SP-A,D在宿主抗甲型流感病毒中的作用
杨勇琼1综述王建军2* 郭述良3审校
（1.四川省三台县人民医院感染科，四川绵阳6211002；杭州师范大学附属医院，浙江杭州310015；3.重庆医科大学附属第一医院，重庆400016）
【摘要】肺泡表面活性蛋白A,D（Surfactant Proteins A and D，SP-A,D）在宿主对抗甲型流感病毒（Influenza A virus，IAV）感染中起着重要的作用。他们能识别结合IAV上的血凝素（hemagglutinin,HA）和神经氨酸酶（neuramidinase,NA），致其失活，抑制IAV的感染和复制，也能介导并增强巨噬细胞、中性粒细胞吞噬和杀灭IAV作用。本文就SP-A,D在宿主抗IAV感染中发挥的作用作一综述。
【关键词】肺泡表面活性蛋白；甲型流感病毒；血凝素；神经氨酸酶；糖基化作用
Role of SP-A,D in anti-Influenza A virus infections
YANG Yong-qiong,WANG Jian-jun,GUO Shu-liang.Department of Infectious medicine，Santai people,s hospital of Sichuan
【Abstract】Effect of Surfactant Proteins A and D in anti-Influenza A virus infections was significantl.They could bind hemagglutinin and neuramidinase which were on the surface of IAV,and made them deactivation,so the ability of infection and duplication was restrained.The effect of macrophage or neutrophil killing IAV could be mediated and enhanced by SP-A,D. This article reviews the effect of SP-A,D in anti-IAV infections.
【Key words】Surfactant Proteins A and D; Influenza A virus; hemagglutinin; neuramidinase; glycosylation
中图分类号：R511.7
IAV感染是传染性疾病中引起发病率和死亡率的主要原因之一。在美国，每年约有4～5万人死于IAV感染[1，2]。抗IA V感染早期，宿主固有免疫起着重要_______________
作者简介：杨勇琼（1977-），女（汉），四川绵阳，医学学士，初级，主要从事感染性疾病的研究，四川省三台县人民医院感染科，138********，Email:wangjianjun531@https://www.doczj.com/doc/2f10650178.html,
通信作者：王建军，杭州师范大学附属医院呼吸科，Email:wangjianjun531@https://www.doczj.com/doc/2f10650178.html,
作用。目前很多证据显示SP-A,D在宿主早期抗IAV感染中发挥重要作用。SP-A,D 是胶原凝集素成员，属于C型凝集素受体，由羧基末端糖识别域（carbohydrate recognition domain，CRD）、靠近CRD区的短螺旋颈区（NCRD）、三倍螺旋胶原区、氨基末端交联区四个特征性区域组成[3-6]。SP-A,D都能结合IAV的HA抑制病毒感染和入侵，还能结合NA抑制IAV感染和复制[5-8]。尽管如此，但是他们在宿主抗病毒中存在不同。
1 SP-A在宿主抗IAV中的作用
SP-A是体内含量最丰富的肺泡表面活性蛋白，主要在肺泡Ⅱ型上皮细胞、浆液细胞和克拉拉细胞中表达，由18个相同的或相似的多肽链组成[9]。研究发现，支气管肺泡灌洗液（BALF）中SP-A水平较低的人群如早产儿、支气管肺囊肿及肺囊性纤维化患者对IAV易感性较正常人群增加，表明SP-A在宿主抗IAV 感染中可能起着重要作用。病毒性肺炎患者BALF中SP-A水平降低，这可能与病毒通过下调SP-A来逃避宿主免疫反应有关 [9]。SP-A一方面直接粘附中和IAV，另一方面作为调理素介导IAV与吞噬细胞粘附，增加吞噬细胞对IAV摄取，并能抑制IAV的传染力和复制能力[4,7,10]。
1.1 SP-A对IAV的中和作用
SP-A对IAV的中和作用与其CRD结合病毒HA糖基化作用位点有关。研究者发现，IAV 拥有越高的糖基化位点对SP-A越敏感[1，4，10]。在流感病毒生存周期中糖基化作用发挥着重要作用，HA和NA糖基化作用是其低聚糖分子结构完整和稳定必须的。宿主免疫细胞也通过识别并结合糖基化位点来屏蔽病毒HA上的抗原决定簇，减少肺泡上皮细胞的初始感染[11]。然而SP-A介导的中和作用并不受HA糖基化程度影响。当IAV的HA被部分糖基化时，相对于SP-D，SP-A能更有效的中和IAV株 [12]。
1.2 SP-A介导的调理素作用
SP-A除了能通过中和病毒减少IAV毒力，还能作为调理素增加中性粒细胞对IAV摄取，使IAV诱导的中性粒细胞产生过氧化氢成为可能。中性粒细胞产生的过氧化氢能显著增强其杀灭病原体能力。用IAV感染SP-A基因敲除小鼠（SP-A-/-小鼠）来研究SP-A是否具有保护宿主对抗IAV作用。研究发现，IAV感染SP-A-/-
更低，体重下降更明显。感染第二天小鼠后引起毒力更强，平均致死剂量LD
50
SP-A-/-小鼠肺中出现更多的中性粒细胞浸润和更高的巨噬细胞炎性蛋白2
（MIP-2）水平，进而导致更严重的气道上皮损伤及肺泡炎性细胞浸润，而中性粒细胞功能失调是引起细菌二重感染的重要原因之一。因此研究者认为SP-A能降低宿主对IAV的易感性，并能控制肺部有害炎症反应[10]。LeVine等也证实了这一点，并指出SP-A-/-小鼠感染IAV后BALF中中性粒细胞髓过氧化物酶活性降低，这会导致中性粒细胞杀灭病原体的能力下降。感染IAV 7天后SP-A-/-小鼠Th1反应能力增强，Th2反应能力减弱，抗IAV能力减弱，炎症损伤加重。如加入外源性SP-A，则能增强SP-A-/-小鼠对病毒清除能力，并减少肺部有害炎症反应。此外SP-A还能介导巨噬细胞吞噬杀灭IAV[4,9]。
1.3 SP-A在宿主抗IAV中发挥的其他作用
研究发现，SP-A抗IAV作用可能部分由gp340介导（gp340是一种清道夫受体蛋白，具有抗病毒作用），gp340通过聚集SP-A显著增强抗IAV活性，且该作用不依赖于钙离子[13]。临床药物研究发现，SP-A还增加奥塞米韦（流感病毒NA抑制剂）抗IAV活性。在SP-A的协同下奥塞米韦能显著增加IAV聚集并抑制HA活性，进而抑制肺泡上皮细胞的初始感染。此外对SP-D抵抗的IAV株仍能被SP-A抑制[1]。
综上所述，SP-A除能直接中和IAV外，还能作为调理素介导吞噬细胞摄取IAV，并减少早期感染时IAV对肺部的有害炎症反应。此外，SP-A还能协同增强抗IAV药物的作用。
2 SP-D在宿主抗IAV中的作用
SP-D在宿主抗IAV感染中也起着重要作用。有研究者用IAV感染SP-A,D双基因敲除的C57BL/6小鼠，通过检测体重、肺内中性粒细胞募集、局部细胞因子的释放等变化情况，来观察病毒复制能力及宿主反应情况，发现SP-A,D双基因敲除小鼠与SP-D-/-小鼠相比各项指标无显著差异。表明在宿主抗IAV感染中，相对于SP-A，SP-D可能起着更重要作用[12]。IAV感染早期，SP-D就能抑制IAV复制，限制有害的炎症反应；并调节吞噬细胞吞噬杀灭IAV能力[14]。此外，SP-D还能与其他抗IAV病毒蛋白（如粘蛋白、SP-A、gp340等）协同对抗IAV[1,4,13]。
2.1 SP-D对IAV的中和作用
SP-D能通过CRD结合IAV上的甘露糖葡聚糖分子（mannose-containing glycans）中和NA活性。NA抑制的关键是SP-D的多聚化及CRD结合特异性。通过检
测NA抑制情况，发现SP-D具有比SP-A更强的NA抑制活性。相对于SP-A-/-小鼠，SP-D-/-小鼠感染IAV后显示出更强的病毒复制能力及更严重的肺部有害炎症反应，这也部分说明SP-D具有更明显的中和IAV作用[7]。在SP-D-/-小鼠中滴入外源性SP-D或使SP-D-/-小鼠肺末端过表达SP-D，均能部分或完全恢复该小鼠抗IAV能力[15]。
SP-D中和IAV活性还与其胶原区域有关。有研究者使用SP-D胶原区域部分或完全缺陷的大鼠感染IAV来研究该区域与抗IAV感染的关系。发现SP-D在缺乏胶原臂时仍能有效中和IAV，并促进中性粒细胞摄取IAV。但是当SP-D缺乏整个氨基末端胶原区域时，尽管其仍保留着一定的凝集素活性及结合病毒能力，却无抗病毒及调理素活性。表明氨基末端胶原区域在抗IAV中起着重要作用。由于SP-D抗病毒活性主要与其多聚化有关，表明氨基末端胶原区域会显著影响SP-D 多聚化。而SP-D多聚化作用可能受该区域的氨基末端肽类分子调节[16]。
SP-D中和IAV活性还与其NCRD有关。研究者发现由SP-D的CRD和NCRD组成的三聚体重组物仍能结合IAV的部分配基并介导部分功能活动。使用单抗封闭NCRD能完全抑制SP-D抗IAV活性，而单抗封闭CRD其他位点不仅不能抑制SP-D 抗IAV活性，还会增强SP-D对HA和NA抑制作用及病毒中和作用。这可能与单抗介导的交联作用有关，它能使NCRD诱导病毒的聚集能力和中性粒细胞摄取IAV 能力增加。这些结果同时也表明即使没有氨基末端和胶原区域，SP-D的抗IAV 活性仍能部分被调用[3]。
2.2 SP-D中和IAV与IAV糖基化程度有关
SP-D通过识别结合IAV的HA头部糖基化位点来中和IAV活性。如改变H3N2株HA基因使HA头部N165位点糖基化不完全，会导致该位点低聚糖形成缺陷，使SP-D结合位点丧失，最终导致SP-D抗IAV能力下降。尽管这些病毒HA上的其他低聚糖分子也与SP-D抗病毒有一定相关性，但研究发现N165位点缺乏葡聚糖分子的H3N2病毒株进入人群中流行后很快能获得对SP-D的抵抗。众多数据显示，SP-D对病毒的高亲和力及在BALF中的强病毒中和活性可能与N165位点糖基化作用有关[11,12，17]。有研究者在H3N2株HA头部N165区域添加其他额外的葡聚糖，随着时间的推移，SP-D对该病毒株变得越来越敏感。另有研究者发现H1N1株在1970-1980期间对SP-D非常敏感，但随着其不断进化使得新近株HA头部
104位点糖基化不完全，使低聚糖形成缺陷，导致SP-D对其越来越不敏感，最终产生抗SP-D株。通过敏感株和抵抗株相比较，SP-D中和IAV与IAV特定部位的糖基化位点有关[17]。
相对于SP-A，SP-D对糖基化程度要求更高，这也决定了特殊IAV株在呼吸道内的复制能力[11]。进化过程中IAV株通过减少HA的糖基化作用，使其头部低聚糖分子缺陷从而获得对SP-D的抵抗。如病毒株PR8，由于其HA头部糖基化作用不完全导致甘露糖葡聚糖分子缺陷，限制了SP-D抗病毒活性及体外甘露糖受体活性，从而能引起严重的临床疾病[11]。大流行及鸟型流感病毒株缺乏对SP-D 易感性，也可能与流感病毒糖基化作用不完全有关[17]。
尽管如此，在抗糖基化不足的IAV株感染中，SP-D仍能发挥一定作用。有研究者用猪SP-D（pSP-D）与糖基化不足的IAV株来研究pSP-D抗IAV作用。HA 抑制分析显示pSP-D利用其CRD上的糖类分子末端唾液酸（SAs）与IAV发生作用。如果pSP-D上的SA链接酶变形，会导致pSP-D对HA抑制活性显著降低，这表明SAs与IAV的链接对于抑制HA活性非常重要，并具有特异性。而这一作用可能在糖基化不足的IAV株中尤其重要[18]。有关糖基化不足的IAV株与SP-D间的相互作用有待进一步研究。
2.3 SP-D介导的巨噬细胞功能
尽管SP-A也能介导巨噬细胞吞噬杀灭IAV，但由于SP-A低聚糖结构的特异性及唾液酸残基结合IAV的独特性，使得肺泡巨噬细胞并不能完全有效识别这种小结合物。而SP-D能使该小结合物再次聚集形成一个更大的聚集物。这个与SP-D 相关的大聚集物能增强气道粘膜纤毛清除率并促进吞噬细胞识别内化病原体。另外，SP-D的CRD能识别并结合IAV上暴露的高水平甘露糖簇，形成一个巨大的聚集物，介导巨噬细胞对其吞噬[4]。SP-D的胶原区域也能调节巨噬细胞对SP-D配基复合物的反应，通过结合巨噬细胞上的信号抑制蛋白α，限制有害的炎症反应，避免组织损伤[16]。
2.4 SP-D介导的中性粒细胞功能
SP-D也能介导中性粒细胞与IAV的相互作用。它能增加中性粒细胞对IAV的摄取及抗IAV作用。SP-D还能对抗IAV诱导的中性粒细胞功能障碍[19]。SP-D-/-小鼠感染IAV后出现肺内中性粒细胞浸润。值得注意的是中性粒细胞的显著升高不仅不
能起到有效的抗IAV作用，反而会加重有害的炎症反应，减少BALF抗病毒活性[2,13]。有研究者将中性粒细胞添加到BALF中与IAV一起孵育，能显著增强BALF清除IAV 能力。然而预先用BALF激活中性粒细胞，再加入IAV将会下调BALF抗IAV能力。究其原因，可能与SP-D减少有关。中性粒细胞活化后产生的人中性粒细胞防御素（HNPs）能结合SP-D，高浓度的HNPs会导致人BALF中SP-D聚集沉淀导致BALF抗IAV 能力下降。在这种情况下，尽管HNPs有一定抗IAV活性，但由于它们抑制了SP-D 活性，最终降低宿主防御对抗IAV能力。研究者同时还发现，预先用激动剂激活中性粒细胞诱导释放HNPs也会引起SP-D消耗。这些结果提示慢性中性粒细胞炎症（如吸烟，肺囊性纤维化等）可能会减少SP-D水平，增加IAV易感性。相反，急性炎症反应，如发生在IAV感染早期，可能促进中性粒细胞的病毒清除能力[2]。
综上所述，SP-D通过多个结构域结合对抗IAV，SP-D中和IAV主要与IAV的糖基化作用程度有关；此外，SP-D还能介导中性粒细胞及巨噬细胞的功能调节宿主抗IAV作用。
结论：
IAV感染初期，宿主首先启动固有免疫系统来对抗IAV。胶原凝集素家族成员SP-A,D通过各自的识别域结合IAV，一方面通过不同的机制中和病毒，另一方面介导病毒与免疫细胞之间发生相互作用，共同促进宿主杀灭IAV。通过对SP-A,D与IAV相互作用的认识，为研制IAV新疫苗及IAV治疗提供新的思路。
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