动物细胞工程12月20日 动物细胞工程常用技术手段有动物细胞培养、动物细胞核移植、动物细胞融合、生产单克隆抗体等，其中动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。 一、动物细胞培养 1、定义：就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后，在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。 2、原理：细胞增殖 3、过程 分散成单个细胞， 制成细胞悬液 注意： ①10代以内细胞保持正常的二倍体核型，无突变发生，常用于实践或冷冻保存。 ②超过50代，极少数细胞突破自然寿命极限，突变成癌细胞，具有无限增殖能力；若超过50代，细胞不再增殖，全部死亡，则说明细胞没有发生癌变。 ③分瓶之前，称原代培养；出现接触抑制用胰蛋白酶处理，再分瓶培养为传代培养。 思考回答： ⑴、为什么选用幼龄动物组织或胚胎进行细胞培养? 答：其细胞的分化程度低，增殖能力强，有丝分裂旺盛，容易培养。 ⑵、动物细胞培养需要脱分化吗?为什么? 答：不需要。因为高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力，所以没有类似植物组织培养的脱分化过程，要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。 ⑶、进行动物细胞传代培养时用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是什么成分?用胃蛋白酶行吗? 答：主要是蛋白质，不行，因为胃蛋白酶作用的适宜PH约为2，当ＰＨ大于6时就会失去活性，多数动物细胞培养适宜PH为7.2－7.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性。（胰蛋白酶作用的适宜PH为7.2－8.4，胰蛋白酶活性较高） ⑷、胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗?为什么?
答：胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白质，长时间作用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有损伤，因此必须控制好消化时间。 ⑸、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？ 不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体 4、重要概念 ①细胞贴壁：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。 产生原因：培养贴附性细胞时，细胞要能够贴附于底物上才能生长增殖。 培养要求：培养瓶或培养皿内表面光滑、无毒，易于贴附。 ②细胞的接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。 ③原代培养：动物组织消化后的初次培养 ④传代培养：原代培养的细胞由于接触抑制不再分裂，需要重新用胰蛋白酶等处理，然后分瓶继续培养，让细胞继续增殖，这种培养叫传代培养。 5、培养条件： ⑴无菌无毒环境：无菌——对培养液和所有培养用具进行无菌处理；在细胞培养液中添加一定量的抗生素。；无毒——定期更换培养液，防止细胞代谢产物积累对自身造成危害。 ⑵营养： 成分：所需营养物质与体内基本相同，例如需要有糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，还需加入血清、血浆等天然成分。 培养基类型：合成培养基（将细胞所需的营养物质按其种类和所需数量严格配制而成的培养基） ⑶温度和pH值：哺乳动物多以36.5±0.5℃为宜，多数细胞生存的适宜pH为7.2～7.4。 ⑷气体环境：通常采用培养皿或松盖培养瓶，将其置于含95％空气加5％CO2的混合气体的培养箱中进行培养。O2：是细胞代谢所必需的CO2主要作用是维持培养液的pH。 6、应用：生产有重要价值的生物制品，如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等。基因工程中受体细胞的培养。用于检测有毒物质，判断某种物质的毒性。科学家培养正常或各种病变的细胞，用于生理、病理、药理等方面的研究，如用于筛选抗癌药物等，为治疗和预防癌症及其他疾病提供理论依据。
《制药工艺学》试卷 班级：学号：姓名： 得分： 一、单选题。（每题2分，共30分）是（）。 A.药品生产质量管理规范 B.药品经营质量管理规范 C.新药审批办法 D.标准操作规程 2.药品是特殊商品，特殊性在于 （）。 A.按等次定价 B.根据质量分为一、二、三等 C.只有合格品和不合格品 D.清仓在甩卖 3.终点控制方法不包括（）。 A.显色法 B. 计算收率法 C.比重 法 D. 沉淀法 4.温度对催化剂活性的影响是（）。 A.温度升高，活性增大 B.温度升高，活性降低 C.温度降低，活性增大 D.开始温度升高，活性增大，到最高速度后，温度升高，活性降低 5.中试一般比小试放大的位数是 （）倍。 ~10 ~30 C.30~50 ~100 6.利用小分子物质在溶液中可通过半 透膜，而大分子物质不能通过的性质，借以达到分离的一种方法是（）。 A.透析法 B.盐析法 C.离心法 D.萃取法 7.液体在一个大气压下进行的浓缩称 为（）A. 高压浓缩 B.减压浓缩 C. 常压浓缩 D.真空浓缩 8.下列不属于氨基酸类药物的是 （） A.天冬氨酸 B.多肽 C.半胱氨酸 D.赖氨酸 9.下列不属于多肽、蛋白质含量测定方法的是（） A.抽提法 B.凯氏定氮法 C.紫外分光光度法 D.福林-酚试剂法 10.下列属于脂类药物的是（）。 A.多肽 B. 胆酸类 C.胰脂酶 D 亮氨酸 11.（）抗生素的急性毒性很低，但副作用较多，另外，对胎儿有致畸作用。 A.四环素类 B.大环内酯类 C.氨基糖苷类 D. β-内酰胺类 12.生产抗生素类药物发酵条件不包括（）。 A.培养基及种子 B.培养温度及时间及通气量 D.萃取及过滤 13.下列不属于动物细胞培养方法的是（）。 A.贴壁培养 B.悬浮培养 C.直接培养 D.固定化培养 14.抗生素类药物生产菌种的主要来源是（）。 A.细菌 B.放线菌 C.霉菌 D.酵母菌 15.将霉菌或放线菌接种到灭菌后的大米或小米颗粒上，恒温培养一定时间后产生的分生孢子称为（）。 A. 米孢子 B.种子罐 C.发酵 D. 试管斜面
第11讲 动物细胞生物制药应用
新民周刊 2010,5.17-23.P76-9 2010.11.2：世界肺炎日（第2个） 全球每年约有160万人死于肺炎链球菌 疾病，平均每38秒1名5岁下儿童死于此 病，1100万儿童因肺炎住院。导致儿童 死亡的头号杀手，并高致残：智力低下 、癫痫（17%）、耳聋（27.7%）。 中国是10个肺炎发病率最高的国家之一 ，1/4儿童携带病菌；死亡儿童该病占 46.8%。占西太平洋区的70%。 红霉素不敏感几乎达到100%，青霉素达 86%。 1983年23价肺炎链球菌夾膜多糖疫苗 PPV23诞生。2000年针对2岁以下儿童的 7价肺炎链球菌蛋白结合疫苗PPV7问世 。目前已经接种3亿剂，世界第一大单 个疫苗。 肺炎链球菌发现100年后，真正安全有 效的PPV7疫苗才大规模使用。制造工艺 非常复杂，约需要一年左右。只有爱尔 兰、美国两家工厂。
猪流感（Swine Flu），是猪群中发现的一种可引起地方性流行性感冒的正黏液病毒，属呼吸系统疾病，由甲型流感病毒(A型流感病毒)引发。 以往曾经发生人类感染猪流感，但未有发生人传人案例。2009年4月墨西哥猪流感造成数150多死亡事 件，并在多个国家蔓延。 病毒及病毒疾病 甲型H1N1 流感病毒
H、N的意思 世界卫生组织2009年4月30日建议使用“A/H1N1流感”的名称。 病毒根据抗原性的不同，可分为A、B、C三型。根据血凝素(Hemagglutinin，H)和神经氨酸酶(Neyramidinase，N)的抗原特性，将A型流感病毒分成不同的亚型。目前，有15种特异的H亚型和9种特异的N亚型。 病毒进入细胞：血凝素（H）能和细胞膜上的蛋白结合，在细胞上打开一个通道，使得病毒能进入细胞。 病毒要钻出宿主细胞：神经氨酸酶（N）通过“水解”的方式切断病毒和宿主细胞的最后联系，使病毒脱离宿主细胞。
细胞工程第一讲 一、概述 1、细胞工程（cell engineering ）定义 应用现代细胞生物学、发育生物学、遗传学和分子生物学的原理方法与技术，按照人们的需要，在细胞水平上进行遗传操作，包括细胞融合、核质移植等方法，快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的生物工程技术。 2、细胞工程的研究内容 （1）动植物细胞和组织培养 植物细胞培养主要用于育种和代谢产物制备，日本等国家用生物反应器培养人参细胞生产有效药用成分。 动物细胞培养用于制备单克隆抗体、疫苗、生长因子等。 （2）细胞融合 改良性状，培育新品种 （3）染色体工程 细胞工程 动植物细胞和组织培养 细胞融合 染色体工程 胚胎工程 细胞遗传工程 器官培养 组织培养 细胞培养 （快速繁育和产物大量制备） （改良性状，培育新品种） （培育新品种，单倍体和多倍体） （获得人们需要的成体） （无性繁殖，改变性状） 克隆 转基因技术
主要用于培育单倍体或多倍体新品种，如四倍体小麦，八倍体小黑麦 （4）胚胎工程 主要是获得人们需要的成体 如：胚胎分割技术、胚胎融合技术、卵核移植技术、体外授精技术等最成功应用于畜牧业获得优良品种与胚胎保存 对人类来说主要用于不孕症获得试管婴儿 （5）细胞遗传工程 克隆：无性繁殖，动物克隆指经无性繁殖而产生遗传性状完全相同的后代个体。 转基因技术：将外源基因整合到生物体内，能够表达并稳定遗传给后代的实验技术。 3、细胞工程的优势 （1）避免了分离、提纯、剪切、拼接等基因操作，只需将细胞遗传物质直接转移到受体细胞中就能够形成杂交细胞。 （2）不仅可以在植物与植物之间、动物与动物之间、微生物与微生物之间，甚至可以在三者之间形成前所未有的杂交物种。 4、细胞工程发展 （1）萌芽阶段---理论渊源和早期的尝试（20世纪初-30年代中期）德国植物生理学家Haberlandt在1902年提出植物细胞的全能性。认为植物细胞有再生出完整植株的潜在能力。 美国生物学家Harrison 是公认的动物组织培养的创始人，1907年，以淋巴液为培养基观察了蛙胚神经细胞突起的生长过程，
动物细胞工程制药的研究进展 程庆佳 （云南大学，生命科学学院，生物技术，20091070004） 摘要：动物细胞工程制药是动物细胞在制药产业中的应用，本文主要介绍动物细胞工程最新的制药研究进展，包括动物细胞融合技术，细胞核移植技术，转基因动物技术，细胞大规模培养技术等，同时讨论动物细胞制药的发展方向和发展前景。 英文摘要：Animal Cell Engineering is animal cells in the pharmaceutical industry in the application. This paper describes the latest pharmaceutical animal cell engineering research, including animal cell fusion techniques, monoclonal antibodies, transgenic animal technology, large-scale cell culture technology, Also discussed animal cell engineering pharmaceutical development prospects. 关键词：动物细胞融合技术，单克隆抗体的制备，转基因动物技术，细胞大规模培养技术，发展前景 英文关键词：Animal cell fusion techniques, monoclonal antibodies, transgenic animal technology, large-scale cell culture technology, development prospects 所谓动物细胞工程就是以动物细胞为基本单位在体外条件下进行培养、繁殖和人为操作，使细胞产生某些人们所需要的生物学特性，从而改良品质，加速繁殖动物个体或获得有用品系的技术。这种技术在制药业中起到关键的作用，目前全世界生物技术药物中使用动物细胞工程生产的已超过8 0％，例如蛋白质、单克隆抗体、疫苗等。当前动物细胞工程制药所涉及的主要技术领域包括细胞融合技术、细胞核移植技术、转基因动物技术和细胞大规模培养技术等方面。本文就是以细胞工程为基础阐述动物细胞工程制药的技术与发展前景。 1、用于制药业的动物细胞系 目前用于生物制药的动物细胞有4类，即原代细胞、传代细胞系，转化细胞系和融合的或重组的工程细胞系。 1.1 原代细胞 原代细胞是直接取自动物组织器官，经过粉碎消化而获得的细胞悬液。动物细胞生产生物药品的早期，一般用原代培养的细胞来生产疫苗，如鸡胚细胞、原代兔肾细胞、鼠肾细胞、淋巴细胞等，Ender最先用原代培养的猴肾组织细胞来生产脊髓灰质炎灭活疫苗。原代细胞增殖能力有限，需要大量动物才能增加产量，费钱费力，限制了它的应用。 1.2 传代细胞系 传代细胞系是二倍体细胞在传代繁殖过程中，有些细胞发生改变，不仅形态发生变化，且生长更快，能以少量的细胞起始培养。由一个这样的细胞得到的细胞克隆，与它起源的细胞株大不相同，它能无限期地生存，这样的细胞克隆称为传代。许多传代细胞系建立于50年代，用它们来生产疫苗不仅可以降低实验动物的量，并且因为所用的细胞性质均一，通过体外大规模培养技术生产的疫苗可以保证质量，避免了动物个体差异产生的疫苗质量不稳定问题。但传代细胞系在生物学特性上与肿瘤细胞有许多相似之处，有时是从肿瘤细胞衍生而来，由于缺乏有效的科学手段来排除其潜在的致瘤性，因而数十年间未允许传代细胞系用于生产。7 O年代以后，大量研究工作证实了二倍体细胞的安全性，wI一38是第一个生产脊髓灰质炎灭活疫苗的二倍体细胞系。二倍体细胞系一般从动物胚胎组织中获取，有明显的贴
第三章动物细胞工程制药 一?生产用动物细胞目前用于生物制药的动物细胞有4类,即原代细胞?二倍体细胞系,融合的或重组的工程细胞系和转化细胞系? 1原代细胞 原代细胞是直接取自动物组织器官,经过粉碎消化而获得的细胞悬液?动物细胞生产生物药品的早期,一般用原代培养的细胞来生产疫苗,如鸡胚细胞?原代兔肾细胞?鼠肾细胞,淋巴细胞等,Ender最先用原代培养的猴肾组织细胞来生产脊髓灰质炎灭活疫苗?原代细胞增殖能力有限,需要大量动物才能增加产量,费钱费力,限制了它的应用? 2传代细胞系 原代细胞经过传代筛选克隆,从多种细胞成分中挑选并纯化出某种具有一定征的细胞株称为CCL?许多CCL建立于50年代,用它们来生产疫苗不仅可以降低实验动物的量,并且因为所用的细胞性质均一,通过体外大规模培养技术生产的疫苗可以保证质量,避免了动物个体差异产生的疫苗质量不稳定问题?但C CL在生物学特性上与肿瘤细胞有许多相似之处,有时是从肿瘤细胞衍生而来,由于缺乏有效的科学手段来排除其潜在的致瘤性,因而数十年间未允许C CL用于生产?7 O 年代以后,大量研究工作证实了二倍体细胞的安全性,wI一38是第一个生产脊髓灰质炎灭活疫苗的二倍体细胞系?二倍体细胞系一般从动物胚胎组织中获取,有明显的贴壁和接触抑制特性,有正常细胞的核型,一般可传代培养5 0代?且无致瘤性,现在C C L已被广泛用于人用治疗性药物的生产,但仍不是理想的生产细胞系? 3工程细胞系 工程细胞系是指采用基因工程技术或细胞融合技术对宿主细胞的遗传物质进行修饰改造或重组,获得具有稳定遗传的独特性状的细胞系?用于构建工程细胞的动物细胞有BHK一2l,CHO—dhfr?Namalwa?Vero?SP2/O,Sf一9等细胞系?sP2/0一Ag l4工程细胞系是通过融合的方法,从抗羊红细胞活性的BALB/c的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞P3x63A98融合杂交瘤sP2/NL—Ag 亚克隆中分离获得,可用于生产单克隆抗体幢l?目前用重组DNA技术改造的C H O细胞生产干扰素,白介素,E P O?单克隆抗体?诊断试剂以及其它各种蛋白质类药品已成为国际医药市场上的热销产品,但这些产品的生产规模普遍较小(大多为5~50升的小型培养罐)? 4转化细胞系 通过某个转化过程形成的,常由于染色体断裂变成异倍体,失去正常细胞特点,而获得无限增殖能力?转化细胞系具有长期培养,倍增时间短,对培养条件和生长因子等要求较低的特点,适于大规模工业化生产?在生物制药中,可通过改造宿主细胞特性,如延长细胞周期.提高工程细胞原始表达水平等来提高药物的产量?李红艳等研究空间环境对CH0(dhfr)细胞生长特性的影响,结果表明空间诱变致生长减慢的细胞株有利于提高目的蛋白的产量,为筛选优化的生物工程制药细胞提供可能?目前cHo(dhfr)作为重要的基因表达受体细咆,已成功应用于表达促红细胞生成素(EPO)?重组乙型肝炎疫苗等生物制药领域? 二、动物细胞工程制药技术 1细胞融合
国内外细胞工程制药研究现状及发展前景 摘要：动物细胞工程制药是动物细胞工程技术在制药行业方面的应用。当前动物细胞工程所涉及的主要技术领域包括细胞融合技术、细胞器特别是细胞核移植技术、染色体改造技术、转基因动植物技术和细胞大量培养技术等方面。本文综合论述了国内外动物细胞工程制药的发展简史，研究近况和制造实例，并在此基础上探讨了动物细胞工程制药的未来发展趋势和前景。 关键词：细胞工程、细胞融合、核移植、染色体改造、转基因、细胞培养 1 前言 细胞工程制药是细胞工程技术在制药工业方面的应用。所谓细胞工程，就是以细胞为单位，按人们的意志，应用细胞生物学、分子生物学等理论和技术，有目的地进行精心设计，精心操作，使细胞的某些遗传特性发生改变，达到改良或产生新品种的目的，以及使细胞增加或重新获得产生某种特定产物的能力，从而在离体条件下进行大量培养、增殖，并提取出对人类有用的产品的一门应用科学和技术。它主要由上游工程（包括细胞培养、细胞遗传操作和细胞保藏）和下游工程（即将已转化的细胞应用到生产实践中用以生产生物产品的过程）两部分构成。当前细胞工程所涉及的主要技术领域包括细胞融合技术、细胞器特别是细胞核移植技术、染色体改造技术、转基因动植物技术和细胞大量培养技术等方面[1]。
21世纪，生物技术制药是制药行业的亮点，近25年来，世界生物技术工业飞速发展，创造了35种重要的治疗性生物技术药物。中国生物技术产业是紧跟世界产业同步发展的。2007年全球生物技术药物市场销售额已达到828亿美元[2]。基因工程、细胞工程和酶工程组成三驾马车行驶在现代生物技术发展大道的前列。动物细胞工程在生物制药的研究和应用中起关键作用，目前全世界生物技术药物中使用动物细胞工程生产的已超过80%，例如蛋白质、单克隆抗体、疫苗等。 2 细胞工程制药研究现状 动物细胞工程制药主要涉及细胞融合技术、细胞器移植尤其是核移植技术、染色体改造技术、转基因技术和细胞大规模培养技术等。 2.1 细胞融合 是用自然或人工的方法使两个或几个不同细胞融合为一个细胞的过程。可用于产生新的物种或品系及产生单克隆抗体等。在我国目前动物细胞工程的发展中,技术最成熟的当数细胞融合。其中淋巴细胞杂交瘤在国内已普遍开展,并培育了许多具有很高实用价值的杂交瘤细胞株系,它们能分泌产生在诊断和治疗病症方面发挥重要作用的单克隆抗体。如甲肝病毒单克隆抗体[3]、抗人Ig M单克隆抗体[4]、肿瘤疫苗[5]等可用于治疗疾病;抗人结肠癌杂交瘤细胞系分泌的单克隆抗体[6],巨噬细胞集落刺激因子受体)胞外区的单克隆抗体等[7]则对诊断疾病具有重要价值。由于技术已趋成熟,目前许多单克隆抗体已经进入产业化的生产阶段。
动物细胞工程制药技术 摘要 生物制药产业以基因工程、抗体工程、细胞工程为主要代表。文章主要讲述动物细胞工程技术。动物细胞工程制药是动物细胞工程技术在制药行业方面的应用。当前动物细胞工程所涉及的主要技术领域包括细胞融合技术、细胞器特别是细胞核移植技术、染色体改造技术、转基因动植物技术和细胞大量培养技术等方面。 关键词：动物细胞工程制药细胞融合细胞大规模培养核移植
1、动物细胞工程制药技术 1、1.细胞融合 细胞融合指在诱导剂或促融剂作用下，两个或两个以上的异源细胞或原生质体相互接触，进而发融合并形成杂种细胞的现象。细胞融合技术作为细胞工程的核心基础技术之一，不仅在农业、工业的应用领域不断扩大，而且在医药领域也取得了开创性的研究成果，如单克隆抗体、疫苗等生物制品的生产。在动物体细胞融合技术的基础上 Kohler G和 Milstein C将能产生特异性抗体的原代 B 淋巴细胞与肿瘤细胞进行融合，创立了单克隆抗体制备的方法。国内外已培育出了许多具有很高实用价值的杂交瘤细胞株系，它们能分泌用于疾病诊断和治疗的单克隆抗体，如甲肝病毒、抗人 I g M 、抗人肝癌和肺癌、抗M-CSFR（Macrophage Colony-Stimulat-ing Factor Receptor，巨噬细胞集落刺激因子受体）胞外区的单克隆抗体等。目前单克隆抗体技术已趋成熟，许多产品已经进入产业化的生产阶段。 此外利用细胞融合技术可以生产各种免疫疫苗，肿瘤细胞 / 树突状细胞融合疫苗是近年来国内外恶性肿瘤免疫治疗研究的热点, 在各种动物模型及病人身上观察到肿瘤的消退。Avigan 等将乳腺癌或肾癌病人的自体癌细胞与树突状细胞在含有人粒 - 巨噬细胞集落刺激因子、白介素 - 4 的自体血清中培养，加入聚乙二醇使两种细胞产生融合, 融合细胞疫苗能使肿瘤消退，显示其在肿瘤治疗方面具有良好的应用前景。 1、2.转基因动物 利用转基因动物乳腺反应器生产药用或食品蛋白是生物制药领域近年来研究的热点之一。因为乳腺是一个外分泌器官，乳汁不进入体内循环，不会影响到转基因动物本身的生理反应，从转基因动物的乳汁中获取的目的基因产物，不但产量高、易提纯，而且表达的蛋白经过了充分的修饰加工，具有稳定的生物活性，因此又被称为动物乳腺生物反应器，所以用乳腺表达人类所需蛋白基因的羊、牛等产量高的动物就相当于一座药物工厂。20 世纪 80 年代中期，英国科学家克拉克首先在鼠的乳腺组织高效表达了人抗胰蛋白酶因子基因，开创了研制动物乳房生物反应器的先河。 据美国遗传学会预测，到2010年，所有基因工程药物中利用动物乳房生物反应器生产的份额将高达95％。国外现已有数十家以动物乳腺反应器为核心技术的公司，可生产α 1 －抗胰蛋白酶、人红细胞生成素、乳铁蛋白、人血清白
《制药工艺学》试卷(A卷) 班级：学号：姓名：得分： 一、单选题。（每题2分，共30分） 1.GMP是（）。 A.药品生产质量管理规范 B.药品经营质量管理规范 C.新药审批办法 D.标准操作规程 2.药品是特殊商品，特殊性在于（）。 A.按等次定价 B.根据质量分为一、二、三等 C.只有合格品和不合格品 D.清仓在甩卖 3.终点控制方法不包括（）。 A.显色法 B. 计算收率法 C.比重法 D. 沉淀法 4.温度对催化剂活性的影响是（）。 A.温度升高，活性增大 B.温度升高，活性降低 C.温度降低，活性增大 D.开始温度升高，活性增大，到最高速度后，温度升高，活性降低 5.中试一般比小试放大的位数是（）倍。 A.5~10 B.10~30 C.30~50 D.50~100 6.利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，而大分子物质不能通过的性质，借以达到分离的一种方法是（）。 A.透析法 B.盐析法 C.离心法 D.萃取法 7.液体在一个大气压下进行的浓缩称为（） A. 高压浓缩 B.减压浓缩 C. 常压浓缩 D.真空浓缩 8.下列不属于氨基酸类药物的是（） A.天冬氨酸 B.多肽 C.半胱氨酸 D.赖氨酸 9.下列不属于多肽、蛋白质含量测定方法的是（） A.抽提法 B.凯氏定氮法 C.紫外分光光度法 D.福林-酚试剂法 10.下列属于脂类药物的是（）。 A.多肽 B. 胆酸类 C.胰脂酶 D 亮氨酸11.（）抗生素的急性毒性很低，但副作用较多，另外，对胎儿有致畸作用。 A.四环素类 B.大环内酯类 C.氨基糖苷类 D. β-内酰胺类 12.生产抗生素类药物发酵条件不包括（）。 A.培养基及种子 B.培养温度及时间 C.PH及通气量 D.萃取及过滤 13.下列不属于动物细胞培养方法的是（）。 A.贴壁培养 B.悬浮培养 C.直接培养 D.固定化培养 14.抗生素类药物生产菌种的主要来源是（）。 A.细菌 B.放线菌 C.霉菌 D.酵母菌 15.将霉菌或放线菌接种到灭菌后的大米或小米颗粒上，恒温培养一定时间后产生的分生孢子称为（）。 A. 米孢子 B.种子罐 C.发酵 D. 试管斜面 二、多选题（每题3分，共45分） 1.世界化学制药工业发展趋向为（） A.高技术 B.高投入和高效率 C.高产量 D.高质量 E.高速度 2.下列属于化学制药生产工艺路线改革的有（） A.原料的改革 B.寻找反应薄弱环节 C.反应后处理方法的影响 D.新技术的应用 3.下列哪些是搅拌的作用（） A.加速传质 B.加速传热 C.加速反应速度 D.增加副反应 4.中试放大的基本方法包括（） A.经验放大法 B.相似放大法 C.数学模拟法 D.理论计算法 5.化学灭菌法有（）灭菌法。 A.环氧乙烷 B.湿热 C.表面 D.热空气 6.常用的分离方法有（）。 A.离心法 B.沉淀法 C.回流法 D.过滤法 7.生物药物的主要来源有（） A.动物脏器和植物 B.血液、分泌物和其他代谢产物 C.海洋生物 D.微生物
?一、半连续式培养 1.半连续式培养又称为重复分批式培养或换液培养。采用机械搅拌式生物反应器系 统，悬浮培养形式。在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，从中取出部分培养物，再用新的培养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变。这种类型的操作是将细胞接种一定体积的培养基，让其生长至一定的密度，在细胞生长至最大密度之前，用新鲜的培养基稀释培养物，每次稀释反应器培养体积的1/2~3/4，以维持细胞的指数生长状态，随着稀释率的增加培养体积逐步增加。或者在细胞增长和产物形成过程中，每隔一定时间，定期取出部分培养物，或是条件培养基，或是连同细胞、载体一起取出，然后补加细胞或载体，或是新鲜的培养基继续进行培养的一种操作模式。剩余的培养物可作为种子，继续培养，从而可维持反复培养，而无需反应器的清洗、消毒等一系列复杂的操作。在半连续式操作中由于细胞适应了生物反应器的培养环境和相当高的接种量，经过几次的稀释、换液培养过程，细胞密度常常会提高。 2.半连续式特点： ·培养物的体积逐步增加； ·可进行多次收获； ·细胞可持续指数生长，并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平，培养过程可延续到很长时间。该操作方式的优点是操作简便，生产效率高，可长时期进行生产，反复收获产品，可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。在动物细胞培养和药品生产中被广泛应用。 二、连续式培养 1.连续式培养是一种常见的悬浮培养模式，采用机械搅拌式生物反应器系统。该模 式是将细胞接种与一定体积的培养基后，为了防止衰退期的出现，在细胞达最大密度之前，以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基；同时，含有细胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出，以保持培养体积的恒定。理论上讲，该过程可无限延续下去。
动物细胞工程试题 1用动、植物成体的体细胞进行离体培养，下列叙述正确的是（C）A都须用液体培养基 B都需用培养箱 C都要在无菌条件下进行 D都可体现细胞的全能性 解析：动物细胞离体培养主要是获得细胞的代谢产物，植物体细胞离体培养体现的是全能性。植物体细胞是固体培养基。动物体细胞培养需要二氧化碳培养箱。 动物细胞培养： 1、动物细胞的培养：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。 2、动物细胞培养液的成分：葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。 3、动物细胞培养液的特点：液体培养基含动物血清。 4、动物细胞培养需要满足以下条件 (1)充足的营养供给——微量元素、无机盐、糖类、氨基酸、促生长因子、血清等。 (2)适宜的温度：36.5℃±0.5℃；适宜的pH：7.2～7.4。 (3)无菌、无毒的环境：培养液应进行无菌处理。通常还要在培养液中添加一定量的抗生素，以防培养过程中的污染。此外，应定期更换培养液，防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。 (4)气体环境：95%空气+5%CO2。O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH。 5、动物细胞培养的过程： 取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）→剪碎→用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理
分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养瓶中进行原代培养→贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。 2下列关于细胞工程的叙述，错误的是（D） A. 电刺激可诱导植物原生质体融合或动物细胞融合 B. 去除植物细胞的细胞壁和将动物组织分散成单个细胞均需酶处理 C. 小鼠骨髓瘤细胞和经抗原免疫小鼠的B淋巴细胞融合可制备单克隆抗体 D. 某种植物甲乙两品种的体细胞杂交与甲乙两品种杂交后代的染色体数目相同 解析：A正确诱导原生质体融合的方法有物理法（离心振动电刺激）化学法（聚乙二醇PEG）生物方法（灭活的病毒）. B正确去除植物细胞壁需要纤维素酶和果胶酶，将动物组织分散成单个细胞需要胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理一段时间。C正确小鼠骨髓瘤细胞和经抗原免疫小鼠的B淋巴细胞融合既可以无限增殖，又可产生特异性抗体。D错误，假设甲植物体细胞是2N,乙植物体细胞是2M，甲乙体细胞杂交染色体数目为2N+2M；而甲乙品种杂交染色体数目是N+M。 3制备单克隆抗体所采用的细胞工程技术包括（A） ①细胞培养②细胞融合③胚胎移植④细胞核移植 A．①②B．①③C．②③D．③④ 解析：单克隆抗体的制备过程是人工诱导经过免疫的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，再经筛选获得能产生特定抗体的杂交瘤细胞，经过培养获得的杂交瘤细胞获得单克隆抗体。 4利用细胞工程方法，以SARS病毒核衣壳蛋白为抗原制备出单克隆抗体。下列相关叙述正确的是（D）
一、名词解释 1、基元反应：凡反应物分子在碰撞中一步转化为生成物分子的反应称为基元.反应30 2、助催化剂：在制备催化剂时，往往加入某种少量物质，这种物质对反应影响很小，但能显著的提高催化剂的活性、稳定性或选择性38 3、对映体过量：指在两个对映体的混合物中，其中一个对映体相对于另一个而过量的百分数，表征对映体的光学纯度48 4、细胞比生长速率：以单位细胞的生物量为基准，表示该参数的变化速率。是生长速率的标准化，反应了菌体活力的大小128 5、原生质体融合：用去壁酶处理将微生物细胞璧除去，制成原生质体，在高渗条件下用PEG促进原生质体风声融合，再生细胞壁，从而获得具有双亲性状的融合细胞，这一技术称为~ 136 6、化学半合成：由已知的具有一定基本结构的天然产物经化学结构改造和物理处理，生产药物的过程 3 7、化学全合成：由简单的化工原料经过一系列化学合成和物理处理，生产药物的过程 3 8、贴壁细胞培养：贴壁依赖性细胞的生长需要适量带电荷的固体或半固体支持表面。由细胞自身分泌或人为在培养基中加入贴附因子，使细胞依附在支持物表面，才能生长和增殖260 9、单层贴壁细胞培养：指把细胞贴附于一定的固体支持表面上，生长形成单层细胞的培养方法，适合于铁壁依赖性细胞培养262 10、无限细胞系：指寿命和活性都不受传代次数影响的细胞系，可连续培养，也称永久细胞系248 11、有限细胞系：指寿命有限制的细胞，经过若干传代培养后失去繁殖能力，衰老死亡248 12、化学需氧量：是在一定条件下，用强氧化剂使污染物氧化所需的氧量。354 13、类型反应法：指利用常见的典型有机化学反应与合成方法进行合成工艺路线设计的方法22 14、催化剂：在化学反应体系中能改变化学反应速率，而本身在反应前后化学性质并无变化的物质37 15、自然选育：在发酵生产过程中，不经过人工诱变处理，根据菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程，称为自然选育135 16、促进剂：促进产物生成、但不是营养物也不是前体的一类化合物141 17、穿梭载体：存在于质粒载体上的含有两个亲缘关系不同的复制子结构及其相应的标记基因，能在两种不同种属的宿主细胞中复制并存在的的基因200 18、微载体培养：是一种三维培养系统，有很大的比表面积，细胞贴附于微载体上增值，再悬浮于培养液中，兼有贴壁和悬浮培养的双重优点263 19、前体：指加入到发酵培养基中的某些化合物，能直接参与产物的生物合成，组成产物分子的一部分，而自身的结构没有发生太大的变化141 二、问答题 1、以薯芋皂素为原料制备氢化可的松的化学合成中，如何控制环氧化、oppenauer 氧化？106 答：（1）控制温度在30℃以下，慢慢加入过氧化氢，保温8小时，当环氧化
摘要 细胞工程制药是细胞工程技术在制药工业方面的应用。所谓细胞工程，就是以细胞为单位，按人们的意志，应用细胞生物学、分子生物学等理论和技术，有目的地进行精心设计，精心操作，使细胞的某些遗传特性发生改变，达到改良或产生新品种的目的，以及使细胞增加或重新获得产生某种特定产物的能力，从而在离体条件下进行大量培养、增殖，并提取出对人类有用的产品的一门应用科学和技术。它主要由上游工程（包括细胞培养、细胞遗传操作和细胞保藏）和下游工程（即将已转化的细胞应用到生产实践中用以生产生物产品的过程）两部分构成。当前细胞工程所涉及的主要技术领域包括细胞融合技术、细胞器特别是细胞核移植技术、染色体改造技术、转基因动植物技术和细胞大量培养技术等方面。 动物细胞工程制药的研究现状 动物细胞工程制药主要涉及细胞融合技术、细胞器移植尤其是核移植技术、染色体改造技术、转基因技术和细胞大规模培养技术等。 细胞融合是用自然或人工的方法使两个或几个不同细胞融合为一个细胞的过程。可用于生产新的物种或品系及产生单克隆抗体等。 在我国目前动物细胞工程的发展中，技术最成熟的当数细胞融合。其中淋巴细胞杂交瘤在国内已普遍开展，并培育了许多具有很高实用价值的杂交瘤细胞株系，它们能分泌产生在诊断和治疗病症方面发挥重要作用的单克隆抗体。如甲肝病毒单克隆抗体、抗人IgM单克隆抗体、肿瘤疫苗等可用于治疗疾病；抗人结肠癌杂交瘤细胞系分泌的单克隆抗体、抗M－CSFR（Macrophage Colony－Stimulating Factor Receptor，巨噬细胞集落刺激因子受体）胞外区的单克隆抗体等则对诊断疾病具有重要价值。由于技术已趋成熟，目前许多单克隆抗体已经进入产业化的生产阶段。 核移植就是将一个动物的细胞核，移植到卵细胞中，并发育生长。核移植技术可用于具有良好发展前景的生物反应器的制备。其中乳腺生物反应器的研制是最为看好的一个转基因制药方向。利用转基因动物乳腺作为生物反应器，生产基因工程人类蛋白质药物，其成本较微生物发酵、动物细胞培养生产基因工程药物大大降低。但十
细胞工程在生物制药的应用与展望 【摘要】细胞工程近年来以其独特的优势在生物制药方面扮演着越来越重要的角色，其中包括动物细胞工程和植物细胞工程的应用，分别生产不同的药用产物。 【关键词】动物细胞工程植物细胞工程生物制药应用前景 细胞工程 细胞工程是指以细胞为单位，按人们的意志，应用细胞生物学、分子生物学等理论和技术，通过类似于工程学的步骤，在细胞整体水平或细胞器水平上，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质以获得新型生物或特种细胞产品的一门综合性科学技术。[1]它主要由上游工程（包括细胞培养、细胞遗传操作和细胞保藏）和下游工程（即将已转化的细胞应用到生产实践中用以生产生物产品的过程）两部分构成。当前细胞工程所涉及的主要技术领域包括真核细胞的基因重组、导入、扩增和表达的理论和技术，细胞融合技术、细胞器特别是细胞核移植技术、染色体改造技术、转基因动植物技术、细胞大量培养技术、将有关产物提取纯化的技术等方面。 动物细胞工程制药 一、细胞融合 细胞融合指在诱导剂或促融剂作用下，两个或两个以上的异源细胞或原生质体相互接触，进而发融合并形成杂种细胞的现象。细胞融合技术作为细胞工程的核心基础技术之一，不仅在农业、工业的应用领域不断扩大，而且在医药领域也取得了开创性的研究成果，如单克隆抗体、疫苗等生物制品的生产。 二、转基因动物 利用转基因动物乳腺反应器生产药用或食品蛋白是生物制药领域近年来研究的热点之一。因为乳腺是一个外分泌器官，乳汁不进入体内循环，不会影响到转基因动物本身的生理反应，从转基因动物的乳汁中获取的目的基因产物，不但产量高、易提纯，而且表达的蛋白经过了充分的修饰加工，具有稳定的生物活性，因此又被称为动物乳腺生物反应器，所以用乳腺表达人类所需蛋白基因的羊、牛等产量高的动物就相当于一座药物工厂。 三、细胞核移植技术 细胞核移植技术，是指将一个动物细胞的细胞核移植至去核的卵母细胞中，产生与供细胞核动物的遗传成份一样的动物的技术。科学家们已经先后在绵羊、小鼠、牛、猪、山羊等动物上获得胚胎细胞核移植后代，目前，体细胞克隆也在牛、山羊、小鼠等物种上均获得了成功。若将转基因与细胞核移植技术获得的克隆动物工厂相结合，在生物制药方面具有巨大的潜在应用价值。 四、动物细胞大规模培养 动物细胞的大规模高效培养技术是生物制药的关键技术，通过动物细胞培养生产生物产品已成为全球生物工业的主要支柱。目前动物细胞培养生产较多的生物制剂是蛋白和抗体，通常采用中国仓鼠的卵巢细胞，事先将能产生某种蛋白质药品的基因片段与仓鼠卵巢细胞的D N A 融合．再在培养液中大量培养它们、最后得到所需药品。与微生物发酵法比，虽然 产量相对较低。但设备费用节省得多，如属于小品种、小产品类生物工程产品，可采用此法。 [2] 植物细胞工程制药 植物细胞含有人类所需的成分，以前靠采用传统的方法提取分离这些物质，但由于如今资源短缺，和需求量的不断加大，且受提取技术限制，靠提取分离途径已经很难满足人类的需要，而人们发现，离体的高等植物细胞也具有合成并积累人类所需要的这些成分，因此利
1.细胞融合：又称为细胞杂交，指真核生物体细胞在体外培养条件下，用人工的方法，使两个或两个以上的细胞融合成一个双核或多核细胞的过程。分为同核融合细胞（相同细胞形成的融合细胞）和异核融合细胞（不同细胞形成的融合细胞）。 2.染色体工程：是人们按照一定的设计，有计划地消减、添加或代换同种或异种染色体的技术。广义上讲，它还包括染色体内部的部分遗传操作。 3.试管动物：是指利用精、卵体外受精、胚胎体外培养和移植获得的各种动物，又称体外受精动物。是试管动物从供体获得精子和卵子，经过成熟培养，在体外人工条件下受精，并经过一段早期发育，再将胚胎移植入受体的子宫内。 4.动物细胞工程：是借助物理、化学、生物等手段来更新细胞的遗传物质或通过受精卵细胞的改造而达到改造生物的遗传特性和生理功能的目的，从而有效提高动物的生产性能和产品质量。因此，动物细胞工程技术的应用，在当前提高动物生产性能方面已成为最基本、最重要的技术措施之一。 5.生物技术：又称生物工程或生物工艺学，是以生物科学的原理为基础，利用生物体系和工程学原理，按照人们设计的蓝图，改良或加工生物体，以提供商品和社会服务的综合性技术科学。生物技术是生物科学和工程技术的发展在非常精密有效的基础上结合在一起，形成的多学科综合的结果。 6.细胞工程：是应用细胞生物学、发育生物学和分子生物学的理论和技术，按照人们的需要，有计划、大规模的培养生物组织和细胞，以获取生物及其产品。或改变细胞的遗传组成，以产生新的种或品种，为社会和人类提供服务。 7.抗体：是一种免疫球蛋白，当机体受到细菌、病毒或其它抗原攻击时，B淋巴细胞就增殖、产生对这些抗原相应的抗体。 6.克隆：由一个细胞繁殖而形成的具有相同遗传特征的细胞。 7.单克隆抗体：由一个抗体形成细胞大量增殖形成的克隆所产生的抗体。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即克隆由许多个被激活B细胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多种抗体。如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体，称为单克隆抗体。 多倍体：是由于细胞内染色体加倍而形成的，既通过抑制受精卵第二极体的排出产生三倍体或抑制第一卵裂产生四倍体。目前广泛应用的诱导方法有：生物学、物理学和化学方法。 9.细胞重组：是细胞工程中将细胞融合技术与细胞核质分离技术结合，即在融合介子诱导下与完整细胞合并，重新构成胞质杂种的过程。 10.转基因动物：借助分子生物学实验手段，将特定的目的基因从某一生物体分离出来，进行扩增和加工，再导入动物的早期胚胎细胞中，使其整合到宿主动物的染色体上，在动物的发育过程中表达，并通过生殖细胞传给后代。这种在基因组中稳定地整合有人工导入的外源基因的动物称转基因动物。 11.干细胞（SC）：是指每个具有生命的有机体在从其最初形式发展成为完整体的过程中，始终保留着部分未分化的原始细胞。 12.生殖细胞：多细胞生物体内能繁殖后代的细胞的总称。包括从原始生殖细胞直到最终已分化的生殖细胞。物种主要依靠生殖细胞而延续和繁衍。
第三章动物细胞工程制药 学习目的与要求 （1）掌握动物细胞培养的基本要求和培养基的种类及其主要组成； （2）熟悉生产常用动物细胞的种类，动物细胞大规模培养的主要方法和操作方式。 （3）了解动物细胞反应器的基本知识，动物细胞制药的发展前景。 为什么选用动物细胞？ （1）生物技术制药的目的---受益者。 （2）哺乳动物细胞表达的优点：蛋白等药物最接近天然蛋白等。 动物细胞工程包括：细胞培养、动物细胞反应器、克隆筛选、核移植、胚胎移植、细胞融合。动物细胞工程概述：根据细胞生物学及工程学原理，定向改变动物细胞内的遗传物质从而获得新型生物或特种细胞产品。 动物细胞工程制药条件： （1）在无菌和人工控制的条件下培养动物细胞 （2）采用遗传操作技术定向改造动物细胞及其遗传性状 （3）获得多肽、蛋白药物以及生产疫苗等 动物细胞的体外培养： 体外培养动物细胞的类型：根据体外培养时动物细胞对生长基质的依赖性 贴壁依赖性细胞（成纤维细胞型、上皮细胞型） 非贴壁依赖性细胞（悬浮细胞） 兼性贴壁细胞 .贴壁依赖性细胞： （1）成纤维细胞型： 名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似 来源：由中胚层间充质组织起源的组织如：真正的成纤维细胞，心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮。 形态：似体内成纤维细胞的形态，胞体梭形或不规则三角形，胞质向外伸出2—3个长短不等的突起，中有卵圆形核 生长特点：排列成放射状，漩涡状，并不紧靠连成片，细胞—细胞接触易断开而单独行动，游离的单独的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起。 （2）上皮型细胞： 名称：仅形态上似体内，实际上不完全相同来源：来源于外胚层、内胚层细胞, 如：皮肤及其衍生物，消化道，乳腺，肺泡, 上皮性肿瘤。形态：类似体内的上皮细胞扁平，不规则多角形，中有圆形核生长特点：易相连成片，相靠—紧密相连—成薄层—铺石状，生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动。 （3）悬浮型细胞： 见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。 概念：培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长或以机械方法使保持悬浮状态下生长 来源：血，脾或骨髓，尤以血中白细胞癌细胞也可能 特点：在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团 优点：生存空间大，提供数量大，传代方便(不需消化)，易于收获，可获得稳定状态缺点：观察不方便，很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞) （4）兼性贴壁细胞： 些细胞并不严格地依赖支持物,它们既可以贴附于支持物表面生长,但在一定条件下,它们还