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海洋沉积物总DNA提取方法研究进展

海洋沉积物总DNA提取方法研究进展
海洋沉积物总DNA提取方法研究进展

Advances in Microbiology 微生物前沿, 2015, 4, 27-35

Published Online June 2015 in Hans. https://www.doczj.com/doc/2f13078876.html,/journal/amb

https://www.doczj.com/doc/2f13078876.html,/10.12677/amb.2015.42005

Advances in Marine Sediments of the Total

DNA Extraction Method

Xinqiang Zhao, Xiaopeng Yu, Mingai Zhang, Cuifang Yu, Fansheng Cheng*

College of Food Science and Engineering, Qingdao Agricultural University, Qingdao Shandong

Email: 1760029992@https://www.doczj.com/doc/2f13078876.html,, *fscheng@https://www.doczj.com/doc/2f13078876.html,

Received: May 25th, 2015; accepted: Jun. 16th, 2015; published: Jun. 19th, 2015

Copyright ? 2015 by authors and Hans Publishers Inc.

This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY).

https://www.doczj.com/doc/2f13078876.html,/licenses/by/4.0/

Abstract

Microorganisms inhabited in marine sediments server as an important role in the marine ecosys-tem as well as the biosphere substances’ circulation. The gradually deepening understanding of the biodiversity and the continuous improvement of research methods in marine sediments still face some basic obstacles, such as the cultivation of microorganisms and DNA extraction. This pa-per aims to summarize the current research progress in environmental DNA extraction method in marine sediment, which corresponds to Metagenomics and other modern molecular ecology re-search methods. Key steps in the sampling, transportation, storage, samples pretreatment, cell disruption, total DNA enrichment, storage and quality evaluation were discussed in detail.

Keywords

Marine Sediments, Microbial Diversity, DNA Extraction, Research Progress

海洋沉积物总DNA提取方法研究进展

赵新强,于晓朋,张名爱,于翠芳,程凡升*

青岛农业大学食品科学与工程学院,山东青岛

Email: 1760029992@https://www.doczj.com/doc/2f13078876.html,, *fscheng@https://www.doczj.com/doc/2f13078876.html,

收稿日期:2015年5月25日;录用日期:2015年6月16日;发布日期:2015年6月19日

*通讯作者。

海洋沉积物总DNA提取方法研究进展

摘要

海洋沉积物中微生物是海洋生态系统的重要组成部分,在维持生态平衡方面发挥着重要作用。随着人们对生物多样性重要性认识的不断深入及研究方法的不断改进,对海洋沉积物中微生物的研究取得了新的进展,但仍然存在一些问题,如微生物难培养、DNA难提取等。本论对海洋沉积物微生物多样性研究中的关键步骤进行分析探讨,主要包括样品取样及预处理、细胞的裂解、总DNA的提取、纯化和保存方法及质量评价等方面。阐述国内外对海洋沉积物微生物多样性研究中DNA提取方法取得的成果,以及存在的局限性。

关键词

海洋沉积物,微生物多样性,DNA提取,研究进展

1. 引言

海洋沉积物中的微生物是自然界生态系统中的重要组成成员,在维持环境与海洋生态平衡方面发挥着至关重要的作用。海洋的面积约占地球总表面积的3/4,在海洋高盐、高压、低温、低营养或无光照等特殊的生态环境下,造就了海洋沉积物中微生物的多样性,是海洋

环境下生物多样性的主要来源之一。沉积物是集化学物质和微生物于一体的特殊生态环境[1],海洋沉积物中的微生物往往因适应其特殊环境而引起功能、遗传、系统发育的多样性,是海洋沉积物微生物分子生态学研究中重要的一部分。目前自然环境中可培养的微生物可能不及所有微生物总数的1%[2],可知约占99%的微生物至今难以培养,甚至一些微生物处于“存活却无法培养”的状态,可见海洋微生物及其沉淀物中的微生物拥有巨大的开发利用价值。

宏基因组学(或元基因组学,Metagenomics)是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象,不依赖于有机体培养的技术手段。研究流程一般包括从环境样品中提取基因组DNA,再进行高通量测序分析或克隆DNA到合适的载体中,再载导入宿主菌体,筛选出目的转化子等现代分子生物学工作。与传统纯培养方法相比较而言,传统方法是对微生物先进行纯培养,再进行重复筛选的过程,因此筛选出的新活性物质的几率是不断降低的[3]。而基于宏基因组学的现代分子生物学研究中不需要先对微生物进行人工培养,可以直接从特定的环境中提取出微生物的总DNA,再进行基因的测序等操作,从而开发微生物和基因资源。宏基因组学的出现使人们打破了物种界的界限,突破了传统方法的局限,为微生物新资源的开发利用提供了更好的技术平台[4]。随着现代分子生物学研究技术的不断发展,宏基因组学在微生物学的研究中得到广泛的应用。在农业微生物研究方面,可以用于改造土壤、提供有机肥料和改进粮食品种等领域;在医学研究领域中,可以用来研究人或动物体内的微生物群体,如Breitbart等[5]利用宏基因组方法获得了人类粪便中的1200个病毒基因型,在对抗病毒基因研究表达等方面获得了突破性的进展[6];

尤其是在水体环境中新型酶及新型功能的已知酶的宏基因组学研究中具有广泛的应用[7]。

海底沉积物中达50%~80%的物质为腐殖质,腐殖质与DNA在分子大小和理化性质方面比较相近,其化学结构复杂,能够阻碍DNA的提取、分离以及抑制某些活性物质。因此在进行海洋沉积物中微生物多样性研究中需去除腐殖质对DNA提取质量的影响。同时能否获得高质量、高纯度的DNA对后面的微生物学分析和下游生物学实验起着决定性的作用。从程凡升等[7]在水体宏基因组学研究进展及应用中可知以水中微生物为研究对象的宏基因组构建比较容易,而对于海洋沉积物环境下的以底泥及附着微生物为研究对象的宏基因组的构建却困难很多,存在泥微粒对于DNA的附着及其酚类物质对DNA及后续操作污染等问题。可见DNA的提取存在一些难题,从另一方面证明提取出高质量的DNA对于海洋沉积物

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微生物的研究起着关键性影响。Lesack等[8]在16S rDNA基因克隆的研究中发现,DNA提取的基因片段及质量效果不好时可能会导致2种不同的16S rDNA类型的结果出现。即验证了DNA的提取过程是宏基因组学研究的关键与前提。刘璞等[1]在海洋沉积物微生物多样性研究中进行了存在问题的总结概述,结果如表1。

在海洋沉积物微生物研究中DNA的提取是研究现代分子生物学的基础,获得完整性好、纯度高和品质好的DNA是宏基因组学的必需条件。而在DNA提取的过程中由于材料来源、微生物多样性及环境组成成分是不同的,因此提取方法往往存在一定的差异。张宁等[9]在对动物、植物、微生物以及海洋生物DNA提取进展的比较中发现:不同来源实验材料由于其组织和细胞结构特点不同往往采用不同的DNA 提取方法。其中对于海洋沉积物微生物的研究虽然方法较多,但技术方法尚不完善,仍然存在微生物DNA 流失等一些问题,可见对于海洋沉积物微生物总DNA的提取方法探究方面仍然有很大的发展空间,因此本研究对海洋沉积物微生物总DNA提取方法方面进行系统的分类概述,并针对其中存在的一些问题优化出最佳方案。

2. 样品取样、运输、保存

海洋沉积物是一种特殊的生态环境,其来源复杂多样。通常采取表层样品,并且要求重金属类样品装在聚乙烯塑料袋中,油类样品放在广口磨砂玻璃瓶中。因此一般借助采样器进行采样。表层样品可用咬合采泥器直接取样,如果底质为基岩或砾石时,可使用拖网采样法进行采样[10]。参照《海洋生态环境监测技术规程》,采集后立即4℃下冷藏运输到实验室,在无菌室中的超净台上取出柱状样品,去除样品外表层以防陆地空气等其他污染,按2 cm进行分层,再分别放入无菌塑料盒中于?40℃保存备用[11]。

3. 样品的预处理

样品的预处理主要包括直接法和间接法。直接法用来去除样品中腐殖酸、蛋白质等杂质的干扰;间接法主要提取样品中的细胞悬液。目前普遍使用的是间接法[12],即通过梯度离心、离心洗涤等操作方式来去除样品中的腐殖酸、蛋白质等杂质的影响,这样收集和裂解的细胞就可以减少或者避免杂质对实验的影响,其不足是容易造成微生物种类和数量的丢失[13]。在对海洋沉积物中微生物总DNA提取过程中,可能还会受到胞外游离的DNA、无机物和有机物的干扰。Nathalie等[14]建议在裂解细胞前,采用磷酸缓冲液进行样品的处理;张娇等[15]在研究DNA提取方法对菌的多样性中采用了此法,获得了较好的纯化结果。

在DNA提取的杂质去除过程中,王琦等[16]在海水多营养层次生态养殖池塘细菌群落分析及与环境因子中比较了三种DNA提取方法,采用CTAB和蛋白酶K,与蛋白质和多聚糖形成复合物,再通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质,提取结果表明提取的DNA产量最高并无明显拖尾,说明杂质去除效果明显;而王宇等[17]通过改进的Tiedje [18]法采用同样方法去除杂质的影响。提取结果发现:

Table 1. Problems are classified study microbial diversity in marine sediments [1]

表1.海洋沉积物微生物多样性研究中存在问题归类[1]

项目存在问题

核酸回收无法回收全部的DNA或RNA;菌体细胞无法完全裂解并且重复性差;伴有腐殖质等杂质的干扰。

PCR DNA混合物中扩增特定基因时可能面临不同物种间的基因序列互相集结形成DNA

聚合物的问题以及PCR技术中的DNA污染问题。

克隆

不同有机体的rDNA基因片段的克隆效率存在差异;根据rDNA克隆的相对丰度来估算其相应种群的相对丰度时一般会产生偏差;DNA提取可能会受到其他微生物基因片段的污染。

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获得的DNA纯化提取液的OD260 nm/OD230 nm值仅为0.89,OD260 nm/OD280 nm值为1.31,说明此方法去除腐殖酸效果较差,却具有较强的去除蛋白质能力。Tiedje等[18]人就结合使用了PVP和CTAB的方法来去除杂质,经测定发现OD260 nm/OD230 nm值仅为1.12,OD260 nm/OD280 nm值为1.27,可以看出去测定的评价效果数值均大于1,所以对于腐殖酸、蛋白质等杂质的去除效果还是比较理想的。

除了采用上述试剂,还可以通过加入脱腐缓冲液使其在细胞的裂解前去除一部分的腐殖酸,同时增加样品洗脱步骤,可以去除可溶性的抑制物和胞外DNA [19]。李靖宇等[20]在DNA的提取及其脱腐处理中,加入了脱腐缓冲液[21]进行腐殖酸的去除处理,在加入DNA提取缓冲液前加入氯化钙进行腐殖酸沉淀反应,注意的是如果DNA提取缓冲液中加入EDTA螯合剂,由于EDTA可以螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性,因此可以将氯化钙形成的沉淀溶解,重新释放出腐殖酸,影响DNA的提取纯度。

上述都是去除腐殖酸等杂质的处理方法,样品的预处理还可以进行菌体细胞的回收,黄婷婷等[22]通过改进Esther M. Gabor的Blending method采用匀浆缓冲液进行匀浆,再进行低速室温离心等操作进行菌体细胞的回收。经研究发现此处理获得的DNA受土壤中腐殖酸等的杂质影响很小。

4. 细胞裂解技术

在样品的预处理之后,需要对菌体细胞进行裂解处理,菌体细胞的裂解主要是对细胞进行破壁等处理,作用主要是用来释放细胞内核酸、蛋白质和核酸分离。细胞裂解一般釆用研磨、超声波、机械破碎等物理方法,或采用添加化学试剂SDS、溶菌酶等化学方法裂解细胞。

在化学方法中通常加入溶菌酶,其是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶,可以破坏菌体细胞的细胞壁;还可以加入SDS等除垢剂,其中SDS是分离DNA时常用的一种阴离子除垢剂,不仅可以溶解膜蛋白及脂肪,从而使细胞膜破裂,还可以溶解核膜和核小体,使其解聚,将核酸释放出来,并对RNase、Dnase有一定的抑制作用。陈双喜等[23]采用SDS-蛋白酶K处理,以提取的混合液总DNA为模板,进行PCR、电泳等处理分析了印度洋与大西洋中脊深海沉积物菌落的分布情况以及砷抗性菌的多样性,可见SDS对于细胞的裂解效果是比较理想的。袁志辉等[24]在对水样进行DNA提取中同样采用了此法,经

0.8%的琼脂糖凝胶电泳显示:所有样品均在23 kb左右出现条带,表明已经获得了水样微生物的宏基因

组DNA的较长基因片段。

CTAB是常用的一种阳离子去污剂,能够与核酸形成复合物然后在低盐溶液沉淀出来。在该法中使用的PVP(聚维酮)与多酚结合形成复合物,能够有效避免多酚类化合物介导的DNA降解[25]。但存在实验操作步骤繁多、试剂组成复杂及实验试剂有一定毒性等问题。

由于CTAB法试验步骤繁多复杂,经过近几年DNA提取方法的不断发展,利用SDS-Tris-EDTA等试剂结合的方法来直接裂解细胞使其释放出DNA的方法逐渐被广泛应用于DNA提取[26]。该法提取所用试剂较少,步骤简单。但不能有效地去除多糖和多酚类物质,因此在DNA提取的后续实验研究中一般需要进行改良优化处理。吴发红等[27]采用了CTAB法、SDS法及改良的CTAB法对真菌进行DNA提取,经电泳结果显示:三种方法都能够获得DNA片段,并且得率较高。改良的CTAB法提取的DNA电泳带很亮而且将提取和纯化实现同步,简化了操作步骤,但所需的费用较高。因此还有待开发一种新型简单易提取、纯度高的方法。

本论文所讲的几种细胞裂解方法有些方法对于湖水中底泥的DNA提取,其与活性污泥、海洋沉积物的物理化学性质有一些相近的地方,因此对于海洋沉积物的DNA提取还是具有一定的参考价值。朱艳霞等[28]在研究太湖入水口底泥微生物宏基因组及聚磷菌多样性研究中采用冻融–溶菌酶-SDS法裂解细胞提取总DNA,进行了3次反复冻融,结果发现提取出的DNA得率较低,而溶菌酶-SDS-二次沉淀法提取的效果最好,得到的DNA颜色洁白透明,OD260/OD280比值在1.86~1.95,OD260/OD23比值在1.67~1.78,

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平均得率为12.365 μg/g。并得出溶菌酶-SDS-二次沉淀法是适合太湖底泥基因组DNA提取的最优方法的结论。熊开容等[29]通过进行了一些改进,采用冻融+玻璃珠+溶菌酶+SDS方法提取了活性污泥的DNA,结果表明获得的DNA适合于酶解和符合PCR扩增要求。

在细胞裂解的过程中,还可以采用一些物理方法进行菌体裂解。在DNA提取中可以采用液氮研磨处理。液氮不仅有助于研磨充分,还可以让细胞冷冻起来,变得很脆,这样容易破细胞壁,同时,液氮的超低温可以大大降低酶活性,防止DNA的降解和组织的破坏。许守英等[30]在热泉微生物研究中,就采用了液氮研磨处理,再利用MPbio土壤基因组DNA提取试剂盒(MP Bio Laboratories, Inc.)提取海水样品、菌苔、沉积物的总DNA,经电泳、PCR确定获取的是目的基因及目的扩增片段,证明获得了总DNA片段。除了液氮研磨还可以超声波、玻璃珠粉碎法进行细胞裂解,赵吉等[31]发明一种快速提取沉积物环境样品总DNA的方法,其中采用玻璃珠破碎-SDS法,不仅能高效去除腐殖酸等杂质,还提高了沉积物中DNA提取的纯度。同时不用添加一些有一定毒性的化学试剂,操作比较简单。李鹏等[32]采用一种超声波法(Miller等[33])处理代替珠磨匀化法,得到结果发现:提取到的活性污泥微生物的总DNA片段分子量约为23 kb,条带较亮,纯度大于1.70,可以用来PCR等后续处理。包慧等[34]为建立一种快速、高效的藻类DNA提取方法,分别采用了纤维素酶法、改良的CTAB法、超声波粉碎及试剂盒法对自然界中的藻类进行DNA的提取及比较。结果证明,三种方法提取的DNA片段完整。但纤维素酶法提取的DNA 沉淀显黄褐色,可能存在蛋白质的污染,改良的CTAB法和超声波粉碎法提取效果差别不大,而后者耗费较大,因此得出改良的CTAB法是比较适合藻类的DNA提取方法。吕新等[35]在探究不同土壤微生物DNA提取方法对DGGE分析微生物群落的影响时采用了高盐法、玻璃珠破碎法、冻融法和试剂盒法对土壤进行微生物DNA提取。通过电泳结果发现:玻璃珠破碎法和试剂盒法提取的DNA均能满足后续土壤微生物多样性分析实验的要求;其中试剂盒法操作简单且提取的DNA质量好,但DNA产率较低且耗费成本较高;而玻璃珠破碎法虽然具有提取耗时较长,步骤复杂的缺点,但DNA产量较高,提取的DNA 对于后续PCR分析等下游实验并没有明显影响。得出玻璃珠破碎法是一种比较适合土壤微生物总DNA 提取方法的结论。

细胞裂解不仅仅局限于单纯的物理或者化学方法,也可以两者进行适当的组合,王宇等[17]在DNA 不同提取方法对养殖池塘底泥细菌多样性PCR-DGGE检测的影响的研究中,通过改进的Tiedje[18]法中使用20% SDS,65℃加热和改进的Martin-Laurent法[36]中酸洗石英砂对底泥细菌进行细胞裂解。结果发现,改进的Tiedje[18]法获得DNA纯度较高、产量一般、耗时长;而后者获得DNA纯度较低;并提出对于提取养殖池塘中的细菌用改进的Martin-Laurent法获取DNA纯度及含量是可以直接用于PCR的。Bourrain等[37]人采用该方法从活性污泥中提取了DNA;Reddy等[38]人同样成功的从堆肥中提取出了DNA。

5. DNA提取方法

在总DNA的提取过程中,常使用乙醇、异丙醇和聚乙二醇等有机溶剂来沉淀样品中的DNA分子,其对DNA分子具有一定优先选择性[39]。李新伟等[40]使用Mobio高效DNA提取试剂盒的提取方法,对胶州湾近岸沉积物中细菌群落组成、结构及功能方面进行了分析。还可以利用磁珠法进行DNA纯化提取,韩云霞[41]通过分析常见的DNA纯化提取方法发现,通过加入适量的磁珠悬液,可以提取出纯度高、完整性好的DNA片段。根据磁珠添加比例区别来回收大小不同的DNA片段,特别适用于微量样品的DNA纯化提取。

除以上方法,Chelex-100煮沸法同样可以用于DNA的纯化提取。Chelex-100是一种碱性多价金属离子螯合树脂,它可以和DNase维持活性的金属离子如镁、锰等所必需的离子相结合,以此可以有效地抑

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制其活性,从而达到保护DNA的效果。还可以提供一个强碱性环境,在煮沸条件下可以裂解细胞并沉淀蛋白质,以分离DNA。这种DNA提取方法简便易行,不需要多次转换离心管,因此降低了其它DNA 污染的可能性。但该方法得到的DNA中含有Taq聚合酶抑制作用,仍需用硅质颗粒或玻璃珠进行DNA 纯化。胡晓红等[39]比较了五种细菌DNA提取方法,结果证明通过进一步优化改进Chelex-100方法获得了一种特异性高、灵敏度高、高效,无需酚/氯仿抽提,大大减少了有毒试剂对人体和环境的危害。Coombs 等[42]则采用热循环方法,将标本上的蜡融入样品溶液,在酶的作用下进行裂解,然后用Chelex-100进行吸附,离心去蜡,这种方法安全、简便、有效、经济。蔡鹏[43]在DNA分离纯化中发现,苯酚–氯仿法提取DNA比Sephadex 50柱脱水效果好。在提取DNA中用氯仿–异戊醇进行DNA提取时,提取液中依然存在大量的腐殖酸等杂质,导致溶液呈现黑褐色。

目前免疫磁珠分离技术已成功应用于DNA研究领域,通过利用纳米磁性粒子的特异性吸附可以用于富集捕获目的菌及DNA的分离。Rudi等[44]通过纳米磁性粒子对裂解菌体释放的DNA进行吸附处理,成功提取了DNA并能用于PCR的测定。裴杰萍[45]通过比较五种DNA提取方法发现,免疫磁珠法制备的DNA纯度高、含量多,尤其适合微量样品的DNA提取,但是以成功制备特定纳米磁珠为前提的。

6. 粗DNA纯化

在总DNA提取的过程中,虽然经过了样品的预处理去除杂质处理,但仍存在一些杂质会对后续的分子生物实验结果造成干扰,如电泳效果不明显、PCR扩增困难等问题。因此往往需要对提取的粗DNA 进行纯化处理。

王琦等[16]采用胶回收和稀释法对粗DNA进行了纯化效果比较,PCR扩增得到目的条带,结果说明对粗提DNA的纯化方法能有效去除样品中的腐殖酸、蛋白质等抑制PCR反应过程中Taq酶活力的杂质且效果显著,并得出胶回收方法是更为理想的纯化方法的结论。还可以利用溶液的回收来进行DNA纯化,李鹏等[32]比较了两种回收纯化DNA方法发现,胶回收的DNA量虽然显著小于溶液的回收量,但均能获得理想的PCR产物条带,所以两种回收纯化方法对DGGE的结果没有明显的影响。

透析袋电洗脱法也是一种常用的DNA纯化方法,黄婷婷等[22]采用透析袋电洗脱法进行粗提DNA 的纯化。结果显示:此法虽然操作复杂,但对于大片段DNA却非常有效。并且回收效率达50% - 60%,基本可以满足后续PCR等实验操作的样品要求。

7. DNA保存技术

DNA分子经纯化之后有可能需要进行一段时间的贮藏,DNA在贮存过程中容易降解,因为DNA会随着时间降解(或称退化),暴露于一定的影响因素下DNA的降解可能会变快,如阳光、水、温度等。经研究发现在理想条件下,DNA的“可读”时间约占其存活时间的1/5,可见DNA的保存同样在海洋沉积物的微生物多样性、资源的利用等方面是至关重要的。

常用的贮藏方法有?20℃TE (无菌水)溶液、?20℃70%酒精、液氮超低温、DNA冻干粉等。这类方法具有操作简单、耗时短等特点,但DNA保存的安全性、质量的完整性不能保证。李娜等[46]通过不同保存方法对基因组DNA提取效果的影响中,比较了直接低温(保温瓶中加生物冰袋)保存、60℃干燥后低温保存、100%乙醇保存及75%乙醇保存样品所提取的DNA对DNA纯度和完整性进行了方法检测比较发现,乙醇保存样品室具有多优点是能够获得较高质量DNA的保存方法,而且操作简单。

8. 质量检测和评价进展

在对提取的DNA片段进行基因的测序、克隆、转化等分子生物学操作过程中,DNA的纯度、品质

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对实验结果起着决定性作用。因此需要对提取的DNA样品进行质量检测及评价,需达到无污染、无降解(脉冲场电泳主带大于40 Kb)、无颜色、不粘稠的要求,以确保后续实验结果的准确性。质量检测和评价主要包括:基因组DNA的片段大小确定、基因组DNA浓度的测定、基因组DNA纯度的测定三个方面进行评价。常用的检测方法有以下几种:

8.1. 紫外吸收与琼脂糖凝胶电泳检测

紫外吸收检测DNA的纯度:核酸的最大吸收波长为260 nm,蛋白质为280 nm。在波长260 nm时,OD值为1时相当于双链DNA浓度为50 μg/mL,单链寡核苷酸的含量为30 μg/mL。因此通过计算可以得知核酸样品的浓度。其中纯净DNA的比值为1.8,RNA为2.0,可以通过测定在260 nm和280 nm的OD值的比值(OD260/OD280)可以估计核酸的纯度。如果比值高于1.8,则说明提取的DNA样品中有RNA 残留。如果存在酚和蛋白质将会导致比值降低,其中270 nm存在高吸收表明有酚的干扰。紫外分光光度法只能测定浓度大于0.25 μg/mL的核酸溶液,对浓度更小的样品,可采用荧光分光光度法(琼脂糖凝胶电泳法)。

琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性:琼脂糖凝胶电泳是利用琼脂糖溶化再凝固后能形成带有一定孔隙的固体基质的特性。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应,琼脂糖凝胶电泳是最常用的鉴定DNA的方法。其原理是利用DNA分子电泳时的电荷效应和分子筛效应及溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光。当提取的DNA片段在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动时,溴化乙锭会从正极向负极移动,致使溴化乙锭分子嵌入到DNA分子中形成荧光络合物,使DNA在紫外光下的能够发射出很强的荧光,而荧光的强度正比于DNA的含量,同时将已知浓度的标准样品作为电泳的对照,进行对比就可以对DNA进行样品的浓度评估。

8.2. DNA扩增片段的测序

对PCR产物进行1.0%的琼脂糖凝胶电泳,扩增效果较好的样品进行回收试剂盒处理,获得的纯化DNA进行测序,从而进行DNA样品的质量检测[46]。以上为常用的几种质量检测和评价的方法,当然还有很多别的不同的方法,需要我们在实验时根据实验目的基因的要求及所需的DNA质量标准进行方法的选择。对DNA进行质量检测和评价可以反映DNA提取方法的不足与优势,从而更好地改进获得新的DNA提取技术,为宏基因组的研究奠定基础。

9. 总结展望

目前微生物多样性研究正处于概念和方法体系构建阶段,单一的研究方法已经基本完善[47]。但在方法的针对性选择和优化组合方面仍存在很大发展空间。与传统培养法相比,PCR技术研究方法的优点是无需分离培养纯种微生物,通过提取DNA即可获得有关微生物群落总体活性与代谢功能的信息,最大限度地保留微生物群落原来的代谢特征[48]。但基于PCR技术的研究方法存在局限性,在DNA提取中每次提取的DNA效率不同即重复性比较差,无法获得完全相同的DNA片段;同时细胞的裂解程度不同导致提取的DNA效果不同,也存在在微生物研究中偏漏的可能:提取DNA所采集的样品只是在某些方面具有代表性,而不能包括所有环境的特征,同时在样品的保存过程中可能导致微生物组分的变化[49]。因此提取的总DNA不能定义为全部的微生物基因,要得到非培养微生物的微生物信息。

本论文比较了目前常见的几种DNA提取方法和试剂盒对DNA提取效果。经过对样品的预处理、细胞的裂解、DNA的提取及纯化方面和提取的DNA质量、得率和PCR扩增效果方面进行分析比较。结果表明,每种DNA提取方法各有利弊,没有一种DNA提取方法或试剂盒可以对所有样品DNA的提取产

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生最好的提取效果。所以总DNA提取方法研究中只有将各种方法有机结合,才能从不同角度揭示微生物多样性,提供更加全面的微生物信息。

微生物功能性研究以基因组DNA序列为基础并依赖其信息的完整性,必须提取出完整的高品质的全部DNA,并使其纯度及片段大小等满足后面的研究需要。因此在现代分子生物学研究中需要原创性地、系统地研究和开发一种新型、高效快速、简单易行、低成本、低毒性或无毒性、高纯度的总DNA提取方法。

基金项目

国家自然基金(No.31301438);山东省优秀中青年科学家奖励基金(No. BS2013SW034).

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微生物基因组DNA提取方法的比较与改进

收稿日期:2006-09-041 作者简介:刘晓侠(1978- ),女,江苏丰县人,嘉兴学院生物与化学工程学院教师,博士,研究方向为基因工程、发酵工程。 微生物基因组DNA 提取方法的比较与改进 刘晓侠1 ,林建平2 ,岑沛霖 2 (11嘉兴学院生物与化学工程学院,浙江嘉兴314001;21浙江大学生物工程研究所,浙江杭州310027) 摘 要:高质量的微生物基因组DNA 是基因工程的前提。目前国内外关于微生物基因组DNA 提取的方法很多,根据研究对象和目的不同而方法各异。该文就现有方法中应用最为广泛的三种提取微生物基因组 DNA 的方法进行了比较,并对它们进行一些改进,获得了针对不同细胞壁成分的微生物相应的简便、快速 且高质量基因组DNA 提取方法,并对提取的DNA 进行PCR 特异性扩增检测,获得较清晰的谱带[1],为基因克隆表达研究奠定了基础。 关键词:微生物;DNA 提取;PCR 中图分类号:Q933 Co m par ison and I m prove m en t of Extracti on M ethods for Geno m i c D NA L I U Xiao -xia 1 ,L I N J ian -p ing 2 ,CE N Pei -lin 2 (11School of B i ol ogy and Che m ical Engineering,J iaxing university,J iaxing,Zhejiang 3140001; 21I nstitute of B i oengineering,Zhejiang University,Hangzhou,Zhejiang 310027) Abstract:H igh quality genom ic DNA fr om m icr oorganis m is the p reconditi on of genetic mani pulati on .Now many methods f or the extracti on of genom ic DNA are devel oped according t o different research object and intenti on .Three kinds of methods widely app lied are compared and ref or med in is olati on of genom ic DNA fr om m icr oorganis m.And ef 2fective methods for extracting high pure genom ic DNA are established considering different cell wall components .Ge 2nom ic DNA gained by three different methods above is s pecifically a mp lified and clear band is observed by agar ose gel electr ophoresis,which is convenient t o genetic mani pulati on later . Key words:m icr oorganis m;DNA extracti on;PCR (Poly merase Chain Reacti on ) 文献标识码:A 1 文章编号:1008-6781(2007)03-0048-03 1 材料与方法111 试验材料 黄色短杆菌(B revibacteriu m helvolum AT CC11822,G -)从北京微生物所购买;放射形土壤杆菌 (Agr obacteriu m radi obacter ACCC10056,G -)从中国菌种保藏中心购买;金黄色葡萄球菌(G +),枯 草芽孢杆菌(G + )为本实验室保藏。 112 试剂及仪器 [2] 主要试剂为10mg/m l 溶菌酶,20mg/m l 蛋白酶K,2×CT AB (十六氨基三乙基溴化铵)。引物序列为:5π-ggaattcggatccatggacttcgaggcattt (B am H I,EcoR I ),3π-ttaagcttcctcacgccaccgcacgcgc (H in d III ),由上海博亚生物技术有限公司合成。 仪器有Lengguang Tech 1Spectrum lab54型分光光度计,L I TT LE GE N I U S (Japan )基因扩增仪。113 聚合酶链式反应(PCR ) PCR 扩增的反应体系为:反应总体积20μl,含10pmole 引物,50ng 基因组DNA,2μl 10×PfuTaq ? 84? 嘉兴学院学报 Jou rna l of J iaxing U n iversity 第19卷第3期2007年5月 Vol .19No .32007.5

DNA提取方法和试剂作用

1试剂的作用 氯仿的作用? 氯仿:克服酚的缺点;加速有机相与液相分层。 最后用氯仿抽提:去除核酸溶液中的迹量酚。(酚易溶于氯仿中) 用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时,通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇,为什么? 异戊醇:减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力,从而减少气泡产生。另外,异戊醇有助于分相,使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。 用乙醇沉淀DNA时,为什么加入单价的阳离子? 用乙醇沉淀DNA时,通常要在溶液中加入单价的阳离子,如NaCl 或NaAc,Na+中和DNA分子上的负电荷,减少DNA分子之间的同性电荷相斥力,而易于聚集沉淀。 2 DNA提取分为三个基本步骤 每个步骤的具体方法可根据样品种类、影响提取的物质以及后续步骤的不同而有区别。 .细胞的破碎 细菌有坚硬的细胞壁,首先要破碎经胞。方法有三种;①机械方法:超声波处理法、研磨法、匀浆法;②化学试剂法:用SDS处理细胞;③酶解法:加入溶菌酶或蜗牛酶,都可使细胞壁破碎。 利用研磨或者超声破碎细胞,并通过加入去污剂以除掉膜脂。 加入蛋白酶,醋酸盐沉淀,或者酚/氯仿抽提,以除掉细胞内的蛋白,如与DNA 结合的组蛋白。将DNA在冷乙醇或异丙醇中沉淀,因为DNA在醇中不可溶而黏在一起,这一步也能除掉盐分。另外,目前也有利用吸附过柱的方法提取DNA 的商业化试剂盒。 DNA提取的几种方法 (1).浓盐法 A. 利用RNA和DNA在电解溶液中溶解度不同,将二者分离,常用的方法是用1M 氯纳抽提,得到的DNA粘液与含有少量蛋白质氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间,而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来. B. 也可用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNA,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白. 两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些. C.以稀盐酸溶液提取DNA 时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA 的分离。在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA 的降解作用,在氯化钠溶液中

DNA提取方法和试剂作用详解

1 试剂的作用 氯仿的作用? 氯仿:克服酚的缺点;加速有机相与液相分层。 最后用氯仿抽提:去除核酸溶液中的迹量酚。(酚易溶于氯仿中) 用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA 时,通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇,为什么? 异戊醇:减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力,从而减少气泡产生。另外,异戊醇有助于分相,使离心后的上层含DNA 的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。 用乙醇沉淀DNA时,为什么加入单价的阳离子? 用乙醇沉淀DNA时,通常要在溶液中加入单价的阳离子,如NaCl或 NaAc,Na+中和DNA 分子上的负电荷,减少DNA 分子之间的同性电荷相斥力, 而易于聚集沉淀。 2 DNA 提取分为三个基本步骤 每个步骤的具体方法可根据样品种类、影响提取的物质以及后续步骤的不同而 有区别。 .细胞的破碎 细菌有坚硬的细胞壁,首先要破碎经胞。方法有三种;①机械方法:超声波处理法、研磨法、匀浆法;②化学试剂法:用SDS 处理细胞;③酶解法:加入溶菌酶或蜗牛酶,都可使细胞壁破碎。 利用研磨或者超声破碎细胞,并通过加入去污剂以除掉膜脂。 加入蛋白酶,醋酸盐沉淀,或者酚/氯仿抽提,以除掉细胞内的蛋白,如与DNA 结合的组蛋白。将DNA 在冷乙醇或异丙醇中沉淀,因为DNA 在醇中不可溶而黏在一起,这一步也能除掉盐分。另外,目前也有利用吸附过柱的方法提取DNA 的商业化试剂盒。 DNA 提取的几种方法 (1).浓盐法 A.利用RNA 和DNA 在电解溶液中溶解度不同,将二者分离,常用的方法是用1M 氯纳抽提,得到的DNA 粘液与含有少量蛋白质氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间,而DNA 位于上层水相中,用2 倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来. B.也可用0.15 MNaCL 液反复洗涤细胞破碎液除去RNA,再以1MNaCL提取脱氧 核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白. 两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.

牦牛血中血红素的提取

目录 摘要 (1) 关键字 (1) 前言 (1) 1.血红素的结构及性质 (1) 2.血红素的提取 (2) 2.1:试验材料及药品 (2) 2.2.试验方法 (2) 2.2.1 提取原理 (2) 2.2.2 试验流程 (3) 2.2.3 试验步骤……………………(3-4) 3.结果与分析 (5) 4..参考文献……………………(5-6)

牦牛中血红素的提取与分离 摘要:以新鲜牦牛血液为原料, 研究牛血红素的提取方法和工艺。采用醋酸钠 法, 蒸馏法, 两种方法提取血红素, 通过试验来确定药品的最佳用量,醋酸钠添加量约为 0.7 倍, 氯仿添加量约为 0.1 倍, 丙酮添加量约为 4倍, 加水量 为约 1 倍,醋酸钠法是提取血红素的最佳工艺。 关键词:血红素提取离心分离蒸馏法醋酸钠法 前言:铁是人体内含量最丰富的一种必需微量元素。机体缺铁能引起缺铁性贫 血, 并影响机体的免疫力, 对儿童还能影响其智力发育, 引起行为改变, 如注意力分散、易烦燥、表情淡漠等。虽然铁在食品中广泛存在, 但由于它在食品中存在的形态不利于机体对它的吸收利用, 所以, 人们易患缺铁症, 特别是轻度缺铁较常见, 多见于儿童、妊娠妇女、哺乳妇女等。我国少年儿童缺铁性贫血症发病率很高, 目前常用的补铁剂是含铁的化学制剂, 主要有硫酸亚铁、富马酸铁、葡萄糖酸亚铁等, 这些补铁剂在人体内吸收利用率较低, 它们对胃肠道有不同的刺激作用, 常使患者食欲不振, 且铁离子在血液中浓度过高, 可导致体内铁负荷过重, 产生铁蓄积中毒。而血红素是血红蛋白的辅基, 简称卟啉铁化合物, 是很好的铁强化剂。血红素治疗缺铁性贫血疗效显著, 已逐渐受到人们的重视。 青海省地处青藏高原地区,牦牛资源十分丰富,牦牛血中的血红素的含量随着海拔的升高而增多,由于有此特性在医学等领域有着广泛的运用,主要研究的有CMC-Na法提取牦牛血中的血红素、低温乙醇发法提取牦牛血中的血清蛋白、牦牛血粉制备氯化血红素、牦牛血红蛋白活性肤酶法的制备工艺牦牛血中超氧化物歧化酶的提取、醇法水解牦牛血红蛋白等研究工艺。从而更加清楚的了解牦牛血中红星无知的理化性质以及特有的作用。 1. 血红素的结构及性质 血红素是由一个二价铁离子镶嵌在一个原卟啉环而构成的称为铁卟啉的化合物,。卟啉环上的4个氮原子位于同一平面上,其中2个氮原子与铁原子以共价键结合,另外2个氮原子则以配位键结合。铁原子以配位键与球蛋白分子的组氨酸残基上的咪唑环的氮原子相结合,以复合蛋白质的形式存在。铁原子的配位数是6,因此还有一个配位键能与其他原子连接。血红素的分子式为C34H33FeN4O4,分子量为633. 49。血红素为片状或针状的紫色结晶,不溶于水、稀酸、醚、氯仿及丙酮,溶于氢氧化钠水溶液、热醇或氨水中,主要存在于动物的血液和肌肉中,是动物血液中的天然色素,具有重要的生理功能和很高的实用价值,是一种优良的铁强化剂及抗贫血药,在医药、食品、化工、保健品、建筑及化妆品行业中有广泛应用,其化学结构如图1所示:

凝胶色谱法的原理和方法血红蛋白的提取和分离

【课题】:课题6 血红蛋白的提取和分离【备课人】: 【备课时间】:【上课时间】: 【课型】:复习【课时数】:1课时 【复习目标】 本课题通过尝试对血液中血红蛋白的提取和分离,使学生能够体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法,并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理,为今后学习运用这些技术打下基础。 【复习重点与难点】 复习重点:凝胶色谱法的原理和方法。 复习难点:样品的预处理;色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。 【知识回顾】: 一、实验原理 蛋白质的物化理性质:形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别,由此提取和分离各种蛋白质。 1.凝胶色谱法(分配色谱法): (1)原理:分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙,路程短,流动快;分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部,路程长,流动慢。 (2)凝胶材料:多孔性,多糖类化合物,如葡聚糖、琼脂糖。 (3)分离过程: 混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子 *洗脱:从色谱柱上端不断注入缓冲液,促使蛋白质分子的差速流动。 (4)作用:分离蛋白质,测定生物大分子分子量,蛋白质的脱盐等。 2.缓冲溶液 (1)原理:由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成(如H2CO3-NaHCO3,HC-NaC,NaH2PO4/Na2HPO4等),调节酸和盐的用量,可配制不同pH的缓冲液。 (2)缓冲液作用:抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。 3.凝胶电泳法: (1)原理:不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同,在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同,导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。 (2)分离方法:琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。

DNA提取方法

一、移液器使用 移液器(也称作“枪”)是所有分子实验操作不可或缺的工具,其正确使用是顺利开展各项实验的先决条件。为保证实验结果的准确性和稳定性,同时延长移液器的使用寿命,请大家细心操作并遵守以下使用规则和注意事项: 1.从未使用移液器或刚进入实验室的研究生,只有完全准确掌握移液器使用 规则后方可独立使用移液器。 2.按需要选用合适量程的移液器,调整刻度时,注意看移液器刻度表,不要 超过最大刻度。 3.装配吸头时,用力不要过猛,以免吸头难以脱卸,同时损坏移液器。 4.吸取液体时,注意要慢慢向上释放控制按钮以免吸入速度过快导致液体进 入移液器内。 5.切忌平放带有残液的吸头的移液器,更不能倒放。 6.使用移液器清洗或溶解固体物质等需反复吸打时,请装配多个叠加的吸 头,且调整刻度不超过移液器最大量程的一半。 7.移液器使用完毕,务必调到最大刻度,并稳妥地放回对应的移液器架上。 8.细心操作,如不小心使移液器表面沾到液体,请及时清洗干净;如不小心 将液体吸入移液器内,应及时清洗。 9.严禁用沾有放射性或腐蚀性物质的手套触摸移液器表面;严禁不熟悉移液 器构造者私自校对移液器刻度。 第一节叶片总DNA的提取 一、取样须知 1. 取样之前一般要先编号(牌子和离心管的编号)和挂牌,务必保证离心管中 的叶片是来自于同一编号单株,编号切勿混淆; 2. 为保证质量,所取样品尽量为幼嫩叶片组织,并尽量保证全程低温(使用冰 袋或碎冰); 3. 取样时间最好在晴天或阴天上午叶面露水干后进行,尽量使样品不沾水及泥 土。 4. 如使用塑料袋装样品,切记将袋内空气排尽,以免在–70℃保存时塑料袋破裂导致样品混合。 二、试剂的配制 1. Tris-HCl ( 1.0 M/L, pH8.0 ) 121.16g Tris-HCl 和43ml HCl 加dd H2O 定容至1 L. 2. EDTA ( 0.5M/L, pH8.0 ) 186g EDTA和25g NaOH加dd H2O 定容至1 L. 3. 2%CTAB 81.9g NaCl 100ml 1.0 M/L Tris-HCl ( pH8.0 )

猪血中高纯度血红素的提取工艺

猪血中高纯度血红素的提取工艺 【摘要】目的:确立最佳溶血方法,建立高产量、高纯度血红素提取工艺。方法:新鲜抗凝猪血为原料,比较了水溶胀法、乙醇法以及超声波法对红细胞溶血效果,以盐酸丙酮配比,盐酸丙酮与溶血液体积比对猪血中血红素提取的影响。结果:确立超声波法进行红细胞溶血,36.5%浓盐酸与丙酮的体积为1%的血红素抽提液,与溶血液的体积比为5∶1抽提10分钟,最终可从新鲜猪血中得到红素6.0 g/L,纯度达99.8%。结论:用超声法溶血效果明显优于水溶胀法、乙醇法,溶血率达100%;36.5%浓盐酸与丙酮的体积比为1%的血红素抽提液,有利于规模化生产。 【关键词】猪血;血红素;超声波溶血;提取 探索酸性丙酮提取法制备血红素工艺中溶血方法、酸性丙酮及其与溶血液的比例对提取的影响,特别是超声波溶血与丙酮提取方法相结合,建立了快速、简便制备高产量和高纯度血红素的新工艺,为规模化生产提供依据。 1 材料与方法 1.1 材料与仪器:原材料:新鲜猪血,南京肉联厂提供。试剂:血红素标准品(Sigma公司),其他试剂均为分析纯。主要仪器与设备:UV-8500型分光光度计(上海天美科学仪器有限公司);超声波细胞粉碎机(宁波新芝科器研究所)。 1.2 实验方法 1.2.1 工艺流程:新鲜抗凝猪血→离心→红血球→洗涤→溶血→加酸性丙酮于溶血液→抽提得血红素溶解液→滤液→真空浓缩→氢氧化钠纯化→干燥得血红素。工艺要点:新鲜猪血加8 g/L柠檬酸三钠为抗凝剂,5 000 r/min,离心15分钟,收集红细胞,再用0.9%氯化钠溶液洗涤红细胞1次。抽提后的血红素溶液采用真空浓缩并回收丙酮。浓缩物采用0.1 mol/L NaOH溶解,3 000 r/min,离心10分钟收集上清液。以1 mol/L盐酸调解pH值至4~5,沉淀血红素,收集沉淀并水洗至中性,50 ℃真空干燥至恒重得血红素。 1.2.2 溶血方法的比较:(1)水溶胀法:取25 ml红细胞,按照去离子水与红细胞溶液体积之比为0.5∶1、1∶1、1.5∶1、2.0∶1、2.5∶1、3.0∶1,6个水平以400 r/min转速搅拌不同时间,用血球计数板计数红细胞破碎数量,比较

植物DNA提取经典方法

植物DNA提取经典方法:CTAB法原理 植物DNA提取经典方法:CTAB法原理 植物DNA提取经典方法CTAB法 标题:植物DNA提取经典方法:CTAB法原理 摘要: CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵),是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(>0 7mol L NaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复…… 关键词:植物DNA提取经典方法CTAB法 最专业的生命科学学术交流论坛 CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵),是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物,只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。 注:CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出,因此,在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热,且离心时温度不要低于15℃。 一、CTAB提取缓冲液的经典配方: Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏; EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性; NaCl 提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,存在于液相中; CTAB溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离;

β-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除。 二、CTAB提取缓冲液的改进配方: (1) PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除多酚,减少DNA中酚的污染;同时它也能和多糖结合,有效去除多糖; (2) 蛋白质的去除:酚/氯仿抽提使用变性剂变性(SDS、异硫氰酸胍等)高盐洗涤蛋白酶处理核酸分离,纯化; (3)多糖的去除:高盐法:用乙醇沉淀时,在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl,高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积),氯苯可以与多糖的羟基作用,从而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA:在500 μL DNA液中加入200μl 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl),冰浴20min.核酸分离,纯化; (4) 多酚的去除:在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂:β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂:如PVP(聚乙烯吡咯酮),PEG(聚乙二醇),它们与酚类有较强的亲和力,可防止酚类与DNA的结合; (5) 盐离子的去除:70%的乙醇洗涤核酸吸附,沉淀和溶解使用合适的吸附材料吸附核酸,其它的杂质均被洗掉,达到纯化DNA的目的另一种方式加入1/10体积的NaAc(pH5.2,3M),用预冷的乙醇或异丙醇沉淀RNA吸附或沉淀后应用70%的乙醇洗涤,以除去盐离子等若长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNasepH值为8.0,可防止DNA发生酸解。 三、基因组DNA提取常见问题 DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质。DNA在溶解前,有酒精残留,酒精抑制

DNA提取方法进展综述

DNA提取方法进展综述 2014-05-10 14:18:51 来源:浏览次数:21 网友评论 0 条 [DNA提取方法进展综述] 张宁,王凤山(山东大学药学院生化与生物技术药物研究所,山东济南250012《中国海洋药物》杂志2004年第2期(总第98期)摘要:dna的提取是分子生物学研究的基础技术,提取的DNA的纯度及结构完整性是进行基因工程(Genetic Engi [海洋生物微生物 DNA提取方法进展细胞组织蛋白质] 张宁,王凤山 (山东大学药学院生化与生物技术药物研究所,山东济南250012 《中国海洋药物》杂志2004年第2期(总第98期) 摘要:dna的提取是分子生物学研究的基础技术,提取的DNA的纯度及结构完整性是进行基因工程(Genetic Engineering)各项研究所必需的条件。近年来一些新的或改进的DNA提取纯化方法不断出现,本文对从陆生动物、植物、微生物以及海洋生物提取DNA的方法进行综述。 关键词:DNA;提取;动物;植物;微生物;海洋生物 Advances of DNA extraction methods ZHANG Ning,WANG Feng-shan (Institute o f Biochemic and Biotechnological Drugs,School of Pharmacy,Shandon g University, Jinan 250012,China) Abstract:DNA extraction is a basic technology of molecular biology. The purity and the integrality of DNA structure are necessary for different experiments of gene eng ineering. In recent years there have been some new or improved DNA extraction methods appeared. The methods of DNA extraction from animals,plants,microorga nisms and marine organisms were summarized in this article. Keywords:DNA;ex traction;an imals;plants;microorganisms;marineo rganisms 自20 世纪50年代Watson和Crick提出DNA双螺旋模型以来,分子生物学在广度和深度上都获得空前的发展。DNA作为分子生物学研究的基础,在生物领域尤其是遗传学方面的研究日渐深人,在此基础上产生的基因工程(Genetic Engineering)技术已在医药、农业、畜牧业等领域获得广泛应用。研究和应用DNA的基础是提取纯化结构完整的DNA,为此针对不同来源的DNA建立了不同的提取纯化方法。本文对从陆生动物、植物、微生物以及海洋生物来源的DNA的传统提取方法及近年来诸多的改良方法进行综述。

DNA提取方法(一)

v1.0 可编辑可修改 1 各种DNA 提取方法 一,基因组DNA 提取方法 制备基因组DNA 是进行基因结构和功能研究的重要步骤,通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb 。在DNA 提取过程中应尽量避免使DNA 断裂和降解的各种因素,以保证DNA 的完整性,为后续的实验打下基础。主要是CTAB 方法,其他的方法还有1物理方式:玻璃珠法超声波法研磨法冻融法。2化学方式:异硫氰酸胍法碱裂解法3生物方式:酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料、阴离子交换树脂等 试验步骤: 1、贴壁细胞用胰酶消化,离心收集。 2、细胞重悬于冰冷的PBS 漂洗一次,离心收集。试验步骤2再重新作一边。 3、加入5mlDNA 提取缓冲液,(10mmol/%SDS)混匀。 4、加入25ul 蛋白酶K 使终浓度达到100ug/ml 混匀,50℃水浴3h 5、用等体积的酚抽提一次,2500rpm 离心收集水相,用等体积的(酚,氯仿,异戊醇)混合物抽提一次,2500r/min 离心收集水相 6、用等体积的氯仿,异戊醇抽提一次。加入等体积的5mol/L 的LiCL 混匀,冰浴,10min.。 7、2500rpm 离心10min.转上清于一离心管中。加入等体积的异丙醇。室温10min 。2500rpm 离心10min 。弃上清。 8、加入倍体积3mol/L 乙酸钠与2倍体积-20℃预冷无水乙醇。-20℃20min 。 9、12000r/min 室温离心5min 。弃上清。将DNA 溶于适量TE 中。 二,外周血DNA 提取技术 分离外周血白细胞提取方法: 试验步骤: 1、取人肘静脉血5ml ,EDTA 抗凝,2500rpm 离心10min 。 2、小心吸取上层血浆,分装到3个 离心管中。 3、在血细胞中加入3倍体积的溶血液,摇匀,冰浴15min 。 4、2500rpm 离心10min ,弃上清。 5、加入10ml 溶血液,摇匀,冰浴15min 。 6、3000rpm 离心10min ,弃上清。 7、倒置离心管,去掉残液。 8、得白细胞,-80℃冻存。 试验要求: 血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h ,4℃放置不超过5h ,以防白细胞自溶。 三,氯仿法抽提外周血白细胞基因组DNA : 试验试剂: Ligsisbuffer : 7.12g30.071g ;最后加灭菌去离子水至1000ml ,高压灭菌。ACD 抗凝剂:__________柠檬酸1.68g 柠檬酸钠4.62g 葡萄糖5.15g ;最后加灭菌去离子水至350ml ,高压灭菌。 提取缓冲液(Extractionbuffer ): 10mMTrisCl(PH=(PH=(PH=(PH=%SDS10%;最后加灭去离子水至100ml , 高压灭菌 试验步骤: 1、在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000μl,充分颠混至清亮。以4000rpm ,离心5min 。弃上清液。 2、沉淀中加入ligsisbuffer1500μl,充分匀浆。以6000rpm ,离心5min 。 3、彻底弃去上清,加入extractionbuffer500μl(裂解细胞),混匀置于37℃,水溶1h 。

DNA提取方法(一)

D N A提取方法(一) -CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1

各种DNA提取方法 一,基因组DNA提取方法 制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤,通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素,以保证DNA的完整性,为后续的实验打下基础。主要是CTAB方法,其他的方法还有1物理方式:玻璃珠法超声波法研磨法冻融法。2化学方式:异硫氰酸胍法碱裂解法3生物方式:酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料、阴离子交换树脂等 试验步骤: 1、贴壁细胞用胰酶消化,离心收集。 2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次,离心收集。试验步骤2再重新作一边。 3、加入5mlDNA提取缓冲液,(10mmol/LTris- cl0.1mol/LEDTAo.5%SDS)混匀。 4、加入25ul 蛋白酶K使终浓度达到100ug/ml 混匀,50℃水浴3h 5、用等体积的酚抽提一次,2500rpm离心收集水相,用等体积的(酚,氯仿,异戊醇)混合物抽提一次,2500r/min离心收集水相 6、用等体积的氯仿,异戊醇抽提一次。加入等体积的5mol/L的LiCL混匀,冰浴,10min.。 7、2500rpm离心10min.转上清于一离心管中。加入等体积的异丙醇。室温10min。2500rpm离心10min。弃上清。 8、加入0.1倍体积3mol/L乙酸钠(PH5.2)与2倍体积-20℃预冷无水乙醇。-20℃20min。 9、12000r/min室温离心5min。弃上清。将DNA溶于适量TE中。二,外周血DNA提取技术分离外周血白细胞提取方法:试验步骤: 1、取人肘静脉血5ml,EDTA抗凝,2500rpm离心10min。 2、小心吸取上层血浆,分装到3个0.5ml 离心管中。 3、在血细胞中加入3倍体积的溶血液,摇匀,冰浴15min。 4、2500rpm离心10min,弃上清。 5、加入10ml 溶血液,摇匀,冰浴15min。 6、3000rpm离心10min,弃上清。 7、倒置离心管,去掉残液。 8、得白细胞,-80℃冻存。 试验要求: 血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h,4℃放置不超过5h,以防白细胞自溶。 三,氯仿法抽提外周血白细胞基因组DNA: 试验试剂: Ligsisbuffer: 133mMNH4ClNHCl7.12g0.9mMNH4HCO3NH4HCO30.071g0.1mMED TA0.5mMEDTA0.2ml;最后加灭菌去离子水至1000ml,高压灭菌。ACD抗凝剂:__________柠檬酸1.68g柠檬酸钠4.62g葡萄糖5.15g;最后加灭菌去离子水至350ml,高压灭菌。 提取缓冲液(Extractionbuffer): 10mMTrisCl(PH=8.0)1MTris.Cl(PH=8.0)1ml0.1mMEDTA(PH=8.0)0.5m MEDTA(PH=8.0)20ml0.5%SDS10%SDS0.5ml;最后加灭去离子水至100ml, 高压灭菌 试验步骤: 1、在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000μl,充分颠混至清亮。以4000rpm,离心5min。弃上清液。 2、沉淀中加入ligsisbuffer1500μl,充分匀浆。以6000rpm,离心5min。 3、彻底弃去上清,加入extractionbuffer500μl(裂解细胞),混匀置于37℃,水溶1h。 4、加入8μl 的蛋白酶K,颠混,37℃过夜(或55℃,3h,但是37℃效果要好些)。 5、每管加入450μl 饱和酚(取溶液下层)缓慢摇晃10min,以5500rpm,离心15min。 6、取上清,每管加入250μl 饱和酚和250μl氯仿-异戊醇,摇匀10min,以5500rpm,离心15min。 7、取上清,每管加入500μl 氯仿-异戊醇,摇匀10min,以5500rpm,离心15min。 8、取上清,每管加50μl 的3M的NaAC+,适量无水乙醇(预冷)至满,摇匀放入-20℃保存2h以上。 9、以12000rpm,离心20min。去上清,加入70%乙醇500μl,以12000rpm,离心5min,去上清,50-60℃干燥。 10、加入50μl 灭菌去离子水,转弹,混匀。 四,NaI提取法提取外周血白细胞基因组: 实验步骤: 1、取外周抗凝血(全血)100ul 于eppendorf管中,12000rpm离心12min。 2、弃上清,加双蒸水200ul 溶解,摇匀20s。 3、混匀后加6MNaI溶液200ul,摇匀20s。 4、加入氯仿/异戊醇(24:1)400ul,边加边摇,摇匀20s,12000rpm离心12min。 5、取上层液350ul,加入另一新eppendorf管中,加0.6倍体积异丙醇,摇匀20s,室温放置15min,静置后的反应体系15000rpm 离心12min,使沉淀紧贴eppendorf管壁。 6、弃异丙醇,加70%乙醇1ml(不振动),以15000rpm离心 12min。 7、弃乙醇,敞开eppendorf管盖,烘干(37℃恒温箱)后,加1xTE溶液30ul,溶解DNA>12h以上,制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。 五,常用的外周血白细胞基因提取方法: 试验原理: 苯酚/氯仿提取DNA是利用岘_Q______酚是蛋白质的变性剂,反复抽提,使蛋白质变性,SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解,在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子,核蛋白变性降解,使DNA 从核蛋白中游离出来。DNA易溶于水,不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团,也容易进行水合作用,并在表面形成一层水化层,使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时,蛋白质

植物DNA提取方法总结

植物DNA的提取分离技术 摘要:主要介绍了近年来国内外几种常用的DNA提取方法:CTAB法、SDS法等,并在对其进行了简单的归纳总结与比较分析同时,并介绍了一些新的改良方法和其他植物提取方法 关键词:植物DNA 提取方法研究进展 市售中药材大多为干品,而中药材的加工和贮藏整个过程,如日晒、高温烘干等都不利于DN的完整性, 为达到要求目前国内外研究发现并使用的DNA提取方法有很多[1-12],其中被最为广泛应用的DNA提取方法是传统的CTAB法和SDS法[13]。由于不同植物的材料组分和干湿程度各异,因此对不同植物DNA的提取存在着不同的效果。目前许多学者都在致力于研究不同的植物DNA提取方法。他们在探索新方法的同时,也针对不同的植物,在传统的提取方法上进行着一些新的改良。 1.十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)法 在目前众多的DNA提取方法中,CTAB法是其中最为广泛应用的一种。它既可以裂解细胞,又可以有效地去除多酚类和多糖类物质的沉淀,因而经常被应用于植物的DNA提取工作中。 1.1方法及原理 CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵),是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl),CTAB 与蛋白质和多聚糖形成复合物,只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽

提,去除蛋白,多糖,酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。 1.2 CTAB提取缓冲液的经典配方 Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏;EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性;NaCl 提供一个高盐环境,使DNP 充分溶解,在于液相中; CTAB溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离。 β-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除 PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除多酚,减少DNA中酚的污染;同时它也能和多糖结合,有效去除多糖。 1.3适用范围及一些改良 由于CTAB提取法能够有效地去除多糖及酚类物质的沉淀,因而适用于从含酚类及糖类物质较高的植物材料中提取DNA。经研究发现CTAB提取法在落羽杉属树木、黑木相思、野生稻、野燕麦、枸杞、花生的DNA的提取中,相比较其他提取方法来说都是最好的提取方法。为了缩短提取流程,提高提取质量,研究人员在传统方法的基础上,针对不同植物的特点,对一些提取步骤进行了改进。李先进[11]在对四种药用蕨类DNA提取的比较研究中发现,由于酚类物质极其容易被氧化,因此可以在最开始研磨材料的时候加入4%PVP,以防止研磨中细胞组织破裂后酚的氧化,从而获得更为理想的DNA。黄永莲[5]

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