TaKaRa Code：DRR039A
Premix Ex Taq TM
(Perfect Real Time)
（200次量）
宝生物工程(大连)有限公司
目录
内 容 页 码
●制品说明 1
●制品内容 1 ●适用的Real Time PCR扩增仪 1
●保 存 1 ●试剂盒原理 2 ●试剂盒特长 2 ●操作注意 2 ●Real Time PCR操作顺序 2 ●操作方法 3
◆应用Thermal Cycler Dice Real Time System扩增仪的操作方法 3
◆应用ABI PRISM 7000/7700/7900 HT，
7300/7500/7500 Fast Real - Time PCR的操作方法 4
◆应用LightCycler Real Time PCR扩增仪的操作方法 5
◆应用Smart Cycler II System Real Time PC R扩增仪的操作方法 6
◆应用Mx3000P Real Time PCR扩增仪的操作方法7
●PCR反应条件说明 8 ●进行RT-PCR反应时的实验方法 8 ●引物设计说明 10 ●特别提示：本公司提供用于基因表达定量分析的引物设计及合成服务 10 ●问 答 11
●制品说明
本制品是采用探针法（TaqMan?，Molecular Beacon等）进行Real Time PCR的专用试剂。是一种2×浓度的Premix Type试剂，进行实验时，PCR反应液的配制十分方便简单。制品中的DNA聚合酶使用了改良后的Hot Start法用 DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq HS，与TaKaRa精心研制的Real Time PCR用Buffer 组合使用，可以有效抑制非特异性的PCR扩增，大大提高PCR的扩增效率，进行高灵敏度的Real Time PCR 扩增反应。
本制品可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对靶基因进行准确定量、检测，重复性好，可信度高。采用嵌合荧光法（SYBR? Green I）进行Real Time PCR时，建议使用SYBR?Premix Ex Taq TM（Perfect Real Time）（TaKaRa Code：DRR041）。
●制品内容（50 μl反应×200次）
Premix Ex Taq TM（Perfect Real Time）（2×Conc.）*1 1.0 ml ×5支
ROX Reference Dye（50×Conc.）*2 200 μl ×1支
ROX Reference Dye II（50×Conc.）*2 200 μl ×1支
*1 内含TaKaRa Ex Taq HS，dNTP Mixture，Mg2+等。
*2 只使用在ABI、Stratagene等公司的Real Time PCR扩增仪上，用以校正
孔与孔之间产生的荧光信号误差。使用ABI PRISM 7000/7700/7900HT和
7300 Real-Time PCR System使用ROX Reference Dye，7500
Real-Time PCR System和7500 Fast Real-Time PCR System使用ROX
Reference Dye II，Stratagene公司的Mx3000P也适用ROX Reference
Dye II。Thermal Cycler Dice Real Time System、Light Cycler、Smart
Cycler System等Real Time PCR扩增仪时不必使用。
●适用的Real Time PCR扩增仪
Thermal Cycler Dice?Real Time System（TaKaRa）
ABI PRISM?7000/7700/7900HT，7300/7500 Real-Time PCR System，7500 Fast Real-Time PCR System（Applied Biosystems）
LightCycler?（Roche Diagnostics）
Smart Cycler?System（Cepheid）
Mx3000P TM（Stratagene）
其他各种Real Time PCR扩增仪
●保 存：
4℃保存。可在-20℃长期保存，一旦融解请于4℃保存。反复冻融制品性能可能下降，请避免多次反复冻融制品。
●试剂盒原理
进行PCR 扩增时，在PCR 反应液中加入荧光探针，然后在PCR 扩增过程中，通过检测PCR 反应液中的荧光强度，可以达到监测PCR 产物扩增量的目的。
本制品中的DNA 聚合酶使用了改良后的TaKaRa Ex Taq HS，并结合TaKaRa 独自开发的Buffer 系统，可以有效抑制非特异性PCR 扩增，大大提高PCR 扩增灵敏度。
1．热变性
2．引物退火/探针与模板的杂交
延伸反应Polymerase
探针杂交
荧光物质 淬灭物质
Primer
◆TaqMan 探针法
TaqMan 探针法是使用5’端带有荧光物质（如：FAM 等），3’端带有淬灭物质（如：TAMRA 等）的TaqMan 探针进行荧光检测的方法。当探针完整时，5’端的荧光物质受到3’端淬灭物质的制约，不能发出荧光。而当TaqMan 探针被分解后，5’端的荧光物质便会游离出来，发出荧光。 当PCR 反应液中加入荧光探针后，在PCR 反应的退火过程中，荧光探针便会和模板杂交。进一步在PCR 反应的延伸过程中，Taq DNA 聚合酶的5’→3’Exonuclease 活性可以分解与模板杂交的荧光探针，游离荧光物质发出荧光。通过检测反应体系中的荧光强度，可以达到检测PCR 产物扩增量的目的。具体原理见右图。
●试剂盒特长
1． 适用于Real Time PCR 反应，可以快速、准确地对目的基因进行检测、定量。
2． 是一种2×浓度的Premix Type 试剂，PCR 反应液配制时，只需加入模板、引物、荧光探针、灭菌蒸
馏水便可进行Real Time PCR 反应，操作简单方便。
3． DNA 聚合酶使用了改良后的TaKaRa Ex Taq HS，可以进行Hot Start 法PCR 反应，再与TaKaRa 公司独自开发的Buffer 系统相结合，具有高扩增效率，高扩增灵敏度，高扩增特异性之特点。
●操作注意
以下为使用本试剂盒时的注意事项，使用前一定认真阅读。
1． 冻结制品融解后，请上下颠倒轻轻均匀混合，避免起泡，并经轻微离心后使用。试剂没有混匀时反应
性能会有所下降，本制品不能用振荡器混匀。Premix Ex Taq （2×conc.）-20℃ 保存时，保存中容易形成沉淀。此时，轻轻用手握一会儿或室温放置一段时间后，颠倒混匀可以完全融解。 2． 溶解后的试剂请于冰上放置。 3． 本制品中不含有荧光探针等。
4． 反应液的配制、分装请一定使用新的（无污染的）枪头、Microtube 等，尽量避免污染。
●Real Time PCR 操作顺序
1． 溶解试剂，上下颠倒混匀，确认溶液完全溶解。
注）避免用振荡器混匀，剧烈振荡会降低制品性能。
以下操作请在冰上进行，长时间室温放置会降低制品性能。
2．配制PCR反应用混合液，分装至PCR反应管中。
3．添加PCR扩增用模板。
4．使用Real Time PCR扩增仪，进行PCR扩增反应。
注）1. 反应液配制方法和PCR扩增条件请参照使用方法。
2. Real Time PCR仪的使用方法，请参照各种仪器说明书。
3. 本制品使用了抗Taq抗体，进行Hot Start法PCR扩增。
●操作方法
◆应用Thermal Cycler Dice? Real Time System扩增仪的操作方法
请按照Thermal Cycler Dice?Real Time System（TaKaRa Code：TP800）的使用说明书要求进行实验操作。
① 按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。
试剂 使用量 终浓度 Premix Ex Taq TM（2×） 12.5 μl1×
PCR Forward Primer（10 μM） 0.5 μl0.2 μM*1
PCR Reverse Primer（10 μM） 0.5 μl0.2 μM*1
荧光探针溶液 1 μl*2
DNA模板 2 μl*3
dH2O（灭菌蒸馏水） 8.5 μl
Total 25 μl
*1 通常引物终浓度为0.2 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.1～1.0 μM范围内调整引物浓度。
*2 使用的探针浓度，与使用的Real Time PCR扩增仪、探针种类、荧光标记物质种类有关，试剂使用时请参照仪器说明书，或各荧光探针的具体使用要求进行。使
用Thermal Cycler Dice? Real Time System时，通常探针终浓度在0.1～0.5
μM范围内进行调整。
*3在25 μl反应体系中，DNA模板的添加量通常在100 ng以下。因不同种类的DNA 模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板
添加量。
如果欲使用本制品进行2 Step RT-PCR反应的第二步PCR扩增反应，第一步的
RT反应液作为DNA模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。
② 进行Real Time PCR反应。
建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序。退火/延伸时间可在20～30秒范围内进行调整，推荐使用30秒的条件。有关PCR的具体反应条件请参照「PCR反应条件说明」。
两步法PCR扩增标准程序：
Stage 1：预变性
Repeat：1
95℃ 30秒
Stage 2：PCR反应
Repeat：40
95℃ 5秒
60℃ 30秒
◆特别提示：
本制品中使用的TaKaRa Ex Taq HS是利用抗Taq抗体的Hot Start用DNA聚合酶，与其他公司
的化学修饰型Hot Start用DNA聚合酶相比，不需要PCR反应前的95℃、5～15分钟的酶的活性
化反应。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其PCR的扩增效率、定量精度等都会受到影响。如果在PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃、30秒。
③ 实验结果分析。
反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。
◆应用ABI PRISM? 7000/7700/7900HT，7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR System的操
作方法
请按照Applied Biosystems公司的仪器使用说明书要求进行实验操作。
1）按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。
试剂 使用量 使用量 终浓度 Premix Ex Taq TM（2×） 10.0 μl25.0 μl1×
PCR Forward Primer（10 μM） 0.4 μl 1.0 μl0.2 μM*1
PCR Reverse Primer（10 μM） 0.4 μl 1.0 μl0.2 μM*1
荧光探针溶液 0.8 μl 2.0 μl*2
0.4 μl 1.0 μl1×
ROX Reference Dye（50×）or
ROX Reference Dye II（50×）*4
DNA模板 2.0 μl 4.0 μl*3
dH2O（灭菌蒸馏水） 6.0 μl16.0 μl
Total 20.0 μl50.0 μl*5 *1 通常引物终浓度为0.2 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.1～1.0 μM范围内调整引物浓度。
*2 使用的探针浓度，与使用的Real Time PCR扩增仪、探针种类、荧光标记物质种类有关，实际使用时请参照仪器说明书，或各荧光探针的具体使用要求进行。
*3 在20 μl反应体系中，DNA模板的添加量通常在100 ng以下。因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板添加量。
如果欲使用本制品进行2 Step RT-PCR反应的第二步PCR扩增反应，第一步的RT反应液作
为DNA模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。
*4 ROX Reference Dye II（50×）比ROX Reference Dye（50×）浓度低，使用7500 Real-Time PCR System 和7500 Fast Real-Time PCR System时，请使用ROX Reference Dye II（50
×）。与使用ROX Reference Dye（50×）相比，校正后的荧光信号值高，但解析结果完全
相同。使用ABI PRISM7000/7700/7900HT及7300 Real-Time PCR System时，请使用
ROX Reference Dye（50×）。
*5 96孔板、Single-Tube、8联Tube采用50 μl反应体系，384孔板、96-well Fast Thermal Cycling plate采用20 μl反应体系。
2）进行Real Time PCR反应。
建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR 条件的优化。有关PCR的具体反应条件请参照「PCR反应条件说明」。
< ABI PRISM? 7000/7700/7900 HT，7300/7500 Real-Time PCR System >
两步法PCR扩增标准程序：
Stage 1：预变性
Reps：1
95℃ 30秒
Stage 2：PCR反应
Reps：40
95℃ 5秒
60℃ 30～34秒*
* 使用7700和7900HT时请设定在30秒。
使用7000和7300时请设定在31秒。
使用7500时请设定在34秒。
<7500 Fast Real-Time PCR System >
两步法PCR扩增标准程序：
Stage 1：预变性
Reps：1
95℃ 30秒
Stage 2：PCR反应
Reps：40
95℃ 3秒
60℃ 30秒
反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。
◆应用LightCycler? Real Time PCR扩增仪的操作方法
请按照LightCycler?（Roche Diagnostics公司）的使用说明书要求进行实验操作。
1）按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。
试剂 使用量 终浓度
Premix Ex Taq TM（2×） 10.0 μl1×
PCR Forward Primer（10 μM） 0.4 μl0.2 μM*1
PCR Reverse Primer（10 μM） 0.4 μl0.2 μM*1
荧光探针溶液 0.8 μl*2
DNA模板 2.0 μl*3
dH2O（灭菌蒸馏水） 6.4 μl
Total 20.0 μl
*1 通常引物终浓度为0.2 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.1～1.0 μM范围内调整引物浓度。
*2 使用的探针浓度，与使用的Real Time PCR扩增仪、探针种类、荧光标记物质种类有关，实际使用时请参照仪器说明书，或各荧光探针的具体使用要求进行。
*3 DNA模板的添加量通常在100 ng以下。因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板添加量。
如果欲使用本制品进行2 Step RT-PCR反应的第二步PCR扩增反应，第一步的RT反应液作
为DNA模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。
2）进行Real Time PCR反应。
PCR反应用毛细管请用离心机轻轻离心后放入LightCycler中进行Real Time PCR反应。建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR条件的优化。有关PCR的具体反应条件请参照「PCR反应条件说明」。
两步法PCR扩增标准程序：
Stage 1：预变性
95℃ 30秒 20℃/秒
1 Cycle
Stage 2：PCR反应
95℃ 5秒 20℃/秒
60℃ 20秒 20℃/秒
40 Cycles
3）实验结果分析。
反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。
◆应用Smart Cycler? II System Real Time PCR扩增仪的操作方法
请按照Smart Cycler?（Cepheid公司）的使用说明书要求进行实验操作。
1）按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。
试剂 使用量 终浓度
Premix Ex Taq TM（2×） 12.5 μl1×
PCR Forward Primer（10 μM） 0.5 μl0.2 μM*1
PCR Reverse Primer（10 μM） 0.5 μl0.2 μM*1
荧光探针溶液 1.0 μl*2
DNA模板 2.0 μl*3
dH2O（灭菌蒸馏水） 8.5 μl
Total 25.0 μl
*1～*3：请参见◆应用LightCycler Real Time PCR扩增仪的操作方法同一部分的*1～*3说明。
2）进行Real Time PCR反应。
PCR反应管请用离心机轻轻离心后放入Smart Cycler II System中进行Real Time PCR反应。建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR条件的优化。有关PCR的具体反应条件请参照「PCR反应条件说明」。
两步法PCR扩增标准程序：
Stage 1：预变性
Hold
95℃ 30秒
Stage 2：PCR反应
Repeat：45 times
95℃ 5秒
60℃ 20秒
3）实验结果分析。
反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线（使用SYBR?Green I时），进行PCR定量时制作标准曲线等。
◆应用Mx3000P TM Real Time PCR扩增仪的操作方法
请按照Stratagene公司的仪器使用说明书要求进行实验操作。
1）按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。
试剂 使用量 终浓度
Premix Ex Taq TM（2×） 12.5 μl1×
PCR Forward Primer（10 μM） 0.5 μl0.2 μM*1
PCR Reverse Primer（10 μM） 0.5 μl0.2 μM*1
荧光探针溶液 1.0 μl*2
ROX Reference Dye II（50×）*4 0.5 μl1×
DNA模板 2.0 μl*3
dH2O（灭菌蒸馏水） 8.0 μl
Total 25.0 μl
*1～*3：请参见◆应用LightCycler Real Time PCR扩增仪的操作方法同一部分的*1～*3说明。
*4： 孔间误差校正请使用ROX Reference Dye II（50×）。试剂盒中附带的ROX Reference Dye （50×）浓度高，不适合Mx3000P使用。
2）进行Real Time PCR反应。
建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR 条件的优化。有关PCR的具体反应条件请参照「PCR反应条件说明」。
两步法PCR 扩增标准程序： Segment 2：PCR 反应 Segment 1：预变性 95℃ 30秒
1Cycle
95℃ 5秒 60℃ 20秒
40 Cycles
3）实验结果分析。
反应结束后确认Real Time PCR 的扩增曲线，进行PCR 定量时制作标准曲线等。
●PCR 反应条件说明
【预变性】
【两步法PCR 】 * 使用Applied Biosystems 公司Real Time PCR 扩增仪时必须根据仪器型号设定不同时间。 7700/7900HT/7500 Fast 设定为30秒，7000/7300设定为31秒，7500设定为34秒。
【循环圈数】 30～45 Cycles
●进行RT-PCR 反应时的实验方法
进行RT-PCR反应时，使用PrimeScript RT-PCR Kit （Perfect Real Time）（TaKaRa Code：DRR061）更为方便。PrimeScript RT-PCR Kit由二部分组成，即：PrimeScript RT reagents（TaKaRa Code：DRR037）和Premix Ex Taq TM （Perfect Real Time）（TaKaRa Code：DRR039）。这二部分试剂可以同时购买（TaKaRa Code：DRR061），也可以单独购买。
1．按下列组份配制RT反应液（反应液请在冰上配制）。
使用TaKaRa Code：DRR037的RT-Reagents试剂。
试剂 使用量
5×PrimeScript Buffer 2 μl
Random 6 mers（100 μM）*1 2 μl
Oligo dT Primer（50 μM）*1 0.5 μl
PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5 μl
Total RNA X μl
RNase Free dH2O Up to 10 μl
Total 10 μl*2
*1 Random 6 mers和Oligo dT Primer同时使用，可有效地将全长mRNA反转录成cDNA。
使用单引物进行反转录时，使用量分别如下：
Random 6 mers（100 μM） 2 μl（200 pmol）
Oligo dT Primer（50 μM）0.5 μl（25 pmol）
Specific Primer（2 μM）0.5 μl（1 pmol）
*2 反应体积可按需求相应放大，10 μl的反应体系可最大使用1 μg的Total RNA。
2．反转录反应条件如下：
37℃ 15 min（反转录反应）*3
85℃ 5 sec（反转录酶的失活反应）
*3 使用Gene Specific Primer时，建议反转录反应条件设置为42℃ 15 min。PCR反应有非特异扩增时，将温度升至50℃会有所改善。
3．PCR反应
请按照第三页“操作方法”进行PCR反应。
◆反应例（使用Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System）
通过Real Time RT-PCR对Mouse Gapd mRNA进行检出。
使用TaqMan Gene Expression Assays（Applied Biosystems公司）的Primer和TaqMan Probe，以Total RNA 1 pg～100 ng相当量的cDNA及Negative Control的dH2O做为模板。
●引物设计说明
进行Real Time PCR反应时，设计反应性能良好的PCR引物非常重要。根据以下原则，可以设计PCR 扩增效率高，反应特异性强的良好引物。
◆ PCR扩增产物长度：80～150 bp最为合适（可以延长至300 bp）。
◆ 设计引物要求如下：
*1 OLIGO: Primer Analysis Software。
*2 Primer3: （https://www.doczj.com/doc/218496737.html,/ftp/distribution/software/）
*3 https://www.doczj.com/doc/218496737.html,/BLAST/
●特别提示：本公司提供用于基因表达定量分析的引物设计及合成服务
本公司以美国NCBI Data Base上登录的Human、Mouse、Rat、Cow、Dog、Chicken的RefSeq 为对象，已经设计完成了各基因用于定量表达分析的Real Time RT-PCR用高特异性Primer Set，此Primer Set最适于本制品使用，可省略PCR反应条件优化实验。具体情况如下：
可提供3对合适的引物，由客户自己选择。
1. 从3’端开始的1,500 Base内的引物候补序列。
2. 从5’端开始的1,500 Base内的引物候补序列。
3. 针对Target基因全长的引物候补序列。
注）本公司只对在本公司合成的引物/探针提供免费设计服务，恕不受理不在本公司合成的引物/探针的设 计委托！
●问答
Q1. Premix Ex Taq融解时，见到有絮状沉淀物，怎么办？
A1. 融解不彻底时，有时会有白色或淡黄色絮状沉淀物。此时请用手稍微加热或于室温稍微放置制品，然后进行上下颠倒混合，使制品充分溶解。溶解后的制品性能不会受到影响，但请不要用振荡器等剧烈搅拌混合。
Q2. Premix Ex Taq为什么要于4℃保存？
A2. 经本公司实验证明，反复冻融制品性能可能下降。因此，我们推荐本制品于4℃保存，避免反复冻融。
可在-20℃长期保存，一旦融解请于4℃保存。
Q3. 使用Premix Ex Taq时，是否要对Mg2+浓度进行研讨？
A3. 使用Premix Ex Taq时，不需要对Mg2+浓度进行研讨。实验时首先请使用本公司说明书推荐的PCR 反应条件，如果得不到良好实验结果时请研讨PCR反应条件，改变使用的PCR引物等。
Q4. Premix Ex Taq的PCR扩增对使用引物有何要求？
A4. PCR用制品的DNA扩增性能与引物种类有一定的内在关系，本公司提拱SYBR Green I嵌合荧光法的PCR或RT-PCR用引物的免费设计服务，详细情况请参见本说明书的「引物设计说明」部分。
使用TaKaRa设计推荐的引物，将更适合于Premix Ex Taq的Real Time PCR扩增。
Q5. 使用ABI PRISM仪器进行Real Time PCR反应时，是否需要进行了95℃ 10分钟的变性步骤？ A5. 本制品不需要使用这一长时间的变性步骤，请遵照本公司说明书的实验条件要求进行PCR反应。
Q6. 使用ABI PRISM仪器进行Real Time PCR反应时实验结果不好，融解曲线无主峰，为什么？
A6. Premix Ex Taq中不含有ROX Reference Dye，在制品包装中另外附有。进行Real Time PCR反应时需在反应体系中添加ROX Reference Dye，在反应体系中不添加ROX Reference Dye时，融解曲线图将会产生无主峰的一条紊乱的波浪线。
MEMO
宝生物工程（大连）有限公司
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