２期
周惠萍，等：农杆菌介导的稻瘟病菌致病突变菌株的筛选
１６３
１．４．３
Ｔ—ＤＮＡ插入验证
１）稻瘟病菌基因组ＤＮＡ的提取参照Ｈｅ瞄】
的ＣＴＡＢ／ＮａＣＩ法收集菌丝，提取ＤＮＡ。
２）ＰＣＲ扩增根据转化双元件载体ｐＢＩＧ２ＲＨ．ＰＨ２插入的Ｔ—ＤＮＡ片段上的潮霉素磷酸转移酶（刎ｗ）基凶编码区（约ｌ４００ｂｐ）设计ｌ对特异引
物：ＨＰＨｆ：５’一ＡＣＧＩｑ＇ＡＡＣＴＧＡＴＡＴＴＧＡＡＧＧＡＧ—
ＣＡＴ－３’：ＨＰＨｒ：５’一ＡＣＧＴｒＡＡＣＴＧＧＴｒＣＣＣＧ—ＧＴＣ－３，【１６
Ｊ，对所得的致病突变体和野生型菌株基
因组进行ＰＣＲ扩增。反应体系为：ＤＮＡ
２０—３０
ｎｇ，１０
Ｘ
ＴａｑＢｕｆｆｅｒ２ＩｘＬ，２．５
ｍＭｄＮＴＰＭｉｘ２
止，１０
ｕＭ
ＨＰＨｆ
ｌ止，１０ｕＭＨＰＨｒｌ弘Ｌ，Ｔａｑ酶１
ｕ，ｄｄＨ２０
１０．８此。反应程序为：９４０Ｃ
４
ｍｉｎ；
９４℃４０Ｓ，６００Ｃ４０ｓ，７２０Ｃ２ｍｉｎ，３０个循环；７２℃
延伸１０
ｍｉｎ。
１．５统计方法
突变体致病百分率（％）＝（在某一单基因系
上产生病斑的突变体数／接种的总菌株数）Ｘ１００
２结果与分析
２．１
稻瘟病菌Ｔ—ＤＮＡ插入转化子的筛选试验采用２８℃共培养４ｄ，然后将滤纸片剪成
０．５
ｃｍ宽的长条，间距０．５ｃｍ左右，翻转放在筛
选培养基上，２８℃培养２ｄ后，转化子沿着滤纸剪
条的两侧生长开来，挑取单菌落保存备用（图１），
共得到５０００多个转化子。随机抽取２００个转化子在含有潮霉素（ｆｉｎ：２００斗ｇ／ｍＬ）的培养基上培
养，结果表明，这些转化子均能生长，转化效率为每ｌ×１００个分生孢子可获得８００一ｌ０００个左右抗潮霉素的转化子。
２．２致病突变体
转化子接种供试品种后，只有少数品系零星发
病，在供试的３６个抗病基因近等基因系中，经过不同批次接种和单孢分离，仅在４个抗病基因系中获得了３０个突变体（表１）。其中在含Ｐｉ—ｔａ２的Ｆ１２８一ｌ上获得了１４个突变体（菌株代号：Ｆ１２８—１—
１、Ｆ１２８—１－２、Ｆ１２８—１－３、Ｆ１２８一ｌ－４、Ｆ１２８一ｌ－５、Ｆ１２８一ｌ一６、Ｆ１２８－ｌ一７、Ｆ１２８－１４３、Ｆ１２８?１－９、Ｆ１２８—１—１０、Ｆ１２８—１—
１ｌ、Ｆ１２８—１—１２、Ｆ１２８—１—１３和Ｆ１２８一ｌ—１４）；在含Ｐｉ一口
的ＩＲＢＬ－２上获得了７个突变体（菌株代号：ＩＲＢＬ－
２－１，ＩＲＢＬ－２－２，ＩＲＢＬ－２－３
７
ＩＲＢＬ－２－４、ＩＲＢＬ－２－５，
ＩＲＢＬ－２－６和ＩＲＢＬ－２－７）；在不含抗性基因的ＬＴＨ上
获得了７个突变体（菌株代号：ＬＴＨ—ｌ、ＬＴＨ－２、
ＬＴＨ－３、ＬＴＨ－４、ＬＴＨ－５、ＬＴＨ－６和ＬＴＨ一７）；在含
Ｐｉｋ．Ｊ的ＩＲＢＬ４上得到了２个突变体（菌株代号：ＩＲＢＬ４．１和ＩＲＢＬ４－２），Ｔｉ质粒似乎有插入热点。
２．３致病突变体的初步验证
２．３．１潮霉素抗性验证将从发病的病斑上分离到的单孢菌株培养于含有潮霉素（ｆｉｎ：２００斗ｇ／
ｍＬ）的培养基上培养，３０个单孢菌株均能生长，而
野生型菌株不能生长，表明这些单孢菌株不是来自
环境污染，而是来自Ｔ—ＤＮＡ插入的结果（图２）。
Ｆｉｇ．２
Ｃｏｌｏｎｉｅｓｏｆｔｈｅｍｕｔａｎｔｉｓｏｌａｔｅｓ
ｏｎ
ＰＤＡｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎＢ
Ｔｈｅ
ｓｍａｌｌｅｓｔｃｏｌｏｎｙｉｓｗｉｌｄｔｙｐｅｓＷｍｎＣＹ２．ｔｈｅｏｔｌＫ猖ａｒｃ
ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ
ｍｕｍｎｔｓ．
２．３．２突变体的分子证据用Ｔ—ＤＮＡ特异性引
Ｆｉｇ．１
Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓｏｎ
ｔｈｅ
ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ
物ＰＣＲ扩增突变体和野生型菌株ＣＹ２，突变体菌ｍｅｄｉｕｍ
株在琼脂糖凝胶上均能检测到ｌ条１
４００
ｂｐ的条
１６４
植物病理学报
３９卷
带，而野生型菌株ＣＹ２却没有，证明突变体确系来自ＣＹ２，且可能均与Ｔ—ＤＮＡ插入有关（图３）。２。３．３致病突变体对琴弼采源的抗病基因产生痛斑的能力３０个突变体均能使对应品系产生大量不同类型的病斑，而且接种４ｄ后病斑就大量出
现，严重的５ｄ后就会露致檀株瑟亡。致病突变体
在Ｆ１４５－２（Ｐｉ－ｂ）、Ｃ１０１ＬＡＣ（聊一，（ｔ））、ＩＲＢＬ－６（Ｐｉｋ－ｐ）、ＩＲＢＬ一７（Ｐｉｋ—ｈ）、ＩＲＢＬ－８（Ｐｉｋ．ｍ）、ＩＲＢＬ一２ｌ（夕￡一７（｝））、ＩＲＢＬ－２２（终≯（￡））秘ＩＲＢＬ－２３（残一Ｊｆ２（￡））等８个品系上不产生病斑；在ＦＳ０－ｌ（辫－良）、Ｆ９８—７（Ｐｉ—ｋ“）、Ｆ１２４—１（Ｐ／－ｔａ）和ＩＲＢＬ．１８（Ｐｆ—Ｊ）等４个品系上产生病斑的菌株蠢总突变体数豹３．３３％；在ＩＲＢＬ－２０（Ｐｉ－５（ｆ））上产生病斑的菌株数为６。６７％；在Ｆ１２９（肼一酽）上产生病斑的菌株数
鸯ｌ◇．∞％；在Ｃ０３９（Ｐｉ—ａ）、Ｃ１０１Ａ５１（残－２（≠））、
Ｃ１０１ＰＫＴ（聊√（ａ）（ｆ））、Ｃ１０４Ｐｌ（Ｔ（Ｐｆ？（ｆ））、ＩＲ—ＢＬｏ（Ｐｉｉ）、ＩＲＢＬ－９（Ｐ既）、ＩＲＢＬ—ｌｌ（Ｐｉｚ—ｔ）、ＩＲＢＬ一１２（Ｐｉ—ｔａ）、ＩＲＢＬ一１３（残一缘）、ＩＲＢＬ一１４《Ｐ／一ｂ）穰ＩＲ－ＢＬ一１９（Ｐｉ－３）等１１个近等基因系上产生病斑的菌株数为１６。６７％一５０．ｏｏ％；在ＩＲＢＬ－５（尸ｉｋ—ｓ）、ＩＲ－ＢＬ—１０（Ｐｉｚ－５）秘ＩＲＢＬ－２（残一矗）上产生病斑的菌株数分别为６３．３３％、７３．３３％和８０．００％；ＩＲＢＬ．１（Ｐｉ～口）和ＩＲＢＬ－２４（Ｐｉ一１９（ｆ））上产生病斑的菌株数连为８３．３３％；ＩＲＢＬ一１５（残一ｆ）、ＩＲＢＬ一１６（籍．藤）和ＩＲＢＬ一１７（脚一幽）上产生病斑的菌株数均为８６。６７％；能使ＬＴＨ和Ｆ１２８一ｌ（Ｐｉ—ｔａ２）产生病斑的菌株数达９３．３３％；能便ＩＲＢＬ－４（Ｐｉｋ—ｓ）产生病斑的菌株数最多，达到９６．６７％。这些结果表明，同
一个基因系上致病突变体数多于分离到的菌株数，
有些突变体除侵入来源基因系外，还侵染其它基网
系，致病范匿拓宽了，如图．瑶所示，分离于基因系Ｆ１２８一ｌ的菌株Ｆ１２８—１－９回接后除能侵染Ｆ１２８?ｌ外，还能侵染ＬＴＨ、ＩＲＢＬ４、ＩＲＢＬｌ５和ＩＲＢＬｌ６，这可能与ＣＹ２菡株鲢致病突变除Ｔ?ＤＮＡ捶入弓｜起外，还可能有自发突变或Ｔ—ＤＮＡ插入弓Ｉ起基因组的结构改变，从而导致致病性的改变有关。这种现
象的真委原因正奄研究分析之中。
３讨论
本研究秘角薹个致病熊力菲常弱的稻瘟病菌
菌株和农杆菌介导Ｔ．ＤＮＡ方法，已成功地获得了
５
０００多个转化子，经过试验条件的摸索和改进，转纯效率迭蓟每王×１０６个分生孢子可获缮８００一
１
０００个左右抗潮霉素的转化子，与Ｒｈｏ等¨４ｏ报道
的基本棚似，优于“等［１副和Ｈｅ等Ⅲｏ报道的转化效率，这可麓与不圈菌株闻的转化效率有关；１：２多
个转化子混合接种含２０多个不同抗病基因的近等
基因系和累加系，从而大大提高了筛选效率，仅在
半年的时闯内就获褥了３０个致病突变体。程默突
变体的构成来看，Ｔ—ＤＮＡ插入似乎有插入热点，如从丽江新团黑谷（ＬＴＨ）上获得了７个突变体，从Ｆ１２８一ｌ上获褥了ｌ碡个突变体，丽从含肖抗病基因Ｐｆ．，的品系Ｃ１０１ＬＡＣ和ＩＲＢＬ一１８等品系上则未
发现任何突变体，但究竟是何种机制导致突变体在分布上的差异还有待进一步研究。尽管已获褥了
３０个突变体，但由于稻瘟病谶易于发生突变，其自
Ｆｉｇ。３
ＰＣＲ—ａｍｐｌｉｆｉｅｄＴ—ＤＮＡｉｎｓｅｒｔｆｒａｇｍｅｎｔｓｗｉｔｈｔｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃ
ｐｒｉｍｅｒｓ
２期周惠萍，等：农杆菌介导的稻瘟病菌致病突变菌株的筛选１６５
Ｆｉｇ．４ＩｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｒｅｓｕＩｔｏｆｍｕｔａｎｔＦ１２８－１－９ｏｎＬＴＨ，Ｆ１２８－１，ＩＲＢＬ４，ＩＲＢＬｌ５，ＩＲＢＬｌ６
Ｌｅｆｔ：ＭｕｔａｎｔＦ１２８－１－９；Ｒｉｇｈｔ：ＣＹ２ａｓｃｏｎｔｒ０１．
发突变频率可高达十万分之一【２引。故这些致病突变体发生的原因可能不是全都来自插入的结果，而其中可能有部分来自致病相关基因自发突变。根据转化野生菌株所用的双元载体ｐＢＩＧ２ＲＨＰＨ２插入的Ｔ—ＤＮＡ片段上的潮霉素磷酸转移酶（Ｈ附）基因编码区设计特异引物对３０个突变体扩增的结果初步证明突变体均来自于野生型菌株ＣＹ２，由于这些致病性不同的菌株均来自同一个亲本菌株，属于近等菌系，故它们将会在水稻抗稻瘟病基因分析上起到积极作用。
长期以来，丽江新团黑谷（ＬＴＨ）一直被认为没有抗病基因。但本研究所用的菌株ＣＹ２却不能侵染该品种，而经过插入突变获得的突变体则能成功地使其发病，表明这一品种也存在抗病基因，只是该基因对众多的稻瘟病菌已失去了抵抗能力。然而，因还没有发现１个品种对ＣＹ２感病，故很难开展杂交遗传分析，证实丽江新团黑谷所携带的抗稻瘟病基因。
笔者对野生型菌株ＣＹ２进行接种洋葱皮观察侵染过程和接种供试品系测定致病性，发现该菌株对所有参测品系，包括ＬＴＨ均不产生病斑，产生附着胞和侵染菌丝的能力极低。所得的致病突变体回接供试品种后与用常规的稻瘟病菌相比较病程缩短，常常接种后４ｄ左右就产生大量病斑，而且病斑密集，连接成片，严重的５ｄ左右就能使植株死亡。应用３套不同遗传背景，不同育种机构育成的含２５个不同来源的抗病基因的３６个近等基因系进行致病性测定的结果表明，同一个抗性基因由于供体亲本不同，３０个突变体对其产生病斑的菌株百分率不同，如：携相同抗病基因爿．胁的品系，３０个致病突变体对来源于菲律宾籼稻品种Ｔａｄｕ—ｋａｎ的ＩＲＢＬ．１２和越南籼稻品种Ｔｅｔｅｐ的ＩＲＢＬ一１３上产生病斑突变体的百分率分别为５０．００％和４６．６７％；同为抗病基因Ｐ／ｋ—Ｓ的来源于日本粳稻藤坂５号的ＩＲＢＬ－４和新２号的ＩＲＢＬ－５的品系，产生病斑突变体分别占９６．６７％和６３．３３％；对于来源于印尼籼稻Ｔｉｊａｈａｊａ的抗病基因Ｐｉ—ｂ，由于育种机构不同，在ＩＲＲＩ与日本合作育成的单基因系瓜一ＢＬ一１４上形成病斑的突变体达４０．００％，而在中国农业科学院育成的Ｆ１４５－２上则不能形成任何病斑。这可能与这些近等基因系在选育过程中，除目标抗病基因被转入的同时，也可能有其它抗病基因被转入，只是用于接种鉴定的菌株不能鉴别的缘故，也可能由于抗病基因成簇的特点，在目标抗病基因转入的同时，遗传累赘片段也起抗病作用，因
此常被认为携带相同抗病基因的近等基因系对突
农杆菌介导的稻瘟病菌致病突变菌株的筛选
作者：周惠萍， 吴毅歆， 辻元人， 久保康之， 何月秋， ZHOU Hui-ping， WU Yi-xin，
Gento TSUJI， Yasuyuki KUBO， HE Yue-qiu
作者单位：周惠萍,吴毅歆,何月秋,ZHOU Hui-ping,WU Yi-xin,HE Yue-qiu(云南农业大学教育部生物多样性与病虫害控制重点实验室,昆明,650201)， 辻元人,久保康之,Gento TSUJI,Yasuyuki
KUBO(日本京都府立大学农学部植物病理实验室,京都,606-8522)
刊名：
植物病理学报
英文刊名：ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA
年，卷(期)：2009，39(2)
被引用次数：0次
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相似文献(2条)
1.学位论文李桂华T-DNA在稻瘟病菌基因组中的整合模式分析及MoUROD基因在致病中的功能研究2008
稻瘟病是最严重的水稻病害，其病原菌稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)的全基因组序列测定已经完成，比较基因组学及功能基因组学研究虽然尚处于起步阶段，但已经增进了对稻瘟病菌与水稻互作分子机制的认识。在所有克隆致病相关基因的方法中，构建致病缺陷突变体无疑是最具潜力的策略
，在植物中，农杆菌介导的遗传转化( ATMT)就是其中很有效的方法。近年来，ATMT转化方法也成功地在稻瘟病菌等多种丝状真菌的研究中建立起来。
在本研究中，作者用ATMT法建立起一个高效的稻瘟病菌转化体系，该体系从106个分生孢子可以得到300多个转化子。利用该转化体系，作者创建了一个T-DNA插入群体，共包括6179个稻瘟病菌转化子。通过致病力测定及其它性状观察，作者从中筛选到30多个具有明显表型的突变体，如致病力下降，产孢能力丧失或孢子畸形等。基于上述研究材料，本论文主要开展以下两方面的研究：1) T-DNA在稻瘟病菌基因组中的整合模式分析；2)尿卟啉原脱羧酶编码基因Mo UROD在稻瘟病菌致病过程中的功能研究。
T-DNA在植物及酵母中的整合模式已经得到广泛研究，而在本研究开始时T-DNA在丝状真菌中的整合模式尚未有详细的研究报道。为了了解T-DNA在稻瘟病菌基因组中的整合模式，作者从上述T-DNA插入群体中随机选取转化子，通过热不对称交互PCR获取T-DNA整合部位的侧翼序列，共计得到623条有边界侧翼序列，124条左边界侧翼序列。序列分析表明T-DNA的整合并非完全随机，T-DNA在非编码区的整合存在偏好性；T-DNA整合进基因组后多保留有完整的右边界，而左边界则经常发生不同程度的缺失；作者发现在少数转化子中，T-DNA整合可以引发大片段染色体重组，如缺失，倒位，易位等。数据表明，与T-DNA在植物(如拟南芥、水稻)基因组的整合模式相比较，T-DNA在稻瘟病菌基因组中的整合模式更精确、简单。
血红素(heme，iron pfotoporphyrin IX)作为一类重要的蛋白辅基，参与生物体的多种生理过程，其生物合成途径在各种生物体中是高度保守的。在本研究中，我们从上述T-DNA插入群体中筛选到一个致病缺陷突变体，分子及遗传分析表明，T-DNA整合进了尿卟啉原脱羧酶编码基因MoUROD的启动子区
，该酶参与催化血红素合成的第五步反应。在该突变体中，MoUROD的转录水平受到显著抑制，尽管仍然具有侵入寄主细胞的能力，但该T-DNA插入突变体产生的病斑很小，进一步扩展受到显著抑制。带有自身启动子的MoUROD基因可以完全恢复突变体的致病力。显微观察证实，突变体的侵染菌丝被限制在了侵染位点附近。DAB染色及细胞学观察发现，该突变体的侵染菌丝不能有效清除寄主植物作为防御反应产生的活性氧，这可能是侵染菌丝扩展受抑制的主要原因。数据表明，除了满足生命的基本需求外，血红素合成途径还参与了稻瘟病菌在水稻组织内的生长扩展，并发挥重要作用。
2.学位论文贺春萍稻瘟菌T-DNA插入的突变表型分析和插入位点定位2005
本研究利用农杆菌介导的遗传转化体系构建稻瘟菌的T-DNA插入突变体库，使突变体数增加到6855个，每转化1.0×106个分生孢子可得到约300个T-DNA插入突变体。抽取最早构建的1600个突变体分别接种在感瘟病水稻品种日本晴和抗瘟病品种C101(对照)上，以测定其致病力的变化，同时对其形态学进行观察分析。结果得到173个菌落形态、分生孢子产生能力或附着胞发育等不正常的突变体。这173个突变体中，有23个对日本晴的致病力从原来的正常下降到完全不能致病，26个致病力明显减弱。
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下载时间：2010年12月13日