第七章生物反应器的放大与控制
生物工程技术的最终目标是为人类提供服务，创造社会和经济效益。因此，一个生物工程产品必须经历从实验室到规模化生产直至成为商品的一系列过程，其研究开发包含了实验室的小试，适当规模中试和产业规模化生产等几个阶段。随着生物产品的生产规模增大，生物加工过程中的关键设备——生物反应器也逐渐增大。生物反应器的放大是生物加工过程的关键技术之一。
从小型的实验室生物反应器到生产规模的生物反应器，离不开工艺条件和参数优化。这时，就要对生物反应器的多项参数进行检测，利用自动化技术实现生物反应过程的最优控制。
本章就生物反应器的放大与计算、生物反应过程的参数检测与控制作一阐述。
第一节生物反应器的放大
生物反应过程的工艺和设备改进的研究，首先在小型设备中进行，然后再逐渐放大到较大的设备中进行。然而在实践中往往是小罐中获得的规律和数据，常常不能在大罐中再现。这就涉及反应器放大的问题。生物反应器的放大是指将研究设备中的优化的培养结果转移到高一级设备中加以重演的技术，实际上也兼具生物反应过程放大的含义。它是生物技术开发过程中的重要组成部分，也是生物技术成果得以实现产业化的关键之一。
反应器的放大涉及内容较多。除涉及微生物的生化反应机制和生理特性外还涉及化工放大方面的内容，诸如：反应动力学，传递和流体流动的机理等。因此，它是一个十分复杂的过程。
目前反应器的放大方法主要有：经验放大法、因次分析法、时间常数法和数学模拟法。
一、经验放大法
经验放大法是依据对已有生物反应器的操作经验所建立起的一些规律而进行放大的方法。这些规律多半是定性的，仅有一些简单的、粗糙的定量概念。由于该法对事物的机理缺乏透彻的了解，因而放大比例一般较小，并且此法不够精确。但是对于目前还难进行理论解析的领域，还要依靠经验放大法。对于生物反应器来说，到目前为止，应用较多的方法也是根据经验和实用的原则进行反应器的放大和设计。下面介绍一下具体的经验放大原则：
（一）几何相似放大
生物反应器的尺寸放大大多数是利用几何相似原则放大。所谓的几何相似指的是两台设备的几何形状完全相似。在几何相似放大中，放大倍数实际上就是反应器体积的增加倍数，即：
（7-1）
（7-2）
和（7-3）
式中——反应器的高度，m；
——反应器的内径，m；
——反应器的体积，m3；
下标“1”——-模型反应器；
下标“2”——放大的反应器。
若按几何相似放大法，当体积增加10倍时，生物反应器的直径和高度均放大101/3倍。
（二）以单位体积液体中搅拌功率相同放大。
以单位体积液体所分配的搅拌轴功率相同这一准则进行的反应器的放大，是一般机械搅拌式化学反应器的放大准则，可以将此准则应用于生物反应器的放大，即：
（7-4）
对于不通气时的机械搅拌生物反应器，根据轴功率计算公式，可以得到：
（7-5）
因此
（7-6）
所以
（7-7）
（7-8）
式中——不通气时的搅拌功率，kW；
——反应器的内径，m；
——发酵液的体积，m3；
下标“1”——模型反应器；
下标“2”——放大的反应器。
对于通气式机械搅拌生物反应器，可取单位体积液体分配的通气搅拌功率相同的准则进行放大，即：
（7-9）
根据通气时搅拌轴功率的计算公式，可知：
（7-10）
所以
（7-11）
（7-12）
式中——通气搅拌率；
——通气量；
——空气的线速度。
（三）以单位培养液体积的空气流量相同的原则进行放大
生物细胞培养过程中空气流量的表示方式有两种：
（1）单位培养液体积在单位时间内通入的空气量（标准态），即：
，m3/（m3·min）（7-13）
（2）操作状态下空气的线速度，m/h。
，m/h （7-14）
，m3/h （7-15）
，m3/（m3·min）（7-16）
式中——反应器内径，m；
——反应器的温度，℃；
——发酵液体积，m3；
——液柱平均绝对压力，Pa。
以单位培养液体积的空气流量相同的原则进行放大时，有
，
即
（7-17）
因此
（7-18）
由上式可知，当体积放大100倍时，，如果忽略液柱压力，则即线速度增大4.64倍，其结果是显得空气线速度放大过多。
（四）以空气线速度相同的原则进行放大
以空气线速度相同的原则进行放大时有
（7-19）
即
（7-20）
由上式可知，当体积放大100倍时，即，若忽略液柱压力，即，即通风量减少4.64倍，其结果是通风量过小。
（五）以相同的原则进行放大
在耗氧发酵过程中，由于氧在培养液中的溶解度很低，生物反应很容易因为反应器供氧能力的限制受到影响，因此以反应器的相同作为放大准则，往往可以收到较好的效果。
反应器的与操作条件及培养液的物性有关，在进行放大时，培养液性质基本相同，所以可只考虑操作条件的影响。
根据文献报道，与通气量、液柱高度、培养液体积存在如下的比例关系：
（7-21）
按相等的原则进行放大，则有：
（7-22）
故
（7-23）
又因为
（7-24）
所以
（7-25）
又因为
（7-26）
故
（7-27）
也有采用下面的表达式作为放大基础：
（7-28）因此
（7-29）
若以
（7-30）
（7-31）
按相同的原则进行放大，则：
（7-32）
（7-33）
（7-34）（六）搅拌器叶尖速度相同的准则
按照搅拌器的叶尖速度相等的原则进行放大。当大小反应器中搅拌器的叶尖速度相等时，
，因此：
（7-35）
（七）混合时间相同的准则
混合时间是指在反应器中加入物料，到它们被混合均匀时所需的时间。在小反应器中，比较容易混合均匀，而在大反应器中，则较为困难。
通过因次分析，得到以下关系：
（7-36）
对于几何相似的反应器，时，从上式可以得出：
（7-37）
需要指出的是上述放大方法是各强调一个侧重点，得出的结论往往有较大的差异。下表所列出的是10L 小罐（n=500r/min，通气1VVM）放大到10000L（即放大1000倍）时，按照不同的放大准则所得出的结论，并以搅拌转速来进行比较。
从表中的数据可以看到，按照不同准则放大，结果是放大后的反应器其他参数发生了悬殊的差别。这说明在放大中选用什么准则是很重要的，这要根据放大体系的特点而确定。
反应器的放大问题现在尚未解决，在放大时往往外还要凭借经验。有人统计，实际放大过程中应用最多的是和相同。
二、其他放大方法
除了上述的一些放大方法之外，还在实验中采用因次分析法、时间常数法、数学模拟法等。
因次分析法也称相似模拟法，它是根据相似原理，以保持无因次准数相等的原则进行放大。该法是根据对过程的了解，确定影响过程的因素，用因次分析方法求得相似准数，根据相似理论的第一定律（各系统互相相似，则同一相似准数的数值相等的原理），若能保证放大前与放大后的无因次数群相同，则有可能保证放大前与放大后的某些特性相同。
迄今为止，因次分析法已成功地应用于各种物理过程。但对有生化反应参与的反应器的放大则存在一定的困难。这是因为在放大过程中，要同时保证放大前后几何相似、流体力学相似、传热相似和反应相似实际上几乎是不可能的，保证所有无因次数群完全相等也是不现实的，并且还会得出极不合理的结果。
在生物反应器的放大过程中，由于同时涉及微生物的生长、传质、传热和剪切等因素，需要维持的相似条件较多，要使其同时满足是不可能的，因此用因次分析法一般难以解决生物反应器的放大问题。为此常需要根据已有的知识和经验进行判断，以确定何者更为重要，同时也能兼顾其他的条件。
时间常数是指某一变量与其变化速率之比。常用的时间常数有反应时间、扩散时间、混合时间、停留时间、传质时间、传热时间和溶氧临界时间等。时间常数法可以利用这些时间常数进行比较判断，用于找出过程放大的主要矛盾并据此来进行反应器的放大。
数学模拟法是根据有关的原理和必要的实验结果，对实际的过程用数学方程的形式加以描述，然后用计算机进行模拟研究、设计和放大。该法的数学模型根据建立方法不同，可分为由过程机理推导而得的“机理模型”、由经验数据归纳而得的“经验模型”和介于二者之间的“混合模型”。
机理模型是从分析过程的机理出发而建立起来的严谨的、系统的数学方程式。此模型建立的基础是必须对过程要有深刻而透彻的了解。
经验模型是一种以小型实验、中间试验或生产装置上实测的数据为基础而建立的数学模型。
混合模型是通过理论分析，确定各参数之间的函数关系的形式，再通过实验数据确定此函数式中各参数的数值，也就是把机理模型和经验模型相结合而得到的一种模型。
下图为数学模拟放大法用于一般过程开发的示意图
数学模拟放大法是以过程参数间的定量关系为基础的，因而消除了因次分析中的盲目性和矛盾性，而能比较有把握地进行高倍数的放大，并且模型的精度越高，放大率、倍数越大。然而模型的精密程度又建立在基础研究之上。由于受到这方面的限制，数学模拟实际取得成效的例子不够多，特别是对生物反应过程，由于过程的复杂性，这方面的问题还远没解决，但无疑它是一个很有前途的方法。
第二节生物反应器的参数检测
一、生物加工过程的参数（物理、化学参数）
要对生化过程进行有效的操作和控制，首先要了解生化过程的状态变化，也就是要了解生化过程的各种信息。这些信息可以分为物理变量信息（如发酵温度）、化学变量信息（如pH）以及生物变量信息（如生物质浓度）。具体项目见下表：
表7-2 生物加工过程的物理、化学参数
物理参数
化学参数
间接参数成熟尚不成熟
温度pH 成分浓度氧利用速率（OUR）
压力氧化还原电位糖二氧化碳释放速率（CER）功率输入溶解氧浓度氮呼吸熵（RQ）
搅拌速率溶解CO2浓度前体总氧利用体积氧传递系数
通气流量排气氧分压诱导物
位置排气CO2分压产物
加料速率其他排气成分代谢物细胞浓度（X）
金属离子细胞生长速率
Mg2+，K+，Ca2+ 比生长速率（μ）培养液重量Na+，SO42- 细胞得率（YX/S）
培养液体积PO43- 糖利用率
NAD，NADH 氧的利用率培养液表观糖度ATP，ADP，AMP 比基质消耗率（υ）积累量脱氢酶活力前体利用率酸其它各种酶活力产物量（ρ）
碱细胞内成分比生产率消泡剂蛋白质其他需要计算的值参数
DNA
细胞量RNA 功率功率准数
气泡含量雷诺数
面积生物量表面张力生物热
碳平衡
能量平衡下面对其中的一些重要参变量简要加以说明
（一）设定参数
工业规模发酵对就地测量的传感器的使用十分慎重，不轻易采取一些无保证、未经考验的就地测量仪器。现在采用的发酵过程就地测量仪器是经过考察、很可靠的化学工厂也在使用的传感器，如用热电耦测量罐温、压力表指示罐压、转子流量计读空气流量和测速电机显示搅拌转速等。常规在线测量和控制发酵过程的设定参数有罐温、罐压、通气量、搅拌转速、液位等。
1．压强
对通气生物发酵反应，必须往反应器中通入无菌的洁净空气，一是供应生物细胞呼吸代谢所必须的氧，二是强化培养液的混合与传质，三是维持反应器有适宜的表压，以防止外界杂菌进入发酵系统。对气升式反应器，通气压强的适度控制是高效溶氧传质及能量消耗的关键因素之一。对嫌气发酵，如废水的生物厌氧生物处理，对反应体系内压强的监控也是十分必要的。
2．温度
不管生物细胞或是酶催化的生物反应，反应温度都是最重要的影响因素。不同的生物细胞，均有最佳的生长温度或产物生成温度，而酶也有最适的催化温度，所以必须使反应体系控制在最佳的发酵反应温度范围。
3．通气量
不论是液体深层发酵或是固体通风发酵，均要连续（或间歇）往反应器中通入大量的无菌空气。为达到预期的混合效果和溶氧速率，以及在固体发酵中控制发酵温度，必须控制工艺规定的通气量。当然，过高的通气量会引起泡沫增多，水分损失太大以及通风耗能上升等不良影响。
4．液面（或浆液量）
对液体发酵，反应器的液面或是装液量的控制是反应器设计的重要因素。液面的高低决定了反应器装液系数即影响生产效率；对通风液体深层发酵，初装液量的多少即液面的高低需按工艺规定确定，否则通入空气后发酵液的含气率达一定值，液面就升高，加之泡沫的形成，故必须严格控制培养基液面。特别地，对气升内环流式反应器，由于导流筒应比液面低一适当高度才能实现最佳的环流混合与气液传质，但在通气发酵过程中，排气会带出一定水分，故反应器内培养液会蒸发减少，因此液面的检测监控更重要，必要时需补加新鲜培养基或无菌水，以维持最佳液位。同理，连续发酵过程液位必须维持恒定，液面的检测控制也十分重要。
5．搅拌转速与搅拌功率
对一定的发酵反应器，搅拌转速对发酵液的混合状态、溶氧速率、物质传递等有重要影响，同时影响生物细胞的生长、产物的生成、搅拌功率消耗等。对某一确定的发酵反应器，当通气量一定时，搅拌转速升高，其溶氧速率增大，消耗的搅拌功率也越大。在完全湍流的条件下，搅拌功率与搅拌转速的三次方成正比，，其N中为搅拌转速。此外，某些生物细胞如动植物细胞、丝状菌等，对搅拌剪切敏感，故搅拌转速和搅拌叶尖线速度有其临界上限范围。
同时，搅拌功率与上述的搅拌转速的关系，是机械搅拌通气发酵罐的比拟放大基准。因而直接测定或计算求出搅拌功率也十分重要。
6．泡沫高度
液体生物发酵，不管是通气还是厌气发酵均有不同程度的泡沫产生。发酵液泡沫产生的原因是多方面的，最主要的是培养基中所固有的或是发酵过程中生成的蛋白质、菌体、糖类以及其他稳定泡沫的表面活性物质，加上通气发酵过程大量的空气泡以及厌气发酵过程中生成的CO2气泡，都会导致生物发酵液面上生成不同程度的泡沫层。如控制不好，就会大大降低发酵反应器的有效反应空间即装料系数低，增加感染杂菌的机会，严重时泡沫会从排气口溢出而造成跑料，这导致产物收率下降。
7．培养基流加速度
对生物发酵的连续操作或流加操作过程，均需连续或间歇往反应器中加入新鲜培养基，且要控制加入量和加入速度，以实现优化的连续发酵或流加操作，获得最大的发酵速率和生产效率。
8．冷却介质流量与速度
生物发酵过程均有生物合成热产生，对机械搅拌发酵罐还有搅拌热，为保持反应器系统的温度在工艺规定的范围内，必须用水等冷却介质通过热交换器把发酵热移走。根据生化反应器的热量平衡算式：
（7-38）
（7-39）
——微生物发酵热，J/min；
——搅拌热，J/min；
——冷却水所带走的热量，J/min；
——冷却水流量，m3/min；
——水的比热容，J/min3·℃；
——冷却水出口温度，℃；
——冷却水入口温度，℃；
要维持工艺要求的发酵温度，对应不同的发酵时期有不同的发酵热以及冷却介质的温度，需相应改变其流量。故必须测定冷却介质的进出口温度与流量，据此也可间接推定发酵罐中的生物反应是否正常进行。
9．培养基质浓度和产物浓度
对生物发酵生产，基质浓度如糖浓度等对生物细胞的生长及产物生成具有重要作用，在发酵结束时，培养液基质浓度则是发酵转化率及产物得率的重要衡量。尤其是连续发酵和流加培养操作，发酵液中的基质浓度更为重要。类似地，产物浓度的测知也同样重要，因为掌握了发酵液中的产物浓度，就可确定发酵的进程以及决定发酵是否正常及是否需要结束发酵。所以基质与产物浓度的检测、控制对各种发酵均是必要的。
（二）状态参数
状态参数是指能反映反应过程中微生物的生理代谢状况的参数，如pH、DO、溶解CO2、尾气O2、尾气CO2、黏度、菌浓等。
1．黏度（或表观黏度）
培养基的黏度主要受培养基的成分及浓度、细胞浓度、温度、代谢产物等影响。而发酵液的黏度（或表观黏度）对溶液的搅拌与混合、溶氧速率、物质传递等有重要影响，同时对搅拌功率消耗及发酵产物的分离纯化均起着重要作用。
2．pH
生物发酵过程培养液的pH是生物细胞生长及产物或副产物生成的指示，是最重要的发酵过程参数之一。因每一种生物细胞均有最佳的生长增殖pH值，细胞及酶的生物催化反应也有相应的最佳pH范围。而在培养基制备及产物提取、纯化过程也必须控制适当的pH。因此生物反应生产对pH的检测控制极为重要。
3．溶氧浓度和氧化还原电位
好气性发酵过程中，液体培养基中均需维持一定水平的溶解氧，以满足生物细胞呼吸、生长及代谢需要。在通风深层液体发酵过程中，溶解氧水平和溶氧效率往往是发酵生产水平和技术经济指标的重要影响因素，不同的发酵生产和不同的发酵时间，均有适宜的溶氧水平和溶氧速率。故对生物反应系统即培养液中的溶氧浓度必须测定和控制。此外，发酵过程溶解氧水平还可以作为判别发酵是否有杂菌或噬菌体污染的间接参数，若溶氧浓度变化异常，则提示发酵系统出现杂菌污染或其他问题。
对一些亚好氧的生物发酵反应如某些氨基酸发酵生产，在产物积累时，只需很低的溶解氧水平，过高或过低都会影响生产效率。这样低的溶解氧浓度使用目前的溶氧电极是无法测定的，故使用氧化还原电极电位计（ORP仪）来测定微小的溶氧值。
4．发酵液中溶解CO2浓度
对通气发酵生产，由于生物细胞的呼吸和生物合成，培养液中的氧会被部分消耗，而溶解的CO2含量会升高。对大部分的好氧发酵，当发酵液中溶解CO2浓度增至某值时，就会使细胞生长和产物生成速率下降。例如组氨酸发酵，二氧化碳分压应低于0.005MPa；而精氨酸发酵，CO2分压应在0.015 Mpa以下，否则会使生产效率降低。当然，对光照自氧的微藻培养，则适当提高CO2浓度就有利于细胞产量的提高。
5．细胞浓度及酶活特性
生化反应过程都是通过菌体的各种酶类来促使反应进行的，而菌体的浓度与酶的活动中心密切相关。通过菌体干重的测定，可以了解生物的生长状态，从而控制和改变生产工艺或补料和供氧，保证达到较好的生产水平。当然，以酶做催化剂的生化反应，则酶浓度（活度）是必须检测监控的参变量。
6．菌体形态
在生化反应过程中，菌体形态的变化也是反应它的代谢变化的重要特征。可以根据菌体的形态不同，区分出不同的发酵阶段和菌体的质量。
（三）间接参数
间接参数是指那些通过基本参数计算求得的参数，如氧利用速率（OUR）、二氧化碳释放速率（CER）、比生产速率（μ）、体积氧传质速率（KL a）、呼吸熵（RQ）等。通过对发酵罐作物料平衡可计算后者反映微生物的代谢状况，尤其能提供从生长向生产过渡或主要基质间的代谢过渡指标。
1．呼吸代谢参数
微生物的呼吸代谢参数通常有三个：即微生物的氧利用速率，二氧化碳释放速率，和呼吸熵。假设流出反应器的气体流量与空气流入量相等，空气中氧浓度为21%，二氧化碳的浓度为零，测量到排出气体的氧浓度为，二氧化碳的浓度为，则由气相物料平衡计算可得：
氧利用速率（OUR）
（7-49）
二氧化碳释放速率（CER）
（7-50）
呼吸熵（）
（7-51）
其中——空气流量，m3/min；
——反应液体积，m3。
2．菌体比生长速率
每小时每单位重量的菌体所增加的菌体量称为菌体的比生长速率，单位为1/h。菌体的比生长速率与生物的代谢有关。例如，在抗生素合成阶段，若比生长速率过大，菌体量增加过多，代谢向菌体合成的方向发展，这不利于合成抗生素。菌体的比生长速率是生化反应动力学中的一个重要参数。
3．氧比消耗速率（rO2）
氧比消耗速率称为菌体的呼吸强度，即每小时每单位重量的菌体所消耗的氧的数量，其单位为毫克分子氧/克干菌体小时。例如，在抗生素生产过程中，根据抗生素比生产速率与氧比消耗速率的关系，可以求得菌体最适当的氧比消耗速率。
二、检测方法与仪器
研究微生物生长过程所需要的检测参数大多是通过在反应器中配置各种传感器和自动分析仪来实现的。这些装置能把非电量参数转化为电信号，这些信号经适当处理后，可用于监测发酵的状态、直接作发酵闭环控制和计算间接参数。图7-2为生物反应器配置传感器或检测装置的示意说明图。
一般可粗略地把检测仪器分成在线检测（On-line measurement）和离线检测（Off-line measurement）两大类。前者是仪器的电极等可直接与反应器内的培养基接触或可连续从反应器中取样进行分析测定，如溶氧浓度、pH、罐压等；而离线测量是指在一定时间内离散取样，在反应器外进行样品处理和分析的测量，
包括常规的化学分析和自动实验分析系统。
表7-3典型生物状态变量的测量范围和准确度或控制变量的精度变量测量范围准确度或精度，% 变量测量范围准确度或精度，%
温度0~150℃0.01 MSL挥发物
搅拌转速0~3000rpm 0.2 甲醇，乙醇0~10g/L 1~5
罐压0~2bar 0.1 丙酮0~10g/L 1~5
重量90~100kg 0.1 丁酮0~10g/L 1~5
0~1kg 0.01 在线FIA:
液体流量0~8m3/h 1 葡萄糖0~100g/L <2
0~2kg/h 0.5 NH4+ 0~10g/L 1 稀释速率0~1h-1 <0.5 PO43- 0~10g/L 1~4
通气量0~2vvm 在线HPLC:
泡沫开/关酚0~100mg/L 2~5
气泡开/关碳酸盐0~100g/L 2~5
液位开/关有机酸0~1g/L 1~4
pH 2~12 0.1 红霉素0~20g/L <8
pO2 0%~100%饱和 1 其他副产物0~5g/L 2~5
pCO2 0~100mbar 1 在线GC：
尾气16%~21% 1 乙酸0~5g/L 2~7 尾气0%~5% 1 羟基丙酮0~10g/L <2 荧光0~5V —丁二醇0~10g/L <8 氧还电位0.6~0.3V 0.2 乙醇0~5g/L 2
RQ 0.5~20（mol/L）/
（mol/L）
取决于传播误差甘油0~1g/L <9
传感器0~100AU 变化很大
发酵过程对传感器的要求：
1.发酵过程对传感器的常规要求为准确性、精确度、灵敏度、分辨能力要高，响应时间滞后要小，能够长时间稳定工作，可靠性好，具有可维修性。
2.对发酵用传感器的特殊要求是由发酵反应的特点决定的，发酵底物中含有大量的微生物，必须考虑卫生要求，发酵过程中不允许有其他杂菌污染。
3.传感器与发酵液直接接触，一般要求传感器能与发酵液同时进行高压蒸汽灭菌，不能耐受蒸汽灭菌的传感器可在罐外用其他方法灭菌后无菌装入。
4.发酵过程中保持无菌，要求传感器与外界大气隔绝，采用的方法有蒸汽汽封、O形圈密封、套管隔断等。
5.发酵用传感器容易被培养基和细菌污染，应选用不易污染的材料如不锈钢，同时要注意结构设计，选择无死角的形状和结构，防止微生物附着及干扰，便于清洗，不允许泄漏。
6.传感器只与被测变量有关而不受过程中其他变量和周围环境条件变化影响的能力，如抗气泡及泡沫干扰等。
由于上述种种原因，使得许多传感器，尤其是检测化学物质浓度、微生物质浓度的传感器，很难在工业规模的生化过程中使用。
（一）主要参数检测原理及应用
1．温度的测量
常用的温度检测仪表有热电阻检测器（RTD）、半导体热敏电阻、热电偶和玻璃温度计等。其中热电阻是中低温区最常用的温度检测元件，具有性能稳定、测量精度高、在中低温区输出信号大、信号可以远传等优点。根据新的国家标准，热电阻的测温范围为-200~850℃。所以在生化反应和后处理过程中，这是最常用的测温元件。
大多数金属导体的电阻随温度而变化的关系可由下式表示：
（7-52）
式中，——分别为热电阻在t℃和t0℃的电阻值；
α——热电阻的电阻温度系数，1/℃。
从上式可见，只要α保持不变（常数），则金属电阻将随温度线性增加。且α越大，灵敏度越大。纯金属的电阻温度系数α为（0.3~0.6）%1/℃，但是绝大多数金属导体的α并不是一个常数，它也随着温度的变化而变化，只能在一定的温度范围内把它近似地看作一个常数。
典型热电阻温度与电阻的关系见图7-3。
测温电阻材料最合适的原材料是铂（Pt），此外还有铜和镍等金属。图7-4为封装在玻璃管内的测温电阻元件的结构实例。线圈的芯子由与白金线膨胀系数相同的玻璃圆棒制成，在这个圆棒上开两个平行的槽，在上面往复缠上白金线并使其固定，这是为了防止电感应的缘故，再将线圈芯子放入玻璃管内，并把两端封死。套管式测温电阻是将测温电阻元件与无机绝缘材料一起牢固地封入在很细的不锈钢管前端的一种温度传感器。这种测温电阻具有响应速度快，抗震性强，对恶劣环境适应性强，弯曲加工容易等优点。
2．压强的检测
压力、压差传感器的测量原理大致可分为以下四个方面：
（1）压力与弹性体的变形应力相平衡，并转换成弹性体的位移；
（2）压力与别的流体压力或电磁力等相平衡，并将其变换成力或电流，这种原理多用于工业生产过程压力测量变送传感器；
（3）压力与流体的重量相平衡，由对应的液体量求得压力，如U形管压力计；
（4）压力与固体的重量相平衡，由对应的固体重量求得压力，多用来标定压力计。
工业上常用的为弹性压力计，主要有波登管式压力传感器、波纹管式压力传感器、膜式压力传感器、电阻应变片等。它们存在的共同性问题是温度对弹性的影响，滞后现象，时效性等。在具体应用上，因观测和控制的需要，通常把压力信号转换成电信号，以便能远距离监控。在生物反应器中，在压力表安装时必须注意使仪表的管路能够加热灭菌，尽量不存死角，这样才能保证反应器的无菌操作。
3．液位和泡沫高度的检测
在生化反应过程中，液位（或泡沫液位）测量有几种方法，其中最简便的方法是导电电极法。这种导电电极可用在不腐蚀导体的液体的液面测量。如图7-5所示，该测量方法可由一支或两支电极所组成，若罐体是金属材料制成的，可只用一支电极。当液面或泡沫达到不绝缘的金属棒的端点时，就会有电流信号
产生，指示出液体或泡沫的存在。这种液位电极传感器所施加的电压一般不超过24V，电流大约为15mA。比较安全可靠的电压为交流10V。采用交流的目的是防止被测液体的极化。
（a）两支电极法（b）单电极法
图7-5 电极法测液面
另一种泡沫传感器是电阻式泡沫电极。当电极垂直安装在罐体上时，其电极电流正比于不绝缘电极棒浸没入液体的长度，由此来测量泡沫液位高度。这种电极有单电极形式和双电极形式。当使用单支电极测量液位或泡沫液位时，往往由于结垢、微生物在电极上的附着等容易造成短路，出现虚假信号。当用该信号进行控制时，就会产生误动作。要防止这一现象发生，主要是在传感器上进行改进。一般用的是单电极传感器，现在可改用双电极传感器，如图7-6所示。这种双电极传感器，比单电极传感器多了一个电极，即保护电极（也叫截流环）。该保护电极能对应生化反应过程中的结垢污染、绝缘降低而造成的漏电流，产生一个相应的补偿作用，这样，就可以在比较恶劣的工作环境下工作，提高了泡沫液位测量准确性，确保泡沫液位控制系统的正确控制。
4．流量测量
测量流量的方法很多，所用的仪表结构各不相同。按照工作原理，流量仪表大致可分为三大类：容积式、速度式和质量式流量计。容积式流量计应用容积法测量流量，即以单位时间内所排出流体的固定容积数目作为测量依据来计算流量，它包括椭圆齿轮流量计、腰轮流量计、括板式流量计及旋转活塞式流量计等。其特点是流量的大小以及流体的密度、黏度等物理条件对精度影响较小，因而可得到较高的测量精度。速度式流量计主要应用流体力学法测量流量，即以测量流体在管道内的流速作为测量依据来计算流量。这类流量计包括差压式流量计、转子流量计、电磁流量计、涡轮流量计、靶式流量计等。质量流量计大致可分成两类：直接型质量流量计和间接型质量流量计。直接型质量流量计是通过直接检测与质量流量成比例的参数来实现质量流量的测量。间接型质量流量计则是通过体积流量计与密度计的组合来实现质量流量测量。下面简要介绍其中几种常见的流量计。
（1）差压式流量计
差压式流量计也叫节流式流量计，是流量测量中最成熟、最常用的一种流量计，它依据流体流动的节流原理，利用流体流经节流装置时产生的压力差来实现流量测量，其压力差与流体流量成对应关系。如图7-8这种流量计由节流元件、引压导管、差压计（或差压变送器及显示仪表）三部分组成。节流元件将被测介质的流量变换成差压信号，经引压管的传递，进入差压计或差压变送器及显示仪表进行显示。这种装置比较简单，长期用于液体、气体的流量测量。
（2）转子流量计
转子流量计由一根上粗下细的锥形管和一个能在其内上下浮动的转子所组成。如图7-9，被测流体自下而上从转子和锥形管内壁之间的环隙中通过，由于流体通过环隙时被突然收缩，在转子上下两侧就产生了压差，使转子受到一个向上的冲力而浮起。当这个力正好等于浸没在流体中的转子的重量时，则作用在转子上的上、下两个作用力达到平衡，转子就停留在某一高度上。如果流体流量增加，则作用在转子上的“冲力”加大，转子就要向上运动。而随着转子的上升，转子与锥形管之间的环形流通截面积增大，流速减低，因而“冲力”也就降低，当“冲力”再次等于转子在流体中的重量时，转子就停留在一个新的高度上。这样，根据转子平衡位置的高低，就可得知流量的大小。
转子流量计的刻度标定及实际流量与被测流体介质性质及工作状态有密切关系，当实际使用条件与刻度标定时的条件不一致时，就必须对流量指示值进行标定。对于液体流量。
（7-53）
其中，为被测液体实际流量；为用水标定的仪表刻度体积流量指示值（标准状态下）；为转子材料密度（通常采用耐酸不锈钢，）；为被测液体的密度；为标定介质水的密度（在101.3）
对于气体流量（7-54）
其中，为被测气体实际体积流量（工作状态下）；为仪表刻度体积流量指示值（101.32kPa，293K下空气标定）；分别为工业状态下被测气体的绝对压力和绝对温度；、分别为工业标准
状况时的绝对压力、绝对温度（）；、分别为标定气体（空气）和被测气体在标准状态（、）下的密度（）。
当用金属管转子流量计测量饱和蒸汽（温度不超过200℃）流量时，
（7-55）
其中，为被测饱和蒸汽的质量流量；为仪表刻度体积流量指示值（101.32，293下，用水标定）；为被测饱和蒸汽密度。
（3）电磁流量计
电磁流量计是利用电磁感应原理制成的流量测量仪表，凡是导电液体（如酸、碱盐溶液）以及含有固体颗粒或纤维的导电液体（如纸浆、泥浆糖浆、乳制品等）均可用它来计量。
电磁流量计由检测和转换两部分组成，前者将被测介质流量转换成感应电势，然后由后者转换成
4~20mA直流电流作为输出，其原理如图7-10所示。在一段非导磁材料制成的管道外面，安装有一对磁极N和S，用以产生磁场，当导电液体流过管道时，因流体在磁场中作垂直方向流动而切割磁力线。根据法拉第电磁感应定律，这时在磁极垂直方向安装的两个电极上将产生感应电势。其大小为
（7-56）
式中——感应电势，V；
——常数；
——磁感应强度，T；
——管道直径，m，即垂直切割磁力线的导体长度；
——垂直与磁力线方向的液体平均流速，m/s；
因为（7-57）
即（7-58）
从其测量原理可看出，电磁流量计采用非接触式测量，具有压力损失小、反应速度快、测量范围大、输出信号不受液体的物理条件变化和流动状态的影响等特点。但被测介质必须是导电的液体，一般其导电率要求不小于水的导电率。
5．发酵液黏度的测量
发酵上常用的黏度测定仪毛细管黏度计、回转式黏度计和涡轮黏度计等。一般装设自动无菌取样循环系统，使发酵液通过取样管路流过回转式黏度计或毛细管黏度计，以实现发酵液黏度的连续在线检测。回转式黏度计测定范围为0.015~100Pa·S，响应时间数十秒，灵敏度为满刻度的±1%。
6．搅拌转速和搅拌功率
搅拌转速检测的常用方法有磁感应式、光感应式和测速发电机等三种。前两种测速仪是利用搅拌轴或电机轴上装设的感应片切割磁场或光束而产生脉冲信号，此信号即脉冲频率与搅拌转速相同。而测速发电机是利用在搅拌轴上或电机轴上装设一小型发电机，后者的输出电压与搅拌速率成线性关系。搅拌功率直接影响发酵液的混合与溶氧、细胞分散及物质传递、热量传递等特性，但目前，生产规模的发酵罐搅拌功率只是测定驱动电机的电压与电流，或直接测定电机搅拌功率，此功率中包含了传动减速机构的功率损失。
7．pH值的测量
为了测量pH值，需要一个测量电极和一个参比电极，其工作原理是利用玻璃电极与参比电极浸泡于某一溶液时具有一定的电位，其pH可表示为：
pH（7-59）
式中——标准电极电位，mV；
——被测溶液的玻璃电极电位，mV；
——法拉第常数；
——气体常数，8.314J/（mol k）；
——热力学温度，K；
pH电极最重要的部位为玻璃微孔膜，若受到蛋白质等大分子污染吸附，则影响膜内外之间的质量传递，pH计的灵敏度和响应时间会下降和延长，此时必须用蛋白酶浸泡使蛋白质酶解溶出。
现在一般采用复合电极。在复合电极中，玻璃电极由参比电极包裹着。由式（7-59）可见温度对pH 值的准确测量有很大的影响，为了补偿温度的影响，在pH复合电极中加一温度敏感元件，从而构成测量电极、参比电极和温度传感元件三位一体的三合一电极，对环境温度有很好的补偿作用。此外，电极内容
第七章生物反应器的放大与控制 生物工程技术的最终目标是为人类提供服务，创造社会和经济效益。因此，一个生物工程产品必须经历从实验室到规模化生产直至成为商品的一系列过程，其研究开发包含了实验室的小试，适当规模中试和产业规模化生产等几个阶段。随着生物产品的生产规模增大，生物加工过程中的关键设备——生物反应器也逐渐增大。生物反应器的放大是生物加工过程的关键技术之一。 从小型的实验室生物反应器到生产规模的生物反应器，离不开工艺条件和参数优化。这时，就要对生物反应器的多项参数进行检测，利用自动化技术实现生物反应过程的最优控制。 本章就生物反应器的放大与计算、生物反应过程的参数检测与控制作一阐述。 第一节生物反应器的放大 生物反应过程的工艺和设备改进的研究，首先在小型设备中进行，然后再逐渐放大到较大的设备中进行。然而在实践中往往是小罐中获得的规律和数据，常常不能在大罐中再现。这就涉及反应器放大的问题。生物反应器的放大是指将研究设备中的优化的培养结果转移到高一级设备中加以重演的技术，实际上也兼具生物反应过程放大的含义。它是生物技术开发过程中的重要组成部分，也是生物技术成果得以实现产业化的关键之一。 反应器的放大涉及内容较多。除涉及微生物的生化反应机制和生理特性外还涉及化工放大方面的内容，诸如：反应动力学，传递和流体流动的机理等。因此，它是一个十分复杂的过程。 目前反应器的放大方法主要有：经验放大法、因次分析法、时间常数法和数学模拟法。 一、经验放大法 经验放大法是依据对已有生物反应器的操作经验所建立起的一些规律而进行放大的方法。这些规律多半是定性的，仅有一些简单的、粗糙的定量概念。由于该法对事物的机理缺乏透彻的了解，因而放大比例一般较小，并且此法不够精确。但是对于目前还难进行理论解析的领域，还要依靠经验放大法。对于生物反应器来说，到目前为止，应用较多的方法也是根据经验和实用的原则进行反应器的放大和设计。下面介绍一下具体的经验放大原则： （一）几何相似放大 生物反应器的尺寸放大大多数是利用几何相似原则放大。所谓的几何相似指的是两台设备的几何形状完全相似。在几何相似放大中，放大倍数实际上就是反应器体积的增加倍数，即： （7-1） （7-2） 和（7-3） 式中——反应器的高度，m； ——反应器的内径，m； ——反应器的体积，m3； 下标“1”——-模型反应器；
综合实训一生物反应器的操作 一、目的要求： 1.掌握机械搅拌通风发酵罐的基本结构 (1)发酵罐主体 (2)蒸汽灭菌系统：正确把握各阀门的操作 (3)通气系统 (4)加热冷却循环系统：各管道联络关系 (5)搅拌动力系统 (6)智能控制系统 2.掌握发酵罐小试的基本操作，包括：培养基配制，灭菌，接种，参数设定 3.掌握发酵过程中的参数测定和在线控制，包括：pH，DO，温度，搅拌速度， 生物量，残糖含量，产物生成量，消泡，CO2。 4.运用所学知识分析发酵过程中的实验数据，讨论某一特定菌株的发酵规律。 二、实验试剂和仪器 1、解脂假丝酵母AS2.1379培养基的配制 培养温度：30℃ 培养时间：2天 （1）种子培养基(100ml)：蔗糖2.0g, 蛋白胨0.5g,NaCl 0.2g, K 2HPO 4 0.2g, 酵母浸膏0.5g； (2)发酵培养基：(%,W/V): 豆油4.0, 全脂豆粉4.0, K2HPO4 0.1, KH2PO4 0.1. 2、主要试剂和原料 菜籽油、橄榄油、玉米油、叔丁醇、甲醇、NaOH、CuSO4 3、仪器 分光光度计、CRYOBANK TM菌种保存管、摇床、电子天平、恒温培养箱、超净
实验台、离心机、50ml锥形瓶、培养皿、离心管、移液管、滴管、烧杯等 三、实验步骤 1、发酵罐操作步骤： （一）了解机械搅拌通分发酵罐的基本结构 （1）．罐体 （2）．发酵罐的搅拌系统 （3）．空气供给系统 （4）．温度控制系统 （5）．pH控制系统 （6）．过程变量的测量 （7）．灭菌系统 （二）生物过程灭菌与发酵过程的操作 1、灭菌操作过程 2、发酵过程操作 （三）测量与控制系统 2、具体操作过程 1）. 了解机械搅拌通分发酵罐的基本结构 2）. 培养基的配制 3）. 装料、灭菌 4）. 溶氧电极“0”的标定 灭菌完毕，此时发酵罐中为100％水蒸气分压，标定溶氧为“0” 5）. 降温冷却 6）. 取样操作 旋松放料口螺旋阀门（开启方向与正常螺旋相反），打开取样阀，先弃掉约20-30mL样液（为什么？），再收集30-50mL灭菌培养基液体，关闭放料阀、取样阀、样液用已灭菌的4层纱布过滤样液（4℃冰箱保存），样液作用测定用。7）. 接种 当罐温降低至40℃以下时，采用火圈法接种摇瓶种子100mL。 火圈法接种：当各测量参数显示正常稳定时，就可进行接种（接种时应确保
生物反应器 生物反应器，是指利用自然存在的微生物或具有特殊降解能力的微生物接种至液相或固相的反应系统。目前研究得最多的两种反应器是“升降机型反应器”和“土壤泥浆反应器”。升降机型反应器是通过水相的流动来提供适当的营养、碳源和氧气，从而达到降解土壤中污染物质的目的。与固相系统相比，生物反应器能够在更短的时间内将污染物进行有效降解。该生物反应器技术已经应用于有机污染土壤的生物修复中。通过研究生物反应器，我们可以了解到：可以知道为达到一定的生产目的需要多大的生物反应器，确定什么样的结构更好；其次，对已有的生物反应器进行分析，达到优化的目的；还有就是分析各种生物反应器的数据，从而对细胞的生长、代谢等过程有更加深入的理解，生物反应器是工程学的一部分也是化学工程的一个分支，加上成本低.、设备简单、效率高、产品作用效果显著、减少工业污染等优点使他能够在很多方面都有着重要的应用，如改良乳汁品质、生产药用蛋白、外源基因在动物体内的位点整合问题、.乳蛋白基因表达组织特异性问题、目的蛋白的翻译后修饰问题、转基因表达产物的分离和纯化问题、转基因的技术与方法问题、伦理道德问题等诸多方面。 生物反应器经历了三个发展阶段：细菌基因工程、细胞基因工程、转基因动物生物反应器。转基因动物生物反应器的出现之所以受到人们极大的关注，是因为它克服了前两者的缺陷，即细菌基因工程产物往往不具备生物活性，必须经过糖基化、羟基化等一系列修饰加工后才能成为有效的药物，而细胞基因工程又因为哺乳动物细胞的培养条件要求相当苛刻、成本太高而限制了规模生产。另外，转基因动物生物反应器还具有产品质量高、容易提纯的特点。一般把目的片段在器官或组织中表达的转基因动物叫做动物生物反应器。几乎任何有生命的器官、组织或其中一部分都可以经过人为驯化为生物反应器。从生产的角度考虑，生物反应器选择的组织或器官要方便产物的获得，例如乳腺、膀胱、血液等，由此发展了动物乳
生物反应器优化——放大控制的最佳手段 在生物产业的生产中，中试放大、处理和控制的知识应该被分享和记载以便获得和维持卓越运营。 通过音频工程基本原理和彻底的过程理解，现代细胞培养工艺已经成功放大到大于25000L的体积。这并不是偶然发生的，而是生物工程专家对生物反应器的性能和发展趋势作了系统全面的描述，开发了坚实可靠的放大工序，建立和维持了恰当的质控标准的结果。对于一家cGMP标准的细胞培养工厂而言，那些对运行最佳实践进行确定并记载的生产商同时也是能够保持成功运行并以及时可靠的服务为病人提供优质生物产品的生产商。 图1.一个生物反应器内喷头位置的描述 (并不是对应尺寸). 生物反应器设计 恰当的生物反应器设计可以解决许多可能会产生的问题。一个不应该被低估的有关生物反应器设计的关键问题就是反应器间几何相似的重要性:维持纵横比、叶轮尺寸比、叶轮间距比和挡板的尺寸和位置将大大提高放大生产后的成功率。恰当的生物反应器设计可以减少有限时间内的质量和过程验证，同时使得工艺过程更加稳健、操作更易成功。 另一个与生物工程中试放大成功有关的重要方面就是喷头的设计。通常情况下，生物反应器内会安装两个喷头但是只有一个喷头用于种子生物反应器。尽管工业生产中有不同型号的喷头可供使用，我们成功的补充运用了钻杆和喷射石。钻杆产生大的气泡和低的kLa(后面将加以讨论)，而喷射石产生小的气泡和高的kLa 以至于同样气流速率下可以递送更多数量的氧气进入细胞悬液中。图1和图2阐明了喷头的位置和两个喷头的类型。 生物反应器输送氧气进入细胞的能力可由方程1中所示的质量转移关系定义。氧气浓度的改变由kLa、气泡中的平均饱和氧气浓度、溶解的氧气浓度([O2]dissolved)和任何存在细胞的氧气吸收控制(OUR)。 方程1： kLa可以根据功率/体积和表面气体流速的幂律函数作图。对kLa的理解可以帮助我们估计生物反应器的OUR，预测所需氧气的流速和预测溶解的二氧化碳水平的时间和进程曲线。 基于过程的需要和喷头的能力，工艺工程师确定生物反应器的优化配置。如果过程OUR需要足够低，默认的设置就是在种子生物反应器中使用一个钻杆，在生产反应器中使用两个钻杆。钻杆和喷射宝石可以合并使用，但由喷射宝石提供的氧气转移能力却并不是必须的。如果可能的话，应该避免使用喷射宝石，因为这样增加了生物反应器安装的操作复杂性、在维持溶解二氧化碳水平的过程中气流流速的手动改变、增加了泡沫和潜在的清洁问题。
动物细胞培养生物反应器的操作模式 米力 第四军医大学细胞工程中心，国家863西安细胞工程基地 陕西西安，710032 动物细胞培养工艺的选择首先考虑的重要一点是该产品所涉及的生物反应器系统。选择反应器系统也就是选择产品的操作模式，操作模式选择将决定该产品工艺的产物浓度、杂质量和形式、底物转换度、添加形式、产量和成本，工艺可靠性等。与许多传统的化学工艺不同，动物细胞反应器设备占整个工艺资金总投入的主要部分（＞50%），也就是说动物细胞培养工艺的选择主要部分是生物反应器系统的选择。选择反应器系统及培养工艺时，必须对工艺的整体性进行全面考虑，主要包括以下几个方面：细胞株及生长形式、产物表达量和稳定性，培养基质及代谢物，产物分离和纯化难度等。 动物细胞大规模培养的生物反应器操作模式，一般分为分批式操作（batch）、流加式操作（Fed-batch）、半连续式操作（semi-continuous）、连续式操作（continuous）和灌流式操作（perfusion）五种操作模式。 1. 批式操作（batch culture） 批式操作是动物细胞规模培养发展进程中较早期采用的方式，也是其它操作方式的基础。该方式采用机械搅拌式生物反应器，将细胞扩大培养后，一次性转入生物反应器内进行培养，在培养过程中其体积不变，不添加其它成分，待细胞增长和产物形成积累到适当的时间，一次性收获细胞、产物、培养基的操作方式。 该方式的特点:(1) 操作简单。培养周期短，染菌和细胞突变的风险小。反应器系统属于封闭式，培养过程中与外部环境没有物料交换，除了控制温度、pH值和通气外，不进行其他任何控制，因此操作简单，
1.3生物反应器的放大 1.3.1引言 生物工程技术的最终目标是为人类提供服务，创造社会和经济效益，因此一个生物工程产品必须经历从实验室到规模化生产之至成为商品的一系列过程。这一系列过程可分为三个阶段： 1.实验室阶段——基本生物细胞的筛选和培养基的研究，摇瓶培养或1——3L 反应器进行 2.中试阶段——小型反应器5——500L规模，环境因数最佳操作条件研究。 3.工厂化规模——实验生产至商业化生产，提供产品并获经济效益。 以上同一发酵生产，规模不同，生物反应相同，但反应溶液的混合状态、传质与供热速率等不尽相同，细胞生长与代谢产物生成的速率也有差别。 1.3.2生物反应器的放大： 1）定义： 生物反应器的放大就是在生物反应器放大过程中，也就是以中试反应设备的实验数据为依据，设计制造大规模反应系统以进行工业规模生产。 2）放大的核心问题和目的 （1）核心问题： 生物反应器中有三种重要的过程：热量传递过程，微观动力学过程（主要指生物反应的速率问题，特别是细胞生长速率，各种基质组分消耗的速率、代谢产物的生成速率等），质量传递过程。其中核心问题是传质过程，其中限制性的传质速率就是气态氧向液相中传递（溶解）的速率。（氧的传递通常是气相的氧先溶在发酵液中再传递给菌体。为什么氧的溶解速率为限制性速率？？请看书中19页的表1-4） （2）放大的目的或指标 维持中试所得到的最佳的细胞生长速率，产物的生成速率。 3）生物反应器的放大原则 生物反应器的类型很多，所使用的体系也各异。因此生物反应器的放大是
比较复杂的。书中介绍的是机械搅拌发酵罐的一些经验放大方法。需要注意的是运用不同的放大原则，放大后罐的操作条件是不一样的。看书中27页得表1-7.这说明在放大中选用什么准则是要积累较多的经验的。 1.4生物反应器的检测和控制 1.4.1引言 根据目前人们对生物反应过程的理解，生物反应器的检测和控制对象主要包括三个部分的参数，即， （1）生物反应进程的物理条件，如温度、压力、搅拌速度等； （2）生物反应器进程中的化学条件，如液相pH，氧气和二氧化碳的浓度等； （3）生物反应器进程中的生化参数，如生物体量，生物体营养和代谢产物浓度等。 以上参数中，大部分物理和化学参数都能够使用一般的手段进行在线 检测和控制。但是进行生化参数的在线检测和控制却非常困难。 1.4.2生物反应器的检测方法 生物反应过程参数检测方法可分为在线检测和离线检测。 1）在线检测：最常用的方法。 （1）过程： 将能够感应检测参数变化的传感器直接放到生物反应器中的测量点上，传感器将测量点的待测参数变化转化为电信号，经放大，送到显示系统和控制单元。（2）传感器： A．功能：感应生物反应过程的各种物理和化学变化，并将这些变化转化为电信号，供放大、显示、记录以及送到反应器的控制单元。通常使用的测量温度的有温度探头，溶氧电极，ph电极。 B．应满足的条件 能够在生物反应器上有效使用的传感器应满足以下条件： （1）反应灵敏快速。传感器是否灵敏对生物反应过程的检测和控制非常重要。如果传感器的反应滞后于生物反应器内部的变化就 意味着传感器得到的数值与实际情况有一个时间差，这个时间
动物细胞培养生物反应器的操作模式
动物细胞培养生物反应器的操作模式 米力 第四军医大学细胞工程中心，国家863西安细胞工程基地 陕西西安，710032 动物细胞培养工艺的选择首先考虑的重要一点是该产品所涉及的生物反应器系统。选择反应器系统也就是选择产品的操作模式，操作模式选择将决定该产品工艺的产物浓度、杂质量和形式、底物转换度、添加形式、产量和成本，工艺可靠性等。与许多传统的化学工艺不同，动物细胞反应器设备占整个工艺资金总投入的主要部分（＞50%），也就是说动物细胞培养工艺的选择主要部分是生物反应器系统的选择。选择反应器系统及培养工艺时，必须对工艺的整体性进行全面考虑，主要包括以下几个方面：细胞株及生长形式、产物表达量和稳定性，培养基质及代谢物，产物分离和纯化难度等。 动物细胞大规模培养的生物反应器操作模式，一般分为分批式操作（batch）、流加式操作（Fed-batch）、半连续式操作（semi-continuous）、连续式操作（continuous）和灌流式操作（perfusion）五种操作模式。 1. 批式操作（batch culture） 批式操作是动物细胞规模培养发展进程中较早期采用的方式，也是其它操作方式的基础。该方式采用机械搅拌式生物反应器，将细胞扩大培养后，一次性转入生物反应器内进行培养，在培养过程中其体积不变，不添加其它成分，待细胞增长和产物形成积累到适当的时间，一次性收获细胞、产物、培养基的操作方式。
该方式的特点:(1) 操作简单。培养周期短，染菌和细胞突变的风险小。反应器系统属于封闭式，培养过程中与外部环境没有物料交换，除了控制温度、pH值和通气外，不进行其他任何控制，因此操作简单，容易掌握；(2)直观的反应细胞生长代谢的过程。由于培养期间细胞的生长代谢是在一个相对固定的营养环境，不添加任何营养成分,因此可直观的反应细胞生长代谢的过程,是动物细胞工艺基础条件或"小试"研究常用的手段；(3)可直接放大。由于培养过程工艺简单，对设备和控制的要求较低，设备的通用性强，反应器参数的放大原理和过程控制，比较其它培养系统较易理解和掌握，在工业化生产中分批式操作是传统的、常用的方法，其工业反应器(Genetech)规模可达12000L。 分批培养过程中，细胞的生长分为五个阶段：延滞期、对数生长期、减速期、平稳期和衰退期，见图1。分批培养的周期时间多在3~5天，细胞生长动力学表现为细胞先经历对数生长期（48~72h）细胞密度达到最高值后，由于营养物质耗劫或代谢毒副产物的累积细胞生长进入衰退期进而死亡，表现出典型的生长周期。收获产物通常是在细胞快要死亡前或已经死亡后进行。 图1 分批式培养动物细胞生长曲线
第七章酶反应器的类型与选择 ◆用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。 ◆按照结构的不同分为: 搅拌罐式反应器（Stirred T ank Reactor, STR）、鼓泡式反应器(bubble column reactor, BCR )、填充床式反应器(packed column reactor, PCR )、流化床式反应器( Fluidized Bed Reactor, FBR)、膜反应器(Membrane Reactor, MR)等； ◆酶反应器的操作方式可以分为分批式反应(batch )、连续式反应(continuous )和流加分批式反应(feeding batch ); ◆将反应器的结构和操作方式结合一起，对酶反应器进行分类， 连续搅拌罐反应器（Continuous Stirred Tank Reactor, CSTR）、分批搅拌罐反应器（Batch Stirred Tank Reactor, BSTR）等。 1.酶反应器的类型 ◆常用的酶反应器类型
1.1搅拌罐式反应器： ◆搅拌罐式反应器(stirred tank reactor, STR)是有搅拌装置的一种反应器(图8-1，8-2所示)。◆在酶催化反应中是最常用的反应器。它由反应罐，搅拌器和保温装置组成。 ◆搅拌式反应器的操作方式可以根据需要采用分批式（batch）、流加分批式(feeding batch)和连续式(continuous)三种。与之对应的有分批搅拌罐式反应器和连续搅拌罐式反应器之分。 (1)分批搅拌罐式反应器： 图8-1 分批搅拌罐式反应器(2)搅拌罐式反应器： 连续搅拌罐式反应器（continuous stirred tank reactor ,CSTR）的结构示意图如图8-2
第七章生物反应器习题 1.何谓恒化器，何谓恒浊器，二者有何区别？ 2.某一酶促反应可以米氏方程表达，已知Km = 0.03mol/ L, r m=13 mol /(L?min),底物流量F = 10L/ min, 入口底物浓度S in= 10mol /L，底物的95%转化为产物，计算以下反 应器条件下所需反应器体积：（1）CSTR 条件下；（2）CPFR 条件下。 3． 初始浓度为0.1mol /m3的麦芽糖在酶的作用下加水水解生成葡萄糖， 底物流量 F = 0.002m3/ s ，转化率χ = 80%，反应符合米氏反应规律， r max= 4.39 ×10 -3mol/( m3?s) ,K =1.03mol /m3。求（1）采用单级CPFR 反应器时 所需体积；（2）采用单级CSTR 反应器时所需体积；（3）其他条件不变，采用两个CSTR 反应器时的反应体积；比较上述3 种情况。 4．利用海藻酸钙凝胶包埋法固定化葡萄汁酵母，采用填充床式反应器，连续加入葡萄糖底 =0.80的反应器。生物反应可采用米氏方程物，产物为乙醇。试设计一确定保转化率χ 2 来描述，已知， K′= 1.74 ×102mol /m3。空隙率为0.4; 入口处底物浓度为S in =10mol /m3；底物流量F = 5.0×10-3m3/ s 。 5. 带有挡板的通用式发酵罐，罐直径D1=0.5m，安装涡轮搅拌器，转速为150rpm，若以单位体积搅拌功率一定，放大至D2=1.5m，问大型罐涡轮搅拌器的转速N2 为多少？另外，若两罐内的液体循环速度相同，N2 为多少？假定以上各状态反应液均为湍流状态。 6. 有一发酵产品，采用具有六弯叶涡轮搅拌器的通用式发酵罐进行实验。经小罐到大罐逐步放大，试验证明：这种发酵能有效地采用单位体积等功率地放大方法。最后在500L 中间规模试验发酵罐中，得到最高产率时地工艺条件是：搅拌转速为300r/min；风量比 0.3m3/（m3?min），并测得在通风情况下得功率消耗为0.53kW。现放大到10m3，求大罐的工艺条件。罐的装填系数为0.7。
齐志BC-7L生物反应器操作指南 一、清洗 玻璃罐体及补料瓶等玻璃器皿先用洗洁精浸泡清洗，然后用自来水将洗洁精彻底冲洗干净后，再用浓硫酸/重铬酸钾洗液浸泡过夜，取出后用自来水冲洗10遍以上，纯化水冲洗6遍以上。 不锈钢罐盖及不锈钢管，快接头，硅胶管，瓶盖等材料先用洗洁精浸泡清洗，然后用自来水将洗洁精彻底冲洗干净后，再用1%氢氧化钠溶液浸泡过夜，取出后用自来水冲洗10遍以上，纯化水冲洗6遍以上。 清洗时使用软布或软刷，碱液或酸液浸泡时，要保证管路及内壁等充分浸泡到。 筛网清洗存放时要小心，不要被硬物划破，有条件的话，用氢氧化钠溶液煮沸清洗或放在氢氧化钠溶液中超声波清洗。 pH电极用纯化水清洗干净后，将电极头部浸泡在饱和KCl溶液中，放在电极包装盒内。溶氧电极用纯化水清洗干净后，沥干放在电极包装盒中。温度电极一般不需要清洗，妥善放置即可。 清洗后的上述设备若要马上准备投入使用，则装配连接后灭菌待用。若暂时一段时间不用，既可以装配连接灭菌后放置也可以彻底烘干后放置。 二、罐体装配及管路连接 罐体清洗后，给罐内装入约2L的PBS(要保证液位没过DO及pH电极)。 将罐盖与罐体底座的螺丝孔对好，旋入配套的螺丝，先用手适度拧紧后再用内六角工具对角均匀拧紧。 罐盖固定好后，将排气瓶，补料瓶，碱瓶，取样瓶等用硅胶管或快接头与罐盖上的相应接口连接起来。 pH及DO电极清洗校正后，也慢慢小心插入到相应的接口中，用手拧紧即可。切勿使用扳手等工具，防止用力过度损坏电极。 三、校正电极 将pH 和DO电极与控制柜上的电极线连接起来，用管理员权限登陆控制系统，切换到电极校正界面。 pH电极校正： pH电极用纯化水清洗干净，轻轻用滤纸吸干水分(切勿摩擦pH敏感膜)。 ZERO校正：用6.86缓冲液，校正值设为6.86。将pH电极放入到准确可靠的6.86缓冲液中，待PV值稳定后，按下ZERO键，等待PV值变为6.86后，再进行SPAN校正。 SPAN校正：用9.18缓冲液，校正值设为9.18。将pH电极清洗拭干后放入到准确可靠的9.18缓冲液中，待PV值稳定后，按下SPAN键，等待PV值变为9.18。 检测校正结果：重新将pH电极清洗拭干后放入到准确可靠的6.86缓冲液中，如果PV 值与6.86偏偏差≤±0.06，校正可靠。如果PV值与6.86偏差较大，重复上述校正步骤，在6.86与9.18之间来回校正几次，待PV值符合要求即可。
一次性生物反应器与平行放大 【定义】 一次性生物反应器 (Single-use bioreactor，SUB) 或用后可弃生物反应器 (Disposable bioreactor)，是使用一次性袋代替由不锈钢或玻璃制成的培养容器的生物反应器。 【组成】 一次性袋通常由三层塑料箔制成： ?一层由聚对苯二甲酸乙二醇酯或低密度聚乙烯 (LDPE) 制成， 以提供机械稳定性。 ?中间层由聚乙烯醇 (PVA) 或聚氯乙烯 (PVC) 制成，用作气 体屏障。 ?最后，与细胞培养物接触的接触层由PVA或聚丙烯 (PP) 制 成。 包裹着一次性袋的是永久硬性支撑结构（通常为摇动支座或长方体或圆柱形钢筒）。此结构可以确保在培养过程中一次性袋的设计特性不变化。一次性袋需要完全适合其保持装置，以防止由于设置期间展开不完全或者不正确而导致的和传统反应器的不可比性。 与产品接触的一次性材料必须经监管机构认证。 【分类】 一次性生物反应器的种类： ?波浪式生物反应器：波浪式生物反应器通过摇摆的动作来混 合。此类型不需要在一次性袋中使用任何机械搅拌器。适合 于各种各样的细胞培养应用，包括常规批次、补料批次和灌 注培养工艺。 ?搅拌式生物反应器：使用像传统生物反应器相似的搅拌器， 但是搅拌器被整合在塑料反应袋中，通常也使用塑料材质。 封闭的袋子和搅拌器预先灭菌处理，通常使用伽马射线。使 用时，将一次性袋安装在固定生物反应器支撑中，再将搅拌 器机械地或磁性地连接到驱动器即可。 【一次性生物反应器选择和评估工艺时需要考虑的因素】
?Scale-up 纵向扩展 ?Scale-out 横向扩展（平行放大） 【产量最大化】 产品与产品间转换时间对产量的影响：一次性反应器和不锈钢的设备，转换时间差别很大，前者需要3-5天，那么后者需要7-14天。当设备采用硬管和不锈钢设计时，批量吞吐量减少20%
第七章污染土壤的现场修复 第一节生物现场修复技术 一、概述 现场修复方法是将受污染土壤在原地处理。处理期间，土壤基本不被搅动，最常见的就地处理方式是土壤的水饱和区进行生物降解。 除了要加入营养盐，氧源（多为H2O2）外，还需引入微生物以提高生物降解的能力。有时，在污染区挖一组井，并直接注入适当的溶液，这样就可以把水中的微生物引入到土壤中。地下水经过一些处理后，可以恢复和再循环使用，在地下水循环使用前，还可以加入土壤改良剂。 Ellis等在斯德歌尔摩中部的一个废弃的木材防腐油生产区，对高浓度低分子量多环芳烃和高分子量的多环芳烃污染进行就地处理。在0.9~4.5 m的深度范围内，土壤中防腐油的总浓度为10~3200 mg/kg土。在污染区设置一些井，往井中注入含有营养盐的磷酸氢钾，氧源（质量分数35%的H2O2，100 mg/L）和表面活化剂的溶液，并接种能促进多环芳烃降解的微生物，对污染区进行处理。污染土壤经过4个月处理，所有多环芳烃的降解都很明显，但是，三环和多环芳烃的降解率一般明显低于60%。因为就地处理对温度较敏感，所以只能在气温大于8 ℃的月份进行。 在一定的时间内，原位处理不可能有效地去除大多数多环芳烃，而且这种方法因受温度和土壤类型的影响而具有一定的局限性。 二、现场生物修复技术类型 1 现场处理法 近年来国外石油烃污染生物处理的研究很多，其中土壤耕作处理是现场处理土壤污染常用的方法。 被污染的废物施在土壤上，通过施肥、灌溉和加石灰等管理措施，保持氧气、水分和pH的最合适值，并进行耕作以改善土壤的通气状况，确保在污染废物和下面土层中污染物的降解。 降解过程所用的微生物多为土著微生物，但是要提高效果还需要引入驯化的微生物。