧｅｎｅＳｃａｎ、Ｐｈｒｅｄ、Ｐｏｌｙｐｈｒｅｄ等相结合，使候选序列同见于２
个或２个以上的文库，以有效排除假阳性结果。
２基于同源序列的候选基因法
这是一种克隆基因的新策略。根据基因家族保守氨基
酸序列设计简并引物，并用简并引物对含目的基因的ＤＮＡ文库进行扩增，再对扩增产物进行扩增、克隆和鉴定。如通过对已克隆的抗性基因蛋白序列的分析，发现这些抗病基因所编码的蛋白都存在同源序列，如富含亮氨酸重复区（ＬＲＲ）、核苷酸结合位点（ＮＢＳ）、蛋白激酶（ＰＫ）等，所以人们设想用同源序列来克隆新的抗病基因。王石平等根据这些保守序列设计合成了特异性和兼并性引物，对水稻基因组ＤＮＡ进行扩增，得到了１００个大小不同的克隆，定位了
２６个克隆，其中的１０个克隆与８个已定位的水稻抗病基
因在分子标记连锁图上的位置对应或毗邻，这表明这些克隆的抗病基因在染色体位置上有较好的对应关系，证明了同源序列分离和克隆基因的可能性。黄烈健等根据已克隆的抗病基因同源序列设计引物，对玉米ＤＮＡ进行扩增、克隆并对克隆进行测序，测序结果表明与Ｇｅｎｂａｎｋ进行序列同源性比较，二者达８５％以上。该法的长处在于：若同源序列与抗病基因紧密连锁或带有抗性基因的同源序列，则可用其作探针来筛选基因组文库，获得侯选基因，但植物基因组中有许多与ＬＲＲ或ＮＢＳ同源的区域，其功能并不都是与抗病有关，所以，该技术应与图位克隆技术结合使用。同源序列技术存在的问题也是值得重视和思考的：①由于密码子的简并性和不同同源序列间同源程度的差异，简并引物
植物新基因克隆策略和技术进展
梁锦锋１，于红卫２，叶国平３
（１．浙江林学院林业与生物技术学院，浙江临安３１１３００；２．浙江林学院工程学院，浙江临安３１１３００；３．浙江省临海市林特局，浙江临海３１７０３６）
摘要对基于表达序列标签（ＥＳＴ）的基因克隆、
基于同源序列的候选基因法、基因图位克隆、基因转座子标签技术和差异表达基因分离技术等植物新基因克隆策略和技术进行了总结，并对其优缺点进行了简要介绍。关键词基因克隆；表达序列标签；同源序列；图位克隆；转座子
中图分类号Ｑ７８文献标识码Ａ文章编号０５１７－６６１１（２００７）２３－０７１１２－０３
安徽农业科学，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｈｕｉＡｇｒｉ．Ｓｃｉ．２００７，３５（２３）：７１１２－７１１４责任编辑姜丽责任校对王淼
的特异性要设计得当；②由于某些同源序列并不专属于某一家族，因而扩增产物不一定是某一基因家族的成员；③基因家族成员成簇存在，克隆的基因片段是否为目的基因尚需进一步判断。因此，对ＰＣＲ扩增产物和克隆产物，有必要进行基因与性状共分离分析、插入失活或遗传转化等功能鉴定，以便最终筛选到目的基因。
３图位克隆技术
是近几年随着各种植物分子标记图谱的相继建立而发展起来的一种基因克隆技术，是根据功能基因组中都有相对稳定的基因座，在利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上，用与目标基因两侧紧密连锁的分子标记筛选含有大的插入片段的基因组文库（如ＢＡＣ和ＹＡＣ），用筛选到的阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群，通过染色体步行、登陆或跳跃获得含有目标基因的大片段克隆，将含有目标基因的大片段克隆进行亚克隆，或以大片段克隆作探针筛选ｃＤＮＡ文库；从而将目标基因确定在一个较小的ＤＮＡ片段上并进行序列分析，通过遗传转化和功能互补试验分析，鉴定获得目的基因。Ｇｉｒａｕｄａｔ等成功地克隆了与拟南芥种子形成和发芽有关的脱落酸信号传导基因ＡＢＩ３；Ａｒｏｎｄｅｌ等则克隆到拟南芥脂肪酸脱饱和基因酶基因ＦＡＤ３；利用图位克隆技术克隆到的抗病基因主要有番茄Ｐｔｏ、拟南芥ＲＰＳ２、ＲＰＭ１和ＮＰＲ１以及水稻Ｘａ２１和Ｐｉ#ｂ基因。图位克隆技术依赖于高密度的分子标记图谱，而随着许多高密度的遗传图谱不断获得，实现基因图位克隆的关键是筛选与目标基因连锁的分子标记，寻找与目标基因连锁的分子标记的方法主要有２种：一是利用近等基因系，即通过检测近等基因系间分子标记多态性来确定目标基因与分子标记的遗传连锁关系；二是利用分离群体分组分析法（ｂｕｌｋｅｄｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ，ＢＳＡ），对于尚没有分子连锁图谱或虽有图谱但连锁密度不高的植物，以及分离没有近等基因系的目的基因，适合应用这种方法。
４转座子标签技术
转座子是ＭｃＣｌｉｎｔｏｃｋ首先在玉米中发现的，之后在金鱼草、飞燕草、甜豌豆、细菌、酵母、拟南芥和一些多细胞绿藻等植物中也发现了转座子的存在。２０世纪８０年代中期人们在了解转座子的遗传特性和分子结构的基础上，开始用转座因子作为分子标签来分离由于它的插入而引起突变的基因，在植物中利用的转座子有Ａｃ／Ｄｓ、Ｅｎ／Ｓｐｍ和Ｍｕｔａｔｏｒ，其中应用最多的是Ａｃ／Ｄｓ双因子系统。由转座子引起的突变可以转座子ＤＮＡ为探针，从纯合突变株构建的基因组文库中筛选含该转座子的同源片段，并获得含有部分突变株ＤＮＡ序列的克隆，进而以该ＤＮＡ为探针，筛选野生型的基因组文库，最终得到完整的基因。Ｊｏｈａｌ等利用转座子克隆到玉米抗圆斑病基因ＨＭ１，这是第一个克隆的功能产物未知的植物抗病基因；Ｊｏｎｅｓ等利用Ａｃ／Ｄｓ系统克隆到番茄抗叶霉病基因ｃｆ２９；Ａａｒｔｓ等利用Ｅｎ／Ｓｐｍ克隆到拟南芥菜的一个雄性不育基因；Ｃｕｉ等利用Ｍｕｔａｔｏｒ克隆到了玉米胞质一个恢复基因。利用转座子标记技术，目前已克隆到的植物抗病基因有玉米抗圆斑病基因Ｈｍ１、Ｈｍ２，番茄抗叶霉病基因Ｃｆ#２，Ｃｆ#４，Ｃｆ#５．Ｃｆ#９及Ｃｆ#ＥＣＰ２，烟草抗花叶病毒病基因Ｎ，亚麻抗锈病基因Ｌ６，Ｍ。这些均表明该技术是目前分离克隆抗病基因的有效工具之一。该技术的优点在于：①分离基因不需要预先知道被标签产物的结构、性质，因此那些背景尚不清楚的如发育、抗病及与生理过程有关的基因都有可能用该法来分离；②转座子插入引起的突变会由于转座子的切离而回复；③由于转座子总是沿其邻近的位点转座，因此只要转座子在染色体上定位后，就很容易确定与其连锁的突变基因的相对位置；④如果把转座子导入目标植物，通过自交、杂交、回交等方法便可得到一个较大的含不同插入位点的转座子群体；⑤把转座子导入异源植物不受转化条件的限制。但转座子标签技术的推广还存在一些困难，如筛选鉴定转座元件引起的表型突变体都是在个体水平上进行的，因而工作量非常大；而且，定向标签还要求有隐性纯合体可进行杂交；由于一些植物很难获得转座子突变体，因而不能运用该方法；对于基因组庞大、重复序列多的植物，该技术的应用也受到了限制。
５差异表达基因分离技术
５．１扣除杂交技术扣除杂交技术的原理是用有特异性表达基因的目标样提取ｍＲＮＡ经逆转录形成ｃＤＮＡ探针，与无特异性表达基因的参照样的过量ｍＲＮＡ或ｃＤＮＡ杂交，经２轮充分杂交后，移去杂交分子和过量的无特异性表达基因的参照样ｍＲＮＡ或ｃＤＮＡ，将不形成杂交体的有特异性表达基因的目标ｃＤＮＡ纯化富集、扩增，建立相应ｃＤＮＡ文库即为差异表达基因ｃＤＮＡ文库。该技术最早是由Ｌａｍａｒ和Ｐａｌｍｅｒ于１９８４年提出的，经过多年的改进，它已发展成为众多克隆技术的基础，很多克隆技术都是从该技术衍生而来的，如抑制性扣除杂交技术。它是先将样本ｍＲＮＡ和参照ｍＲＮＡ分别逆转录成ｃＤＮＡ，用４种碱基识别并酶切２种ｃＤＮＡ以产生平端片段；样本ｍＲＮＡ分别接上接头１和接头２，并与过量的经Ｒｓａ１消化的参照样本杂交；在接头处设计引物，使具有差异表达的片段成为ＰＣＲ扩增的模板，重复杂交以减少非特异性扩增片段，利用接头上的酶切位点进行克隆和测序。
５．２差式筛选技术分别从有特异性表达基因的目标样和无特异性表达基因的参照样中提取ｍＲＮＡ，经逆转录形成ｃＤＮＡ，并构建有特异性表达基因的目标样的ｃＤＮＡ文库，再分别用有特异性表达基因的目标样和无特异性表达基因的参照样的ｃＤＮＡ探针与有特异性表达基因的目标样ｃＤＮＡ文库的菌落或噬菌斑作原位杂交，选出只与有特异性表达基因的目标样杂交的克隆，即为有特异性表达基因的目标样特异表达的克隆。该技术要经过多轮菌斑杂交，不仅费力费钱，重复性差，而且灵敏度低。
５．３差异显示ＰＣＲ（ＤＤＲＴ!ＰＣＲ）１９９２年由Ｌｉａｎｇ和Ｐａｒｄｅｒ报道的。该技术是基于ＲＴ#ＰＣＲ的基本原理而建立的。利用大多数真核细胞基因的ｍＲＮＡ结尾处有ｐｏｌｙ（Ａ）结构，在其３′端设计５′ｐｏｌｙ（Ｔ）引物，该引物可与ｍＲＮＡ结合，从而使这部分的基因达到转录。然后从两种不同类型的细胞中分离ｍＲＮＡ，作反转录，比较ＰＣＲ产物后即可克隆目的基因。该技术能快速地显示细胞ｍＲＮＡ的组成，可对各样本ｍＲＮＡ的差异同时进行比较和展示，并且所用ｍＲＮＡ量少；可以立即对扩增的ｃＤＮＡ进行测序和克隆及与探针标记、杂交和文库筛选。ＤＤＲＴ技术已广泛应用于植物形态发生、信号传导、植物抗逆与抗病性相关的基因比较鉴定和克隆研究中。如郭宾会等在小麦苗期进行水分胁迫
梁锦锋等植物新基因克隆策略和技术进展
３５卷２３期７１１３
诱导检出１５个阳性克隆，其中１１个与已知序列高度同源，
４个为新基因；赵大中等利用ＤＤＲＴ!ＰＣＲ在冬小麦春化进
程中分离得到一新的春化特异克隆ＶＲＣ５４；毛爱军等用
ＤＤＲＴ!ＰＣＲ分析了拟南芥野生型和ａｓｔ突变株基因表达的
差异，获得１３个差异条带；黄旭等用ＤＤＲＴ!ＰＣＲ分离得到水稻抗稻瘟病相关ｃＤＮＡ克隆。它的缺点是假阳性条带较多，对丰度低的基因表达不容易检测，无法定量研究；基因的克隆受ｍＲＮＡ表达时效的影响；其扩增出的条带往往是在基因的３′端有比较短的一段序列，这部分序列往往是在基因３′ＵＴＲ区，所提供的信息比较少，为得到ｃＤＮＡ必须进行ｃＤＮＡ文库的筛选。
ＰＣＲ技术的发展和应用为差异表达基因分离技术注入
了新的活力。Ｌｉｓｉｔｓｙ等将ＰＣＲ引入扣除杂交，发展了扣除扩增方案，同时用特异性引物结合技术在ＰＣＲ中选择性地扩增差异ｃＤＮＡ，形成了代表差示分析法（ＲＤＡ）；Ｓｔｒａｕｓ等受扣除杂交的启发，提出了基因组扣除方案，若目的基因存在该基因缺失的突变体，就可以用变性的野生型基因组ＤＮＡ与缺失基因组ＤＮＡ进行扣除杂交，纯化出“多余的ＤＮＡ片段”然后设计引物进行扩增、富集，制备探针，筛选侯选基因的ＤＮＡ文库。以上方法在具体操作中也可结合起来使用，如Ｋａｎｇ等利用扣除杂交后的ＲＮＡ或ＤＮＡ样品进行差异显示ＰＣＲ，发展了交互式差减差异ＲＮＡ显示技术，成为一种高效、快速克隆差异表达基因的方法。
随着生物信息学、计算科学、催化化学、电子工程学等学科的发展，基因克隆的技术发展将更快，种类也将越来越多，但每一种方法都有它的优势和劣势及适用范围和限制因素，因而必须根据所克隆基因的类型和实际条件选择最佳的方案。随着各种知识的积累，克隆基因的技术也逐步完善，速度效率也不断提高，相信人类终将掌握大规模、快捷、经济的基因克隆技术。参考文献
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下游物质———β!胡萝卜素的合成，含氮化合物以阻断下游物质产生作用为主从而提高番茄红素合成量［３］；杜为民研究表明，葡萄糖处理可提高坚熟期千禧番茄果实中番茄红素合成的前体物质八氢番茄红素的合成量，从而提高了八氢番茄红素的所有下游物质番茄红素及β!胡萝卜素的合成量，与葡萄糖不同，谷氨酸钠主要通过抑制番茄红素合成的下游产物β!胡萝卜素的合成量而促进番茄红素的合成［４］。另外，不同种类的含氮化合物对提高番茄红素合成量的作用不同，说明含氮化合物的结构对番茄红素的代谢影响不同。因此，关于含氮化合物的作用机理问题，是增加了前体物质
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安徽农业科学２００７年
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科技论文写作规范———摘要
摘要篇幅以５０～３００字为宜。试验研究和专题研究类论文，应写成报道性摘要。内容应包括研究工作的目的、方法、结果和结论。摘要应具有独立性和自含性，即不阅读全文，就能获得必要的信息。摘要中不出现图、表、化学结构式和非公知公用的符号和术语，也不宜引用文中图、表、公式和参考文献的序号。但中文稿的英文Ａｂｓｔｒａｃｔ，可加注主要的图表序号，以便不同语言习惯的读者阅读。
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植物基因克隆技术的研究进展 随着科学技术的不断发展，人类基因组计划的不断实施，世界生命科技工作者对于植物基因克隆技术的研究不断进步，近年来，我国在基因克隆技术领域也有了长足的进步，在玉米，小麦，大豆，水稻，拟南芥等植物中，已经克隆了许许多多与植物的产量、品质、抗性及农艺性状等相关的基因。文章主要从基因芯片技术，功能克隆、定位克隆、同源序列克隆、PCR擴增技术分别介绍基因克隆技术的现状以及研究进展。 标签：植物；基因克隆技术；研究 植物基因克隆技术在生命科学技术中扮演着越来越重要的角色，而植物基因克隆技术从传统意义上来讲可分为两种不同的方式。正向以及反向的遗传学方式，正向遗传学途径是一种很早的经典的克隆方法，通过研究突变表型性状进行克隆，包括了功能以及表型克隆等较为基本的克隆的方式；反向遗传学途径和正向遗传学途径截然不同，它是通过一些特殊的方法，获得遗传基因片段，然后经过一系列的定位，将之后所研究的基因逆向研究。如定位克隆，同源序列克隆等。除了这两种克隆技术外，随着社会发展，也有一些新的克隆技术产生。 1 基因芯片技术 基因芯片技术是电子克隆技术的典型代表，基因芯片又称DNA芯片、DNA 微阵列，是以预先设计的方式将大量的基因探针固定在玻片、硅片等固相载体上组成的密集分子阵列。基因芯片技术类似于计算机的电子芯片技术，其具有高通量、微型化、连续化、自动化、快速和准确等特点。是一种随着人类基因组计划的进行而发展出的产物，这一发展使得人类对越来越多的微生物和动植物基因组取得了更长远的认识，对其的研究，是全人类对于基因组认识做出的不断地努力的成果，其中不乏许多典型的实例，用cDNA芯片技术对草莓、矮牵牛其基因是如何进行表达的进行研究，进而实现对转基因植物进行形状的观察及控制，可以更好的获悉分子对于基因表达是如何作用以及影响的也有利于获得更为优异更为良好的作物[1]。 基因芯片技术是一种新型的克隆技术，是科技创新和生命科学的很好的结合，代表着人类在基因的克隆方面进展和成就，解决了很多传统克隆不能解决的问题，也讲基因克隆技术引向一种新的思维模式。 2 功能克隆 功能克隆是人类采用最早的基因克隆策略，功能克隆技术从已知蛋白质的功能着手进行研究，其方法原理是先测知基因的编码蛋白质，利用它的信使RNA 进行反转录成cRNA，再利用cDNA做探针，从基因组中获取基因本身，进而完成克隆。
Germany embryologists pointed out for the first time, and then was born dolly, then what the pig sheep cow came, Use the way monkey cloning embryos split researchers recently announced that they in biotechnology fields have achieved a landmark progress. Scientists use the cloning of embryos split ways, created a monkey. Rather, it is a rhesus monkeys, named "TaiTeLa", it is the first time scientists have been cloned way to foster primates. Now the technology have been developed to human cloning is not a problem, but it is the condemnation of the factors against, so it YuKeLong application on organs necrosis, for the benefit of mankind. 德国胚胎学家首次提出的，然后就诞生了克隆羊多莉，接着的什么猪羊牛的都来了， 运用分裂胚胎的方式克隆猴子科研人员最近宣布,他们在生物工艺学领域取得了一项有里程碑意义的进展。科学家们利用分裂胚胎的克隆方式,培育出了一只猴子。确切地说,这是一只恒河猴,名叫“泰特拉”,它是科学家首次以克隆方式培育出的灵长目动物。 现在的技术已经发展到克隆人是不成问题的，但这会受到社会的谴责的因素的反对，所以就把它应用于克隆坏死的器官上，为人类造福。 Cloning technology, has experienced three periods: the first period is microbial cloning, which is a bacteria soon copies of tens of thousands of and it exactly the same bacteria, and become a bacteria group; The second period is biological cloning technology, such as by using the genetic gene-DNA cloned; The third period is animal cloning, namely the a cells cloned into an animal. Cloned sheep "duoli" by a head of s omatic cells and to which cloning, the use of animal cloning technology is. 克隆技术，已经经历了三个发展时期：第一个时期是微生物克隆，即用一个细菌很快复制出成千上万个和它一模一样的细菌，而变成一个细菌群；第二个时期是生物技术克隆，比如用遗传基因――DNA克隆；第三个时期是动物克隆，即由一个细胞克隆成一个动物。克隆绵羊“多利”由一头母羊的体细胞克隆而来，使用的便是动物克隆技术。 As the new century advanced science, cloning technology from its birth of the moment attracts many the world's attention. As the world's largest developing country, China has been dedicated to the frontier science research. 作为新世纪的尖端科学，克隆技术从它诞生的那一刻起就吸引了众多世人的目光。作为世界最大的发展中国家，中国一直在致力于前沿科学的研究。 Science has always been a double-edged sword. But, a scientific and technological progress is not really good for people, the key lies in how to treat and apply it to humans, and not for the temporary unreasonable of it. 科学从来都是一把双刃剑。但是，某项科技进步是否真正有益于人类，关键在于人类如何对待和应用它，而不能因为暂时不合情理就因噎废食。 Cloning, is Clone of transliteration, meaning asexual reproduction, cloning technology which asexual reproduction technology. Recently reported the roslin institute of British trials are successful dolly, is for the first time use somatic cells cloned successfully, it in the biological engineering in history has turned a new page. 克隆，是Clone的译音，意为无性繁殖，克隆技术即无性繁殖技术。前不久报道的英国罗斯林研究所试验成功的克隆羊多利，是首次利用体细胞克隆成功的，它在生物工程史上揭开了新的一页。 At present, cloning, gene engineering research is improved by leaps and bounds of forward development, the establishment of the gene concept and the theory, opened the humans to understand life and control the window of the life. Genetic research has become the current scientific research of one of the most decisive field, become the impetus biological pharmaceutical industry, food and the development of the engine. As is known to all, the development of the 20 th century genetics worldwide attention, because the genetics of development, the social function of science and social science to the restriction of the more concern, from the test tube babies to cloning technology to the human genome map the affects all the hearts of men. 21 century is the century of biological technology revolution, the cloning technology application will promote genetics, cell developmental biology, produce scientific disciplines such as research, and to the whole world of scientific progress and improve the quality of life, the life of mankind will have
植物基因克隆实验规则 一、植物基因克隆实验课的目标 根据基因克隆实验操作的整体性和连贯性特点, 将该实验设计为综合性实验课程，实验内容设计上完全抛弃了原来分散的、孤立的单纯学习某一实验技术的缺陷, 将单个实验综合为系统的、连贯的系列型大实验，注重科研成果在教学中的应用，我们从以往的科研项目中选取了部分研究内容用于学生的综合性实验教学，这是基于教学实验与实际科学研究实验之间的新的实验教学模式。 整套实验围绕洋甘菊倍半萜生物合成途径中关键酶基因HMGR的克隆这一研究课题进 行操作, 设计的实验内容具有极强的连续性和综合性，让学生在独立实践操作中学习基因克隆的基本研究方法和体会科学研究的严密逻辑和培养科研理念。 我们将实验内容设置为8个部分, 实验内容前后衔接紧密, 环环相扣, 不可分割, 前一个实验的结果是下一个实验的材料。该课程使学生获得了整个类似科研实践过程的训练和体验, 学习了从事科研工作的基本功, 对完成自己的毕业论文及将来从事生命科学研究奠定了科 研基础。 二、实验的进行程序和要求 1、预习学生在课前应认真预习实验指导以及教材有关章节，必须对该次实验的目的要求、实验内容、基本原理和操作方法有一定的了解。 2、讲解教师对该实验内容的安排及注意事项进行讲解，让学生有充分的时间按实验指导的要求进行独立操作与观察。 3、独立操作与观察除个别实验分组进行外，一般由学生个人独立进行操作和观察。在实验中要按实验指导认真操作，仔细观察，作好记录。有关基本技能的训练，要按操作程序反复练习，以达到一定的熟练程度。
4、演示每次的实验都备有演示内容，其目的是帮助学生了解某些实验中的难点，扩大在实验课有限时间内获得更多感性知识的机会。 5、作业实验报告参照硕士毕业论文的格式写，必须强调科学性，实事求是地记录、分析、综合。在实验结束时呈交。 6、小结每次实验结束后，由师生共同小结本次实验的主要收获及今后应注意的问题。 三、实验规则和注意事项 1、每次上课前，必须认真阅读实验指导，明确本次实验的目的要求、实验原理和注意事项，熟悉实验内容、方法和步骤。 2、上实验课时必须携带实验指导、记录本及文具等。进入实验室要按规定座位入座。 3、实验时要遵守纪律，听从教师指导，保持肃静。有问题时举手提问，严禁彼此谈笑喧或随意走动，也不得私自进行其他活动。 4、实验时要遵守实验操作规程，严格按照教师的安排和实验指导的要求进行。操作观察要认真仔细，边做、边看、边想，认真做好实验记录。 5、要爱护仪器和器材设备，注意节约实验材料、药品和水电。如有损坏器材应立即报告并主动登记、说明情况。 6、实验结束后，应清理实验台面，认真清理好仪器、药品及其他用品，放回原处，放好凳子，方可离开实验室。值日生要负责清扫地面，收拾实验用品，处理垃圾，关好水、电、门窗后再离开。
DNA分子克隆技术（也称基因克隆技术）：在体外将DNA分子片段与载体DNA片段连接，转入细胞获得大量拷贝的过程中DNA分子克隆(或基因克隆)。其基本步骤包括：制备目的基因→将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接，制成DNA重组→导入宿主细胞→筛选、鉴定→扩增和表达。载体（vecors）在细胞内自我复制，并带动重组的分子片段共同增殖，从而产生大量的DNA分子片段。主要目的是获得某一基因或NDA片段的大量拷贝，有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的结构与功能，随着引入的DNA片段不同，有两种DNA库，一种是基因组文库（genomic library）,另一种是cDNA库。 载体所谓载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。 细菌质粒是一种细菌染色体外小型双链环状结构的DNA，分子大小为1-20kb，对细菌的某些代谢活动和抗药性表型具有一定的作用。质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。最常用的质粒是 pBR322。 基因库的建造 含有某种生物体全部基历的随机片段的重组DNA克隆群体，其含有感光趣的基因片段的重组子，可以通过标记探针与基因库中的重组子杂交等方法而筛选出来，所得到的克隆经过纯化和扩增，可用于进一步的研。其主步骤包括：（1）构建基因库迅速的载体；(2)DNA片段的制备；（3）DNA片段与载体DNA 的连接；（4）包装和接种。 cDNA库的建造 是指克隆的DNA片段，是由逆转录酶自mRNA制备的cDNA。cDNA库包括某特定细胞的全部cDNA克隆的文库，不含内含子。 特异基因的筛选 常用的方法有：（1）克隆筛选即探针筛选法；（2）抗体检测法，检测其分泌蛋白质来筛选目的基因；（3）放射免疫筛选法，查出分泌特异抗原的基因；（4）免疫沉淀法，进行特异基因的筛选。 核酸序列测定 DNA的碱基序列决定着基因的特性，DNA序列分析（测序，sequencing）是分子生物学重要的基本技术。无论从基因库中筛选的癌基因或经PCR法扩增的基因，最终均需进行核酸序列分析，可藉以了解基因的精细结构，获得其限制性内切酶图谱，分析基因的突变及对功能的影响，帮助人工俣成基因、设计引物，以及研究肿瘤的分子发病机制等。测序是在高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的基础上建立起来的。目前最常用的方法有Maxam-Gilbert的化学降解少和Sanger的双脱氧法等，近年来已有DNA序列自动测定仪问世。化学降解法是在DNA的片段的5`端标记核素，然后用专一性化学试剂将DNA特异地降解，在电泳和自显影后，可得到从标记端延伸的片段供测读序列和进行比较。一般能读出200-250个核苷酸序列。双脱氧法是采用核苷酸链终止剂，如：2`，3`-双脱氧核苷三磷酸ddNTP(如ddTTP、ddTTP、ddGTP和ddCTP中的一种)掺入到DNA链中以终止链的延长，与掺入4种正常的dNTP的混合物分成四组进行反应，这样可得到一组结尾长衙不一、不同专一性核苷酸链终止剂结尾的DNA片段，经凝胶电泳分离和放射自显影，可读出合成的DNA核苷酸序列，根据碱基互补原则，可推算出模板DNA分子的序列。
浅谈生物克隆技术及其未来应用问题与前景 肖婷2012333500202 浙江理工大学经管学院工商管理专业 指导老师：解纯刚浙江理工大学生科学院 【摘要】：随着生命科学时代的到来，基因研究已经取得了巨大的进展，克隆技术特别是人的克隆技术作为基因研究的重要组成部分，愈来愈引起社会各界的广泛关注。克隆技术作为人类的创造性活动，有其产生和存在的合理性，在诸多领域蕴藏巨大的应用潜力与巨大应用价值和广阔的发展前景。但克隆技术目前仍存在一些问题,如克隆技术对社会伦理和人类健康的影响。人类克隆技术的进步为人类带来的利益是巨大的,因而它的发展是难以阻止的。应对人类克隆技术带来的巨大挑战。 【关键词】：克隆技术；利弊；社会影响；应用前景 一、克隆是什么？ 克隆是英文Clone一词的音译，意为无性繁殖系，即通过无性繁殖（如细胞丝分裂）可连续传代并形成的群体，常用于细胞水平的描述。克隆的定义是指独立细胞繁殖系，指后代完全由一个细胞复制，具有完全相同的物遗传质。 一个细菌经过20分钟左右就可一分为二；一根葡萄枝切成十段就可能变成十株葡萄；仙人掌切成几块，每块落地就生根；一株草莓依靠它沿地“爬走”的匍匐茎，一年内就能长出数百株草莓苗。凡此种种，都是生物靠自身的一分为二或自身的一小部分的扩大来繁衍后代，这就是无性繁殖。时至今日，“克隆”的含义已不仅仅是“无性繁殖”，凡来自一个祖先，经过无性繁殖出的一群个体，也叫“克隆”。 自然界的许多动物，在正常情况下都是依靠父方产生的雄性细胞（精子）与母方产生的雌性细胞（卵子）融合（受精）成受精卵（合子），再由受精卵经过一系列细胞分裂长成胚胎，最终形成新的个体。这种依靠父母双方提供性细胞、并经两性细胞融合产生后代的繁殖方法就叫做有性繁殖，但是，如果我们用外科手术将一个胚胎分割成两块，四块、八块……最后通过特殊的方法使一个胚胎长成两个、四个，八个……生物体，这些生物体就是克隆个体，而这些个体就叫做无性繁殖系。 二、克隆技术是什么？ 克隆技术是利用生物技术由无性生殖产生与原个体有完全相同基因组织后代的过程。科学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫克隆，这门生物技术叫克隆技术，含义是无性繁殖。
基因工程与克隆技术 考点1 基因工程 1.(2015·浙江10月选考,节选)从扩大培养的大肠杆菌中提取含有目的基因的DNA,用 分别切割含目的 基因的DNA 和农杆菌的Ti 质粒,然后用DNA 连接酶连接,形成重组DNA 并导入农杆菌。 2.(2016·浙江4月选考,节选)兔肝细胞中的基因E 编码代谢甲醛的酶,拟利用基因工程技术将基因E 转入矮牵牛中,以提高矮牵牛对甲醛的代谢能力。请回答: (1)从兔肝细胞中提取mRNA,在 酶的作用下形成互补DNA,然后以此DNA 为模板扩增得到基因E 。在相关酶的作用下,将基因E 与Ti 质粒连接在一起,形成 ,再导入用氯化钙处理的 ,侵染矮牵牛叶片,将被侵染的叶片除菌后进行培养,最终得到转基因矮牵牛。其中培养过程正确的是 (A.叶片在含合适浓度生长素的培养基上分化形成愈伤组织 B.愈伤组织在含细胞分裂素和生长素配比较高的培养基上形成芽 C.再生的芽在细胞分裂素含量高的培养基 上生根 D.愈伤组织在含合适浓度植物生长调节剂的培养基上脱分化形成再生植株)。 (2)取转基因矮牵牛叶片,放入含MS 液体培养基和适量浓度甲醛且密封的试管中。将试管置于 上,进行液体悬浮培 养。一段时间后测定培养基中甲醛的含量,以判断基因E 是否在转基因矮牵牛中正常表达。培养过程中液体培养基的作用: 一是提供营养;二是 ,从而使叶片保持正常的形态。 3.(2018·浙江4月选考,节选)回答与基因工程和植物克隆有关的问题: (1)将含某抗虫基因的载体和含卡那霉素抗性基因的载体pBI121均用限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ酶切,在切口处形成 。选取含抗虫基因的DNA 片段与切割后的pBI121用DNA 连接酶连接,在两个片段相邻处形成 ,获得重组质粒。 (2)已知用CaCl 2处理细菌,会改变其某些生理状态。取CaCl 2处理过的农杆菌与重组质粒在离心管内进行混合等操作,使重组质粒进入农杆菌,完成 实验。在离心管中加入液体培养基,置于摇床慢速培养一段时间,其目的是 , 从而表达卡那霉素抗性基因,并大量增殖。 【考点梳理】 1.基因工程的工具 2.基因工程的原理与操作步骤 (1)基因工程的原理 ①基本原理:让人们感兴趣的基因(即目的基因)在宿主细胞中稳 定和高效地表达。 ②基本要素:多种工具酶、目的基因、载体和宿主细胞等。 (2)基因工程的基本操作步骤 3.形成重组DNA 分子 (1)单酶切法（如右图）：将同一种限制性核酸内切酶切割的质粒与目的基因片 段混合,加入DNA 连接酶,两两连接的产物(重组DNA 分子)有以下3种:目的基因与目的基因的连接物;质粒与质粒的连接物;目的基因与质粒的连接物。其中,只有目的基因与质粒的连接物才是真正需要的。 (2)双酶切法
4植物基因克隆的策略与方法 基因的克隆确实是利用体外重组技术,将特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子中。基因克隆的要紧目标是识不、分离特异基因并获得基因的完整的全序列,确定染色体定位,阐明基因的生化功能,明确其对特定性状的遗传操纵关系。通过几十年的努力由于植物发育,生理生化,分子遗传等学科的迅速进展,使人们把握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识,再运用先进的酶学和生物学技术差不多克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆,育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。我们实验室对天麻抗真菌蛋白基因作了功能克隆的研究(舒群芳等,1995;舒群芳等,19 97),为了克隆植物基因也探讨了其它克隆方法,本文论述基因克隆的策略、方法及取得的一些进展。 1功能克隆(functional Cloning) 功能克隆确实是按照性状的差不多生化特性这一功能信息,在鉴定和已知基因的功能后克隆(Collis,1995)。其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库,DNA文库中基因的选择按照情形要紧可用二种方法进行,(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序,据此合成寡核苷酸探针 从cDNA库或基因组文库中选择编码基因,(2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针,从cDNA入载体表达库中选择相应克隆。功能克隆是一种经典的基因克隆策略,专门多基因的分离利用这种策略。 Hain等从葡萄中克隆了两个编码白藜芦醇合成的二苯乙烯合成酶基因(Vst1和Vst2),葡萄中抗菌化合物白藜芦醇的存在,能够提升对灰质葡萄孢(B otrytis cinerce)的抗性,在烟草和其它一些植物中无二苯乙烯合成酶,因此克隆该基因通过转基因后,对有些植物产生对灰质葡萄孢的抗性专门有意义(H ain等,1985)。Kondo等1989年对编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的基因组DN A做了克隆和序列分析(Kondo等,1989)。周兆斓等构建了水稻cDNA文库,分离了编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的cDNA(周兆斓等,1996)。植物蛋白酶抑制剂是一类天然的抗虫物质,它可抑制摄食害虫对蛋白质的消化,使害虫因 缺乏所需氨基酸而导致非正常发育或死亡。胡天华等人从烟草中分离出流行于我国的黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic virus)(CMV),并克隆了编码该
植物基因的克隆 08医用二班姚桂鹏0807508245 简介 克隆（clone）是指一个细胞或一个生物个体无性繁殖所产生的后代群体。通常所说的基因克隆是指基于大肠埃希菌的DNA片段（或基因）的扩增，主要过程包括目标DNA的获取、重组载体的构建、受体细胞的转化以及重组细胞的筛选和繁殖等。本文主要介绍植物基因的特点、基因克隆的载体、基因克隆的工具酶、基因克隆的策略以及植物目的基因的分离克隆方法等内容。 关键词 植物基因基因克隆载体工具酶克隆策略分离克隆方法 Plant gene cloning Introduction Cloning (clone) refers to a cell or an individual organisms asexual reproduction produced offspring. Usually said cloning genes means
based on escherichia coli segment of DNA (or genes), including the main course target DNA, restructuring of the carrier, transformation of receptor cells and reorganization of screening and reproductive cells. This paper mainly introduces the characteristics of plant gene and gene cloning and carrier, gene clone tool enzyme, gene cloning and plant gene strategy of separation cloning method, etc. Keywords Plant gene cloning tool enzyme gene cloning vector method of separation of cloning strategy 一、植物基因的结构和功能 基因（gene）是核酸分子中包含了遗传信息的遗传单位。一般来说，植物基因都可分为转录区和非转录的调控区两部分。 （一）植物基因的启动子 启动子（promoter）是指在位于结构基因上游决定基因转录起始的区域，植物积阴德启动子包括三个较重要的区域，一时转录起始位点，而是转录起始位点上游25~40bp的区域，三是转录起始位点上游-75bp处或更远些的区域。 （二）植物基因的增强子序列
第6卷第4期(专辑) 2002年12月 生命科学研究 Life Science Research Vol.6No.4(Suppl.) Dec.2002基因克隆技术的研究进展X 钟军,李,官春云 (湖南农业大学油料作物研究所,中国湖南长沙410128) 摘要:为能快速而准确地克隆目的基因,综述了一些基因克隆常用技术,包括差异表达基因分离技术、转座子标签技术、图位克隆技术、同源序列技术、表达序列标签技术的原理、应用及应用潜力,并对其作了简要的评价. 这些技术有利有弊,应根据不同的实验目的和水平来选择相应的技术. 关键词:基因;克隆;差异表达基因分离技术;转座子标签技术;图位克隆技术;同源序列技术;表达序列标签技术 中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:1007-7847(2002)S1-0148-05 Advances in Gene Cloning Technique ZHONG Jun,LI Xun,GUAN Chun-yun (T he Oil Crop Institute of H unan Agriculture University,Chan gsha410128,H unan,China) Abstract:To clone candidate gene quickly and correctly,advances about gene cloning included map-based cloning, transposon tagging,homology-based candidate gene method,expressed sequence tagging methods and some differen-tially expressed gene clone method are introduced and appraised.Because of the advantages and disadvanta ges of those techniques,various technique should be selected according special purpose and level. Key words:gene;clone;differentially e xpressed gene clone method;transposon tagging;map-based cloning;ho-mology-based candidate gene method;e xpressed sequence ta gging method (Li f e Science Research,2002,6(Suppl):148~152) 克隆基因的途径有两种,正向遗传学和反向遗传学途径.前者是依据目标基因所表现的功能为基础,通过鉴定其产物或某种表型突变而进行的;后者则着眼于基因本身,通过特定的序列或在基因组中的位置进行.近几十年来,许多重点实验室致力于植物基因的克隆,到1992年取得了突破性进展.基因的克隆一般采用下列技术:差异表达基因分离技术、转座子标签技术、表达序列标签技术、图位克隆技术和同源序列技术等. 1差异表达基因分离技术 1.1扣除杂交技术 扣除杂交技术的原理是用有特异性表达基因的目标样提取mRNA经逆转录形成cDNA探针,与无特异性表达基因的参照样的过量mRNA或cDNA杂交,经两轮充分杂交后,移去杂交分子和过量的无特异性表达基因的参照样mRNA或cD-NA,将不形成杂交体的有特异性表达基因的目标样cDNA纯化富集、扩增,建立相应cDNA文库即为差异表达基因cDNA文库.此技术最早是由Lamar和Palmer于1984年提出[1],他们先用超声波打断雌性小鼠的DNA,用Mbo1完全消化雄性小鼠DNA;将两者一起变性、复性,再将产物克隆入表达载体的Bam H I位点中,只有那些两端有GATC序列的基因才能被克隆入载体,这样就达到了扣除两者共有序列的目的,并得到雄性小鼠 X收稿日期:2002-06-11;修回日期:2002-10-14 作者简介:钟军(1973-),女,湖南沅江人,博士研究生,从事分子遗传学研究.Tel:+86-0731-*******,E-mail:zhhjp@s https://www.doczj.com/doc/2b18784827.html,
来自dxy 22003luocong 植物基因全长克隆几种方法的比较 基因是遗传物质基本的功能单位，分离和克隆目的基因是研究基因结构、揭示基因功能及表达的基础，因此，克隆某个功能基因是生物工程及分子生物学研究的一个重点。经典克隆未知基因的方法比如通过筛选文库等有个共同的弊病, 即实验操作繁琐, 周期较长、工作量繁重,且不易得到全长序列。又由于在不同植物中目的基因mRNA丰度不同，所以获得目的基因的难易程度又不一样，特别是对于丰度比较低的目的基因即使使用不用的方法也不一定能获得成功。近年来随着PCR技术的快速发展和成熟.已经有多种方法可以获得基因的全长序列, 比如经典的RACE技术，染色体步移法和同源克隆法等，本文主要综述几种重要的克隆方法的原理和运用，并且比较分析这几种方法的优缺点，为你的实验节约时间和成本。 1 RACE技术 1985年由美国PE-Cetus公司的科学家Mulis等[1]发明的PCR技术使生命科学得到了飞跃性的发展。1988年Frohman等[2] 在PCR技术的基础上发明了一项新技术, 即cDNA末端快速扩增技术( rapid amplification of cDNA ends, RACE), 其实质是长距PCR( long distance, PCR)。通过PCR由已知的部分cDNA 序列, 获得5′端和3′端完整的cDNA, 该方法也被称为锚定PCR ( anchored PCR) [3] 和单边PCR( one-sidePCR) [4]。RACE技术又分为3?RACE和5?端RACE。3′RACE 的原理是利用mRNA 的3′端天然的poly(A) 尾巴作为一个引物结合位点进行PCR, 以Oligo( dT) 和一个接头组成的接头引物( adaptor primer, AP)反转录mRNA得到加接头的第一链cDNA。然后用一个正向的基因特异性引物( gene-specific primer, GSP) 和一个含有接头序列的引物分别与已知序列区和poly(A) 尾区退火, 经PCR扩增位于已知序列区域和poly( A) 尾区之间的未知序列，若为了防止非特异性条带的产生, 可采用巢式引物( nested primer) 进行第二轮扩增, 即巢式PCR( nested PCR) [5，6]。5?RACE 跟3?RACE原理基本一样，但是相对于3?RACE来说难度较大。 5'-RACE受到诸多因素的影响而常常不能获取全长，因此研究者都着手改进它。这些措施主要是通过逆转录酶、5'接头引物等的改变来实现的，因此出现了包括基于“模板跳转反转录”的SMART RACE技术( switching mechanism at 5′ end of RNA transcript) [7] , 基于5′脱帽和RNA酶连接技术的RLM-RACE技术(RNA ligase mediated RACE)[8], 利用RNA连接酶为cDNA第一链接上寡聚核苷酸接头的SLC RACE技术(single strand ligation to single-stranded cDNA)[9] , 以及以内部环化的cDNA第一链为模板进行扩增的自连接或环化RACE技术(self-ligation RACE or circular RACE)[10]，和通过末端脱氧核苷酸转移酶( TdT)加尾后引入锚定引物的锚定RACE技术( anchored RACE)[11]。 笔者主要介绍两种比较新的RACE技术，基于…模板跳转?的SMART RACE 技术和末端脱氧核苷酸转移酶( TdT)加尾技术。 1.1基于‘模板跳转’的SMART RACE技术[7，12]
基因克隆技术攻略：让更多的新手迅速走出基因克隆的阴霾 一直以来都想把自己在基因克隆方面的心得写出来，让更多的刚刚进入生命科学领域的人受益，因为自己刚开始做克隆时也遇到过各种问题，经过较长时间的总结和实践，我的题组现在的基因克隆都是一次到位的，基本不需要重复做。其实我只是一个只有几十万科研经费的小青椒，不过我对科研非常热爱，我喜欢买实验用的各种酶啊，好用的耗材之类的东东超过我对自己的衣服鞋子的热爱，所以我看起来穿的及其普通，可是我的实验花费有点奢华，呵呵，可能像我这样的人不多吧，哈哈，反正无所谓开心就好。下面言归正传 （1）是酶切位点的选择。我的实验室有Takara、Promega以及NEB三种公司的常用的酶，这极大的丰富了我们的选择，所以在设计PCR产物的酶切位点之前首先要看看哪两个酶之间是可以进行同时酶切的。因为这三家公司的双酶切表的组合完全不同，最佳的方案是我们能够按照需要去选择合适的酶。有人说这得花很多钱吧，其实不然，Takara几乎每年9月都有一次促销活动，在他们七折的时候我一下买了三千块钱的酶，这一年来有用之不尽的感觉。Promega的酶也非常好用，而且长期五折，我也是常用的酶买了一批放在实验室里。至于NEB的实在是有一点贵的，我一般不批量买了，在NEB买的一般都是不常用的酶，比如FseI、AscI等等。酶的选择是实验成功的关键吆。 （2）PCR引物的设计这一点我不想多说，虽然有很多的攻略里面讲到了PCR引物设计的原则等等，大家设计的时候要参考各种原则，我认为不然，因为做过实验的战友都清楚，有的时候很多PCR引物的选择是没有选择的，比如我要扩增一个完整的基因的ORF框，那么它的起始密码子，终止密码子部分都要克隆出来的，不能多也不能少一个碱基，即使起始部位或者终止部位的AT含量很高，高到你难以忍受，那怎么办呢，基本我们没有选择，如果实在是没办法的条件下，只能在PCR引物的5端加入人为设计的碱基而把引物的扩增部分后移或前移来避开难以扩增的部位，我不知道说清楚没有，如果引物序列OK，可以忽略上句话。所以大多数情况下引物我们是没得选择的，那么我们只能从PCR扩增条件上下功夫。（3）PCR扩增对于PCR扩增其实不同的基因可能策略不同，我来说几点相同的。首先很多新手会忽略引物的浓度问题，我在最开始做PCR的时候因为当时的基因非常容易扩增，所以其实我的条件并不是最佳的，但当时把基因扩出来了我也没有在意，直到有一天我需要在基因的5端加入3个HA标签，这样的PCR引物长度差异很大，一支引物100多bp，一支引物只有30bp，于是当我还有以前的条件时我扩不出任何的基因。当时扩了几次都不成功，各种温度都试过了也不成。于是我静下心来，把PCR的实验条件进行了全方位优化，在PCR 反应体系中，把引物调整到各种浓度的，把模板调整到各种浓度的，有的加Mg2+，有的加BSA，还使用梯度PCR的条件，试了各种扩增温度的，结果让我很开心，最后我的基因被扩增出来了，而且好亮好亮的那种。记得当时自己高兴地跳了起来。也许这就是科研的魅力吧！在这次试验中我找到了最佳的PCR条件，这是三年前的事了，这个条件让我在三年中屡试不爽，几十个基因的扩增从未失手过。其实体系很简单，50ul体系中buffer 5ul、Mg2+ 1mM、dNTP 0.2mM、引物每支1ul（配成10umol/L浓度)、PCR酶一般是0.5ul、其余部分用水补平，混匀，离心一下，进行PCR扩增。其中引物从公司拿到干粉后我一般用水溶解至100umol/L浓度保存，吸取少量稀释十倍后用于PCR反应，这个浓度是最佳的。所以PCR 体系中引物并不是越多越好，同样的模板的量也很关键，一般我都在10ng-100ng之间，太少或太多都会抑制PCR反应。当然，不同的基因其退火温度差异较大，建议第一次做直接做梯度PCR，设置的温度范围宽些，总会有扩出来的。反正把反应体系加好，把温度控制好应该就万事大吉了，如果这样仍然扩不出来，那就直接调整DNA模版的量吧，其他的因素应该不是原因（当然得保证引物，以及酶的质量得前提下）。 （4）PCR产物的酶切，这是最简单的一步，一般我都是酶切过夜的。因为我认为PCR产物切得尽可能的充分对克隆很重要，毕竟保护性碱基只有几个。
克隆技术的发展及应用前景 克隆通常是一种人工诱导的无性生殖方式或者自然的无性生殖方式（如植物）。一个克隆就是一个多细胞生物在遗传上与另外一种生物完全一样。克隆可以是自然克隆，例如由无性生殖或是由于偶然的原因产生两个遗传上完全一样的个体（就像同卵双生一样）。但是通常所说的克隆是指通过有意识的设计来产生的完全一样的复制。克隆技术在现代生物学中被称为“生物放大技术”，它已经历了三个发展时期：第一个时期是微生物克隆，即用一个细菌很快复制出成千上万个和它一模一样的细菌，而变成一个细菌群；第二个时期是生物技术克隆，比如用遗传基因――DNA克隆；第三个时期是动物克隆，即由一个细胞克隆成一个动物。克隆绵羊“多利”由一头母羊的体细胞克隆而来，使用的便是动物克隆技术。 目前，克隆技术发展十分迅速。各国政府有关人士、民间对克隆技术的评价褒贬不一。克隆技术已展示出广阔的应用前景，包括以下四个方面： （1）培育优良畜种和生产实验动物； （2）生产转基因动物； （3）生产人胚胎干细胞用于细胞和组织替代疗法； （4）复制濒危的动物物种，保存和传播动物物种资源。 在不久的将来，克隆技术技术将可以用来治疗糖尿病、中风、癌症、爱滋病、心脏病以及诸如帕金森综合症等精神疾病，并极大改变现有的器官移植理论和治疗手段，给人类带来福音。 克隆技术会给人类带来极大的好处，例如，英国PPL公司已培育出羊奶中含有治疗肺气肿的a-1抗胰蛋白酶的母羊。这种羊奶的售价是6千美元一升。一只母羊就好比一座制药厂，用什么办法能最有效、最方便地使这种羊扩大繁殖呢？最好的办法就是“克隆”。同样，荷兰PHP公司培育出能分泌人乳铁蛋白的牛，以色列LAS公司育成了能生产血清白蛋白的羊，这些高附加值的牲畜如何有效地繁殖？答案当然还是“克隆”。母马配公驴可以得到杂种优势特别强的动物——骡，骡不能繁殖后代，那么，优良的骡如何扩大繁殖？最好的办法也是“克隆”，我国的大熊猫是国宝，但自然交配成功率低，因此已濒临绝种。如何挽救这类珍稀动物？“克隆”为人类提供了切实可行的途径。具体应用有以下几个方面： 转基因动物研究 转基因动物研究是动物生物工程领域中最诱人和最有发展前景的课题之一，转基因动物可作为医用器官移植的供体、作为生物反应器，以及用于家畜遗传改良、创建疾病实验模型等。但转基因动物的实际应用并不多，除单一基因修饰的转基因小鼠医学模型较早得到应用外，转基因动物乳腺生物反应器生产药物蛋白的研究时间较长，已进行了10多年，但在全世界范围内仅有2例药品进入3期临床试验，5～6个药品进入2期临床试验；而其农艺性状发生改良、可资畜牧生产应用的转基因家畜品系至今没有诞生。转基因动物制作效率低、定点整合困难所导致的成本过高和调控失灵，以及转基因动物有性繁殖后代遗传性状出现分离、难以保持始祖的优良胜状，是制约当今转基因动物实用化进程的主要原因。 体细胞克隆 体细胞克隆的成功为转基因动物生产掀起一场新的革命，动物体细胞克隆技术为迅速放大转基因动物所产生的种质创新效果提供了技术可能。采用简便的体细胞转染技术实施目标基因的转移，可以避免家畜生殖细胞来源困难和低效率。同时，采用转基因体细胞系，可以在实验室条件下进行转基因整合预检和性别预选。在核移植前，先把目的外源基因和
植物基因克隆的策略与方法 基因的克隆就是利用体外重组技术,将特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子中。基因克隆的主要目标是识别、分离特异基因并获得基因的完整的全序列,确定染色体定位,阐明基因的生化功能,明确其对特定性状的遗传控制关系。通过几十年的努力由于植物发育,生理生化,分子遗传等学科的迅速发展,使人们掌握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识,再运用先进的酶学和生物学技术已经克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆,育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。我们实验室对天麻抗真菌蛋白基因作了功能克隆的研究(舒群芳等,1995;舒群芳等,1997),为了克隆植物基因也探讨了其它克隆方法,本文论述基因克隆的策略、方法及取得的一些进展。 1 功能克隆(functional Cloning) 功能克隆就是根据性状的基本生化特性这一功能信息,在鉴定和已知基因的功能后克隆(Collis,1995)。其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库,DNA文库中基因的筛选根据情况主要可用二种办法进行,(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序,据此合成寡核苷酸探针从cDNA库或基因组文库中筛选编码基因,(2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针,从cDNA入载体表达库中筛选相应克隆。功能克隆是一种经典的基因克隆策略,很多基因的分离利用这种策略。 Hain等从葡萄中克隆了两个编码白藜芦醇合成的二苯乙烯合成酶基因(Vst1和Vst2),葡萄中抗菌化合物白藜芦醇的存在,可以提高对灰质葡萄孢(Botrytis cinerce)的抗性,在烟草和其它一些植物中无二苯乙烯合成酶,因此