第二章 分子克隆工具酶
DNA重组技术中对核酸的“精雕细刻”主要用酶作为工具。60年代末，70年代初科学家们陆续发现了DNA连接酶、T4DNA连接酶、Ⅱ型限制性核酸内切酶Hin fI和Eco RI、反转录酶等，才使他们能对DNA分子进行剪切、连接等基因操作，故称这些酶为工具酶。到目前为止，世界上发现的工具酶种类和数量繁多，现将重组DNA分子技术中常的工具酶简介如下。限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）在重组DNA技术中有重要地位，在此较详细介绍。
第一节 限制性核酸内切酶
核酸酶可分为两类：核酸外切酶（exonuclease）是从核酸的一端开始，一个接一个把核苷酸水解下来；核酸内切酶(endonuclease)则从核酸链中间水解3’，5’磷酸二酯键，将核酸链切断。很多细菌和细胞中都能识别外来的核酸并将其分解，1962年发现这是因为细菌中含有特异的核酸内切酶，能识别特定的核酸序列而将核酸切断;同时又伴随有特定的核酸修饰酶，最常见的是甲基化酶，能使细胞自身核酸特定的序列上碱基甲基化，从而避免受内切酶水解，外来核酸没有这种特异的甲基化修饰，就会被细胞的核酸酶所水解.这样细胞就构成了限制一修饰体系，其功能就是保护自身的DNA，分解外来的DNA，以保护和维持自身遗传信息的稳定，这对细菌的生存和繁衍具有重要意义。这就是限制性核酸内切酶名称中“限制”二字概念的由来。
1.1 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)
1.1.1 限制性核酸内切酶的概念
是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸水解酶。它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。到目前为止，已经分离出可识别230种不同DNA序列的Ⅱ型限制性核酸内切酶达2300种以上。在限制性核酸内切酶作用下，侵入细菌的“外源”DNA分子便会被切割成不同大小的片段，而细菌自己固有的DNA碱基甲基化，在此修饰酶的保护下，则可免受限制性核酸内切酶的降解。由于限制性核酸内切酶的发现与应用而导致体外重组DNA技术的发展，使人们有可能对真核染色体的结构、组织、表达及进化等问题进行深入的研究。因此，有人赞叹限制性核酸内切酶是大自然赐给基因工程
学家的一件了不起的礼物。
1.1.2 限制性核酸内切酶的命名原则
1973年H.O.Smith和D.Nathams首次提出命名原则，1980年Roberts在此基础上进行了系统分类。总规则是以限制性核酸内切酶来源的微生物学名进行命名，其命名原则如下。
①限制性核酸内切酶第一个字母（大写，斜体）代表该酶的微生物（宿主菌）属名(genus)；第二、三个字母（小写，斜体）代表微生物种名(species)。
②第四个字母代表寄主菌的株或型(strain)。
③如果从一种菌株中发现了几种限制性核酸内切酶，即根据发现和分离的先后顺序用罗马字母表示。如大肠杆菌(Escherichia coli)R株中分离到几种限制性核酸内切酶，分别表示为Eco RI、Eco RⅡ和Eco RⅤ等。Eco RI读作Eco R one，Eco RⅡ读作Eco R two，以此类推。
1.1.3 限制性核酸内切酶的分类
根据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。
Ⅰ型限制性核酸内切酶属于复合功能酶，由3种不同亚基构成，兼具有修饰酶活性和依赖于ATP的限制性内切酶活性，它能识别和结合于特定的DNA序列位点，去随机切断在识别位点以外的DNA序列，通常在识别位点周围400-700bp。这类酶的作用需要Mg2+、ATP和S-腺苷酰甲硫氨酸作为催化的辅助因子，在DNA降解时伴随有ATP的水解，即具有核酸内切酶、甲基化酶、ATP酶和DNA解旋酶四种活性；在DNA链上的识别和切割位点不一致，没有固定的切割位点，一般在识别位点外的1kb至几个kb处随机切割，不产生特异片段。
Ⅲ型限制性核酸内切酶与Ⅰ类酶相似，是多亚蛋白质，既有内切酶活性，又有修饰酶活性，但在DNA链上有特异切割位点，切断位点在识别序列周围25-30bp范围内，酶促反应除Mg2+外，也需要ATP供给能量。Ⅰ、Ⅲ限制性核酸内切酶对重组DNA技术无重要价值。
Ⅱ限制性核酸内切酶只由一条肽链构成，Ⅱ限制性核酸内切酶限制修饰系统（R-M系统）分别由核酸内切酶和甲基化酶两种不同的酶组成，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，它能识别和切割双链DNA的特异顺序，产生特异的DNA片段，切割DNA特异性最强，且就在识别位点范围内切断DNA，是分子生物学中应用最广的限制性内切酶。通常在重组DNA技术提到的限制性核酸内切酶主要指Ⅱ类酶而言。
1.1.4 Ⅱ限制性核酸内切酶的功能
第1个Ⅱ限制性核酸内切酶Hin dII由H.O.Smith和K.W.Wilcox于1970发现的。Ⅱ限制性核酸内切酶有严格的识别、切割顺序，它以核酸内切方式水解DNA链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5`端为P，3`端为OH，识别序列一般为4～6个碱基对，通常是反转录重复顺序，具有180°的旋转对称性即迴文结构。大部分限制性核酸内切酶识别DNA序列具有回文结构特征，切断的双链DNA都产生5’磷酸基和3’羟基末端。不同限制性核酸内切酶识别和切割的特异性不同，结果有三种不同的情况：
Ⅱ限制性核酸内切酶切割双链DNA产生3种不同的切口：
①在识别顺序的对称轴上，对双链DNA同时切割，产生平末端(blunt end)，例如Eco R Ⅴ识别的顺序是:
5`-GATATC-3`
3`-CTATAG-5`
它的切点在T和A之间，在对称轴上将DNA从T与A之间切开：
↓
5`-GAT ATC-3` Eco RⅤ 5`-GAT + pATC-3`
3`-CTA TAG-5` 3`-CTAp TAG-5`
↑
②在识别顺序的双侧末端切割DNA双链，于对称轴的5`末端切割，产生5`端突出的粘性末端(cohesive end or sticky end)。例如Bam HI识别的顺序是：
5`-GGATCC-3`
3`-CCTAGG-5`
它的切点在G和G之间，其切口情况是：
↓
5`-G GATCC-3` Bam HI 5`-G + pGATCC-3`
3`-CCTAG G-5` 3`-CCTAGp G-5`
↑
③在识别顺序的双侧末端切割DNA双链，于对称轴的3`末端切割，产生3`端突出的粘性末端。例如Sac I识别的顺序是：
5`-GAGCTC-3`
3`-CTCGAG-5`
它的切点在T和C之间，其切口情况是：
↓
5`-GAGCT C-3` Sac I 5`-GAGCT + pC-3`
3`-C TCGAG-5` 3`-Cp TCGAG-5`
↑
不同有限制性核酸内切酶识别的DNA序列可以不相同。有的识别四核苷酸序列，有的识别六或八核苷酸序列。如果DNA中的核苷酸序列是随机排列的，则一个识别四核苷酸序列的
内切酶平均每隔256bp出现一次该酶的识别切割位点，同样的对识别六或八核苷酸序列的内切酶则大致上分别是每隔4kb或65kb出现一次识别切割位点。按此可大致估计一个未知的DNA分子限制性内切酶可能具有切点频率，以便选用合适的内切酶。
种最常用的限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶名称识别序列和切割点
BamHⅠCla ⅠEooR ⅠHind ⅢHindⅡKpnⅠNot ⅠPst ⅠSal ⅠSau3A ⅠSfi ⅠSma ⅠXba ⅠXho ⅠG↓GATCC
AT↓CGAT
G↓AATTC
A↓AGCTT
GTPy↓PuAC GGTAC↓C
GC↓GGCCGC CTGCA↓G
G↓TCGAC
↓GATC GGCCNNNN↓NGGCC CCC↓GGG
T↓CTAGA
C↓TCGAG
1.1.5 同裂酶与同尾酶
同裂酶(isoschizomers):有一些来源不同的限制性核酸内切酶识别的是同样的核苷酸靶序列，这类酶称为同裂酶。Sma I和Xma I(CCCGGG)。
同尾酶(isocaudamer):有一些来源不同的限制性核酸内切酶识别的靶序列也各不相同，但都产生相同的粘性末端，这类酶称为同尾酶。Bam HI(GGATCC))和BglⅡ(AGATCT)。
1.1.6 Ⅱ限制性核酸内切酶的主要用途
①DNA重组克隆及亚克隆
②DNA杂交与序列分析
③改建质粒
④构建基因组DNA物理图谱和文库
1.1.7 影响Ⅱ型限制性核酸内切酶活性的因素
(1)DNA的纯度
限制性核酸内切酶消化DNA底物的反应效率在很大程度上是取决于所使用的DNA本身的
纯度。DNA制剂中的其他杂质，如蛋白质、酚、氯仿、酒精、乙二胺四乙酸(EDTA)、十二烷基硫酸钠(SDS)以及高浓度的盐离子等，都有可能抑制限制性核酸内切酶的活性。应用微量碱抽提法制备的DNA制剂，常常都含有这类杂质。为了提高限制性核酸内切酶对低纯度DNA 制剂的反应效率，一般采用以下3种方法:
①增加限制性核酸内切酶的用量，平均每微克底物DNA可高达10单位甚至更多些。
②扩大酶催化反应的体积，以使潜在的抑制因素被相应地稀释。
③延长酶催化反应的保温时间。
在有些DNA制剂中，尤其是用碱抽提法制备的DNA制剂，会含有少量的DNase的污染。由于DNase的活性需要Mg2+的存在，而在DNA的储存缓冲液中含有二价金属离子整合剂EDTA，因此在这种制剂中的DNA仍是稳定的。然而在加入了限制性核酸内切酶缓冲液之后，DNA则会被DNase迅速地降解。要避免发生这种状况，唯一的办法就是使用高纯度的DNA。
在反应混合物中加入适量的聚阳离子亚精胺(polycation spemidine)(一般终浓度为1～2.5mmol/L)，有利于限制性核酸内切酶对DNA的消化作用。但鉴于在4℃下亚精胺会促使DNA沉淀，所以务必在反应混合物于适当的温度下保温数分钟之后方可加入。
(2)DNA的甲基化程度
限制性核酸内切酶是原核生物限制-修饰体系的组成部分，因此识别序列中特定核苷酸的甲基化作用便会强烈地影响酶的活性。通常从大肠杆菌寄主细胞中分离出来的质粒DNA，都混有两种作用于特定核苷酸序列的甲基化酶，一种是dam甲基化酶，催化GATC序列中的腺嘌呤残基甲基化；另一种是dcm甲基化酶，催忧CCA/TGG序列中内部的胞嘧啶残基甲基化。因此，从正常的大肠杆菌菌株中分离出来的质粒DNA，只能被限制性核酸内切酶局部消化，甚至完全不被消化，是属于对甲基化作用敏感的一类。为了避免产生这样的问题，在基因工程操作中通常使用丧失了甲基化酶的大肠杆菌菌株制备质粒DNA。
哺乳动物的DNA有时也会带有5-甲基胞嘧啶残基，而且通常是在鸟嘌呤核苷残基的5'侧。因此不同位点之间的甲基化程度是互不相同的，且与DNA来源的细胞类型有密切的关系。可以根据各种同裂酶所具有的不同的甲基化的敏感性对真核基因组DNA的甲基化作用模式进行研究。例如，当CCGG序列中内部胞嘧啶残基被甲基化之后，MspI仍会将它切割，而HpaII(正常情况下能切割CCGG序列)对此类的甲基化作用则十分敏感。
限制性核酸内切酶不能够切割甲基化的核苷酸序列，这种特性在有些情况下具有特殊的用途。例如，当甲基化酶的识别序列同某些限制酶的识别序列相邻时，就会抑制限制酶在这些位点发生切割作用，这样便改变了限制酶识别序列的特异性。另一方面，若要使用合成
的衔接物修饰DNA片段的末端，一个重要的处理是必须在被酶切之前，通过甲基化作用将内部的限制酶识别位点保护起来。
(3)酶切反应的温度
DNA消化反应的温度是影响限制性核酸内切酶活性的另一重要因素。不同的限制性核酸内切酶具有不同的最适反应温度，而且彼此之间有相当大的变动范围。大多数限制性核酸内切酶的标准反应温度是37℃，但也有许多例外的情况，它们要求37℃以外的其他反应温度。还有些限制性核酸内切酶的标准反应温度低于标准的37℃，例如SmaI是25℃，ApaI 是30℃。消化反应的温度低于或高于最适温度都会影响限制性核酸内切酶的活性，甚至导致酶的完全失活。
(4)DNA的分子结构
DNA分子的不同构型对限制性核酸内切酶的活性也有很大的影响。某些限制性核酸内切酶切割超螺旋的质粒DNA所需要的酶量要比消化线性的DNA高出许多倍，最高的可达20倍。此外，还有一些限制性核酸内切酶切割位于DNA不同部位的限制位点，其效率亦有明显的差异。据推测，这很可能是由于侧翼序列的核苷酸成分的差别造成的。大体说来，一种限制性核酸内切酶对其不同识别位点的切割速率的差异最多不会相差10倍。尽管这样的范围在通常的标准下是无关紧要的，然而当涉及到局部酶切消化时，则是必须考虑的重要参数。DNA 分子中某些特定的限制位点，只有当其他的限制位点也同时被广泛切割的条件下，才能被有关的限制性核酸内切酶所消化。少数的一些限制性核酸内切酶，如NarI，NaeI，SacII以及XmaIII等，对不同部位的限制位点的切割活性会有很大的差异，其中有些位点是很难被切割的。
(5)限制性核酸内切酶的缓冲液
限制性核酸内切酶的标准缓冲液的组分包括氯化镁、氯化钠或氯化钾、Tris-HCl、β-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白(BSA)等。酶活性的正常发挥，是绝对地需要2价阳离子，通常是Mg2+。不正确的NaCl或Mg2+浓度，不仅会降低限制酶的活性，而且还可能导致识别序列特异性的改变。缓冲液Tris-HCl的作用在于，使反应混合物的pH值恒定在酶活性所要求的最佳数值的范围之内。对绝大多数限制酶来说，在pH=7.4的条件下，其功能最佳。巯基试剂对于保护某些限制性核酸内切酶的稳定性是有用的，而且还可保护其免于失活。但它同样也可能有利于潜在污染杂质的稳定性。有一部分限制性核酸内切酶对于钠离子或钾离子浓度变化反应十分敏感，而另一部分限制性核酸内切酶则可适应较大的离子强度的变化幅度。
在“非最适的”反应条件下(包括高浓度的限制性核酸内切酶、高浓度的甘油、低离子强度、用Mn2+取代Mg2+以及高pH值等等)，有些限制性核酸内切酶识别序列的特异性会发生改变，导致从识别序列以外的其他位点切割DNA分子。有的限制性核酸内切酶在缓冲液成分的影响下会产生所谓的星号活性。由于前面有关内容对此已有涉及，这里不再赘述。
1.1.8 Ⅱ限制性核酸内切酶对DNA的消化作用
(1)限制性核酸内切酶与靶DNA识别序列的结合模式
J.A.McClarin等人应用X射线晶体学技术对限制酶-DNA复合物的分子结构的研究表明，II型酶是以同型二聚体形式与靶DNA序列发生作用的。在这种研究的基础上，目前已弄清了许多限制性核酸内切酶同其识别序列之间相互作用的精巧的分子细节。以EcoRI为例，它是以同型二聚体上的6个氨基酸(其中每个亚基各占1个Glu残基和2个Arg残基)同识别序列上的嘌呤残基之间形成12个氢键的形式结合到靶DNA识别序列上，并从此发生链的切割反应。
(2)限制性核酸内切酶对DNA分子的局部消化
从理论上讲，如果一条DNA分子上的4种核苷酸的含量是相等的，而且其排列顺序也完全是随机的，那么识别序列为6个核苷酸碱基的限制性核酸内切酶(如BamHl)将平均每隔46=4096bp切割一次DNA分子；而识别序列为4个核苷酸的限制性核酸内切酶(如Sau3AI)将平均每隔44二256bp切割一次DNA分子。如果一种限制性核酸内切酶对DNA分子的切割反应达到了这样的片段化水平，称之为完全的酶切消化作用(complete digestion)。
然而，由于DNA上的4种核背苷酸碱基的组成并不是等量的，而且其顺序排列也不是随机的，因此实际上限制性核酸内切酶对DNA分子的消化作用的频率要低于完全消化的频率。例如，λ噬菌体DNA的相对分子质量约为49kb，按理对识别序列为6个核苷酸碱基的限制性核酸内切酶应具有12个切割位点，可事实上BglII且只有6个切割位点，BamHI有5个切割位点，SalI有2个切割位点，其GC含量也小于50%。
根据上述分析和实际经验，即便是限制性核酸内切酶对DNA的消化不十分完全，也可获得平均相对分子质量大小有所增加的限制片段产物。此类不完全的限制酶消化反应，通常叫作局部酶切消化(partial digestion)。在进行局部消化的反应条件下，任何DNA分子中都只有有限数量的一部分限制位点被限制酶所切割。在实验中，通过缩短酶切消化反应的保温时间，或降低反应的温度(如从37℃改为4℃)以约束酶的活性，都可以达到局部消化的目的。
(3)限制性核酸内切酶对真核基因组DNA的消化作用
一旦一种靶DNA分子被某种限制性核酸内切酶消化之后，如其相对分子质量比较小，研
究者就可能通过琼脂糖凝胶电泳或是高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)将目的基因片段分离出来，作进一步的克隆扩增和其他研究。但真核生物的基因组，特别是哺乳动物或高等植物的基因组，一般大小都可达1O9bp左右，经限制性核酸内切酶消化之后，常要产生出数量高达105～106种不同大小的DNA限制片段。因此，要应用琼脂糖凝胶电泳或HPLC分离其中某一特定DNA片段，实际上往往是行不通的，它需要通过建立相应的基因文库的办法才能达到分离的目的。
1.1.9 Ⅱ限制性核酸内切酶反应的终止
消化DNA样品后，常常需要在进一步处理DNA前钝化酶的活性。钝化大多数限制性核酸内切酶可以采用在65℃条件下温浴5min的办法。某些酶如BamHI和HaeIII受热不易钝化，必须采用其他手段。通常可在电泳前往样品中加终止反应物，其中含有一种钝化酶的变性剂，如SDS或尿素。虽然这类物质钝化限制性酶极为有效，但如果要将这类物质从DNA中去除，却极为困难。为了应用这类物质而又不至于影响下面的反应程序，可以用下述的方法重新提纯DNA:用等体积的酚-氯仿去除蛋白质，提取DNA。在DNA中残留的酚将会抑制进一步的酶促反应，必须去除。可将样品用乙醚处理，并经冷乙醇沉淀或在0.2mol/L NaCl存在的情况下，用异丙醇进行沉淀即可达到去除残余酚的目的。离心以后，DNA沉淀可用70%酒精洗一次，以去除残留的盐分，再将DNA干燥后重新悬浮在缓冲液中，这时样品中无蛋白质成分，容易接受下一步的酶处理。
1.1.10 Ⅱ限制性核酸内切酶操作的注意事项
①商品化的限制性核酸内切酶均为浓缩液，每次操作时应使用新的吸头去取酶，加入酶的体积应不超过总体积的10%，否则酶液中的甘油浓度超过5%时将会抑制酶的活性。
②整个操作应在0℃进行，即在冰浴中进行，而且是在加入其它试剂之后，最后加入酶。
③当切割大量DNA时，通常采用延长反应时间，减少酶的用量。
④当DNA需2种或以上酶切时，应用通用缓冲液，若没有通用缓冲液时，只有用1种酶切完后，纯化酶切产物，再进行下一个酶切反应。
1.1.11 Ⅱ限制性核酸内切酶的星活性
限制性核酸内切酶在非标准反应条件下，能切割一些与其特异识别顺序类似的序列，降低酶切反应的特异性，这种现象称为酶的星活性。
星活性产生的原因如下：
①反应体系中甘油的浓度大于5%。
②酶用量过大，大于100U/微克DNA。
③低离子强度，小于25mmol/L。
④高pH，大于8.0。
⑤含有机剂，如乙醇、二甲基亚砜、二甲基乙酰胺等。
⑥Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的二价离子的存在。
常发生星活性的内切酶有：Eco RI、Hin dⅢ、Kpn I、Pst I、Sal I、Hin fI等。
第二节 其他工具酶
1 DNA连接酶
DNA连接酶能催化双链DNA切口处的5′-磷酸根和3′-羟基生成磷酸二酯键。这种反应需要供给能量，大肠杆菌和其他细菌的DNA连接酶以NAD作为能量来源，动物细胞和噬菌体的连接酶则以ATP作为能量来源。
1.1 T4 DNA连接酶的作用机制：
①ATP+DNA ligase(E)→ E-AMP+PPi。
②E-AMP上的AMP转移到DNA的5′磷酸根上，使其活化，释放出酶。
③活化的5′磷酸根与相邻的3′羟基形成3′，5′－磷酸二酯键，并释放出AMP。
1.2 DNA连接酶的反应条件
Tris-HCl 50-100mmol/L pH7.5
MgCl2 10mmol/L
ATP 0.5-1mM
DTT 5mM
Volume 10-20uL
T T 4-15℃ 4-16hr
1UDNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15℃反应1小时，完全连接1ugλ-DNA（Hind III 片段）所需的酶量。
1.3 平头双链DNA片段的连接操作
从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连
接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢的多。
提高平头末端连接效率的方法包括：
加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）
加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会。
加入10%PEG8000，促进大分子之间的有效作用
加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200 mmol/L
2 DNA聚合酶
DNA聚合酶是指以脱氧核苷三磷酸作为底物催化合成DNA的一类酶。从不同生物包括细菌、植物、动物中都发现有这种酶，所有DNA聚合酶的作用方式基本相似。它们催化脱氧核苷三磷酸加到复制中的DNA链的3′羟基末端，合成方向从5′→3′，由模板决定加上何种脱氧核苷酸。DNA聚合酶催化所需要的条件是：四种脱氧核苷酸、镁离子、模板DNA和RNA 引物。
1957年，Arthur kornberg首次在大肠杆菌中发现DNA聚合酶Ⅰ，(DNA polymerase Ⅰ，简写DNA polⅠ)后来又相继发现了DNA聚合酶Ⅱ和DNA聚合酶Ⅲ。(DNA polymerase Ⅱ，Ⅲ，简写DNA polⅡ，DNA polⅢ)实验证明大肠杆菌中DNA复制的主要过程靠DNA polⅢ起作用，而DNA polⅠ和DNA polⅡ在DNA错配的校正和修复中起作用。这种酶的共同性质是：①需要DNA模板，因此这类酶又称为依赖DNA的DNA聚合酶(DNA dependent DNA polymerase，DDDP)。②需要RNA或DNA做为引物(primer)，即DNA聚合酶不能从头催化DNA的起始。③催化dNTP加到引物的3′桹H末端，因而DNA合成的方向是5′→3′。④三种DNA聚合酶都属于多功能酶，它们在DNA复制和修复过程的不同阶段发挥作用。由于DNA聚合酶Ⅰ是研究得最清楚而且代表了其他DNA聚合酶的基本特点，所以我们着重介绍DNA polⅠ的作用并指出另外二种DNA pol的特殊性：
1.DNA聚合酶Ⅰ：
DNA polⅠ是由一条多肽链组成，分子量为109KD。酶分子中含有一个Zn++，是聚合活性必须的。大肠杆菌每个细胞中约有400个酶分子，每个酶分子每分钟在37℃下能催化667个核苷酸参入到DNA链中，用枯草杆菌蛋白酶可将此酶水介成两个片段，大片段分子量为76KD，通常称为klenow片段，小片段为34KD。大小片段具有不同的酶活性。
(1)DNA聚合酶的5′→3′聚合活性：
这是DNA聚合酶最主要的活性，按模板DNA上的核苷酸顺序，将互补的dNTP逐个加到引物RNA3′桹H末端，并促进3′桹H与dNTP的5′桺O4形成磷酸二酯键，酶的专一性表
现为新进入的dNTP必须与模板DNA碱基配对时才有催化作用，5′→3′聚合活性存在于klenow片段上。
(2)DNA聚合酶的3′→5′外切核酸酶活性：
这种酶活性的主要功能是从3′→5′方向识别并切除DNA生长链末端与模板DNA不配对而游离的核苷酸，这种功能称为校对功能，这是保证其聚合作用的正确性不可缺少的，因此对于DNA复制中极高的保真性是至关重要的。
(3)DNA聚合酶的5′→3′外切核酸酶活性：
这种酶活性是从DNA链的5′端向3′末端水解已配对的核苷酸，本质是切断磷酸二酯键，每次能切除10个核苷酸。因此，这种酶活性在DNA损伤的修复中可能起重要作用，对完成的DNA片段去除5′端的RNA引物也是必须的。
DNA polⅠ的5′→3′聚合活性和5′→3′外切酶活性协同作用，可以使DNA一条链上的切口从5′→3′方向移动，这种反应叫做缺刻平移(nick translation)，利用此反应可在体外对DNA片段进行放射性磷(α-32PdNTP)的标记制成探针(probe)，进行核酸的分子杂交实验，是现代分子生物学的一项重要技术。
图 缺刻平移标记DNA探针
许多实验证实DNA polⅠ并不是DNA复制过程中的主要酶，它的作用主要与DNA损伤后的修复有关。
大肠杆菌DNA聚合酶I为分子量103KD的单链多肽，每个大肠杆菌细胞中含400个分子，用蛋白酶水解可得到68KD和35KD的两个片段，大片段称为Klenow大片段。
2.DNA聚合酶Ⅱ(DNA polⅡ)
此酶分子量为120KD，每个细胞约有100个酶分子，但活性只有DNA polⅠ的5%，它具有5′→3′聚合活性和3′→5′外切活性，起校正作用，而没有5′→3′外切活性，它的作用可能与DNA损伤修复有关。目前认为DNA聚合酶Ⅱ的生理功能主要起修复DNA的作用。
3.DNA聚合酶Ⅲ(DNA polⅢ)
大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ由α、ε、2θ、τ、2γ、σ、β9个亚基组成，其中α、ε、θ构成核心酶，是DNA复制的主要聚合酶。
图 DNA聚合酶Ⅲ催化先导链和随从的合成
这是在DNA复制过程中起主要作用的聚合酶，它是由一个多亚基组成的蛋白质分子，其分子量＞600kDa整个酶分子形成一个不对称的二聚体，每个大肠杆菌细胞中只有10?0个酶分子，但催化dNTP参入DNA链的速率却是最快的，约为9000核苷酸/每分钟/每个酶分子。这也证明DNA polⅢ是DNA复制过程中主要发挥作用的酶。在大肠杆菌染色体DNA进行复制时，DNA聚合酶Ⅲ全酶并不是单独起作用的，而是与引发体，介链酶等构成一个复制体(replisome)。由于复制体的存在，先导链和随从链可以同时复制。DNA polⅢ是由多亚基组成的不对称二聚体，它可能同时负责先导链和随从链的复制，在φ×174的复制中观察到引发体总是伴随着DNA噜噗(loop)的存在。图16?2可以看到，由于随从链的模板DNA在DNA 聚合酶Ⅲ全酶上绕转了180°而形成一个噜噗，因此岗崎片段的合成方向能够与先导链的合成方向以及复制体移动方向保持一致。
随着DNA polⅢ向前移动，先导链的合成逐渐延长的同时，岗崎片段也在不断延长，这一噜噗也在不断扩大。当岗崎片段合成到前一个片段的5′端时，这一大噜噗就释放出来，由于复制叉向前移动又可将另一部分随从链的模板置换出来，由引发体合成新的引物，然后再形成一个小的噜噗，进行新的岗崎片段的合成。由此模型不难看出：随从链的合成需要周期性的引发，因此其合成进度总是与前导链相差一个岗崎片段的长度。岗崎片段完成后，其5′端的RNA引物由DNA polⅠ的5′→3′外切酶活性切除，由此造成的空隙再由DNA pol
Ⅰ的5′→3′聚合活性催化dNTP得到填补。所以DNA的复制是在DNA polⅢ和DNA polⅠ互相配合下完成的。
下面列表说明三种大肠杆菌DNA聚合酶的特性
表1 大肠杆菌DNA聚合酶特征
DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶ⅡDNA聚合酶Ⅲ 分子量 109KD 120KD ＞600KD
每个细胞中的分子数 400 17-100 10-20
5′→3′聚合活性 + + +
37℃转化率核苷酸数／酶
600 30 30，000
分子·分钟
5′→3′外切活性 + - -
5′→3′外切活性 + + +
切刻平移活性 + - -
对dNTP亲和力 低 低 高
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功能
去除引物
填补空缺
Klenow 酶的基本用途：
补平由核酸内切酶产生的5`粘性末端
DNA 片段的同位素末端标记
cDNA 第二链的合成
双脱氧末端终止法测定DNA 序列
T4-DNA酶的基本特性：
有3`→5`的核酸外切酶活性和5`→3的DNA聚合酶活性 在无dNTP时，可以从任何3`-OH端外切
－在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸
－在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位。
真核生物DNA聚合酶
真核生物DNA聚合酶有α、β、γ、δ及ε。它们的基本特性相似于大肠杆菌DNA聚合酶，其主要活性是催化dNTP的5′→3′聚合活性，基本特征见表2。
表2 真核生物DNA聚合酶
αβγδε亚基数44425
分子量（KD)＞25036-38160-300170256
细胞内定位核核线粒体核核
5′→3′聚合活性＋＋＋＋＋
3′→5′外切活性－－－－－
功能复制、引发修复复制复制复制
真核细胞在DNA复制中起主要作用的是DNA polα，主要负责染色体DNA的复制。DNA polβ的模板特异性是具有缺口的DNA分子，被认为它与DNA修复有关。DNA polγ在线粒体DNA的复制中起作用。DNA polδ不但有5′→3′聚合活性，而且还具有3′→5′外切酶活性，据认为真核生物DNA复制是在DNA polα和DNA polδ协同作用下进行的，前导链的合成靠DNA polδ催化，并且还需要一种细胞周期调节因子参与。而随从链的合成靠DNA polα和引发酶配合作用完成。
3 反转录酶
基本特性：以RNA为模板聚合cDNA链。
双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链
4 核酸酶
结合着下载的资料复习吧~~~~ 绪论 分子生物学的发展简史 Schleiden和Schwann提出“细胞学说” 孟德尔提出了“遗传因子”的概念、分离定律、独立分配规律 Miescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离出DNA Morgan基因存在于染色体上、连锁遗传规律 Avery证明基因就是DNA分子，提出DNA是遗传信息的载体 McClintock首次提出转座子或跳跃基因概念 Watson和Crick提出DNA双螺旋模型 Crick提出了“中心法则” Meselson与Stah用N重同位素证明了DNA复制是一种半保留复制 Jacob和Monod提出了著名的乳糖操纵子模型 Arber首次发现DNA限制性内切酶的存在 Temin和Baltimore发现在病毒中存在以RNA为模板，逆转录成DNA的逆转录酶 哪几种经典实验证明了DNA是遗传物质? (Avery等进行的肺炎双球菌转化实验、Hershey 利用放射性同位素35S和32P分别标记T2噬菌体的蛋白质外壳和DNA) 第二章染色体与DNA 第一节染色体 一、真核细胞染色体的组成 DNA：组蛋白：非组蛋白：RNA = 1：1：(1-1.5)：0.05 （一）蛋白质（组蛋白、非组蛋白） （1）组蛋白：H1、H2A、H2B、H3、H4 功能：①核小体组蛋白（H2A、H2B、H3、H4）作用是将DNA分子盘绕成核小体
②不参加核小体组建的组蛋白H1，在构成核小体时起连接作用 （2）非组蛋白：包括以DNA为底物的酶、作用于组蛋白的酶、RNA聚合酶等。常见的有（HMG蛋白、DNA结合蛋白） 二、染色质 染色体：分裂期由染色质聚缩形成。 染色质：线性复合结构，间期遗传物质存在形式。 常染色质（着色浅） 具间期染色质形态特征和着色特征染色质 异染色质（着色深） 结构性异染色质兼性异染色质 （在整个细胞周期内都处于凝集状态）（特定时期处于凝集状态）三、核小体 由H2A、H2B、H3、H4各2 分子组成的八聚体和绕在八聚体外的DNA、一分 子H1组成。八聚体在中央，DNA分子盘绕在外，由此形成核心颗粒。,H1结合在核心颗粒外侧DNA双链的进出口端，如搭扣将绕在八聚体外DNA链固定，核心颗粒之间的连接部分为连接DNA。 核小体的定位对转录有促进作用
Section A 细胞与大分子 简述复杂大分子的生物学功能及与人类健康的关系。 Section C 核酸的性质 1.DNA的超螺旋结构的特点有哪些？ A 发生在闭环双链DNA分子上 B DNA双链轴线高卷曲，与简单的环状相比，连接数发生变化 C 当DNA扭曲方向与双螺旋方向相同时，DNA变得紧绷，为正超螺旋，反之变得松弛为负超螺旋。自然界几乎所有DNA分子超螺旋都为负的，因为能量最低。 2.简述核酸的性质。 A 核酸的稳定性：由于核酸中碱基对的疏水效应以及电荷偶极作用而趋于稳定 B 酸效应：在强酸和高温条件下，核酸完全水解，而在稀酸条件下，DNA的核苷键被选择性地断裂生成脱嘌呤核酸 C 碱效应：当PH超出生理范围时（7-8），碱基的互变异构态发生变化 D 化学变性：一些化学物质如尿素，甲酰胺能破坏DNA和RNA二级结构中的 而使核酸变性。 E 粘性：DNA的粘性是由其形态决定的，DNA分子细长，称为高轴比，可被机械力和超声波剪切而粘性下降。 F 浮力密度：1.7g/cm^3,因此可利用高浓度分子质量的盐溶液进行纯化和分析 G 紫外线吸收：核酸中的芳香族碱基在269nm 处有最大光吸收 H 减色性，热变性，复性。 思考题：提取细菌的质粒依据是核酸的哪些性质？ 质粒是抗性基因，，在基因组或者质粒DNA中用碱提取法。 Sectio C 课前提问 1.在1.5mL的离心管中有500μL，取出10 μL稀释至1000 μL后进行检测，测得A260=0.15。 问（1）：试管中的DNA浓度是多少？ 问（2）：如果测得A280=0.078, .A260/A280=？说明什么问题？ (1)稀释前的浓度：0.15/20=0.0075 稀释后的浓度：0.0075/100=0.75ug/ml （2）0.15/0.078=1.92〉1.8，说明DNA中混有RNA样品。 2.解释以下两幅图
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease） 1．定义：凡能识别和切割双链DNA分子内特定核苷酸序列的酶，也称为限制酶（restriction enzyme，RE）。 2．类型：来自原核生物，有三种类型。 Ⅰ型：兼具甲基化修饰和ATP参与的核酸内切酶活性，随机切割。 Ⅱ型：大多能特异识别4～6个核苷酸序列（回文结构），最大识别序列为8个核苷酸，如SfiI、NotI；但有近10种Ⅱ型限制酶的识别序列为非回文结构，如SfaNI、MnlI等，Ⅱ型限制酶均可作为基因工程的工具酶。另有一些来源不同的限制酶的识别位点是相同的核苷酸序列，将这类酶特称为同工异源酶（isoschizomers）或同裂酶。同工异源酶切割产生相同的末端；有一些同工异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，故可用来研究DNA 甲基化作用，如SmaI和XmaI；HpaII和MspI；MboI和Sau3AI是成对的同工异源酶；其中HpaII和MspI是一对同工异源酶，其识别位点是CCGG。与同工异源酶对应的一类限制酶，它们虽然来源各异，识别序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，称为同尾酶（isocaudamers）。常用的限制酶BamHI、BclI、BglII、Sau3AI和XhoII就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。显而易见，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆实验中很有用处。但必须指出，由两种同尾酶消化产生的粘性末端，重组之后所形成的序列结构再不能被原来的任何一种同尾酶所识别。 Ⅲ型：功能基本同Ⅰ型，但为特定位点切割。 三种限制酶的区别如下表所示： Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型 DNA底物dsDNA dsDNA dsDNA 辅助因子Mg2+,A TP,SAM Mg2+ Mg2+,A TP 识别序列特异特异特异 切割位点非特定（于识别序列前后100~1000bp范围之内）特定（切割于识别序列之中或近处，固定位点）特定（切割点在识别序列后25~75bp处） 与甲基化作用的关系内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用酶蛋白不具有甲基化作用内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用 3．命名：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株。另外用罗马数字代表同一菌株中不同限制酶的编号，现在常用来表示发现的先后次序。如HindⅢ是来自Haemophilus influenzae D（嗜血流感杆菌D 株第三种限制酶）。 4．切割位点和结果：限制酶位点在DNA链上是随机分布的，若识别位点为4bp，则44（256）个核苷酸可遇一个切点。若为6bp，则平均46（4096）个核苷酸才遇到一个切点。限制酶沿回文结构的对称轴切开，则产生平头末端（flush or blunt ends）如BalⅠ。多数限制酶错位
现代分子生物学总结(朱玉贤、最新版)
一、绪论 两个经典实验 1、肺炎球菌在老鼠体内的毒性实验：先将光滑型致病菌（S型）烧煮杀活性以后、以及活的粗糙型细菌（R型）分别侵染小鼠发现这些细菌自然丧失了治病能力；当他们将经烧煮杀死的S型细菌和活的R型细菌混合再感染小鼠时，实验小鼠每次都死亡。解剖死鼠，发现有大量活的S型细菌。实验表明，死细菌DNA 进行了可遗传的转化，从而导致小鼠死亡。 2、T2噬菌体感染大肠杆菌：当细菌培养基中分别带有35S或32P标记的氨基酸或核苷酸，子代噬菌体就相应含有35S标记的蛋白质或32P标记的核酸。分别用这些噬菌体感染没有放射性标记的细菌，经过1~2个噬菌体DNA 复制周期后进行检测，子代噬菌体中几乎不含带35S标记的蛋白质，但含30%以上的32P 标记。说明在噬菌体传代过程中发挥作用的可能是DNA而不是蛋白质。 基因的概念：基因是产生一条多肽链或功能RNA分子所必需的全部核苷酸序列。
二、染色体与DNA 嘌呤嘧啶 腺嘌呤鸟嘌呤胞嘧啶尿嘧啶胸腺嘧啶 染色体 性质：1、分子结构相对稳定；2、能够自我复制，使亲、子代之间保持连续性；3、能指导蛋白质的合成，从而控制生命过程；4、能产生可遗传的变异。 组蛋白一般特性：1、进化上极端保守，特别是H3、H4；2、无组织特异性；3、肽链上氨基酸分布的不对称性；4、存在较普遍的修饰作用；5、富含赖氨酸的组蛋白H5 非组蛋白：HMG蛋白；DNA结合蛋白；A24非组蛋白
真核生物基因组DNA 真核细胞基因组最大特点是它含有大量的重复序列，而且功能DNA序列大多被不编码蛋白质的非功能蛋白质所隔开。人们把一种生物单倍体基因组DNA的总量称为C值，在真核生物中C 值一般是随着生物进化而增加的，高等生物的C 值一般大于低等动物，但某些两栖类的C值甚至比哺乳动物还大，这就是著名的C值反常现象。真核细胞DNA序列可被分为3类：不重复序列、中度重复序列、高度重复序列。 真核生物基因组的特点：1、真核生物基因组庞大，一般都远大于原核生物的基因组；2、真核基因组存在大量的的重复序列；3、真核基因组的大部分为非编码序列，占整个基因组序列的90%以上，这是真核生物与细菌和病毒之间的最主要的区别；4、真核基因组的转录产物为单顺反之；5、真核基因组是断裂基因，有内含子结构；6、真核基因组存在大量的顺式元件，包括启动子、增强子、沉默子等；7、真核基因组中存在大量的DNA多态性；8、真核基因组具有端粒结构。
分子生物学 第一章绪论 分子生物学研究内容有哪些方面？ 1、结构分子生物学； 2、基因表达的调节与控制； 3、DNA重组技术及其应用； 4、结构基因组学、功能基因组学、生物信息学、系统生物学 第二章DNA and Chromosome 1、DNA的变性：在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。 2、DNA复性：变性DNA在适当条件下，分开的两条单链分子按照碱基互补原则重新恢复天然的双螺旋构象的现象。 3、Tm(熔链温度)：DNA加热变性时，紫外吸收达到最大值的一半时的温度，即DNA分子内50%的双链结构被解开成单链分子时的温度） 4、退火：热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，称为退火 5、假基因：基因组中存在的一段与正常基因非常相似但不能表达的DNA序列。以Ψ来表示。 6、C值矛盾或C值悖论:C值的大小与生物的复杂度和进化的地位并不一致，称为C值矛盾或C值悖论(C-Value Paradox)。 7、转座：可移动因子介导的遗传物质的重排现象。 8、转座子：染色体、质粒或噬菌体上可以转移位置的遗传成分 9、DNA二级结构的特点：1）DNA分子是由两条相互平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成；2）DNA分子中的脱氧核苷酸和磷酸交替连接，排在外侧，构成基本骨架，碱基排列在外侧；3）DNA分子表面有大沟和小沟；4）两条链间存在碱基互补，通过氢键连系，且A=T、G ≡ C（碱基互补原则）；5）螺旋的螺距为3.4nm，直径为2nm，相邻两个碱基对之间的垂直距离为0.34nm，每圈螺旋包含10个碱基对；6）碱基平面与螺旋纵轴接近垂直，糖环平面接近平行 10、真核生物基因组结构：编码蛋白质或RNA的编码序列和非编码序列，包括编码区两侧的调控序列和编码序列间的间隔序列。 特点：1）真核基因组结构庞大哺乳类生物大于2X109bp；2）单顺反子（单顺反子：一个基因单独转录，一个基因一条mRNA，翻译成一条多肽链；）3）基因不连续性断裂基因（interrupted gene）、内含子(intron)、外显子(exon)；4）非编码区较多，多于编码序列(9:1) 5）含有大量重复序列 11、Histon(组蛋白)特点：极端保守性、无组织特异性、氨基酸分布的不对称性、可修饰作用、富含Lys的H5 12、核小体组成：由组蛋白和200bp DNA组成 13、转座的机制：转座时发生的插入作用有一个普遍的特征，那就是受体分子中有一段很短的被称为靶序列的DNA会被复制，使插入的转座子位于两个重复的靶序列之间。 复制型转座：整个转座子被复制，所移动和转位的仅为原转座子的拷贝。 非复制型转座：原始转座子作为一个可移动的实体直接被移位。 第三章DNA Replication and repair 1、半保留复制：DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱
第一章、基因的结构和功能实体及基因组 1、基因定义 基因（遗传因子）是遗传的物质基础，是DNA（脱氧核糖核酸）分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列的总称，携带有遗传信息的DNA序列，是具有遗传效应的DNA分子片段，是控制性状的基本遗传单位，通过指导蛋白质的合成来表达自己所携带的遗传信息，从而控制生物个体的性状表现。 2、DNA修复 DNA修复（DNA repairing）是细胞对DNA受损伤后的一种反应，这种反应可能使DNA结构恢复原样，重新能执行它原来的功能；但有时并非能完全消除DNA的损伤，只是使细胞能够耐受这DNA的损伤而能继续生存。也许这未能完全修复而存留下来的损伤会在适合的条件下显示出来（如细胞的癌变等），但如果细胞不具备这修复功能，就无法对付经常在发生的DNA损伤事件，就不能生存。对不同的DNA损伤，细胞可以有不同的修复反应。3、DNA损伤 DNA损伤是复制过程中发生的DNA核苷酸序列永久性改变，并导致遗传特征改变的现象。情况分为：substitutation （替换）deletion （删除）insertion （插入）exon skipping （外显子跳跃）。 DNA损伤的改变类型：a、点突变：指DNA上单一碱基的变异。嘌呤替代嘌呤（A与G之间的相互替代）、嘧啶替代嘧啶（C与T之间的替代）称为转换（transition）；嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤则称为颠换（transvertion）。b、缺失：指DNA链上一个或一段核苷酸的消失。c、插入：指一个或一段核苷酸插入到DNA链中。在为蛋白质编码的序列中如缺失及插入的核苷酸数不是3的整倍数，则发生读框移动（reading frame shift），使其后所译读的氨基酸序列全部混乱，称为移码突变（frame-shift mutaion）。d、倒位或转位：（transposition）指DNA链重组使其中一段核苷酸链方向倒置、或从一处迁移到另一处。 e、双链断裂：对单倍体细胞一个双链断裂就是致死性事件。 4、同源重组 同源重组，（Homologus Recombination)是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。同源重组需要一系列的蛋白质催化，如原核生物细胞内的RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR等；以及真核生物细胞内的Rad51、Mre11-Rad50等等。同源重组反应通常根据交叉分子或holiday 结构（Holiday Juncture Structure) 的形成和拆分分为三个阶段，即前联会体阶段、联会体形成和Holiday 结构的拆分。 a、基因敲除 基因敲除（geneknockout），是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除，或用其它顺序相近基因取代，然后从整体观察实验动物，推测相应基因的功能。这与早期生理学研究中常用的切除部分-观察整体-推测功能的三部曲思想相似。基因敲除除可中止某一基因的表达外，还包括引入新基因及引入定点突变。既可以是用突变基因或其它基因敲除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因。 b、因转移法 同源重组(homologousrecombination)是将外源基因定位导人受体细胞染色体上的方法，因为在该座位有与导人基因同源的序列，通过单一或双交换，新基因片段可替换有缺陷的基因片段，达到修正缺陷基因的目的。位点特异性重组是发生在两条DNA链特异位点上的重组，重组的发生需一段同源序列即特异性位点(又称附着点；attachmentsite，att)和位点特异性的蛋白因子即重组酶参与催化。重组酶仅能催化特异性位点间的重组，因而重组具有特异性和高度保守性。
分子生物学总结完整版 1、结构分子生物学； 2、基因表达的调节与控制； 3、DNA重组技术及其应用； 4、结构基因组学、功能基因组学、生物信息学、系统生物学 第二章DNA and Chromosome 1、DNA的变性：在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。 2、 DNA复性：变性DNA在适当条件下，分开的两条单链分子按照碱基互补原则重新恢复天然的双螺旋构象的现象。 3、 Tm(熔链温度)： DNA加热变性时，紫外吸收达到最大值的一半时的温度，即DNA分子内50%的双链结构被解开成单链分子时的温度） 4、退火：热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，称为退火 5、假基因：基因组中存在的一段与正常基因非常相似但不能表达的DNA序列。以Ψ来表示。 6、 C值矛盾或C值悖论:C值的大小与生物的复杂度和进化的地位并不一致，称为C值矛盾或C值悖论(C-Value Paradox)。 7、转座：可移动因子介导的遗传物质的重排现象。 8、转座子：染色体、质粒或噬菌体上可以转移位置的遗传成分
9、 DNA二级结构的特点：1）DNA分子是由两条相互平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成；2）DNA分子中的脱氧核苷酸和磷酸交替连接，排在外侧，构成基本骨架，碱基排列在外侧；3）DNA分子表面有大沟和小沟；4）两条链间存在碱基互补，通过氢键连系，且A=T、G ≡ C（碱基互补原则）；5）螺旋的螺距为 3、4nm，直径为2nm，相邻两个碱基对之间的垂直距离为0、34nm，每圈螺旋包含10个碱基对；6）碱基平面与螺旋纵轴接近垂直，糖环平面接近平行 10、真核生物基因组结构：编码蛋白质或RNA的编码序列和非编码序列，包括编码区两侧的调控序列和编码序列间的间隔序列。特点：1）真核基因组结构庞大哺乳类生物大于2X109bp；2）单顺反子（单顺反子：一个基因单独转录，一个基因一条mRNA，翻译成一条多肽链；）3）基因不连续性断裂基因（interrupted gene）、内含子(intron)、外显子(exon)；4）非编码区较多，多于编码序列(9:1) 5）含有大量重复序列1 1、Histon(组蛋白)特点：极端保守性、无组织特异性、氨基酸分布的不对称性、可修饰作用、富含Lys的H5 12、核小体组成： 由组蛋白和200bp DNA组成 13、转座的机制：转座时发生的插入作用有一个普遍的特征，那就是受体分子中有一段很短的被称为靶序列的DNA会被复
第一章、基因的结构与功能实体及基因组 1、基因定义 基因(遗传因子)就是遗传的物质基础,就是DNA(脱氧核糖核酸)分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列的总称,携带有遗传信息的DNA序列,就是具有遗传效应的DNA分子片段,就是控制性状的基本遗传单位,通过指导蛋白质的合成来表达自己所携带的遗传信息,从而控制生物个体的性状表现。 2、DNA修复 DNA修复(DNA repairing)就是细胞对DNA受损伤后的一种反应,这种反应可能使DNA结构恢复原样,重新能执行它原来的功能;但有时并非能完全消除DNA的损伤,只就是使细胞能够耐受这DNA的损伤而能继续生存。也许这未能完全修复而存留下来的损伤会在适合的条件下显示出来(如细胞的癌变等),但如果细胞不具备这修复功能,就无法对付经常在发生的DNA 损伤事件,就不能生存。对不同的DNA损伤,细胞可以有不同的修复反应。 3、DNA损伤 DNA损伤就是复制过程中发生的DNA核苷酸序列永久性改变,并导致遗传特征改变的现象。情况分为:substitutation (替换)deletion (删除)insertion (插入)exon skipping (外显子跳跃)。DNA损伤的改变类型:a、点突变:指DNA上单一碱基的变异。嘌呤替代嘌呤(A与G之间的相互替代)、嘧啶替代嘧啶(C与T之间的替代)称为转换(transition);嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤则称为颠换(transvertion)。b、缺失:指DNA链上一个或一段核苷酸的消失。c、插入:指一个或一段核苷酸插入到DNA链中。在为蛋白质编码的序列中如缺失及插入的核苷酸数不就是3的整倍数,则发生读框移动(reading frame shift),使其后所译读的氨基酸序列全部混乱,称为移码突变(frame-shift mutaion)。d、倒位或转位:(transposition) 指DNA链重组使其中一段核苷酸链方向倒置、或从一处迁移到另一处。e、双链断裂:对单倍体细胞一个双链断裂就就是致死性事件。 4、同源重组 同源重组,(Homologus Recombination)就是指发生在姐妹染色单体(sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。同源重组需要一系列的蛋白质催化,如原核生物细胞内的RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR等;以及真核生物细胞内的Rad51、Mre11-Rad50等等。同源重组反应通常根据交叉分子或holiday结构(Holiday Juncture Structure) 的形成与拆分分为三个阶段,即前联会体阶段、联会体形成与Holiday 结构的拆分。 a、基因敲除 基因敲除(geneknockout),就是指对一个结构已知但功能未知的基因,从分子水平上设计实验,将该基因去除,或用其它顺序相近基因取代,然后从整体观察实验动物,推测相应基因的功能。这与早期生理学研究中常用的切除部分-观察整体-推测功能的三部曲思想相似。基因敲除除可中止某一基因的表达外,还包括引入新基因及引入定点突变。既可以就是用突变基因或其它基因敲除相应的正常基因,也可以用正常基因敲除相应的突变基因。 b、因转移法 同源重组(homologousrecombination)就是将外源基因定位导人受体细胞染色体上的方法,因为在该座位有与导人基因同源的序列,通过单一或双交换,新基因片段可替换有缺陷的基因片段,达到修正缺陷基因的目的。位点特异性重组就是发生在两条DNA链特异位点上的重组,重组的发生需一段同源序列即特异性位点(又称附着点;attachmentsite,att)与位点特异性的蛋白因子即重组酶参与催化。重组酶仅能催化特异性位点间的重组,因而重组具有特异性与高度保守性。 5、碱基错配对修复
SectionA 1 三个域：真细菌，古细菌，真核生物 2 组装中的主要作用力：非共价健作用力 SectionB 1 蛋白质纯化的分析方法 2
正电荷：天冬氨酸谷氨酸 负电荷：赖氨酸精氨酸组氨酸 极性：天冬酰胺谷氨酰胺苏氨酸丝氨酸半胱氨酸 非极性：脂肪族甘氨酸丙氨酸缬氨酸亮氨酸异亮氨酸甲硫氨酸脯氨酸芳香族苯丙氨酸酪氨酸色氨酸 Cys 二硫键 Gly 无手性 Pro 亚氨基酸 芳香族氨基酸最大吸收峰280mm 3 蛋白质的一级(决定蛋白折叠及其最后的形状的最重要的因素)：氨基酸脱水缩合形成肽链N端到C端共价键 二级：多肽链中空间结构邻近的肽链骨架通过氢键形成的特殊结构。 α转角 β螺旋氢键为主要作用力 三级：多肽链中的所有二级结构和其他松散肽链区域（散环结构）通过各种分子间作用力（非共价键为主），弯曲、折叠成具有特定走向的紧密球状构象。 非共价键 四级：许多蛋白分子由多条多肽链（亚基，subunits ）构成。组成蛋白的各亚基以各种非共价键作用力为主，结合形成的立体空间结构即为四级结构。非共价键 4 偶极：电子云在极性共价键的两原子间不均匀分布，使共价键两端的原子分别呈现不同的电性 兼性离子：具有正电荷（碱性），又具有负电荷（酸性）的分子 双极性分子：
Section C 1核酸的光学特性： 增色性：一种化合物随着结构的改变对光的吸收能力增加的现象 减色性：一种化合物随着结构的改变对光的吸收能力减少的现象 Reason: 碱基环暴露在环境中的越多，对紫外的吸收力越强 Absorbance（吸收值）：Nucleotide > ssDNA/RNA > dsDNA 核酸的最大吸收峰260mm(碱基有芳香环) 芳香族氨基酸最大吸收峰280mm A260/A280: 纯的dsDNA：1.8 纯的RNA：2.0 纯的Protein：0.5 2 Tm 值（熔解温度）：热变性时，使得DNA双链解开一半所需要的温度。 Tm=2x(A+T) + 4x(G+C) Tm值与DNA分子的长度，及GC的含量成正比 Annealing（退火）:热变性的DNA经过缓慢冷却后复性 快速冷却：Stay as ssDNA 缓慢冷却: 复性成dsDNA 3 脱氧核糖核酸与核糖核苷酸得到画法 4 支持双螺旋结构的两个实验：查戈夫规则X射线晶体衍射 5 双螺旋的内容： 双链之间的关系：DNA分子由两条链组成 双链反向平行(5’3’方向) 两链的碱基通过氢键互补配对，A:T; G:C。 双链序列反向互补 各基团排列方式：糖-磷酸骨架DNA分子排列在外; 碱基对平面相互平行，排列在DNA分子的内部。 空间结构为：右手双螺旋结构 每转一圈~10个碱基对，每一圈长度33.2A 双链螺旋中形成大沟，小沟。 6 碱对DNA的影响：高pH值对DNA的影响比低pH值的要小。 高pH 值(pH>11)会改变碱基构象，使DNA变性（双链解旋，成单链）RNA的影响：高pH值，2’羟基会攻击磷酸二酯键，使其断裂，形成2’，3’-环式磷酸二酯键，从而使RNA分子断裂 7 共价闭合环状DNA (convalently closed circular DNA, cccDNA）。即通过共价键结合形成的封闭环状DNA分子。 8 超螺旋DNA（Supercoil DNA）:松弛型双链DNA进一步旋转后，再形成闭环结构时，就会形成DNA超螺旋结构 L=T+W 判断是否为超螺旋正负超螺旋 9 拓扑异构酶：暂时断裂DNA分子中一条或两条单链上的磷酸二酯键，改变DNA分子的连接数及拓扑状态。 功能：消除DNA复制和转录等过程产生的超螺旋。 细胞中，Ⅰ型酶与Ⅱ型酶的活性保持一种平衡状态。Ⅱ型酶的“使DNA超螺旋化”与
分子生物学实习总结 三天的分子生物学实习，我能认真听老师的讲解和很好的按照老师的安排完成实验。期间，接触和学习到了很多有关分子生物学实验的方法、仪器的使用、技术，而且对分子生物学实验有一个大致的了解，学习到很多以前没有接触过的知识。 这几天来做的不足的地方有： 1.预习不够充分。只是浏览了实验报告上的原理、操作等内容，并没有深入了解每一个步骤的操作会对实验有什么的作用和影响。实验失败了，不能自主找到原因。 2.实验操作过程不够细心。实验要求十分细心，严谨和专注。实验中很多细小的地方还是没有很好的注意到。 3.遇到不懂的没有及时发问。实验就是一个让我们实操的过程，一边操作一边巩固书本上的知识。过程中，遇到不明白的地方应该及时问别人活着自己翻阅资料，力求把实验弄透彻。 但是我还是有很多收获的： 1.对分子生物学实验有了了解。例如实验的基本的流程和操作，常用的方法等基础知识已经有了一定了解，对以后的实验会有一定的帮助。 2.最基本的移液枪、离心机、涡旋器等的使用还有实验中的PCR仪、电泳等有一定的认。 3.学会了严谨和细心。实验所用的材料都是比较昂贵的，而且实验只要一步错了，就得重做。所以需要非常严谨。不仅仅是分子生物学实验，其他实验也要求，所以培养这个有点对以后的实验非常有好处。 4.学会了坚持。很多次因为实验做的时间很长，大家都会很累，但是，还是要坚持，一点点累都受不了是不能把实验做好的。开始慢慢了解到做科研的人员的辛酸，长时间整天呆在实验室做实验，这需要很大的毅力。 5.把握实验机会，让自己学得更多。实验过程中，只要有实操的机会，我都会去操作。因为说和做是不一样的。而且在操作中能加深巩固知识和学得更加深入。 三天的分子生物学实习虽然很累，因为要天天去院楼，而却实验时间都比较长。但是 还是很有意义的，因为学习到很到东西，收获了很多。 老师也为我们准备了很多的材料和准备，实验才做得那么快和顺利，其实，实验室简 化了很多了，而且我们所做的实验都是已经设计好的，按照操作做就行了。如果时间和资 金允许，应该设立一些自主完成的实验，这样可以培养我们更加多的能力，开阔知识面和 拓宽思维。
分子克隆工具酶答案（选择和判断） 题1 关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下列描述中只有( )不太恰当。 B. 这一系统中的核酸酶都是Ⅱ类限制性内切核酸酶 题目2 Ⅱ型限制性内切核酸酶：( ) D. 限制性识别非甲基化的核苷酸序列 题目3 Ⅲ型限制性内切核酸酶：( ) E. 不同亚基的识别位点甲基化和限制活性相互排斥：MS亚基促使甲基化，R亚基促使限制 题目4 限制性片段长度多态性(RFLP)是：( ) E. 物种中的两个个体限制性图谱间的差别 题目5 下面有关限制酶的叙述哪些是不正确的?( ) E. 限制酶是外切酶而不是内切酶 题目6 因研究λ噬菌体的限制与修饰现象的本质而获得诺贝尔奖的科学家是：( ) C. WArber 题目7 第一个被分离的Ⅱ类酶是：( ) A. HindⅡ 题目8 双链DNA中一段自我互补的序列被称为回文序列，这种序列不具有下列特征：( ) B. 可增强基因的表达 题目9 在下列进行DNA部分酶切的条件中，控制那一项最好?( ) B. 酶量酶量 题目10 在下列试剂中，那一种可以螯合Ca2＋离子?( ) A. EGTA 题目11
在下列工具酶中，那一种可以被EGTA抑制活性?( ) C. Bal 31核酸酶 题目12 限制性内切核酸酶可以特异性地识别：( ) B. 双链DNA的特定碱基序列 题目13 限制性内切核酸酶的星号活性是指：( ) B. 在非常规条件下，识别和切割序列发生变化的活性。 题目14 下面哪一种不是产生星号活性的主要原因?( ) C. 酶切反应时酶浓度过低 题目15 关于回文序列，下列各项中，( )是不正确的 B. 是高度重复序列 题目16 关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下列描述中只有( )不太恰当 D. 这一系统中的核酸酶都是Ⅱ类限制性内切核酸酶 题目17 T4DNA连接酶是从T4噬菌体感染的E．coli中分离的，这种连接酶( ) B. 既能催化平末端连接又能催化黏性末端连接 题目18 DNA连接酶在体内的主要作用是在DNA复制、修复中封闭缺口，( ) A. 将双链DNA分子中的5，磷酸基团同3，-OH末端重新形成磷酸二酯键 题目19 在长模板链的指导下引物延伸合成长的DNA互补链时应选用( ) A. T7DNA聚合酶 题目20 末端转移酶是合成酶类，( ) D. 在C0 2＋的存在下，可以在3’突出末端延长DNA链 题目21 在基因工程中，可用碱性磷酸酶( ) B. 防止DNA的自身环化 题目22
第二章基因工程中常用的工具酶 限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。 §2-1 核酸内切限制酶 定义：核酸内切限制酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。 到目前为止已经从许多种不同的微生物中分离出了2300种以上不同的核酸内切限制酶。核酸内切限制酶的发现及其生物功能（图） 一、限制修饰系统的种类（图） 二、限制性内切酶的定义、命名 1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指II型限制酶。 2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。 例如：Hin dⅢ前三个字母来自于菌种名称H. influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。 Eco RI—Escherichia coli RI Hin dⅢ—Haemophilus influensae d Ⅲ Sac I (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ) 三、Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶的缺点 a.Ⅰ型核酸内切限制酶虽然能够识别DNA分子中的特定序列，但它们的切割作用却是 随机的，在距特异性位点至少1000bp的地方可以随机地切割DNA分子，因此这类酶在基因克隆中显然是没有用处的。——远距离随机切割 b. Ⅲ型核酸内切限制酶大约从距离识别序列25bp处切割DNA分子。——远距离定点 切割 c.Ⅰ型核酸内切限制酶和Ⅲ型核酸内切限制酶，在切割反应过程中，都会沿着DNA分 子移动，因此是一种需要能量的过程。——需要能量的反应 d.Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶，一般都是大型的多亚基的复合物，既具有内切酶活性， 又具有甲基化酶活性。——内切酶活性和甲基化酶活性 四、Ⅱ型核酸内切限制酶的特点 (1)基本特点： ①在双链DNA分子上有一个特殊的靶子序列，即所谓的识别序列，并由此切割DNA 分子形成链的断裂；——识别序列 ②2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的；——单链切割
反义RNA：（antisense RNA） 参与转录后调控： 细菌响应环境压力（氧化压力、渗透压、温度等）的改变，产生的一些非编码的小RNA分子，能与mRNA中的特定序列配对并改变所配对mRNA分子的构象，导致翻译过程被开启或者关闭，也可能导致目标mRNA分子的快速降解。（例如：细菌铁蛋白用来储存细胞中过剩的铁离子，bfr基因编码铁蛋白，anti-bfr基因编码反义RNA。无论培养基铁离子的高低，bfr基因都正常转录，而anti-bfr基因的转录受到能感受铁离子浓度变化的Fur蛋白的调控。铁离子过多时，Fur蛋白关闭anti-bfr基因，bfr基因正常翻译；而铁离子过低时，anti-bfr基因转录生成大量反义RNA，与bfr的mRNA配对，阻止细菌铁蛋白基因的翻译。） 参与DNA复制调控： 在EolE1质粒DNA的复制完全依靠宿主DNA聚合酶Ⅰ，质粒DNA编码两个负调控因子Rop蛋白和反义RNA（RNA1），他们控制了起始DNA复制所必须的引物合成。RNA1的编码区在引物RNA编码区的5’端，转录方向与引物RNA相反，因此与引物RNA的5’端互补。RNA1通过氢键配对与引物RNA前体相互作用，阻止了RNaseH加工引物前体，使其不能转换为有活性的引物而对复制起负调控作用。RNA1不仅控制质粒的拷贝数，而且决定了质粒的不相容性。RNA1与引物RNA分子的相互作用是可逆的，因此细胞内RNA1的浓度决定了EolE1质粒复制的起始频率。而另一个负调控因子Rop蛋白能提高RNA1与引物前体的相互作用，从而加强了RNA1的负调控作用。 RNA干涉（RNAi） 利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA从而阻断靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。
分子生物学总结 1.分子生物学的三大原则 根据“序列假说”、“中心法则”这两个基本原则，分子生物学作为所有生命物质的共性学科遵循“三大原则：其一，构成生物大分子的单体是相同的。在动物、植物、微生物3大系统的所有生物物种间都具有共同的核酸语言，即构成核酸大分子的单体均是A、T(U)、C、G。所有生物物种间都具有共同的蛋白质语言，即构成蛋白质大分子的单体均是20种基本氨基酸。 其二，生物大分子单体的排列决定了不同生物性状的差异和个性特征。 其三，所有遗传信息表达的中心法是相同的。 2.简述Morgan基因论 经典基因概念：即基因是孤立的排列在染色体上的实体，是具有特定功能的，能独立发生突变和遗传交换的，“三位一体”的、最小的遗传单位。 3.简述“顺反子假说”的主要内容 顺反子理论认为：基因（即顺反子）是染色体上的一个区段，在一个顺反子内有若干个交换单位，最小的交换单位被称为交换子。在一个顺反子中有若干个突变单位，最小的
突变单位被称为突变子。在一个顺反子结构区域内，若果发生突变就会导致功能丧失，所以顺反子即基因只是一个具有特定功能的、完整的、不可分割的最小的遗传单位。 4.名词解释：等位基因、全同等位基因、非全同等位基因等位基因（allele）：同一座位存在的两个不同状态的基因 全同等位基因（homoallele）：在同一基因座位(locus)中，同 一突变位点（site）向不同方向 发生突变所形成的等位基因非全同等位基因（heteroallele）：在同一基因座位（locus） 中，不同突变位点（site）发 生突变所形成的等位基因 5.简述DNA作为遗传物质的优点(自然选择的优势) DNA作为主要的遗传物质的优点在于： 1）储存遗传信息量大，在1kb DNA序列中，就可能编码出41000种遗传信息 2）以A / T, C / G 互补配对形成的双螺旋，结构稳定，利于复制，便于转录，可以突变以求不断进化，方便修复以求遗传稳定； 3）核糖的2’ – OH 脱氧，使其在水中的稳定性高于RNA，DNA中有T无U，消除了C突变为U带来进化中的负担
第二章染色体与DNA 第一节染色体 1、真核细胞的染色体具有如下性质：分子结构相对稳定；能够自我复制，使亲子代保持连 续性；能指导蛋白质的合成，从而控制生命过程；能产生可遗传的变异。 2、染色体上的蛋白质包括组蛋白和非组蛋白。组蛋白是染色体的结构蛋白，它与DNA组成核小体。组蛋白分为H1、H2A、H2B、H 3、H4。 组蛋白：histones真和生物体细胞染色质中的碱性蛋白质含精氨酸和赖氨酸等碱性氨基酸特 别多，二者加起来约为所有氨基酸残基的四分之一。 3、组蛋白的一般特性： ○1进化上的极端保守：不同种生物组蛋白的氨基酸组成是十分相似的，特别是H3、H4 可能对稳定真核生物的染色体结构起重要作用。 ○2无组织特异性 ○3肽链上氨基酸分布的不对称性 ○4存在较普遍的修饰作用 ○5富含赖氨酸的组蛋白H5 4、非组蛋白：主要包括与复制和转录有关的酶类、与细胞分裂有关的蛋白等。 5、真核生物基因组DNA： 真核细胞基因组的最大特点是它含有大量的重复序列，而且功能DNA序列大多被不编码蛋白质的非功能DNA所隔开。人们把一种生物单倍体基因组DNA的总值称为C值。在真核生物中C值一般是随生物进化而增加的，高等生物的C值一般大于低等生物，但某些两栖 类的C值甚至比哺乳类还大，这就是著名的“Ｃ值反常现象”。 6、真核细胞DNA序列可分为三类： ○1不重复序列：在单倍体基因组里，一般只有一个或几个拷贝，占DNA总量的40%~80%。结构基因基本上属于不重复序列。 ○2中度重复序列：重复次数在10~104之间，占DNA总量的10%~40%，各种rRNA、tRNA 以及某些结构基因（如组蛋白基因）都属于此类。 ○3高度重复序列：如卫星DNA。只在真核生物中出现占基因组的10%~60%，由10~60个碱基组成，在DNA链上串联重复高达数百万次，这类DNA高度浓缩，是异染色质的组成部分，可能与染色体的稳定性有关。 7、染色质与核小体：染色质纤维细丝是由DNA和组蛋白构成，DNA和组蛋白构成核小体，核小体连成念珠状构成染色质。 ○1核小体的装配过程： 两分子的H3和两分子的H4先形成四聚体，然后由H2A和H2B构成的异二聚体在该四聚体 的两侧分别结合而形成八聚体。长146bp的DNA按左手螺旋盘绕在八聚体上 1.8圈，形成核小体的核心颗粒，每圈约80bp。核心颗粒两端的DNA各有11bp与H1结合，形成完整的核小体。核小体的形成是染色体压缩的第一个阶段。 ○2染色体的压缩： DNA双链以左手螺旋盘绕在组蛋白形成的八聚体核心上即核小体------念珠状结构-----核小体结构进一步盘绕折叠形成染色质丝----组成突环----玫瑰花结------螺线圈-----由螺线圈组成染色单体。 8、真核生物基因组的特点: ○1真核基因组庞大，一般都远大于原核生物的基因组 ○2真核基因组存在大量的重复序列
现代分子生物学要点总结(朱玉贤版) 一、绪论 两个经典实验 1、肺炎球菌在老鼠体内的毒性实验：先将光滑型致病菌（S型）烧煮杀活性以后、以及活 的粗糙型细菌（R型）分别侵染小鼠发现这些细菌自然丧失了治病能力；当他们将经烧煮杀死的S型细菌和活的R型细菌混合再感染小鼠时，实验小鼠每次都死亡。解剖死鼠，发现有大量活的S型细菌。实验表明，死细菌DNA进行了可遗传的转化，从而导致小鼠死亡。 2、T2噬菌体感染大肠杆菌：当细菌培养基中分别带有35S或32P标记的氨基酸或核苷酸， 子代噬菌体就相应含有35S标记的蛋白质或32P标记的核酸。分别用这些噬菌体感染没有放射性标记的细菌，经过1~2个噬菌体DNA复制周期后进行检测，子代噬菌体中几乎不含带35S标记的蛋白质，但含30%以上的32P标记。说明在噬菌体传代过程中发挥作用的可能是DNA而不是蛋白质。 基因的概念：基因是产生一条多肽链或功能RNA分子所必需的全部核苷酸序列。 二、染色体与DNA 嘌呤嘧啶 腺嘌呤鸟嘌呤胞嘧啶尿嘧啶胸腺嘧啶 染色体 性质：1、分子结构相对稳定；2、能够自我复制，使亲、子代之间保持连续性；3、能指导蛋白质的合成，从而控制生命过程；4、能产生可遗传的变异。 组蛋白一般特性：1、进化上极端保守，特别是H3、H4；2、无组织特异性；3、肽链上氨基酸分布的不对称性；4、存在较普遍的修饰作用；5、富含赖氨酸的组蛋白H5 非组蛋白：HMG蛋白；DNA结合蛋白；A24非组蛋白 真核生物基因组DNA 真核细胞基因组最大特点是它含有大量的重复序列，而且功能DNA序列大多被不编码蛋白
质的非功能蛋白质所隔开。人们把一种生物单倍体基因组DNA的总量称为C值，在真核生物中C值一般是随着生物进化而增加的，高等生物的C值一般大于低等动物，但某些两栖类的C值甚至比哺乳动物还大，这就是著名的C值反常现象。真核细胞DNA序列可被分为3类：不重复序列、中度重复序列、高度重复序列。 真核生物基因组的特点：1、真核生物基因组庞大，一般都远大于原核生物的基因组；2、真核基因组存在大量的的重复序列；3、真核基因组的大部分为非编码序列，占整个基因组序列的90%以上，这是真核生物与细菌和病毒之间的最主要的区别；4、真核基因组的转录产物为单顺反之；5、真核基因组是断裂基因，有内含子结构；6、真核基因组存在大量的顺式元件，包括启动子、增强子、沉默子等；7、真核基因组中存在大量的DNA多态性；8、真核基因组具有端粒结构。 原核生物基因组的特点：1、结构简练，绝大部分用来编码蛋白质，只有很少一部分控制基因表达的序列不转录；2、存在转录单元，原核生物DNA序列中功能相关的RNA和蛋白质基因，往往丛集在基因组的一个或者几个特定部位，形成功能单位或转录单元，可以被一起转录为含多个mRNA的分子；3、有重叠基因，所谓重叠基因就是同一段DNA携带两种或以上不同的蛋白质的编码信息。 DNA的结构 DNA又称脱氧核糖核酸，是deoxyribonucleic acid的简称。 L=T+W，L指环形DNA分子两条链间交叉的次数，只要不发生断裂，L是一个常量。T为双螺旋的盘绕数，W为超螺旋数。双螺旋DNA的松开导致负超螺旋，而拧紧则导致正超螺旋。 双螺旋碱基间距（nm）螺旋直径（nm）每轮碱基数螺旋方向 A-DNA0.26 2.611右 B-DNA0.34 2.010右 Z-DNA0.37 1.812左 DNA的复制 半保留复制：Semi-conservative replication；半不连续复制：Semi-discontinuous replication 把生物体的复制单位称为复制子，一个复制子只含一个复制起始点。 归纳起来，无论是原核生物还是真核生物，复制起点是固定的，表现为固定的序列，并识别参与复制起始的特殊蛋白质。复制叉移动的方向和速度虽是多种多样的，但以双向等速方式为主。 复制的几种主要方式 双链DNA的复制大都以半包六复制方式进行的，通过“眼”型、θ型、滚环型或D-环型等以复制叉的形式进行。 1、线性DNA双链进行双向复制时，由于已知的DNA聚合酶和RNA聚合酶都只能从5’ 到3’移动，所以，复制叉呈眼型； 2、环状双链DNA复制可分为θ型、滚环型和D-环形几种类型 Ⅰ、θ型，大肠杆菌染色体DNA是环状双链DNA，它的复制是典型的θ型复制，从一个起点开始，同时向两个方向进行复制，当两个复制叉相遇时，复制就停止 Ⅱ、滚环型，是单向复制的一种特殊方式，在噬菌体中很常见。DNA的合成由对正链原点的专一切割开始，所形成的自由5’端被从双链环中置换出来并为单链DNA结合蛋白所覆盖，