中南大学学报（医学版）
J Cent South Univ (Med Sci)
2013, 38(7) https://www.doczj.com/doc/2914858245.html,; https://www.doczj.com/doc/2914858245.html,
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深低温冷冻保存对脐血细胞的影响及机制
李昕，陈方平，蒋铁斌，王二华，刘竞
(中南大学湘雅三医院血液科，长沙 410013)
[摘要]目的：判断深低温冷冻保存对于脐血单个核细胞和CD34+细胞集落形成能力及凋亡率的影响，从而选取能准确反映冷冻损伤的指标以及优化脐血冷冻保存的方式。方法：从脐血中分离出单个核细胞及CD34+细胞，对这两种形式的细胞进行深低温冷冻保存，保存30 d 后复温，并分别进行冷冻前后的粒-巨噬细胞集落形成单位(colony forming unit-granulocyte/monocyte ，CFU-GM)和髓系多向造血干细胞(colony forming unit-granulocyte ，erythrocyte, monocyte and megakaryocyte ，CFU-GEMM) 的培养，比较冷冻前后的细胞集落产率，同时Annexin V–FITC-PI 染色后流式细胞仪检测两种保存形式的细胞冷冻前后的细胞凋亡率。结果：冷冻保存对于以单个核细胞形式保存的细胞其集落形成能力和以CD34+细胞形式保存细胞的CFU-GM 产率均无明显影响(P =0.31)，而对以CD34+细胞形式保存的细胞其CFU-GEMM 的产率却有明显影响，冷冻后的CFU-GEMM 的产率明显低于冷冻前(P<0.05)，且冷冻前即发现两种形式的细胞均有凋亡，冷冻后以单个核细胞形式保存的细胞其细胞凋亡率稍有所上升，但以CD34+细胞形式保存的细胞其细胞凋亡率更高。结论：冷冻前细胞即存在凋亡，冷冻对于以CD34+细胞形式冷冻保存的细胞中的较早期的祖细胞CFU-GEMM 存在一定的损伤，其损伤可能主要为诱导细胞凋亡所致，而对于以单个核细胞形式保存的细胞的影响较小。
[关键词] 冷冻保存；脐血；凋亡；髓系多向造血祖细胞
Effect of cryopreservation on umbilical blood cells
and its mechanism
LI Xin, CHEN Fangping, JIANG Tiebin, WANG Erhua, LIU Jing
(Department of Hematology, Third Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410013, China)
ABSTRACT Objective: To evaluate the effect of cryopreservation on clonogenic ability and apoptosis rate of
mono-nuclear cells and CD34+ cells in umbilical blood (UB), and to choose the index to present the freezing injury and optimize the cryopreservation of UB.
Methods: The mono-nuclear cells (MNC) and CD34+ cells were separated from UB and frozen.
收稿日期(Date of reception)：2012-06-20
作者简介(Biography)： 李昕，博士，副主任医师，主要从事造血干细胞和多发性骨髓瘤方面的研究。通信作者(Corresponding author)：刘竞， Email: jingliu0318@https://www.doczj.com/doc/2914858245.html,
基金项目(Foundation items)：湖南省科技厅一般项目(2010FJ6024，2012WK3068)。This work was supported by the grant fund of Hunan Science and T echnology Department, P. R. China (2010FJ6024, 2012WK3068).
DOI:10.3969/j.issn.1672-7347.2013.07.011
https://www.doczj.com/doc/2914858245.html,/xbwk/fileup/PDF/201307709.pdf
中南大学学报(医学版), 2013, 38(7) https://www.doczj.com/doc/2914858245.html,; https://www.doczj.com/doc/2914858245.html, 710
脐血移植由于具备来源广泛、采集方便、移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)发生率低、造血重建稳定等优点已成为造血干细胞移植及其他细胞治疗的优良细胞来源之一[1]。临床上脐血的采集时间是不能完全人为控制的，且异基因脐血移植需要人类白细胞抗原(HLA)配型，故患者预处理后一般均不能及时输注新鲜的脐血，所以脐血一般都需预先冷冻保存。而为了提高脐血冷冻库的保存效率，减少保存体积，现基本不用全血形式保存，多为分选出单个核细胞进行保存，甚至分选出CD34+细胞进行保存。因此，如何在进一步缩小保存体积以减低成本的同时，提高脐血干细胞冻存后的回收率和克隆形成能力以提高移植成功率具有重要的临床意义。研究[2-3]报道优化的冷冻体系及冷冻方法可以避免冷冻冻融过程对脐血造血细胞的影响，其冷冻前后的集落形成能力无明显影响，但亦有研究[4]报道冷冻不可避免地会导致脐血造血细胞的凋亡率增加，从而影响其活性及增殖能力。为判断脐血冷冻是否会引起细胞活性的改变，判断选取何种冷冻方式能达到最佳冷冻效果和经济简便的目的，本研究选取了以单个核形式和CD34+细胞形式分别对脐血细胞进行冷冻冻融处理后观察其集落形成能力的变化，从而判断冷冻是否会影响脐血造血细胞的增殖能力；同时检测冷冻前后不同保存形式细胞的凋亡率，以验证是否存在凋亡导致的冷冻损伤，从而选取最佳的脐血细胞冷冻形式和进一步判断冷冻损伤的原因。1 材料及方法
1.1 脐血采集
选取中南大学湘雅医院产科足月妊娠健康产妇，新生儿娩出后，断脐，消毒脐带，以采血针进行脐静脉穿刺，将脐带-胎盘血导入采血袋中，2 h内进行处理[5]，共收集标本10例。
1.2 材料
羟乙基淀粉和Ficoll为美国Sigma公司产品，流式细胞仪荧光抗体为美国BD公司产品，干细胞培养基为美国GIBCO公司产品，免疫磁珠分选试剂为德国Miltenyi Biotec公司产品，粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和促红细胞生成素(EPO)购自沈阳三生公司，Annexin V 凋亡检测试剂盒为美国Clontech公司产品。
1.3 方法
1.3.1 以密度梯度离心法分离单个核细胞
脐带血采集后，先以6%羟乙基淀粉沉积红细胞，将富白细胞上清分离，沉淀洗涤后，加入Ficoll中进行密度梯度离心分离出单个核细胞。1.3.2 CD34+细胞的分选
分离出单个核细胞后，采用免疫磁珠分选出CD34+细胞[5]。在分选后所得的细胞液中加入PE标记的鼠抗人CD34荧光抗体作阳性标记，并以PE标记的鼠抗人的IgG作为阴性标记，室温避光孵育30 min，PBS洗涤2次后上流式细胞仪进行检测。
After 30 days, they were thawed in warm water. Clonogenic capacity and clonogenic recovery before
and after the cryopreservation was compared. We also used Annexin V–FITC-PI to investigate the
apoptosis rate of the cells before and after the cryopreservation of these 2 types of cells.
Results: The number of colony forming unit-granulocyte/monocyte (CFU-GMs) was not changed after freezing and thawing in both MNCs and CD34+ cells, while the number of colony forming
unit-granulocyte, erythrocyte, monocyte and megakaryocyte (CFU-GEMM) was obviously
reduced after freezing in CD34+ cells. The 2 types of cryopreserved cells had certain degree of
apoptosis before the cryopreservation. MNC-type cryopreservation increased the cells apoptosis a
little, while CD34+-type cryopreservation increased more.
Conclusion: The cells have certain degree of apoptosis before the cryopreservation. The freezing and thawing procedure does affect the early stage progenitor cells—CFU-GEMM in the CD34+-
type cryopreserved cells in UB. The damage may be induced by the cell apoptosis.
KEY WORDS cryopreservation; umbilical blood; apoptosis; CFU-GEMM
深低温冷冻保存对脐血细胞的影响及机制 李昕，等711
1.3.3 单个核细胞及CD34+细胞的低温保存及复温
配制冷冻保护剂，将联合冷冻保护剂及被保存的细胞于4 ℃预冷20 min ，在0 ℃冰水混合物中混匀，置于程序冷冻仪中进行冷冻，程序结束后投入液氮中进行保存。30 d 后，对冻存的细胞采用快速复温法进行复温，复温后迅速洗涤进行培养[6]。1.3.4 单个核细胞及CD34+细胞的集落半固体培养
根据脐血造血细胞数与集落的线性关系，选择种入单个核细胞浓度为2×105个/mL ， CD34+细胞 2×103个/mL ，培养体系包括：干细胞无血清培养基，0.9%甲基纤维素，100 ng/mL GM-CSF ，2 mmol/L L -谷氨酰胺，50 ng/L 促红细胞生成素，30 ng/L 干细胞因子(SCF)，30 ng/L IL -3。置37 ℃，5% CO 2，饱和湿度培养箱中进行培养。培养14 d 后，置倒置显微镜下计数集落数[7-8]。1.3.5 细胞凋亡检测
Annexin V-FITC-PI 法：冷冻前后的单个核细
胞与CD34+细胞各1×105个与5 μL CD34-PE ，5 μL Annexin V-FITC 和10 μL 碘化丙锭 (PI) 室温避光孵育15 min ，加 400 μL 结合缓冲液用流式细胞仪检测， 测定细胞凋亡率[9]。
1.4 统计学处理
采用SPSS13.0软件分析，数据以均数±标准差(x±s )表示，采用配对t 检验及卡方检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 脐血CD34+细胞的分离纯化结果
M i d i M a c s 分离纯化获得的C D 34+细胞经流式细胞仪检测，其纯度为88.30%~97.62%(93.34%±6.34%)，其分选前后的CD34+率见图1。
图1 分选前后的流式细胞仪分析图。 A ，B ：分选前的检测图，A 为阴性对照，B 显示阳性细胞峰无明显右移，脐血中单个核细胞的CD34+细胞比率为0.27%；C ，D ：分选后的检测图，C 为阴性对照，D 显示阳性细胞峰明显右移，CD34+细胞比率为98.56%。
Figure 1 FACS before and after cell sorting. A, B: FACS before cell sorting, A is negative control, and B shows the positive cell peak is not in a dextraposition, and the purity of CD34+ cells is only 0.27%; C, D: FACS after cell sorting, C is the negative control, and D shows the positive cell peak is in a dextraposition, and the purity of the CD34+ cells is 98.56%。
A
C D
B
10080
6040200
200160
120
80400200160
12080400
10080
6040200
100 101 102 103 104
10
10
1
10
2
10
3
10
4
100 101 102 103 104
100 101 102 103 104
CD34-Control
CD34-Control
CD34CD34
0.27%
M1
M1
M1
M1
M2
M2
98.56%
C o u n t s
C o u n t s
C o u n t s
C o u n t s
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2.2 脐血CFU-GM和CFU-GEMM的培养特征
CFU-GM的集落形态(图2A，2B)：每个集落中的细胞数大于50个，其中透光的为粒细胞，黄褐色不透光的为单核(巨噬)细胞，冷冻前后细胞形态无改变。
CFU-GEMM的集落形态(图2C，2D)：集落较大，混合集落包括粒系、单核系、红系、巨核系，红系位于集落的中心，呈红色，巨核系以单个或小细胞团混于集落中，巨噬细胞较大，呈黄褐色，粒系细胞最多，其集落形成高峰在第14天左右。
图2 CFU-GM和CFU-GEMM集落形态。A：CFU-GM (×100)；B：CFU-GM (×400)；C：CFU-GEMM (×100)；D：CFU-GEMM (×400)。
Figure 2 CFU-GM and CFU-GEMM under light microscope. A: CFU-GM (×100)；B: CFU-GM (×400)；C: CFU-GEMM (×100)；D: CFU-GEMM (×400).
2.3 冷冻前后单个核细胞的CFU-GM和CFU-GEMM的产率
单个核细胞冷冻前后的CFU-GM产率分别为(128±16)/105和(118±15)/105，两者无明显差异，而其冷冻前的CFU-GEMM产率为(43±11)/105，冷冻后为(42±7)/105，两者差异亦无统计学意义(P>0.05)。
2.4 冷冻前后CD34+细胞的CFU-GM和CFU-GEMM的产率
以CD34+细胞形式保存的细胞进行冷冻前后的集落培养，冷冻前后CD34+细胞的CFU-GM产率分别为(148±10)/103和(142±12)/103，两者差异无统计学意义(P>0.20)。冷冻前后单个核细胞的CFU-GEMM产率分别为(69±10)/103和(49±7)/103，冷冻后明显低于冷冻前，两者差异有统计学意义(P<0.05)。
2.5 冷冻前后细胞凋亡率的比较
单个核细胞和C D34+细胞在冷冻前即有细胞凋亡，凋亡率分别为(14.21±5.73)%和(22.05±6.31)%，而冷冻后单个核细胞的凋亡率为(21.52±8.62)%；而以CD34+细胞形式冷冻后的细胞凋亡率明显增高，达到(38.05±5.93)%(图3)。
A
C D
B
深低温冷冻保存对脐血细胞的影响及机制 李昕，等
713
3 讨 论
临床上判断移植物中造血细胞的活力一般采用台盼兰染色、单个核细胞计数及CD34+细胞计数和CFU-GM 集落计数等，但以上指标均存在一定的缺陷，如台盼兰染色不能及时反映细胞的存活状态及其增殖能力，单个核细胞和CD34+细胞计数仅仅反映了细胞数量，不能提示其增殖活力，而CFU-GM 集落计数虽反映了一定程度的细胞增殖活力，但其代表的一般为粒/巨噬祖细胞的增殖活力，而不能代表其他系的增殖活力。所以本实验采用了CFU-GEMM 集落培养方法，这是体外克隆实验中能反映较早期祖细胞的增殖活力及移植后造血重建能力的方法。另外，本研究主要探讨脐血造血细胞的最佳保存形式，因此，就冷冻速率、冷冻保护剂、冻融速率等各方面有可能影响冷冻保存效果的的各条件均选择了最优方式，如使用程序降温仪控制冻存温度，改良冷冻保护剂，并在冻存液中加入膜稳定剂和生物抗氧化剂等冷冻方法以保证最佳冻存效果[5,9]。
本研究中发现冷冻对于单个核细胞形式保持的集落形成能力影响不大，其冷冻前后的集落产率(包括CFU-GM 和CFU-GEMM)的差异无统计学意义。而冷冻对CD34+细胞形式保存的CFU-GEMM 的产率却有明显影响，冷冻后其产率明显低于冷冻前(P <0.05)，而对CFU-GM 无明显影响，提示冷冻对于CD34+细胞中的较早期的祖细胞CFU-GEMM 仍然存在一定的损伤。
对脐血CD34 细胞在冻融过程中的生物学行为进行研究，结果显示：冻存细胞的凋亡率明显增加，细胞内出现 DNA 断裂片段，其造血克隆形成能力明显下降，提示细胞凋亡是导致脐血干细胞冷冻损伤的重要途径 [10-12]。本研究通过Annexin V-FITC-PI 法测得冷冻后以单个核细胞形式和CD34+
图3 冷冻前后细胞凋亡率检测的流式细胞仪图。 A ：单个核细胞冷冻前的凋亡率，仅为14.89%；B ：单个核细胞冷冻后的细胞凋亡率，为21.52%；C ：分选后CD34+细胞冷冻前的凋亡率，为22.27%；D ：分选后CD34+细胞冷冻后的凋亡率，达到了36.82%。
Figure 3 FACS for detecting apoptotic rate of the cells before and after cryopreservation. A: Apoptotic rate of MNCs before cryopreservation is only 14.89%; B: Apoptotic rate of MNCs after cryopreservation is 21.52%; C: Apoptotic rate of sorted CD34+ cells before cryopreservation is 22.27%; D: Apoptotic rate of sorted CD34+ cells after cryopreservation is 36.82%.
A
D
104103102
101100
10
10
1
10
2
10
3
10
4
Annexin V FITC
Data 5.005
Data.005
14.89
Annexin V FITC P r o p i d i u m l o d i d e
P r o p i d i u m l o d i d e
100 101 102 103 104
104
103
102
101
100
B
Data.
Annexin V FITC
P r o p i d i u m l o d i d e
100 101 102 103 104
104
103
102
101
100
21.52
36.82
C Data 4.004
22.27
Annexin V FITC P r o p i d i u m l o d i d e
10
10
1
10
2
10
3
10
4
104
103102
101
100
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细胞形式保存的细胞的凋亡率均有上升，但以后者上升明显(21.52 vs 38.05)。冷冻对细胞凋亡的影响与对CFU-GEMM产率的影响是一致的，提示早期凋亡的检测比CF U-GM集落产率更为敏感地显示了冷冻的损伤。但无论是集落产率还是凋亡率的检测均提示以单个核形式保存的细胞其受冷冻影响的概率明显低于以CD34+细胞形式保存的细胞。因此，通过以上结果证实，虽然CD34+细胞形式保存的脐血细胞体积可以控制在很少的体积以内(1 mL以内)，节约了较大的保存体积，但其分选过程的细胞损耗及冷冻冻融后的损伤较单个核细胞形式保存的脐血细胞更为明显，因此笔者认为以单个核细胞形式保存的脐血造血细胞比CD34+细胞的形式更为理想。另外，通过对冻存前后的细胞进行早期凋亡的检测，进一步明确了冷冻前后均存在细胞的早期凋亡，但冷冻后脐血CD34+细胞的凋亡率明显上升，其早期凋亡的检测有助于预判脐血干细胞移植后造血重建的成功率大小，而且此种方法比集落形成率的检测更为快速准确。
脐血移植是一种重要的造血干细胞移植方式，然而每份的细胞数量有限，提高脐血干细胞冻存后回收率和克隆形成能力具有重要的临床意义。本研究通过改良方法对不同细胞群体的保存以及对造血干细胞在冷冻损伤中的凋亡事件进行探讨，对脐血库监测冻存脐血细胞质量和改善低温冻存体系具有一定的参考意义。
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(本文编辑彭敏宁)
本文引用：李昕, 陈方平, 蒋铁斌, 王二华, 刘竞. 深低温冷冻保存对脐血细胞的影响及机制[J]. 中南大学学报:医学版, 2013, 38(7): 709-714. DOI:10.3969/j.issn.1672-7347.2013.07.011
Cite this article as:LI Xin, CHEN Fangping, JIANG Tiebin, WANG Erhua, LIU Jing. Effect of cryopreservation on umbilical blood cells and its mechanism[J]. Journal of Central South University. Medical Science, 2013, 38(7): 709-714. DOI:10.3969/j.issn.1672-7347.2013.07.011
深低温冷冻保存对脐血细胞的影响及机制
作者：李昕， 陈方平， 蒋铁斌， 王二华， 刘竞， LI Xin， CHEN Fangping， JIANG Tiebin， WANG Erhua，LIU Jing
作者单位：中南大学湘雅三医院血液科,长沙,410013
刊名：
中南大学学报（医学版）
英文刊名：Journal of Central South University (Medical Science)
年，卷(期)：2013(7)
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12.Shim JS;Cho B;Kim M Early apoptosis in CD34+cells as a potential heterogeneity in quality of cryopreserved umbilical cord blood[外文期刊] 2006(02)
本文链接：https://www.doczj.com/doc/2914858245.html,/Periodical_hnykdx201307011.aspx
细胞冻存方法 一、概述 目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。如细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丢失。如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。 二、主要冷冻设备和材料 常用的细胞冷冻贮存器为液氮贮存器，规格有35L3和50L3两种。使用时要注意以下几点：（1）一般两周需充液氮一次，至少一个月充氮一次。液氮温度达-196℃，使用时注意勿让液氮溅到皮肤上，以免引起冻伤。 （2）液氮容器为双层结构，中间为真空层，瓶口有双层焊接处，应防止焊接部裂开。（3）在装入液氮时，要注意缓慢小心，并用厚纸卷筒或特制漏斗作引导，使液氮直达瓶底，如有专用液氮灌注装置则更好。若为初次使用，加液氮时更要缓慢，以免温度骤降而使容器损坏。 细胞冻存时常备的材料有：0.25%胰蛋白酶，含10%～20%的血清培养液，DMSO(分析纯)或无色新鲜甘油(121°C蒸气高压消毒)，2mL安瓿（或专用细胞冻存管）、吸管、离心管、喷灯、纱布袋（或冻存管架）等。 三、细胞冻存方法 主要操作步骤为： （1）选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天最好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细胞则不要消化处理。然后将细胞收集于离心管中离心(1000r/min，10分钟)。 （2）去上清液，加入含20%小牛血清的完全培养基，于4℃预冷15分钟后，逐滴加入已无菌的DMSO或甘油，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，细胞浓度为3×106～1×107/mL之间。（3）将上述细胞分装于安瓿或专用冷冻塑料管中，安瓿装1～1.5mL在火焰喷灯上封口，封口处要完全封闭，圆滑无勾。冷冻管要将盖子盖紧，并标记好细胞名称和冻存日期，同时作好登记（日期、细胞种类及代次、冻存支数）。 （4）将装好细胞的安瓿或冻存管装入沙布袋内；置于液氮容器颈口处存放过夜，次日转入液氮中。采用控制降温速度的方法也可采用下列步骤：先将安瓿置入4℃冰箱中2～3小时，再移至冰箱冷冻室内3～4小时（此步可省略），再吊入液氮容器颈气态部分存放2小时，最后沉入液氮中。 细胞冻存在液氮中可以长期保存，但为妥善起见，冻存半年后，最好取出一只安瓿细胞复苏培养，观察生长情况，然后再继续冻存。
细胞传代培养的原理及操作步骤 （一）原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，须进行传代再培养。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 （二）细胞传代培养具体操作 1、细胞：贴壁细胞株 2、操作步骤 1）将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 2)加入0.5-1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。 3)瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml培养液终止消化。 观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1-3分钟。 4)用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。 细胞冻存 1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射15min；培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水 浴箱37℃预热备用；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液 2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入适量胰蛋白酶消化。 3. 适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的 细胞悬液。 4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心(1000r/min，10分钟)。 5. 去上清液，加入与细胞悬液等量的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀 6. 冷存管置于4℃10分钟----20℃30分钟----80℃16～18小时(或隔夜)---液氮槽vaporphase长期储 存。-20℃不可超过1h，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 7．记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。 细胞复苏 1.室内紫外消毒；培养基、PBS于37℃恒温水浴预热备用。 2.自液氮罐中取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，离心。 3.去上清，加入培养基，吹打，然后移入培养瓶中，用培养基清洗冻存管，清洗液也移入培养瓶中。 4.于培养瓶中加入适量培养基，放入CO2培养箱中培养 5.记录复苏日期；次日换液。
细胞冻存的方法与步骤文件编码（GHTU-UITID-GGBKT-POIU-WUUI-8968）
细胞冻存、解冻方法与细胞计数 江苏大学附属医院风湿科李晶??????〖〗 一、细胞冷冻保存 1.材料： 生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(SigmaD-2650)、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)、0.4％（w/v）trypanblue(GibcoBRL15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SeriesII) 2、冷冻保存方法： （1）传统方法:冷存管置于4℃10分钟--->-20℃30分钟--->-80℃16～18小时(或隔夜)--->液氮槽vaporphase长期储存。 -20℃不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 （2）程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。 3、步骤： （1）冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期。 （2）配制冷冻保存溶液(使用前配制)：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜（DMSO）至20%浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用。 （3）离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。 （4）取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液（DMSO最后浓度为5～10％），使细胞浓度为1～5×106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1～2ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。
不同时限深低温保存对猪心脏瓣膜生物力 学比较 本文采用液氮深低温保存的猪主动脉瓣，随着保存限时延长分析瓣膜生物力学特性及差异性，以期为今后临床应用奠定理论基础。 资料与方法 实验过程：于猪宰杀后30min内清洁条件下取出心脏，经过取瓣、修剪、灭菌培养等处理，制备20只主动脉瓣膜，分别随机分成5组，通过程序性降温，采用液氮冷冻（-196℃）保存，将瓣膜完全浸润在冻存液中。分别经过2周、4周、6周、8周、10周深低温储存后，解冻后测定不同储存时限瓣膜生物力学指标。 检测指标：生物学检测指标主要有组织厚度，组织含水量，热皱缩温度；强度、组织伸长比。 统计分析：所有数据资料均以（χ±s）表示。采用SPSS 13.0、SAS 10.0统计学软件进行统计处理，所有数据正态性检验后，两样本均数采用组间或配对t检验，显著性标准为P<0.05。 结果 深低温保存不同时限5组瓣膜厚度、组织热皱缩温度
及组织含水量随着保存时限延长呈逐渐递增趋势（f=8.238，p=0.074），但无统计学意义；破坏强度及伸长比各组间存在明显差异，经统计学检验有显著性差异，见表1。 讨论 由于目前临床运用的人造心脏瓣膜 存在诸多的缺陷，机械瓣膜耐久性很好，但是术后抗凝的不当会引起出血和血栓的发生，组织工程瓣膜能很好地解决这一问题。最近研究表明其在细胞方面：不易黏附上去，胶原、弹力蛋白和蛋白聚糖等天然固有成分的缺失，力学性能较差。其主要原因为静态环境下培养的瓣膜上的内皮细胞黏附力低下，同时人体心脏瓣膜的结缔组织具有复杂的结构和分布形式，以耐受瓣叶起闭过程中不断变化的应力作用。以上研究提示生物瓣膜的细胞和纤维支架两者都是造成瓣膜衰败的重要因素。 同其他类型瓣膜相比同种瓣膜术后患者无须抗凝治疗，广泛应用于瓣膜替换手术及婴幼儿复杂先心病矫治术中。1962年Ross首次把人同种异体主动脉瓣应用于临床并取得成功，1986年O’Bfien首创了液氮超低温冷冻保存技术，提高瓣膜耐久性，有效地减少了由人工瓣膜引起的心内膜炎的发生率。其机制主要在于深低温环境可中断细胞的代谢，将损伤减到最小。同时，有文献报告冷冻保存技术能抑制移植物内皮细胞黏附因子的表达。因此目前如何提高同种
培养细胞的冷冻保存与复苏 ?概述?冻存过程 ?冷冻保存与复苏的原理?冻存结果 ?冷冻速率?讨论 ?冷冻保存温度?冻存细胞的复苏 ?复温速率?非玻璃化冻存细胞的复 苏 ?冷冻保护剂?主要材料 ?冷冻保存方法?复苏过程 ?非玻璃化冻存方法?结果 ?主要材料?讨论 ?冻存过程?玻璃化冻存细胞的复苏 ?冻存结果?主要材料 ?讨论?复苏过程 ?玻璃化冻存方法?结果 ?主要材料?讨论
? Ｐolge等人(１9４9)发现了甘油对低温下贮存的细胞具有保护作用,她们仍 然以精子进行研究发现,加入甘油能够大大提高贮存于-７９0C下精子的存活率。接下来的重大进展就是Luyｅｔ(１9５1)与Ｌoveｌock(1953)等多位学者发现了电解质浓度对贮存细胞的损伤作用。她们的结论就是,电解质浓度增大就是造成贮存细胞损伤的主要原因。冷冻理论后来得到Ｍerryman(１９5６)、Reｙ(195７)以及Ｓmｉtｈ(1９61)等学者的继续与发展。 １94９年至1９６0年这一段时间可以称为冷冻保存的“甘油时期”,这一时期对生物材料的冷冻保存一般都就是以甘油作为保护剂。Lovｅｌock(１95９)等人发现了一种新的化学保护剂,这就就是人们熟悉的二甲基亚砜(ＤMSＯ)。而且,用于冷冻保存的仪器也有明显的发展。目前,无论就是冷冻保存理论、各种保护剂、冷冻用品与设备以及各种生物材料的保存与复苏技术都已十分成熟与完备。 返回页首 ?冷冻保存与复苏原理 在低于-70０C的超低温条件下,有机体细胞内部的生化反应极其缓慢,甚至终止。水在低于零度的条件下会结冰。如果将细胞悬浮在纯水中,随着温度的降低,细胞内外的水分都会结冰,所形成的冰晶会造成细胞膜与细胞器的破坏而引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而导致的细胞损伤称为细胞内冰晶的损伤。如果将细胞悬浮在溶液中,随着温度的降低,细胞外部的水分会首先结冰,从而使得未结 冰的溶液中电解质浓度升高。如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长,
细胞冻存、解冻方法与细胞计数 江苏大学附属医院风湿科李晶〖返回主页〗 一、细胞冷冻保存 1、材料： 生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(Sｉｇma D-2６５0）、无菌塑料冷冻保存管(Naｌgene 5０0０—00２0)、0、４％（w／ｖ)tryｐan blue(GibcoBＲL1５250-061）、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KＲYＯ10Sｅri ｅsIＩ) 2、冷冻保存方法： （１)传统方法：冷存管置于4℃１0分钟－--＞-20℃3０分钟--－>-80℃１6~18小时（或隔夜)——->液氮槽ｖaｐorphａsｅ长期储存. -20℃不可超过１小时,以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入—80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。 (２）程序降温:利用已设定程序得等速降温机以—１～-3℃／分钟之速度由室温降至（－8０℃以下）-12０℃，再放在液氮槽vａｐｏrphａｓｅ长期储存。适用于悬浮型细胞与hybｒidoｍａ之保存。 ３、步骤： （1）冷冻前2４－4８小时更换半量或全量培养基,使细胞处于指数生长期。 （2)配制冷冻保存溶液（使用前配制）：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜（DMＳO）至20％浓度,即制成双倍得冻存液，置于室温下待用。 (3）离心收集培养之细胞，用加血清得培养基重悬起细胞,取少量细胞悬浮液(约０、1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。 （4）取与细胞悬液等量得冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管,制成细胞冻存悬液（DMSO最后浓度为5～10％），使细胞浓度为1～5×１0６cｅlls/ｍl，混合均匀,分装于已标示完全之冷冻保存管中，1~2mｌ/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测.严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。 4、注意事项: （１）欲冷冻保存之细胞应在生长良好（lｏgphase）且存活率高之状态，约为80~90%致密度。冷冻前检测细胞就是否仍保有其特有性质,例如hｙbrｉdoｍa应在冷冻保存前一至二日测试就是否有抗体之产生。
培养细胞的冷冻保存与复苏 Polge等人（1949）发现了甘油对低温下贮存的细胞具有保护作用，他们仍然以精子进行研究发现，加入甘油能够大大提高贮存于-790C下精子的存活率。接下来的重大进展是Luyet（1951）与Lovelock（1953）等多位学者发现了电解质浓度对贮存细胞的损伤作用。他们的结论是，电解质浓度增大是造成贮存细胞损伤的主要原因。冷冻理论后来得到Merryman（1956）、Rey（1957）以及Smith （1961）等学者的继续和发展。 1949年至1960年这一段时间可以称为冷冻保存的“甘油时期”，这一时期对生物材料的冷冻保存一般都是以甘油作为保护剂。Lovelock（1959）等人发现了一种新的化学保护剂，这就是人们熟悉的二甲基亚砜（DMSO）。而且，用于冷冻保存的仪器也有明显的发展。目前，无论是冷冻保存理论、各种保护剂、冷冻用品和设备以及各种生物材料的保存与复苏技术都已十分成熟和完备。 冷冻保存与复苏原理 在低于-700C的超低温条件下，有机体细胞内部的生化反应极其缓慢，甚至终止。水在低于零度的条件下会结冰。如果将细胞悬浮在纯水中，随着温度的降低，细胞内外的水分都会结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏而引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而导致的细胞损伤称为细胞内冰晶的损伤。如果将细胞悬浮在溶液中，随着温度的降低，细胞外部的水分会首先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高。如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长，细胞膜上脂质分子会受到损坏，细胞便发生渗漏，在复温时，大量水分会因此进入细胞内，造成细胞死亡。这种因保存溶液中溶质浓度升高而导致的细胞损伤称为溶质损伤或称溶液损伤。当温度进一步下降，细胞内外都结冰，产生
中华试剂网 试剂·原料·仪器 https://www.doczj.com/doc/2914858245.html, TEL: +86-21-34053660 Add: old humin Road, Shanghai 200237, P.R.C 病毒的超低温保存法 大多数微生物可用超低温保存，超低温保存法是适用范围最广的微生物保存法。需要复杂营养的微生物种，如用其他的贮存方法不能保持其活力（如植物的病原性真菌），通常可用超低温的方法保存（ATCC 1983；Halliday，Baker 1985）。此法是将冻存在小管或安瓿里的细胞以较慢的冷冻速率（1℃／分钟）冷冻，直至—150℃，再将这些小管贮存在—150～－196℃的液氮中。 超低温的冷冻保护剂不同于冻干法所用的冷冻剂。ATCC 常用一种由甘油（10％）、二甲基亚砜（5％）和培养液制成的混合剂保存多数的细胞株。这些化学试剂进入细胞内可避免内 膜的冷冻损伤。 贮存在低温容器内的细胞复苏时必须小心操作。当小管被加热时，所形成的冰晶会将细 胞杀死，正确操作就可避免这种事故。只要迅速将样品解冻就能减少活力的丢失，做法是：将封口的小管迅速放入37℃的水中，直至所有的冰融化，然后打开管口，将内容物移入培养基。 超低温保藏的微生物必须始终贮存在温度非常低的环境中，因此需要液氮罐。在长期贮存的过程中必须经常注意补充液氮。这种贮存方式比冻干法需要更多的经费，包括为了维持贮存温度所必要的劳动力和液氮等。 2.2 材料 病毒超低温保存所需材料有：热收缩塑料管（Nunc Cryoflex），液氮罐，防护手套和面罩，永久性记号笔，气体喷灯，装液氮的保温瓶。 2.3 方法 （1）剪一段两端各超出冷冻管长度2cm 的热收缩塑料管。 （2）将含有澄清病毒悬液（组织培养的上清培养基，或组织培养基内的细胞溶解产物均可）冰浴几分钟，用灭菌移液管将0.2ml 冰浴过的上清悬液分装到冷冻管内，并将盖子拧紧。 （3）将有病毒的冷冻管放入热收缩塑料管中部，插入正确的标签。 （4）用喷灯小心加热热收缩塑料管，并使之包住冷冻管。注意不要用太高的温度加热热收缩塑料管。 （5）再小心加热热收缩塑料管的两端，用大号镊子夹紧管的端口至完全密封。 （6）将密封好的冷冻管快速在装有液氮的保温瓶中冷冻（操作时要求戴面罩和手套）。（7）将冷冻过的冷冻管放入液氮罐中的格子内，同时记录样品的详细的存放位置、实验编号和存放日期等。 （8）需要用时，迅速从液氮罐内取出所需样品，并投入37℃水浴箱中解冻后，用解剖刀片在冷冻管的硅化垫圈处切开热收缩塑料管。拧开冷冻管的盖子时不需要除去热收缩塑料管。
细胞冻存的原理与要求 1. 原理：在不加保护条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水会形成冰晶，能导致 细胞内发生一系列的变化，如机械损伤、电解质浓度升高、渗透压改变、脱水、pH值改变、蛋白质变性等，能引起细胞死亡。但如向培养基中加入保护剂（甘油或DMSO ），可使冰点降低，在缓慢的冻存条件下，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外。储存在- 130度以下低温中能加水冰晶的形成。溶解细胞时，速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的- 5?0度后，细胞仍能生长，活力不受任何损害。当前使用的保护剂为DMSO和甘油，它们对细胞 无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞，使用浓度范围在5?10%之间，常用10%。 2. 要求：为保护细胞最大存活率，一般采用慢冻快溶的方法。标准的冻存速度为- 1?-2 度/分钟，当温度达—25度时，下降率刻增至—5?—10度/分钟到—100度时则可迅速浸入液氮中。要适当掌握下降速度，过快能影响到细胞内水分透出，太慢则促进冰晶形成。但各种细胞对冻存速度要求不一样，上皮细胞和成纤维细胞的耐受性大些，骨髓干细胞-1?-3 度/分钟较合适，胚胎细胞耐受性较小，总之，在一开始时下降速度不能超过- 10度/分钟。另外，用什么保护剂合适和用量多大，要依细胞而定，初代培养用DMSO较好，一般细胞 可用甘油。用量以较小为好，有人认为人皮肤上皮细胞储存在20~30%甘油中很好。原则上 细胞在液氮中可储存多年，但为妥善起见，冻存一年后，应再复苏培养一次，然后再继续 冻存。 冻存液是（DMSO10%+90%FBS ） 技术总结要点 1. 冷冻速度 冷冻速度也就是降温的速度，它与冷冻效果直接相关。Morris认为在冷冻过程中生物物理 作用比生物化学作用更重要。冷冻速度、细胞收缩引起细胞膜和细胞器的变化是造成损伤的主要因素目。冷冻速度不同，细胞内水分向细胞外流动的情况也会不同。如果冷冻速度过慢，细胞内水分外渗多，细胞脱水，体积缩小，同时细胞内溶质浓度增高，细胞内不发生结冰；冷冻速度过快，细胞内水分没有足够时间外渗，随着温度的下降，细胞内会发生结冰；如果冷冻速度非常快，细胞内形成的冰晶反而非常小或不结冰而呈玻璃状凝固（玻璃化冷冻）。不同的冷冻速度会使细胞内外产生不同的生理变化，同样也会对细胞造成损伤。冷冻速度过慢，细胞严重脱水，体积急剧收缩.超过一定程度时细胞失去活性。冷冻速度过慢会引起细胞外溶液部分结冰，从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度增高，产生溶液损伤。冷冻速度 过快，细胞内水分来不及外渗，会在胞内形成较大冰晶，造成细胞膜和细胞器的损伤，产生细胞内冰晶损伤。1937年，Luyet实液体的凝固可分为两种形式：一种是晶体化，液体中的分子呈有序的排列；另一种为非晶体化即玻璃化，液体中的分子呈无序排列，保持未凝固前的状态。故从细胞存活角度来说玻璃化冷冻是最为理想的冻存方法。细胞内外呈玻璃化凝固。 无冰晶形成或形成很小的冰晶，对细胞膜和细胞器不造成破坏；细胞也不会在高浓度溶质的
超低温保存箱的使用注意点 超低温保存箱在出厂之前都是经过12小时以上的调试才发货的，今天超低温保存箱小编就和大家分享下，在使用的时候有些问题也是要注意的哦！ 一、运输与存放事项 1.从车上卸下时，要用双叉车进行，并要充分注意安全，体型小的柜子当有人扶着；或用吊车吊下时，要在指定的部位用φ10mm以上的钢索或钢带，安全的吊下； 2.移动柜体时,切勿用力过猛或剧烈振动等，损坏底脚及其它部件； 3.使用前确保揭掉所有外包装保护膜，拆包后，必须安放在平整的地面上，安放水平； 二、超低温保存箱适用环境 柜体周边离墙和其他物距离应不小于30厘米，以保证冷凝器散热良好； 避免将柜体安放在漏雨、漏水或潮湿的场所； 确保使用环境干燥、通风良好，勿靠近热源，避免阳光直射，以免影响制冷效果； 超低温保存箱不可在易燃、易爆气体环境中使用，切勿在箱子附近喷射油漆、涂料等易燃物品，以免发生火灾。 三、超低温保存箱电气注意事项 1.为确保超低温保存箱正常工作，请务必使用220V电源，10A以上的三孔插座（尽量不要使用接线板插座）； 2.超低温系列产品属于宽电压带设计，电源187V～242V/50Hz，超低温冷冻箱小编告诉大家，如果电压波动过大应加装1250VA以上的自动稳压器，以免损坏压缩机以及其它电器元件； 3.插拔电源线插头时，应用手持插头，不可拉扯电源线； 4.必须为超低温保存箱安装可靠的单独的接地线，接地线不得与煤气管、暖气管、水管连接，也不得借用单相电源的零线； 5.如需加长电源线，导线截面积≥1.5mm2，导线可以是单股，也可以是多股，严禁采用多用插座驳接。 四、储物注意事项 注：超低温冰箱属于保存设备，区别于速冻设备，切勿一次性放入相对太热的物品，否则可能会造成压缩机长时间工作不停机，温度不下降且容易烧毁压缩机； 1.将食品或物品存入柜子之前，须先将空箱通电并达到设定温度后，放入物品； 2.箱内一次性放入的物品或其它制品不超过箱内容积的三分之一，不可过挤，应保证有适当的间隙，以利于箱内冷气的流通； 3.如存放物品含水量较大，放置物品时适当减少每次放入量。 五、日常维护 1.箱体清洁：断电后，清洗超低温保存箱内外表面应用无腐蚀性的中性清洗剂，清洗后，用干布擦干。 注意：严禁用水直接冲洗箱子的内外表面，以免影响电器绝缘性能。严禁用开水、去污粉、酸、碱、汽油、酒精、苯类、腐蚀性清洁剂，硬毛刷进行清洁。 2.超低温保存箱长期运行时，门封处、柜口部及箱内侧壁容易积霜，霜层过厚会影响密封性能和制冷性能，请用除霜铲定期除霜，并用干布擦拭干净。
培养细胞的冷冻Polge等人（1949）发现了甘油对低温下贮存的?概述?冻存过程 ?冷冻保存的原理?冻存结果 ?冷冻速率?讨论 ?冷冻保存温度?冻存细胞的复苏 ?复温速率?非玻璃化冻存细胞的复 苏 ?冷冻保护剂?主要材料 ?冷冻保存方法?复苏过程 ?非玻璃化冻存方法?结果 ?主要材料?讨论 ?冻存过程?玻璃化冻存细胞的复苏 ?冻存结果?主要材料 ?讨论?复苏过程 ?玻璃化冻存方法?结果 ?主要材料?讨论 细胞具有保护作用，他们仍然以精子进行研究发现，加入甘油能够大大提高贮存于-790C下精子的存活率。接下来的重大进展是Luyet（1951）与Lovelock（1953）等多位学者发现了电解质浓度对贮存细胞的损伤作用。他们的结论是，电解质浓度增大是造成贮存细胞损伤的主要原因。冷冻理论后来得到Merryman（1956）、Rey（1957）以及Smith（1961）等学者的继续和发展。 1949年至1960年这一段时间可以称为冷冻保存的“甘油时期”，这一时期对生物材料的冷冻保存一般都是以甘油作为保护剂。Lovelock（1959）等人发现
了一种新的化学保护剂，这就是人们熟悉的二甲基亚砜（DMSO）。而且，用于冷冻保存的仪器也有明显的发展。目前，无论是冷冻保存理论、各种保护剂、冷冻用品和设备以及各种生物材料的保存与复苏技术都已十分成熟和完备。 冷冻保存与复苏原理 在低于-700C的超低温条件下，有机体细胞内部的生化反应极其缓慢，甚至终止。水在低于零度的条件下会结冰。如果将细胞悬浮在纯水中，随着温度的降低，细胞内外的水分都会结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏而引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而导致的细胞损伤称为细胞内冰晶的损伤。如果将细胞悬浮在溶液中，随着温度的降低，细胞外部的水分会首先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高。如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长，细胞膜上脂质分子会受到损坏，细胞便发生渗漏，在复温时，大量水分会因此进入细胞内，造成细胞死亡。这种因保存溶液中溶质浓度升高而导致的细胞损伤称为溶质损伤或称溶液损伤。当温度进一步下降，细胞内外都结冰，产生冰晶损伤。但是如果在溶液中加入冷冻保护剂，则可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。因为冷冻保护剂容易同溶液中的水分子结合，从而降低冰点，减少冰晶的形成，并且通过其摩尔浓度降低未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质损伤，细胞得以在超低温条件下保存。在复苏时，一般以很快的速度升温，1-2分钟内即恢复到常温，细胞内外不会重新形成较大的冰晶，也不会暴露在高浓度的电解质溶液中过长的时间，从而无冰晶损伤和溶质损伤产生，冻存的细胞经复苏后仍保持其正常的结构和功能。冷冻保护剂对细胞的冷冻保护效果还与冷冻速率、冷冻温度和复温速率有关。而且不同的冷冻保护剂其冷冻保护效果也不一样。 冷冻速率 冷冻速率是指降温的速度，直接关系到冷冻效果。细胞在冷冻过程中会发生如下变化：当细胞被冷至-50C时，因溶液中加有冷冻保护剂而降低溶液的冰点，细胞内外溶液仍未结冰；当被冷至-5～-150C之间时，细胞外溶液先出现结冰而细胞内仍保持未结冰状态。细胞内未结冰的水分子会比细胞外部分结冰溶液中的水分子具有更高的化学能。其结果是，细胞内水分子为了和细胞外水分子保持化学能的平衡，会向细胞外流动。冷冻速度不同，细胞内水分向外流动的情况也不
冷冻保存方法： （1）传统方法：冷存管置于4℃10分钟→ -20℃30分钟→ -80℃16～18小时（或隔夜）→液氮槽vaporphase长期储存。-20℃不可超过1小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 （2）程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。 3、步骤： （1）冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。 （2）配制冷冻保存溶液（使用前配制）：将DMSO加入新鲜培养基中，最后浓度为5～10％，混合均匀，置于室温下待用。 （3）依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液（约0.1ml）计数细胞浓度及冻前存活率。 （4）离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1～5×106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。 4、注意事项： （1）欲冷冻保存之细胞应在生长良好（logphase）且存活率高之状态，约为80–90％致密度。 （2）冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。 （3）注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色（以0.22micron FGLP Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650），以5～10ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。 这是我的实验记录，经过实践检验的，成功率很高。 1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射15min；培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水浴箱37℃预热备用；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液 2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入适量胰蛋白酶消化。 3. 适时去掉胰蛋白酶，加入1.5ml新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。 4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心(1000r/min，10分钟)。 5. 去上清液，加入与1ml的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀
背景知识： 细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。 原理： 细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。 主体内容（操作步骤）： 一、材料 （一）仪器 1. 净化工作台 2. 离心机 3. 恒温水浴箱 4. 冰箱（4℃、-20℃、-70℃） 5. 倒置相差显微镜 6. 培养箱 7. 液氮冰箱 易生物仪器库：https://www.doczj.com/doc/2914858245.html,/yp/product-list-42.html （二）玻璃器皿 1. 吸管（弯头、直头） 2. 培养瓶 3. 玻璃瓶（250ml、100ml） 4. 废液缸 （三）塑料器皿 1. 吸头 2. 枪头 3. 胶塞 4. 移液管（10ml） 5. 15ml离心管 6. 冻存管（1～2ml） （四）其他物品 1. 微量加样枪 2. 红血球计数板 3. 记号笔 4. 医用橡皮膏 5. 移液枪 （五）试剂 1. D-Hanks液 2. 小牛血清
细胞冻存与复苏技术 概述 细胞培养技术自1907年开创以来，历经一个世纪现已成为自然科学领域不可缺少的研究方法之一。在细胞培养技术广泛用于科学研究领域的令天，细胞株的冷冻保存和解冻复苏这一基础技术日益得到重视。 低温保存是活体组织保存最常用的方法之一。冷冻保存一般是指在0—196 oC进行保存，就是将体外培养物悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度，并在此温度下对其长期保存的过程。主要有-20~-40℃冰箱保存、-60~-80℃深低温冰箱和液氮(一196℃)超低温保存等。 应用方向 1. 医学方面 近年来干细胞的研究越来越被人们关注，由于它是一种具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，可分化为多种功能细胞。 根据发育阶段和取材来源，干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞两大类。骨髓和脐血是成体干细胞的主要来源。 骨髓干细胞在骨髓中含量极少，约占骨髓有核细胞的十万分之一，所以要在临床上广泛应用首先必须具备先进的冻存与复苏技术。 而干细胞研究的深入将解决包括癌症等一系列为人们所知的“绝症”。而“冬眠”技术对医学的发展有着里程碑式的意义。 2. 生物学方面 细胞冻存技术是生物学保存物种的重要手段。在环境遭到史无前例的破坏动物、植被随时可能面临灭绝危险的今天，更是尤为关键，虽然不是治本的方法，但至少可以尽可能的留下那些曾经存在的生命痕迹。 发展历史 1. 1776年．Spallanzani最早发表了“冷”处理对“细胞”生命活动影响的报道。 2. 十九世纪中后叶，许多早期的工作者(Prevost，1840；de Quatrefages，1853；Mantegazza，1866；Scheuk，1870)重复研究了低温处理对精子活动的影响，得出了和Spallanzani相似的结论。即“冷不能杀死精子”。 3. 1900年前后，科学家基本上肯定了生物成份能够在零下温度储存的事实。 4. 二十世纪50年代Luyet等多位学者发现了电解质浓度对储存细胞的损伤作用，他们的基
细胞冻存和细胞复苏的方法步骤 点击次数：3337 发布时间：2011-4-12 细胞的冻存 一、概述 目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。如细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丢失。如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。 二、细胞冻存操作步骤： (1)选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天最好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细胞则不要消化处理。然后将细胞收集于离心管中离心(1000r/min，10分钟)。 (2)去上清液，加入含20%小牛血清的完全培养基，于4℃预冷15分钟后，逐滴加入已无菌的DMSO或甘油，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，细胞浓度为3×106～1×107/mL之间。(3)将上述细胞分装于安瓿或专用冷冻塑料管中，安瓿装1～1.5mL在火焰喷灯上封口，封口处要完全封闭，圆滑无勾。冷冻管要将盖子盖紧，并标记好细胞名称和冻存日期，同时作好登记(日期、细胞种类及代次、冻存支数)。 (4)将装好细胞的安瓿或冻存管装入沙布袋内；置于液氮容器颈口处存放过夜，次日转入液氮中。采用控制降温速度的方法也可采用下列步骤：先将安瓿置入4℃冰箱中2～3小时，再移至冰箱冷冻室内3～4小时(此步可省略)，再吊入液氮容器颈气态部分存放2小时，最后沉入液氮中。 细胞冻存在液氮中可以长期保存，但为妥善起见，冻存半年后，最好取出一只安瓿细胞复苏培养，观察生长情况，然后再继续冻存。
细胞冻存和复苏技术 一、实验目的 学习与了解细胞超低温冻存于复苏的基本原理，初步掌握培养细胞常规超低温冻存于复苏以及玻璃化超低温冻存于复苏的方法。 二、实验原理 为了保持细胞株（系）遗传的稳定性以及非连续使用细胞的长期保存，建立了细胞超低温冻存于复苏技术。目前细胞超低温冻存技术主要有两种方法，即常规超低温冻存和玻璃化超低温冻存。 活细胞在超低温下克服了分子间的热运动，因而可长期保存而不影响活力。在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。 细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，当细胞冷到零度以下，细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶。否则形成大结晶。大结晶会造成细胞膜、细胞器损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。 目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。 三、试剂和器材 器材：液氮罐、冻存管（塑料螺口专用冻存管或安瓿瓶）、离心管、吸管、离心机等。 试剂：0.25％胰酶、培养基、含保护剂的培养基（即冻存液）。 四、操作步骤 （一）冻存 1、消化细胞，将细胞悬液收集至离心管中。 2、加5mLPBS，1000rpm离心10分钟，弃上清液。重复一次。 3、沉淀加含保护液的培养液，计数，调整至5×1000000/ml左右。 4、将悬液分至冻存管中，每管1 ml。 5、将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。 6、贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。 7、将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液 氮罐罐口，按每分钟温度下降1～2 ℃的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。 注意：操作时应小心，以免液氮冻伤。液氮定期检查，随时补充，绝对不能挥发干净，一般30立升的液氮能用1～1.5月。 （二）复苏 1、从液氮中取出冻存管、迅速置于37℃水浴中并不断轻轻搅动。使冻存管中的冻存物在1分钟之内融化。 2、打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。 3、1000rpm离心10分钟，弃去上清液。 4、沉淀加10ml培养液，吹打均匀，再离心10分钟，弃上清液。（细胞数量少的情况下，复
细胞冷冻保存方法、注意事项 1、欲冷冻保存之细胞应在生长良好(log phase) 且存活率高之状态，约为80 –90 ％致密度。 2、冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma 应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。 3、注意冷冻保护剂之品质。DMSO 应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22 micron F GLP Telflon 过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650)，以5~10 ml 小体积分装，4 oC 避光保存，勿作多次解冻。Glycerol 亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。 4、冷冻保存之细胞浓度： （1）normal human fibroblast: 1~3 x 106 cells/ml （2）hybridoma: 1~3 x 106 cells/ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma 会因冷冻浓度太高而在解冻24 小时后死去。 （3）adherent tumor lines: 5~7 x 106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma 解冻后须较高之浓度，而HeLa 只需1-3 x 106 cells/ml。 （4）other suspensions: 5~10 x 106 cells/ml, human lymphocyte 须至少5 x 10 6cells/ml。 5、冷冻保护剂浓度为5 或10 ％DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。 6、冷冻方法： （1）传统方法: 4 oC 10 分钟---> -20 oC 30 分钟---> -80 oC 16 - 18 小时(或隔夜)---> 液氮槽vapor phase 长期储存。 （2）程序降温：利用等速降温机以–1 ～-3 oC/分钟之速度由室温降至–120 oC，放在液氮槽vapor phase 长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma 之保存。 7、材料：
细胞的冻存 细胞深低温保存的基本原理是：在－70℃以下时，细胞内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。细胞低温保存的关键，在于通过0~20℃阶段的处理过程。在此温度范围内，水晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。总的原则是缓慢冻存！！！ 一材料： 生长良好之培养细胞，新鲜培养基，DMSO ，无菌塑料冷冻保存管，血球计数盘与盖玻片。 二步骤： 2.1 冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形,最好细胞应该处于对数生长期。 2.2. 配制冷冻保存溶液(使用前配制)：将DMSO 加入新鲜培养基中，最后浓度为5-10％，混合均匀，置于室温下待用。 2.3. 依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞与冻存管内，取少量细胞悬浮液(约0.1 ml) 计数细胞浓度。2.4. 先将冻存管放入4℃冰箱，约40min。 2.5 接着置于-20℃冰箱，约30-60min。 2.6. 置于-80超低温冰箱中放置过夜。 2.7. 置于液氮罐中长期保存。 2.8 同时做好冻存记录，在自己的笔记本和冻存记录本上均要记录。 三注意事项： 3.1.使用DMSO前，不需要进行高压灭菌，它本身就有灭菌的作用。高压灭菌反而会破坏它的分子结构，以至于降低冷冻保护效果。在常温下，DMSO对人体有害，故在配制时最好戴上手套操作。混合DMSO要快，因为DMSO对细胞有毒性，混合之后应尽快冻存，提醒各位注意的是加入冻存液后一定要混匀，防止DMSO 沉淀。冻存液比例培养基7：血清2：DMSO1，也有将血清比例加大的做法，有的甚至将血清提高到90%，
具体浓度视经验而定，但是好多人认为小牛血清含量越高越好！ 3.2.不宜将冻存细胞放置在0℃～-60℃这一温度范围内过久，低温损伤主要发生在这 一温度区内，是“危险温区”。可以先在泡沫上打孔，把冻存管塞进去。这样降温可以慢一点，当然包上棉花也是不错的主意 3.3 .注意定期检查液氮罐内液氮量，及时添加。 3.4 -20°C 不可超過1 小時，以防止冰晶過大而造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟，冷凍管置於厚保麗龍內，直接放入-80°C 冰箱中，但存活率會降低一些。但是大多数人：4度半小时，—20度半小时，—80度过夜，液氮保存。 3.5 冷凍管內細胞數目一般至少為10*6-7/ml以上，冻存细胞健康程度一般要求活细胞在95%以上，细胞活力差的在冻存后的成活机率很小，因此，一定要在细胞旺盛分裂时期冻存 3.6 细胞冻存管一般有1.5-2ml左右体积，原则上可以存放1.5ml充满均匀悬浮细胞的冻存液，一些人喜欢灌注1-1.5ml冻存液冻存，这实际上并不好。原因如下：冻存液冻存需要一段时间，如果这段时间冻存管倾斜，液体容易流到管口，很容易在后续的操作中造成污染。建议0.5-1ml之间即可。但是还是用1.5ml的话，具体操作时，冻存管直立起来放在-20的冰箱里，这样不容易造成污染。 同时冻存细胞的时候，一定加上封口膜，这样可以避免复苏的时候，水浴箱里的水进入盖子的缝隙中！冻存管外面用封口膜封上后，最好再用白胶布再封一下。这样可以防止细胞复苏时，封口膜崩裂，水浴箱中的水进入冻存管。 3.7 提醒;细胞冻存在-4度，或－20时就忘了，我干过好几次这样的事（这几次细胞种很好，很心疼），其实可以将冻存细胞时用厚厚的棉花把冻存管包起来，直接放进－70度冰箱，复苏效果也不错。