福建农林大学学报(自然科学版)第31卷第3期Journal of Fujian A griculture and Fo restry U niversity(N atural Science Editi on)2002年9月
苏云金杆菌摇瓶发酵培养基
黄天培,邱思鑫,黄志鹏,黄必旺,关 雄
(福建农林大学生物技术中心,福建福州350002)
摘要:采用正交试验法,对苏云金芽孢杆菌高毒力菌株T S16进行了摇瓶发酵培养基筛选试验.结果表明,不同原料对发酵液毒力的影响相差很大,在几种培养基组分中以鱼粉对发酵液的影响最大.试验所得的最佳培养基组合为:黄豆饼粉32g ?L21、玉米粉14g?L21、花生饼粉32g?L21、鱼粉14g?L21、蛋白胨4g?L21、酵母6g?L21、FeSO4?7H2O0.04g?L21、Zn2 SO4?7H2O0.08g?L21.
关键词:苏云金芽孢杆菌;培养基筛选;正交设计
中图分类号:Q939.97文献标识码:A文章编号:100627817(2002)0320317203
M ed iu m of shak i ng f la sk ferm en ta tion of B acillus thu r ing iens is
HUAN G T ian2p ei,Q I U Si2x in,HUAN G Zh i2p eng,HUAN G B i2w ang,GUAN X i ong
(B i o techno logy Center,Fujian A griculture and Fo restry U niversity,Fuzhou,Fujian350002,Ch ina)
Abstract:T he op ti m izati on experi m ent of m edium of shak ing flask fer m entati on of B acillus thu ring iensis T S16strain w as conducted by the o rthogonal design.T he results w ere as fo llow s:the effects of agricultural by2p roducts on the fer m enta2 ti on liquids w ere different,fishm eal w as the mo st effecient substrate fo r B t;by o rthogonal design experi m ent,the best m edium fo r m ula w as go t,w h ich w as:defatted soy flour32g?L21,co rn m eal14g?L21,defatted peanut flour32g?L21, fishm eal14g?L21,pep tone4g?L21,yeasts6g?L21,FeSO4?7H2O0.04g?L21and ZnSO4?7H2O0.08g?L21.
Key words:B acillus thu ring iensis;m edium op ti m izati on;o rthogonal design
苏云金杆菌对营养要求不高,除了在牛肉膏蛋白胨培养基中生长良好外,在许多由农副产品组成的培养基中,甚至一些以工业废水、废渣为主的培养基中也能生长良好[1-3].但不同的苏云金芽孢杆菌菌株之间的营养需求差异很大,故不能以某一特定配方作为所有苏云金芽孢杆菌的发酵培养基.从化学成分的角度确定苏云金芽孢杆菌的培养基组分是很难的[4].不同农副产品、它们之间的不同配比以及培养基的含固量,对菌株可产生显著的毒力差异[2,5-7].因此,发酵培养基配方的筛选在B t的工业化生产上尤为重要.
1 材料与方法
1.1 菌株
苏云金芽孢杆菌T S16菌株为福建农林大学生物技术中心选育、保存.
1.2 供试昆虫
参照农业部行业标准N Y293295饲养的小菜蛾(P lu tella xy lostella),采自福州建新蔬菜基地.
1.3 培养基原料
LB培养基(质量浓度):胰蛋白胨10g?L21(东海制药厂产品)、酵母膏5g?L21(上海生物化学试剂公司产品)、N aC l10g?L21(广东西陇化工厂产品)、pH7.2.筛选培养基:黄豆饼粉、鱼粉、花生饼粉(泰禾集团)、淀粉、玉米粉(浦城生物农药厂)、蛋白胨(东海制药厂产品)、酵母膏、FeSO4?7H2O(上海山海工学实验厂产品)、ZnSO4?7H2O(浙江杭州萧山化学试剂厂产品)、M nSO4?H2O(广州化学试剂公司产品)、M g2 SO4?7H2O(广东金山县兴塔化工厂产品).
1.4 培养基筛选试验
根据文献[7]中的试验方法设置适当的培养基组合,选择黄豆饼粉、玉米粉、花生饼粉、鱼粉、酵母膏、蛋白胨等6个因素,每个因素选高、中、低3个浓度进行正交试验设计[8,9].应用L18(2×37)正交表对各组分进行优化试验,考察不同培养基组分对发酵液毒力的影响.各因素水平见表1.
收稿日期:2001-11-01
基金项目:国家“十五”攻关项目(20012BA708B072123)、福建省科技厅资助项目(2002N004)和福建省农业科技跨越计划(07032200127).
作者简介:黄天培(1979-),男.研究方向:生物农药与仿生农药学.
1.5 无机盐对毒力的影响试验
以L 18(2×37)正交试验确定的较佳培养基为基本培养基,分别加入不同量的FeSO 4?7H 2O 、ZnSO 4?7H 2O 、M nSO 4?H 2O 和M gSO 4?7H 2O ,考察无机盐类对发酵液毒力的影响.每种无机盐选高、中、低3个浓度,采用L 9(34)正交表进行试验设计,试验设计方案见表2.
表2 无机盐正交试验因素水平表
T able 2 O rthogonal experi m ental facto r levels fo r ino rganic salts
m g ?L 21
水平Θ(FeS O 4?7H 2O )Θ(ZnS O 4?7H 2O )Θ(M nS O 4?H 2O )Θ(M gS O 4?7H 2O )180203020024080604003204090800
表1 正交试验因素水平表
T able 1 O rthogonal experi m ental facto r levels
g ?L 21
水平Θ(黄豆饼粉)Θ(玉米粉)Θ(花生饼粉)Θ(鱼粉)Θ(酵母膏)Θ(蛋白胨)13016321042232142818663
34
12
25
14
8
4
1.6 摇瓶试验
按正交试验设计,分别配制不同培养基,取每种培养基25mL ,分别装入250mL 三角瓶中培养.消毒
前pH 8.5.冰箱保存的斜面菌种活化后接种到新鲜的LB 培养基中过夜,再按1%接种量转接到不同的培养基中,30℃、200r ?m in 21,摇床培养至30%芽孢脱落后终止培养,加酸调节pH 值至5.5-6.0后置于冰箱备用.将发酵液按一定比例稀释后进行生物测定,并进行统计分析.1.7 生物测定方法
采用浸叶饲喂法[10],即用无菌水配制好的不同浓度B t 供试药液浸泡定量的小白菜叶片,浸泡5m in 后取出,晾干后供饥饿24h 的小菜蛾3龄幼虫取食.将小菜蛾3龄幼虫接入已装有带毒小白菜叶片的养虫瓶中,每瓶接虫20头,每处理重复3次,设空白对照.将供试昆虫置于25℃恒温饲养,测定B t 发酵液对小菜蛾48h 的致死率.判断死亡与否标准是:以毛笔轻轻触动虫体,无任何反应者为死虫,否则为活虫.当对照组死亡率低于10%时,试验有效.2 结果与分析
2.1 培养基筛选试验
从表3可知,各因素对杀虫效果的影响以鱼粉最大.大多数因素以中间浓度水平较佳,说明已接近最佳水平,最佳水平为A 2B 2C 1D 3E 2F 3G 1,即黄豆饼粉32g ?L 21、玉米粉14g ?L 21、花生饼粉32g ?L 21、鱼粉
14g ?L 21、酵母膏6g ?L 21、蛋白胨4g ?L 21
.其中花生饼粉含量还处于最大值,还需进一步试验.
表3 培养基筛选正交试验结果1)
T able 3 O rthogonal experi m ental results of m edium op ti m izati on
试验号
A B C D E F G 校正死亡率 %
1
111111171.2
2122222274.63133333372.84211223384.75222331169.56233112247.57312132345.88323213171.29331321279.710113322164.411121133247.412132211356.013212313271.214223121367.815231232181.416313231257.617321312371.218
332123157.6
j 386.4394.9435.6337.3388.3401.7415.3 j 422.0401.7374.7425.5428.8384.8377.9
j
383.1394.9381.3428.8374.5405.1398.3R j 38.96.860.991.654.320.337.4S j
77.92.5186.1448.9132.819.358.1
1)A .黄豆饼粉;B .玉米粉;C .花生饼粉;D .鱼粉;E .酵母膏;F .蛋白胨;G .空列.
2.2 无机盐对毒力影响的试验
选择表3中4号培养基组合进行无机盐对杀虫效果影响的正交试验(表4).从表4可知,FeSO 4?7H 2O 对B t 毒力影响较明显,其次是ZnSO 4?7H 2O ,而M nSO 4?H 2O 、M gSO 4?7H 2O 的影响较小,因此
?813?福建农林大学学报(自然科学版)第31卷
在发酵培养基中加入0.04g ?L 21FeSO 4?7H 2O 和0.08g ?L 21ZnSO 4?7H 2O ,有助于提高发酵液毒力. 表4 无机盐对毒力影响的正交试验结果1)
T able 4 O rthogonal experi m ent of effects of m edium w ith ino rganic salts on B t
toxicity 试验号
A B C D 校正死亡率 %
1
1
11178.42122281.73133375.04212391.75223190.06231281.77313283.38321385.09
332178.4
j 235.1254.2245.1245.2 j 261.8255.1251.8247.5
j
247.0235.1247.5251.7R j 26.720.06.76.5S j
58.1
42.1
3.5
3.3
1)A :FeSO 4?7H 2O ;B :ZnSO 4?7H 2O ;C :M nSO 4?H 2O ;D :M gSO 4?7H 2O .
3 结果与讨论
不同苏云金杆菌菌株对矿物质的需求各不相同,不同矿物质对发酵液毒力影响不一样,且在工业培养基中矿物质的加入量还与农副产品中矿物质含量有关.因此,对培养基中矿物质含量也要进行优化.
Zn 2+、M n 2+、N H 4+、K 3PO 4等能刺激外毒
素的产生,其产生量受各物质浓度的影响,高盐浓度会破坏产孢和外毒素的相关性,对矿物质浓度优化后可得到高产孢和外毒素配方.在试验中没有对微量元素进行详细筛选,只对4种B t 所需常规无机盐进行了简单研究,这方面工作还有待于以后进一步加强.参考文献:
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(责任编辑:叶济蓉)
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913?第3期黄天培等:苏云金杆菌摇瓶发酵培养基
工业发酵进展
微生物发酵培养基的优化方法 对于微生物的生长及发酵，其培养基成份非常复杂，特别是有关微生物发酵的培养基，各营养物质和生长因子之间的配比，以及它们之间的相互作用是非常微妙的。面对特定的微生物，人们希望找到一种最适合其生长及发酵的培养基，在原来的基础上提高发酵产物的产量，以期达到生产最大发酵产物的目的。发酵培养基的优化在微生物产业化生产中举足轻重，是从实验室到工业生产的必要环节。能否设计出一个好的发酵培养基，是一个发酵产品工业化成功中非常重要的一步。以工业微生物为例，选育或构建一株优良菌株仅仅是一个开始，要使优良菌株的潜力充分发挥出来，还必须优化其发酵过程，以获得较高的产物浓度（便于下游处理），较高的底物转化率（降低原料成本）和较高的生产强度（缩短发酵周期）。设计发酵培养基时还应时刻把工 实验室最常用的优化方法是单次单因子法，这种方法是在假设因素间不存在交互作用的前提下，通过一次改变一个因素的水平而其他因素保持恒定水平，然后逐个因素进行考察的优化方法。但是由于考察的因素间经常存在交互作用，使得该方法并非总能获得最佳的优化条件。另外，当考察的因素较多时，需要太多的实验次数和较长的实验周期[3]。所以现在的培养基优化实验中一般不采用或不单独采用这种方法，而采用多因子试验。 2.多因子试验 多因子试验需要解决的两个问题: (1)哪些因子对响应具有最大(或最小)的效应，哪些因子间具有交互作用。 (2)感兴趣区域的因子组合情况，并对独立变量进行优化。
3.正交实验设计 正交实验设计是安排多因子的一种常用方法，通过合理的实验设计，可用少量的具有代表性的试验来代替全面试验，较快地取得实验结果。正交实验的实质就是选择适当的正交表，合理安排实验的分析实验结果的一种实验方法。具体可以分为下面四步： （1）根据问题的要求和客观的条件确定因子和水平，列出因子水平表； （2）根据因子和水平数选用合适的正交表，设计正交表头，并安排实验； （3）根据正交表给出的实验方案，进行实验； （4）对实验结果进行分析，选出较优的“试验”条件以及对结果有显著影响的因子。 正交试验设计注重如何科学合理地安排试验，可同时考虑几种因素，寻找最佳因 次 报道。CastroPML报道用此法设计20种培养基，做24次试验，把gamma干扰素的产量提高了45%。 6.部分因子设计法 部分因子设计法与P1ackett-Burman设计法一样是一种两水平的实验优化方法，能够用比全因子实验次数少得多的实验，从大量影响因子中筛选出重要的因子。根据实验数据拟合出一次多项式，并以此利用最陡爬坡法确定最大响应区域，以便利用响应面法进一步优化。部分因子设计法与Plaekett-Burman设计法相比实验次数稍多，如6因子的26-2部分因子设法需要进行20次实验，而Plackett-Burman设计法只需要7次实验。 7.响应面分析法
课程设计说明书 课程名称：发酵工程 设计题目：大肠杆菌的高细胞密度发酵 院系：生物与食品工程学院 学生姓名：郑帅超 学号：201106040030 专业班级：11 生物技术 指导教师：李安华 2014年5月26日
课程设计任务书 设计题目枯草芽孢杆菌产淀粉酶发酵工艺的优化 学生姓名郑帅超所在院系生物与食品工 程学院 专业、年级、班11生物技术 设计要求： 1、树立正确的设计指导思想，严谨负责、实事求是、刻苦钻研、勇于探索的作风和学风。 2、根据所给资料，按照任务书中提出的范围和要求按时独立完成，不得延误，不得抄袭他人成果。 3、说明书应字迹清楚文字通顺，并附有各项设计成果表，摘引其他书籍或杂志的材料必须注明出处。 4、设计标准要求规范、实用、切合实际。 5、设计应严格按有关设计规范进行。 6、设计结束后，以个人为单位提交设计说明书一份（后附流程图）。 学生应完成的工作： 1、在老师的帮助下完成题目设计。 2、学生查阅相关文献、资料制定实验路线，并有指导老师检查实验路线的合理性和可行性。 3、学生在实验室完成实验方案。 4、完成课程设计说明书的初稿，由指导老师帮助修改，最后定稿。 参考文献阅读： [1]李寅等著，高细胞密度发酵技术，化学工业出版社，2006-10-01，177~288. [2]陈坚,李寅,毛英鹰,等. 生物工程学报,1998 ,14(4) :452～455. [3]李民,陈常庆,朴勤,等. 生物工程学报,1998 ,14(3) :270～275. [4]杨汝燕,李民,陈常庆. 工业微生物,1998 ,28(3) :30～33. [5 ]李民,陈常庆,朴勤等,生物工程学报,1998 ,14 (3) :270~275. [6]杨汝燕,李民,陈常庆,工业微生物,1999 ,29(1) :25～28. [7]徐皓,李民,阮长庚,等. 工业微生物,1998 ,28(2) :20～25. [8]刘社际,葛永红,杨立明. 中国生物制品学杂志,1999 ,12 (1) :29 ～31. 工作计划： 2013.5.11分组并确认指导老师，在老师指导下查阅文献，确定题目。 2013.5.12----2013.5.13 进行理论试讲阶段，确定实验路线，然后确定实验方案。 2013.5.14----2013.5.17 进行实验操作和书写设计说明书。 2013.5.18----2013.5.22 修改说明书，和指导老师沟通。 2013.5.23—2013.5.26 上交课程设计说明书，并由指导老师填写评语和成绩。 任务下达日期：2014年5月13日 任务完成日期：2014年5月26日 指导教师（签名）：学生（签名）：
Bt（苏云金杆菌）乳剂生产工艺规程 衡阳市微生物厂 一九九二年三月
Bt 乳剂工业生产技术 一、概述 Bt 即苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis ）的简称，是一种寄生于昆虫体内引起昆虫发病死亡的能产生伴孢晶体的芽孢杆菌，其制剂广泛应用于农、要、果、蔬、城市园林方面的害虫防治。 二、生产工艺流程 砂土管菌种 斜面菌种 扁瓶 菌种扩大培养 发酵罐 过滤 浓缩 加助剂 检验 包装 三、生产工艺操作规程 （一）砂土管菌种的制备 1、砂的处理： 取建筑用砂或河砂经60－80目过筛后用工业Hc 浸泡48h 后用清水洗净，再用0.2NNao 中和，烘干后用磁铁除去其中带磁性之金属微粒，装入洁净容器内备用。 2、砂土管制备： 将以上已处理好之砂土分装于1.2×12公分之小试管中，每管约装2克，塞上棉塞，先用2.0kg/cm 2高压灭菌1.5小时，间歇灭菌三次，再以160℃干热灭菌2小时，经无菌试验，即抽取一点砂土置于斜面试管中 36℃培养24小时才检查无杂菌后备用。 27－29℃ 48－72h 27－29℃ 18－24h 27－29℃ 36－48h
3、砂土孢子的制作： 选择生长良好，经过生产能力考查合格的优良试管斜菌种一支加入无菌水5ml，用接种针刮下孢子制成高浓度的孢子悬液用无菌吸管吸取0.2－0.3ml接入砂土管中，而后置入真空干燥器内，用真空泵间歇抽干，用石蜡封口，以后置于0－5℃冰箱中，在干燥情况下保存。 （二）斜面菌种的制备 1、培养基：牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、琼脂2%，调节7.5－8.0溶化后分装试管，加塞放入试管篓内包好灭菌。 2、灭菌：在消毒锅内 1.1kg/cm2下蒸气灭菌30分钟，等冷却到60－70℃时取出摆成斜面，空白培养2天观察无杂菌方可使用。 ３、接种培养：将菌种试管斜面放在接种室内或无菌操作箱中，打开紫外线灯灭菌30分钟后关闭。用接种环按操作规程刮取种子菌苔少许，转至新鲜斜面培养基上划线接种，然后放入30℃培养箱内3－4天，经检查正常，放入冰箱内备用。 （三）扁瓶扩大种子制备 1、培养基：同斜面培养组成，另加葡萄糖1%，溶化后装入扁瓶。 2、灭菌、接种、培养均与斜面菌种同。 （四）发酵 1、培养基棉籽饼粉 3.5% 玉米粉 2.0% 鱼粉 1.0% 酵母粉0.2%
枯草芽孢杆菌发酵培养基优化 作者姓名 专业 指导教师姓名 专业技术职务
目录 摘要 (1) ABSTRACT (2) 第一章绪论 (3) 1.1枯草芽孢杆菌简介 (3) 1.2枯草芽孢杆菌的应用 (3) 1.2.1枯草芽孢杆菌在工业酶生产中的应用 (3) 1.2.2枯草芽孢杆菌在生物防治领域中的应用 (3) 1.2.3枯草芽孢杆菌在微生物添加剂领域中的应用 (4) 1.2.4 枯草芽孢杆菌在医药方面的应用 (4) 1.2.5 枯草芽孢杆菌在水产中的应用 (4) 1.2.6枯草芽孢杆菌是微生物学与分子生物学研究的良好试验材 料 (5) 1.2.7枯草芽孢杆菌在环境保护方面的应用 (5) 1.3 国内外的研究现状与发展趋势 (6) 1.4研究的思路、目的及意义 (7) 第二章材料与方法 (7) 2.1实验材料 (7) 2.1.1 菌株鉴定 (7) 2.1.2 培养基 (7)
2.1.3 主要设备 (8) 2.2 培养基的优化 (9) 2.2.1 培养方法 (9) 2.2.2实验流程 (9) 2.2.3实验方法 (10) 2.2.4正交试验 (11) 第三章结果和分析 (11) 3.1 鉴定结果如下 (11) 3.2 枯草芽孢杆菌最优化培养基正交实验结果 (16) 3.3 pH变化曲线（以G18为例） (19) 3.4 实验总结 (25) 致谢 (27)
摘要 枯草芽孢杆菌是主要的饲用益生菌菌株，本论文以两株枯草芽孢杆菌G18和G21培养的延滞期和倍增时间为评价指标，通过三角瓶摇床培养，进行了两因素三水平的正交试验，对发酵培养基主要组分进行了优化，豆粕处理的蛋白酶加量2u/g 豆粕、5u/g豆粕、10u/g豆粕和玉米浆添加量0.5%、1.0% 、1.5% 做两个因素三水平的正交实验，研究表明：G18最佳培养基是：葡萄糖0.5%，淀粉3%，豆粕3%，玉米浆1.0%，破壁酵母0.5%，磷酸氢二钠0.2%，硫酸镁0.1%，硫酸锰0.01%，普通a淀粉酶2u/g淀粉，蛋白酶添加量10u/g豆粕。G21的最佳培养基是：葡萄糖0.5%，淀粉3%，豆粕3%，玉米浆1.5%，破壁酵母0.5%，磷酸氢二钠0.2%，硫酸镁0.1%，硫酸锰0.01%，普通a淀粉酶2u/g淀粉，蛋白酶添加量5u/g豆粕。[关键词] 枯草芽孢杆菌培养基优化正交试验
大肠杆菌培养 一、菌种冻存液的制备 含有足量细菌的液体培养基离心后在沉淀中加入等量40%甘油，-80o C冻存。 二、培养基制备 LB培养基配方（胰化蛋白胨（Trypton）：10 g/L；酵母提取物（Yeast Extract）：5 g/L；NaCl：10 g/L；pH 7.4） 液体培养基 胰化蛋白胨 10.0g 酵母粉 5.0g 氯化钠 10.0g 水 1000ml pH 7.4 固体培养基在液体培养基的基础上再加入1.5％－2.0％的琼脂 三、平板的制备 1）称取胰化蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，加入800mL二次水溶解，并用玻璃棒搅拌均匀，用1mol/L的NaOH调pH至7.4左右，定容至1L，调pH 7.4（若溶液pH大于7.4，用1mol/L HCl回调）。 2）分装在锥形瓶中，每瓶量不宜太多，没过瓶底一指左右。如需固体培养基在分装后的液体培养基内加入约2%的琼脂（150mL液体培养基加入2.5g琼脂）。3）在锥形瓶口依次覆盖带滤纸通气小孔的塑料膜和硬质纸，用皮筋捆好。所有锥形瓶如上述操作。用记号笔注明培养基名称、配制日期。 4）高压蒸汽灭菌锅121 oC灭菌15min。 5）灭菌后的培养基取出置电热鼓风干燥器内60oC烘干，待锥形瓶的封口纸干燥后取出。液体培养基可直接保存或使用，此时加有琼脂的培养基不会凝固，可在预先紫外杀菌30min以上的无菌操作台上，将培养基倒入培养皿内，每个培养皿培养基约10-15mL（直径90mm），在培养皿中厚度大约4mm左右。将平皿叠放在无菌操作台上，放置10min左右，待琼脂基本凝固可涂平板。6）若平板不直接使用，灭菌后将培养基在锥形瓶中保存，待需制备平板时，微波炉中火加热约3min，使琼脂熔化，室温冷却20min至不烫手可制备平板。 四、接种大肠杆菌 1）取实验室储备的大肠杆菌BL21冻存液，管口用酒精灯灼烧，打开离心管。2）接种方法一：用灭菌枪头蘸取冻存液在平板边缘上划横条，每三道为一组，旋转平皿一圈，最后中间划之字；接种方法二：用移液枪吸取100uL溶液于平板上，用酒精灯灭菌厚的涂抹棒划十字，涂布平板。 3）因实验一般都要求挑取单菌落，故涂平板适应考虑冻存液内细菌数量，若菌量过大应适当稀释。一般方法一获得单菌落的可能性比较大。涂平板应在酒
1）生物素营养缺陷型 ?作用机制:生物素是脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA羧化酶的辅酶,参与 了脂肪酸的合成,进而影响脂肪酸的合成.当磷脂合成量少到正常的1/2左右时,细胞变形,Glu向膜外泄漏. ?控制关键:使用该类突变株必须限制发酵培养基中生物素亚适量(5-10 g/L).在发酵 初期(0-8小时),细胞正常生长,当生物素耗尽后,在菌的再次倍增时,开始出现异常形态细胞,即完成了细胞从生长型到积累型转换. 2）油酸营养缺陷型 ?作用机制:油酸营养缺陷型丧失了合成油酸的能力,通过控制油酸使磷脂合成量减少 到正常量的1/2左右. ?控制关键:保证在培养基中油酸亚适量,完成细胞从生长型到生产型的转换. （3）添加表面活性剂 ?添加表面活性剂(如吐温60)或不饱和脂肪酸(C16-18),也能造成细胞渗漏,积累谷氨 酸. ?机理:两者在脂肪酸合成时对生物素有拮抗作用,导致磷脂合成不足,形成不完整的细 胞膜. ?关键:控制好脂肪酸或表面活性剂的时间和浓度,必须在药剂加入后,在这些药剂存在 下进行分裂,形成产酸型细胞. （4）添加青霉素 ?机理:青霉素抑制谷氨酸生产菌细胞壁后期的合成,细胞膜在失去保护,在渗透压的作 用下受损,向外泄露谷氨酸. ?控制关键:一般在进入对数生长期的早期(3-6小时)添加.添加青霉素后倍增的菌体不 能合成完整的细胞壁,完成细胞功能的转换. 谷氨酸发酵强制控制工艺 ?为了稳产,克服培养基原料中某些成分不易控制带来的影响,在谷氨酸发酵时可采取 “强制控制”的方法,如:“高生物素高吐温”或“高生物素高青霉素”的方法. ?控制方法:在发酵培养基中预先配加一定量(过量)的纯生物素,大大地削弱每批原料 中生物素含量变化的影响,高生物素、大接种量能促进菌体迅速增殖.再在菌体倍增的早期加入相对高的吐温或青霉素,形成产酸型细胞.固定其它条件,确保高产稳产。谷氨酸发酵 ? 1.适应期:尿素分解出氨使pH上升.糖不利用.2-4h. 措施:接种量和发酵条件控制使适应期缩短. ? 2.对数生长期:糖耗快,尿素大量分解使pH上升,氨被利用pH又迅速下降.溶氧急剧 下降后维持在一定水平.菌体浓度迅速增大,菌体形态为排列整齐的八字形.不产酸.12h. 措施:及时供给菌体生长必须的氮源及调节pH,在pH7.5-8.0时流加尿素;维持温度30- 32℃ ? 3.菌体生长停止期:谷氨酸合成. 措施:提供必须的氨及pH维持在7.2-7.4.大量通**,控制温度34-37 ℃. ? 4.发酵后期:菌体衰老,糖耗慢,残糖低. 措施:营养物耗尽酸浓度不增加时,及时放罐. 发酵周期一般为30h. 二、谷氨酸发酵的生化过程
苏云金杆菌的使用方法 尽管苏云金杆菌是杀虫剂中使用比较广泛的杀虫剂之一。但还是有不少农民用户对苏云金杆菌的使用方法不是很了解的。今天小编详细给大家介绍苏云金杆菌的使用方法。 苏云金杆菌的使用方法： 十字花科蔬菜菜青虫、小菜蛾 幼虫3龄前，每667平方米使用8000IU/毫克可湿性粉剂100～300克，或16000IU/毫克可湿性粉剂100～150克，或32000IU/毫克可湿性粉剂50-80克，或2000IU/微升悬浮剂200～300毫升，或4000IU/微升悬浮剂100～150毫升，或8000IU/微升悬浮剂50～75毫升，或100亿活芽孢/克可湿性粉剂ioo～iso克，兑水30～45丁-克均匀喷雾。 水稻稻纵卷叶螟、稻苞虫 幼虫孵化高峰至3龄前，每667平方米使用8000IU/毫克可湿性粉剂300～400克，或16000IU/毫克可湿性粉剂150r-_J200克，或32000iu/毫克可湿性粉剂80～100克，或2000IU/微升悬浮剂400～500毫升，或4000IU/微升悬浮剂200～250毫升，或8000IU/微升悬浮剂100-120毫升，兑水30～45千克均匀喷雾。 棉花棉铃虫、造桥虫 幼虫孵化高峰至钻铃前，每667平方米使用8000IU/毫克可湿性粉剂400～500克，或16000克可湿性粉剂200～250克，或32000IU/毫克可湿性粉剂120克，或2000IU/微升悬浮剂400---500毫升，或4000升悬浮剂200～250毫升，或8000IU/微升悬浮剂100-120毫升，
或100亿活芽孢/克可湿性粉剂250～400克，兑水45-75千克均匀喷雾。 玉米、高梁玉米螟 每667平方米使用8000IU/毫克可湿性粉剂250-300克，或4000IU/微升悬浮剂150-200毫升，在玉米或高粱大喇叭口时期喷雾或混细沙制成毒土灌心叶。 大豆天蛾、甘薯天蛾 幼虫孵化盛期，每667平方米使用8000IU/毫克可湿性粉剂200～300克，或16000iu/毫克可湿性粉剂100～150克，或32000iu/毫克可湿性粉剂50～80克，或2000iu/微升悬浮剂200-300毫升，或4000IU/微升悬浮剂100~150毫升，或8000IU/微升悬浮剂50-75毫升，兑水30～45千克均匀喷雾。 烟草烟青虫 幼虫3龄前喷药，每667平方米使用8000IU/毫克可湿性粉剂400-500克，或16000IU/毫克可湿性粉剂200～250克，或32000IU/毫克可湿性粉剂100～120克，或2000IU/微升悬浮剂400～500毫升，或4000IU/微升悬浮剂200--250毫升，或8000IU/微升悬浮剂100～120毫升，兑水30～45千克均匀喷雾。 茶树茶毛虫 幼虫孵化高峰至3龄前喷药，使用8000IU/毫克可湿性粉剂100～150倍液，或16000iu/毫克可湿性粉剂200～300倍液，或32000iu/毫克可湿性粉剂400-500倍液，或2000IU/微升悬浮剂80～100倍液
苏云金杆菌 苏云金杆菌又称苏云金芽胞杆菌，英文名称：Bacillus thuringiensis（B.t.）为了方便都将B.T.写成BT或Bt，故Bt即苏云金杆菌的简称。苏云金杆菌杀虫剂是利用苏云金杆菌杀虫菌经发酵培养生产的一种微生物制剂。苏云金杆菌在自然状态下以一种生物细菌的形式生存于土壤及水中。这种杀虫菌在生长发育过程中产生芽胞并形成一种蛋白质毒素，在显微镜下观察，通常是不规则的菱形结晶，叫做伴孢晶体。 当害虫蚕食了伴孢晶体和芽孢之后，在害虫的肠内碱性环境中，伴孢晶体溶解，释放出对鳞翅目幼虫有较强毒杀作用的毒素。这种毒素使幼虫的中肠麻痹，呈现中毒症状，食欲减退，对接触刺激反应失灵，厌食，呕吐，腹泻，行动退缓，身体萎缩或卷曲。一般对作物不再造成危害，经一段发病过程，害虫肠壁破损，毒素进入血液，引起败血症，同时芽孢在消化道内迅速繁殖，加速了害虫的死亡。死亡幼虫身体瘫软，呈黑色。所以，害虫只有把Bt细菌吃到肚子里，再经过一个发病过程，才能死掉，大约48小时方能达到杀灭害虫的目的。 Bt杀虫剂与化学农药相比有许多优点 第一，对人畜无毒，使用安全。Bt细菌的蛋白质毒素在人和家畜、家禽的胃肠中不起作用。
第二，选择性强，不伤害天敌。Bt细菌只特异性地感染一定种类的昆虫，对天敌起到保护作用。 第三，不污染环境，不影响土壤微生物的活动，是一种干净的农药。 第四，连续使用，会形成害虫的疫病流行区，造成害虫病原苗的广泛传播，达到自然控制虫口密度的目的。 第五，没有残毒，生产的产品可安全食用，同时，也不改变蔬菜和果实的色泽和风味。 第六，不易产生抗药性，这只是相对而言。最近已经发现了抗药性的报道，但不象化学农药产生的那么快。 毒性： 鼠经口按2*10^22活芽孢/Kg体重给药无死亡，也无中毒症状。18名志愿者每人每天吞服30亿芽孢，连服5天，1个月后检查，一切化验正常，无毒性反应。亚急性和毒性试验未见异常，对猪、禽、鸟、鱼、蜂的急性和慢性饲喂养试验未见不正常现象，对家蚕敏感。无致癌、致畸、致突变作用。注意事项： [1]本品对家蚕有毒，蚕室和桑园附近禁用； [2]不能与内吸性有机磷杀虫剂或杀菌剂混合使用(如乐果、甲基内吸磷、稻丰散、伏杀硫磷、杀虫畏)及碱性农药等物质混合使用。
苏云金杆菌 苏云金杆菌（简称Bt）是目前商业开发最为成功的微生物杀虫剂。当前全世界每年生 产的Bt制剂约有7000～10000吨，年销售额已达1.5亿美元，其中欧洲国家产量在2000 吨左右，占欧洲国家生物农药总量的90%。 Bt制剂的研究与利用始于20世纪30年代，因其生产设备较为简单，使用比较方便， 尤其是它可有效地防治150多种鳞翅目幼虫（其中有些是重要的经济害虫），因此，70年代以后，Bt制剂便成为防治农田和仓库害虫的重要生物杀虫剂之一。美国环保局已将其指定 为用于大田作物、果树、蔬菜和观赏植物的主要生物农药，并将它用于仓库害虫的防治。 晶体或孢子的混合物进入敏感幼虫体内后，这种没有杀虫活性的原毒素被碱性肠液活化，并在中肠蛋白酶作用下进一步转化为有杀虫活性的δ-内毒素。δ-内毒素能破坏幼虫肠壁 的上皮细胞，使幼虫停止取食，从而中毒死亡。幼虫致死的时间取决于昆虫种类和剂量。 使用苏云金杆菌杀虫剂注意事项 温度：细菌生物农药杀虫剂的活性成分是蛋白质晶体和有生命的芽孢。在低温条件下（15℃以下），蛋白晶体不易发生作用。15℃以下或30℃以上使用Bt都基本无效，但在相对高温下更能发挥作用，一般在30℃左右时最好，害虫死亡速度较快。 湿度：细菌生物农药杀虫剂中细菌的芽孢喜欢潮湿环境，因此，在田间湿度越大药效越高。阳光：阳光中的紫外线对芽孢有杀伤作用。所以，喷施细菌生物农药最好再傍晚或阴天进行。雨水：喷施细菌生物农药后短期内，如遇大雨，会降低药效。 本品对蜜蜂有毒，对家蚕高毒；对鱼类等水生生物有毒。 不能与内吸性有机磷杀虫剂或杀菌剂混合使用。 对人、畜无毒，使用安全。选择性强，不伤害天敌。不污染环境，不影响土壤微生物的活动，连续使用，无残毒，不易产生抗性。
品名：苏云金杆菌（无添加任何化学杀虫成分） 有效含量：16000iu/mg 剂型：可湿性粉剂 净含量：100克 一、作用方式及特点 苏云金杆菌又称苏云金芽胞杆菌是一种革兰氏阳性细菌，英文名称：Bacillus thuringiensis （B.t.）即苏云金杆菌的简称。苏云金杆菌（Bt菌）杀虫剂是利用苏云金杆菌杀虫菌经发酵培养生产的一种微生物制剂。Bt的杀虫活性物质,主要有二种,即晶体和孢子.晶体又叫原毒素,它是一种蛋白质。当害虫蚕食了伴孢晶体和芽孢之后，在害虫的肠内碱性环境中，伴孢晶体溶解，释放出对鳞翅目幼虫有较强毒杀作用的毒素—毒性肽。这种毒素使幼虫的中肠麻痹，肠道内碱性内含物漏入血腔，孢子和菌体通过被破坏的肠壁进入体腔。使其呈现中毒症状，食欲减退，对接触刺激反应失灵，厌食，呕吐，腹泻，行动退缓，身体萎缩或卷曲。一般对作物不再造成危害，经一段发病过程，害虫肠壁破损，毒素进入血液，引起败血症，同时芽孢在消化道内迅速繁殖，加速了害虫的死亡。死亡幼虫身体瘫软，呈黑色。所以，害虫只有把Bt细菌吃到肚子里，再经过一个发病过程，才能死掉，大约48小时方能达到杀灭害虫的目的，不象化学农药作用那么快，但染病后的害虫，上吐下泻，不吃不动，不再危害作物。 毒性：对人、畜低毒，大鼠口服急性LD50 852.7-856.7毫克/公斤，对家禽、鸟类、鱼、畜等低毒,对害虫天敌无伤害。 中毒症状: 吞服了制剂可能引起胃肠炎。 中毒急救：溅到皮肤或眼内立即用清水冲洗15分钟后就医。吸入，应将病人移到通风处，就医。误服，立即催吐，并送医院对症治疗。 二、杀虫原理 苏云金杆菌长得像根棍棒，矮矮胖胖,身高不到5‰毫米。当它长到一定阶段，身体一端会形成一个卵圆形的芽孢，用来繁殖后代；另一端便产生一个菱形或近似正方形的结晶体，因为它与芽孢相伴而生，我们叫它伴孢晶体，有很强的毒性。昆虫取食后，晶体蛋白在昆虫碱性肠道内溶解，经过中肠蛋白酶的酶解作用，将前毒素降解为活性蛋白。活性蛋白插入昆虫中肠细胞膜，形成跨膜离子通道或孔，破坏钾离子平衡，最终使昆虫中毒，麻痹而死。三、防治对象 Bt对鳞翅目、双翅目、鞘翅目等100多种害虫和动植物线虫有很好的毒杀作用。国内外应用统计，Bt对64种森林害虫，34种果树害虫，12种茶树害虫都显示高毒力。最常用具特效的防治对象有：菜青虫、小菜蛾、斜纹夜蛾、玉米螟、稻苞虫、稻纵卷叶螟、二化螟、三化螟、棉铃虫、棉小造桥虫、茶毛虫、茶尺蠖、松毛虫、天幕毛虫、毒蛾、刺蛾等鳞翅目、膜翅目、双翅目、鞘翅目等害虫有很好的防治效果，且有杀卵作用。此外对大豆拌种防治地下线虫也有特效。 四、使用方法 1.一包100克可兑水100斤 2.可放农用喷雾器里（一喷雾30斤水），也可放园艺喷雾（800ml约可配18桶/1500ml 可配10桶。记得喷撒之前先过滤沉淀物哦，以免塞住喷壶嘴) 3.杀虫剂苏云金杆菌制剂可用于喷雾、喷粉、灌心、制成颗粒剂或毒饵等，也可进行 大面积飞机喷洒，也可与低剂量的化学杀虫剂混用以提高防治效果。草坪害虫的防 治用100亿孢子/g的菌粉750g／hm2对水稀释2000倍喷洒，或用乳剂1500～ 3000g/hm2与52.5～75kg的细沙充分拌匀，制成颗粒剂撒人草坪草根部，防治危 害根部的害虫。也可将苏云金杆菌致死的发黑变烂的虫体收集起来，用纱布袋包好，在水中揉搓，每50g虫尸洗液加水50～l00kg 喷雾（病毒重复利用！）。(2)防治蔬
苏云金杆菌杀虫剂 苏云金杆菌简称Bt，是包括许多变种的一类产晶体芽孢杆菌。可用于防治直翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目，特别是鳞翅目的多种害虫。目前世界上研究最深入, 应用最广泛的微生物杀虫剂, 对人畜安全, 不伤害控制害虫群体的天敌, 不污染环境, 是生物防治害虫的重要组成部分, 更适合农作物虫害的综合防治。 苏云金杆菌是一种微生物源低毒杀虫剂，以胃毒作用为主。该菌可产生两大类毒素，即内毒素（伴胞晶体）和外毒素，使害虫停止取食，最后害虫因饥饿和死亡而外毒素作用缓慢，在蜕皮和变态时作用明显，这两个时期是RNA合成的高峰期，外毒素能抑制依赖于DNA的RNA 聚合酶。该药作用缓慢，害虫取食后2天左右才能见效，持效期约1天，因此使用时应比常规化学药剂提前2～3天，且在害虫低龄期使用效果较好。由于苏云金杆菌制剂的杀虫活性物质是一种毒性晶体蛋白与活菌的混合物, 其防效易受强光、温度和雨水的影响。最适宜使用苏云金杆菌的温度是24～32℃, 不适宜温度为13～17℃, 雨水主要影响施药的残效期。使用苏云金杆菌杀虫剂一定要在阴天或晴天下午4点以后施药于害虫危害部位。对鱼类、蜜蜂安全，但对家蚕高毒。 苏云金杆菌一般对暴食叶片的鳞翅目害虫防效好, 对结苞、卷叶、钻蛀性害虫防治技术性强。如: 2 代棉铃虫发育世代较整齐, 前代成虫产卵主要在棉株嫩尖上, 且初孵幼虫有食卵壳的习性, 防治2代棉铃虫, 主要喷在棉株顶部嫩叶正反面, 即可达到防治效果。稻纵卷叶螟幼虫两龄前结苞较松, 傍晚转苞危害, 防治它应在其幼虫2 龄前, 傍晚施药。玉米螟幼虫在玉米心叶末期, 有群聚喇叭口内危害习性,只要用苏云金杆菌对着喇叭口喷雾或拌毒土撒施入喇叭口内即可。小菜蛾( 吊丝虫) 幼虫2 龄前, 喜在十字花科作物叶背群聚食叶肉, 这是防治的最适期。豆荚螟, 本着治花不治荚的原则, 在日出前重点喷在蕾、花、嫩荚和落地花上。第2 代茶毛虫的初孵幼虫,有群聚叶背取食叶肉习性, 用苏云金杆菌防治应掌握这一时机。苏云金杆菌杀虫剂混用性能好，苏云金杆菌杀虫剂与化学农药交替使用可克服害虫的抗化学农药性。Bt杀虫剂可与多种其它生物制剂、昆虫生长调节剂、菊酯类沙蚕毒素类、氨基甲酸酯类、有机磷类农药及部分杀菌剂和化学肥料现混现用。
大肠杆菌发酵经验总结 大肠杆菌发酵经验总结 首先，补料速率与比生长速率直接影响着乙酸的生成速率和积累量（主要是补料速率与比生长速率影响发酵液中的残糖量，进而影响），所以适当的控制补料速率和比生长速率，对于控制乙酸的量有很好的效果。 其次，必须要保证充足的溶氧，并严格控制pH值，而且补酸碱的速率尽量缓和，不能太快；温度对于蛋白的表达也有很重要的影响，较低的发酵温度下所生产出的蛋白大多是有活性的，而较高的发酵温度下产生的蛋白大多一包涵体形式存在。 第三，选取合理的诱导时间非常重要，一般的诱导时间选在指数生长后期，而且诱导时的比生长速率最好能控制在0.2之，选在此时诱导，1.将菌体的快速生长期与蛋白合成期分开，使这两个阶段互不影响，有利于蛋白的高表达；2.已经得到了大量的菌体，而且菌体的生物量基本接近稳定，不论是从动力学角度，还是能耗，物料成本方面，都比较合理。 第四，补料过程中的碳氮比也很重要。若氮源过高，会使菌体生长过于旺盛，pH偏高，不利于代产物的积累，氮源不足，则菌体繁殖量少从而影响产量；碳源过多，则容易刑场较低的pH，抑制菌体生长，碳源不足，则容易引起菌体的衰老和自溶。另外，碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质，从而直接影响菌体的生长和产物的合成。 根据自己的经验，一般情况下，对于一个稳定的发酵工艺下，如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象，而且能排除噬菌体和染菌的可能性后，那就可能是因为碳氮比不合理造成的。可以适当调整碳氮比。 大家讨论得较多的是关于代副产物乙酸对大肠杆菌发酵的影响，现总结以下几点，并作出相应解决措施。 一、代副产物-乙酸 乙酸是大肠杆菌发酵过程中的代副产物，在多大的浓度下产生抑制作用各种说法不一，一般认为在好气性条件下，5～10g/L 的乙酸浓度就能对滞后期、最大比生长速率、菌体浓度以及最后蛋白收率等都产生可观测到的抑制作用。当乙酸浓度大于10或20g/L 时，细胞将会停止生长，当培养液中乙酸浓度大于12g/L 后外源蛋白的表达完全被抑制。 预防乙酸产生的措施：
谷氨酸的性质及基本介绍 147.12926 1.538 主要用途简介： （一）食品工业：谷氨酸钠俗称味精，是重要的鲜味剂，对香味具有增强作用。 （二）日用化妆品：谷氨酸作为营养药物可用于皮肤和毛发。 N—酰基谷氨酸钠系列产品是由谷氨酸缩合而成的性能优良的阴离子表面活性剂，广泛用于化妆品、香皂、牙膏、香波、泡沫浴液、洗洁净等产品中。 焦谷氨酸钠（味精脱水生成的产物）具有极强的吸湿性，能保持皮肤湿润，防止干燥，并增强皮肤和毛发的柔软和弹力。日本己有以谷氨酸钠（或谷氨酸）为原料生产的高级人造革、化妆品和洗涤剂等产品。 （三）医药行业：谷氨酸作有较高的营养价值，医学上主要用于治疗肝性昏迷，还用于改善儿童智力发育。 （四）农业：谷氨酸与某些激素配合，可制成柑桔增甜剂；还可作为微肥的载体，在氮磷钾基本满足的条件下，作为叶面喷洒的微肥具有投入少、效益高等特点。 谷氨酸钠既是西红柿保护性杀菌剂，又是防治果树腐烂病的特效杀菌剂。 氨基酸铜是目前生产上良好的杀菌剂，有机铜比无机铜的应用效果好。 特殊说明： （一）谷氨酸晶体为白色结晶或结晶性粉末，味微酸。 （二）吸湿性温度50℃，其临界湿度在90%以上。
谷氨酸生产水平与市场分析 生产水平： 谷氨酸棒状杆菌-生物素敏感型高产菌株：采用生物素亚适量工艺，发酵32h，产酸达140g/L以上，糖酸转化率达62%以上，国内同类研究的领先水平。 谷氨酸棒状杆菌-谷氨酸温度敏感型突变株：在最佳发酵条件下，发酵24h，产酸达到160g/L，糖酸转化率达72%，国际同类研究的先进水平。 市场分析： 我国味精工业的产量稳居世界第一位，2007年全国味精产量达190万吨。味精工厂的味精平均销售价格为7,800元/吨，成本为7,000元/吨。按照上述产量计算，我国味精工业中纯味精的总产值约150亿元，加上相当于上述总值30%的副产品（主要是饲料蛋白、化肥、液态肥料）的产出，我国味精工业年生产总值约为200亿元人民币。 从市场需求来看，2007年国内谷氨酸年产量约190万吨，国内人均消费味精仅1kg，与日本、香港、台湾、东南亚等国家及地区的味精消费水平（1.5kg）相比，还是较低的。味精综合开发利用的效益显著，通过提高产酸率，吨味精成本可降低500元左右，其生产成本将低于日本的味精生产成本，具备了参与国际市场的竞争力，可以抓住机遇扩大味精出口量。同时在国内可降低味精销售价格，刺激国内市场消费。
苏云金杆菌说明书 篇一：常用农药安全技术说明书 常用农药安全技术说明书 目录 百菌清......................................................................................................... 1 甲基托布津................................................................................................... 2 甲霜灵......................................................................................................... 3 福美双......................................................................................................... 4 多菌灵......................................................................................................... 5 井冈霉素...................................................................................................... 6 辛硫磷.........................................................................................................7 苏云金杆菌 (8) 1. 百菌清
大肠杆菌培养基配制及培养方 法(总2页) -CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1 -CAL-本页仅作为文档封面，使用请直接删除
大肠杆菌培养 一、菌种冻存液的制备 含有足量细菌的液体培养基离心后在沉淀中加入等量40%甘油，-80o C冻存。 二、培养基制备 LB培养基配方（胰化蛋白胨（Trypton）：10 g/L；酵母提取物（Yeast Extract）：5 g/L；NaCl：10 g/L；pH 7.4） 液体培养基 胰化蛋白胨 10.0g 酵母粉 5.0g 氯化钠 10.0g 水 1000ml pH 7.4 固体培养基在液体培养基的基础上再加入1.5％－2.0％的琼脂 三、平板的制备 1）称取胰化蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，加入800mL二次水溶解，并用玻璃棒搅拌均匀，用1mol/L的NaOH调pH至7.4左右，定容至1L，调pH 7.4（若溶液pH大于7.4，用1mol/L HCl回调）。 2）分装在锥形瓶中，每瓶量不宜太多，没过瓶底一指左右。如需固体培养基在分装后的液体培养基内加入约2%的琼脂（150mL液体培养基加入2.5g琼脂）。 3）在锥形瓶口依次覆盖带滤纸通气小孔的塑料膜和硬质纸，用皮筋捆好。所有锥形瓶如上述操作。用记号笔注明培养基名称、配制日期。 4）高压蒸汽灭菌锅121 oC灭菌15min。 5）灭菌后的培养基取出置电热鼓风干燥器内60oC烘干，待锥形瓶的封口纸干燥后取出。液体培养基可直接保存或使用，此时加有琼脂的培养基不会凝固，可在预先紫外杀菌30min以上的无菌操作台上，将培养基倒入培养皿内，每个培养皿培养基约10-15mL（直径90mm），在培养皿中厚度大约4mm左右。将平皿叠放在无菌操作台上，放置10min左右，待琼脂基本凝固可涂平板。 6）若平板不直接使用，灭菌后将培养基在锥形瓶中保存，待需制备平板时，微波炉中火加热约3min，使琼脂熔化，室温冷却20min至不烫手可制备平板。 四、接种大肠杆菌 1）取实验室储备的大肠杆菌BL21冻存液，管口用酒精灯灼烧，打开离心管。 2）接种方法一：用灭菌枪头蘸取冻存液在平板边缘上划横条，每三道为一组，旋转平皿一圈，最后中间划之字；接种方法二：用移液枪吸取100uL溶液于平板上，用酒精灯灭菌厚的涂抹棒划十字，涂布平板。 3）因实验一般都要求挑取单菌落，故涂平板适应考虑冻存液内细菌数量，若菌量过大应适当稀释。一般方法一获得单菌落的可能性比较大。涂平板应在酒精灯附近进行，若冻存液涂完的平板应倒置，防止平皿盖上产生水蒸气。 五、大肠杆菌的培养
[转载]枯草芽孢杆菌发酵探讨 枯草芽孢杆菌是我国农业部允许作为饲料添加剂的两 种芽孢杆菌之一，已被越来越多地研制成饲用微生态制剂。因其制剂是无毒、无残留、无污染的“绿色”添加剂，故具有 广阔的发展前景，并已在畜牧业、饲料业广泛应用，显示巨大的社会效益和生态效益。枯草芽孢杆菌具有很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等活性，能产生抗菌素，在动物肠道内具有较强生物夺氧能力。这些特性对促进动物营养的消化吸收、提高动物的饲料转化率、防病和促进生长起到重要作用。鉴于此，国内外专家学者对研究开发枯草芽孢杆菌制剂用于畜禽养殖日趋关注，从而也促进了这一产业的迅猛发展，但在现阶段的工业化生产中，存在着制约枯草芽孢杆菌发酵的诸多因素。 1、枯草芽孢杆菌的生物学特点 杆菌：一般（0.7～0.8）×（2.0～3.0）μm，电子显微镜测 量为（0.5～0.6）×（1.1～3.5）μm，革兰氏阳性，运动， 有长而又丰富的周生鞭毛。 芽孢：椭圆形，中生或偏中生，即使孢囊膨大也不显著。 生长温度：最高温度45～55℃；最低温度5～20℃。 阳性反应：接触酶；V-P反应；在7％的氯化钠中生长；pH5.7生长；分解葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露醇产酸；水解淀
粉；利用柠檬酸作为碳源；还原硝酸盐为亚硝酸盐；分解酪素；石蕊牛奶产碱胨化。 阴性反应：厌氧生长； 卵黄反应：在葡萄糖洋菜上或酪氨酸洋菜上形成可溶性黑色素；28℃4星期水解马尿酸盐；利用丙酸盐并分解酪氨酸。在55℃生长的菌株被0.02％的叠氮化合物抑制。 变化的性质：在V-P液中产酸(pH5.0～8.0)；对溶菌酶的抗性；在10％的氯化钠中生长。2、芽孢杆菌制剂的作用机理2.1可产生酶类和营养物质 研究表明芽孢杆菌能够分泌大量的胞外酶，如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等，有助动物对饲料的降解、消化，提高饲料利用率。饲料中未被消化的蛋白质和一些含氮物质在肠道中被大肠杆菌和其他细菌脱梭生成具有潜在的毒性的腐胺、吲哚、酚类等物质。一些芽孢杆菌可产生氨基氧化、SOD酶、分解硫化氢的酶以及其他抗菌物质如过氧化氢，起到杀菌作用，从而减少动物体内有害物质的产生。研究表明一些芽孢杆菌产生SOD酶，SOD可以清除生物体内活性氧自由基，减少其对细胞的毒害作用，使生物体免受伤害。芽孢杆菌在 生长繁殖过程中可以产生挥发性脂肪酸，如乙酸、丙酸、丁酸等，一些脂肪酸可降低动物肠道的pH，从而为乳酸菌的 生长创造条件，并且抑制病菌的生长。其中丙酸还可以参与三梭酸循环，为动物的新陈代谢提供能量。同时，能够产生
Open Journal of Nature Science 自然科学, 2018, 6(1), 63-70 Published Online January 2018 in Hans. https://www.doczj.com/doc/2a12347722.html,/journal/ojns https://https://www.doczj.com/doc/2a12347722.html,/10.12677/ojns.2018.61010 Safety Evaluation of Bacillus thuringiensis to Environmental Organisms Zeqing Wang1,2, Fanmin Huang1,3, Jianhua Chen1,3 1Guangdong Engineering Research Center of Microbe Pesticides, Yangjiang Guangdong 2Guangzhou Harit Bioscience CO. LTD, Guangzhou Guangdong 3Guangdong New Scene Biological Engineering CO. Ltd., Yangjiang Guangdong Received: Jan. 1st, 2018; accepted: Jan. 12th, 2018; published: Jan. 19th, 2018 Abstract This study evaluates the safety of Bacillus thuringiensis GDX026 to environmental organisms based on degrees of toxicity and division standards. The results showed that the toxic degree of Bacillus thuringiensis8000 IU/μL SC to birds, bees, zebrafish, Daphnia, Trichogramma and silk-worm was Ib. The toxic degrees of Bacillus thuringiensis·Indoxacarb 5% SC to bees, silkworm and Daphnia magna was I b, to zebrafish and Trichogramma was II and low toxicity to birds. The toxic degrees of Emamectinbenzoate·Bacillus thuringiensis2.4% SC of silkworm and Daphnia magna was Ia, Ib to bees and zebrafish, II to Trichogramma and no risk to birds. Mixture of Bacillus thu-ringiesis GDX026 and chemical pesticides showed higher risk levels to environmental organisms compared with Bacillus thuringiesis GDX026. Keywords Bacillus thuringiensis, Environmental Organisms, Safety Evaluation 苏云金杆菌对环境生物的安全性 评价 王泽清1,2，黄番敏1,3，陈建华1,3 1广东省微生物农药工程技术研究中心，广东阳江 2广州禾立田生物科技有限公司，广东广州 3广东新景象生物工程有限公司，广东阳江 收稿日期：2018年1月1日；录用日期：2018年1月12日；发布日期：2018年1月19日