[文章编号] 16712587Ⅹ(2010)0120081205
[收稿日期] 2009209222
[基金项目] 吉林省科技厅科技发展计划项目资助课题(20080712,20090249);吉林省长春净月科技三项费用项目资助
课题(2008B003)
[作者简介] 王会岩(1968-),女,吉林省吉林市人,在读农学博士,主要从事生物反应器与基因工程药物研究。[通信作者] 肖业臣(Tel :0431284533327,E 2mail :yechenxiao2400@1261com );
李校堃(Tel :0431284533348,E 2mail :xiaokunli @1631net )
人成纤维细胞生长因子221基因的克隆表达及蛋白的纯化
王会岩1,2,田海山1,2,赵宏鑫1,3,张耀方1,万晓姗1,邵明龙1,杨 苹1,3,肖业臣1,李校堃1
(11吉林农业大学生物反应器与药物开发教育部工程研究中心,吉林长春130118;21吉林农业大学生命
科学学院,吉林长春130118;31吉林农业大学中药材学院,吉林长春130118)
[摘 要] 目的:构建和表达人成纤维细胞生长因子221(F GF21)的基因工程菌,为治疗2型糖尿病的新药开
发提供实验数据。方法:通过PCR 方法,以质粒p ET20b 2F GF21为模板扩增F GF21全长,将其与分子伴侣
SUMO 相融合,再将该融合基因与原核表达载体p ET20b 连接后转化至BL21(Rosetta )宿主细胞中,通过IP T G 诱导获得可溶性表达。将融合蛋白经Ni 2N TA 、分子筛等进行纯化,获得的蛋白纯度在95%以上。
结果:经酶切和基因测序证实获得的F GF21基因序列与G enBank (登录号NM019113)报道的完全一致,构建的p ET20b 2SUMO 2F GF21表达载体在BL21大肠杆菌中成功表达F GF21蛋白,蛋白表达量在15%以上,经SDS 2
PA GE 证实其相对分子质量为19401,与理论预期值相符。Western blotting 分析该表达产物与人F GF21多克隆
抗体具有特异性结合能力,经SUMO 酶酶切后获得纯度大于95%以上的纯蛋白。结论:成功构建表达人F GF21融合蛋白的基因工程菌,经IPT G 诱导、Ni 2N TA 、分子筛等进行纯化后获得了F GF21纯蛋白。
[关键词] 成纤维细胞生长因子21;p ET 220b ;小泛素相关修饰蛋白质类[中图分类号] Q78 [文献标志码] A
Cloning and expression of hum an FGF21gene and
purif ication of recombinant protein
WAN G Hui 2yan 1,2,TIAN Hai 2shan 1,2,ZHAO Hong 2xin 1,3,ZHAN G Yao 2fang 1,WAN Xiao 2shan 1,
SHAO Ming 2long 1,YAN G Ping 1,3,XIAO Ye 2chen 1,L I Xiao 2kun 1
(11Engineering Research Center of Bioreactor and Pharmaceutical Development ,Ministry of Education ,Jilin Agricultural University ,Changchun 130118,China ;2.C ollege of Life Sciences ,Jilin Agricultural University ,Changchun 130118,China ;31College of T raditional Chinese Medicine ,Jilin Agricultural University ,Changchun 130118,China )
Abstract :Objective To establish E.coli strain and express human fibroblast growth factor 21(F GF21),and provide experimental foundation for development of new drugs for treatment of type 2diabetes.Methods Human F GF21gene fragments were obtanined by PCR.After the F GF21was f used with SUMO (small ubiquitin 2related modifier )by PCR ,the f used gene was expressed in E.coli BL21(Rosetta ).By inducing high levels of expression with IPT G ,the soluble proteins were obtanined.The f used protein was purified by DEA E Sepharose and Ni 2N TA affinity chromatography.Once cleaved f rom SUMO ,the purity of human F GF21by SDS 2PA GE was shown to be higher than 95%.Re sults Acquired gene f ragments of hF GF21were identified by digestion and DNA sequencing with the human F GF21reported in G enBank (Accession no.NM019113).The recombinant vector of p ET20b 2SUMO 2F GF21was constructed successf ully.SDS 2PA GE result proved that SUMO 2F GF21f usion protein with a relative molecular mass of about 19401was expressed.Western blotting result showed that the expressed products 1
8第36卷 第1期2010年1月吉 林 大 学 学 报 (医 学 版)Journal of Jilin University (Medicine Edition )Vol.36No.1 Jan.2010
had specific reaction with anti2human F GF21polyclonal antibody.Conclusion The engineering E.coli strain expressing human F GF21f usion protein is successf ully established and the purified protein is obtained.
K ey w ords:fibroblast growth factor21;p ET220b;small ubiquitin2related modifier proteins
成纤维细胞生长因子(fibroblast growt h factor,F GF)是一类由F GF基因家族编码的结构相关的蛋白质。F GF21作为F GF家族的一个新成员,优先在肝脏中表达[1]。Wente等[2]证明: F GF21可以通过激活细胞外信号调节激酶1/2和Akt信号通路来提高胰β细胞的活性并对胰β细胞产生保护作用。Kharitonenkov等[3]研究表明: F GF21全身给药能使糖尿病猕猴空腹血糖、果糖胺、甘油三酯、胰岛素、胰高血糖素迅速下降。实验过程从始至终,都没有出现低血糖现象。F GF21是F GFs家族中目前发现的唯一没有促有丝分裂的基因,从而大大降低临床用药的风险。F GF21的主要生物学功能表现在降低血糖,降低低密度脂蛋白和升高高密度脂蛋白[4]。small ubiquitin2like modifier(SUMO)作为分子伴侣在DNA修复、信号转导以及转录调节方面有重要作用[5]。Huang 等[6]用SUMO成功表达Metallot hionein(M T),肖业臣等[7]用SUMO获得可溶性表达抗真菌肽Drs。迄今,将人F GF21基因与分子伴侣SUMO 串联并在原核中表达制成融合蛋白尚未见报道。本研究拟利用基因工程手段,将F GF21与分子伴侣相融合,将其与表达载体相连接后导入到适当的宿主细胞中,使其可溶性表达F GF21蛋白,经Ni2 N TA、分子筛等进行纯化,获得纯度在95%以上的蛋白,为开发治疗糖尿病、肥胖病和肝癌的候选药物奠定基础。
1 材料与方法
111 菌株、质粒及主要试剂 大肠杆菌D H5α、BL21(Rosetta)、原核表达载体p ET20b为生物反应器与药物开发教育部工程研究中心保存。PCR 引物和测序由北京三博远志有限公司完成。Pf u DNA聚合酶、限制性内切酶B am HⅠ及X hoⅠ、T4DNA连接酶购自MBI公司。PCR产物回收试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、小量质粒提取试剂盒购自长春百金生物试剂经销有限公司,IP T G为Merk公司产品,Ni2N TA琼脂糖胶购自Invit rogen,SUMO p rotease由黄亚东博士惠赠。其余试剂均为国产分析纯。112 人F GF21和SUMO融合基因的PCR扩增 根据序列设计一对引物和一个Linker。上游引物: 5′2GGAA T TCCA TA T GCA TCA TCA TCA TCA T2 CAA G23′,下游引物5′2CC GCTC GA GTCA G2 GAA GC GTA GCT GGGGC T TC GGCCC T GGGAA2 GGT23′(下划线为酶切位点)。Linker:T G2 GA GTCA GGGA T GGGGT GACCACCAA TCT GT2 TCTC T GT,以SUMO和质粒p ET20b2F GF21为模板扩增SUMO2F GF21全长,反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。
113 表达质粒p ET20b2SUMO2F GF21的构建及序列分析 将SUMO2F GF21的PCR产物用B am HⅠ和X hoⅠ双酶切,回收酶切片段,并与用同样两种酶处理的p ET20b质粒进行连接,连接产物转化大肠杆菌D H5α感受态细胞,氨苄青霉素抗性平板筛选阳性转化子。PCR鉴定后,挑单菌落接种培养,抽提质粒送北京三博远志公司测序,检测其开放阅读框是否正确。
114 表达菌株的筛选、诱导表达及可溶性表达的确定 将测序正确的质粒转化大肠杆菌BL21 (Rosetta)感受态细胞,挑单菌落,37℃震荡培养15h。按照5%转接新鲜LB培养基,37℃、200r?min-1培养4h,37℃加IP T G(终浓度014mmol?L-1)诱导,分别在诱导后的1、2、3、4和5h后取菌,离心收集菌体。进行12%SDS2 PA GE电泳分析。选取高表达菌株接种到含AM P (100mg?L-1)的LB培养基中,37℃、200r?min-1培养4h,加IP T G诱导4h后,收集菌体并称量湿重。加入8倍体积的细胞裂解液(20mmol?L-1Tris2Cl、p H910,1mmol?L-1 ED TA、p H910,20mmol?L-1NaCl),超声破碎后8000r?min-1离心30min,收集上清液及沉淀。沉淀用等体积的裂解液溶解,上清和沉淀同时进行12%SDS2PA GE电泳分析,观察目的条带诱导前后的变化。
115 免疫印迹分析 表达产物经SDS2PA GE后,按参考文献[8]方法以BIO2RAD系统电转移至PVDF转移膜上,经牛血清白蛋白封闭后,依次加入F GF21的多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的Ig G抗体,最后在联苯胺(DAB)溶液中显色并观
28吉林大学学报(医学版) 第36卷 第1期 2010年1月
察目的带是否显色。
116 融合蛋白及F GF21蛋白的纯化 将阳性菌株
进行扩大培养,离心收集菌体,用细胞裂解液(20mmol ?L -1Tris 2Cl 缓冲液,20mmol ?L -1NaCl )裂解后经超声破碎,离心收集上清,阴离子交换层析粗提融合蛋白,层析峰上Ni 金属亲和层析提纯融合蛋白,收集蛋白峰过Sep hadex G 50柱(2cm ×80cm )除盐,获得的目标峰浓缩到蛋白含量达到210g ?L -1以上,-20℃冻存备用。将-20℃冻存的蛋白溶液加入酶切缓冲液,按照1%的蛋白量加入SUMO 蛋白酶,4℃过夜酶切,SDS 2PA GE 电泳分析酶切效果;将酶切完全的蛋
白溶液上Ni 金属亲和层析柱,流速2mL ?min -1,收集目标峰,进行SDS 2PA GE 电泳,用薄层扫描分析纯度。2 结 果
211 SUMO 2F GF21基因的扩增 以质粒p ET20b 2SUMO 2F GF21为模板,利用SUMO 2F GF21基因的特异性引物进行PCR 扩增。扩增产
物经1%琼脂糖凝胶电泳分析,可见1条为864bp 的DNA 片段(图1),与预期DNA 片段大小一致,表明已经成功获得SUMO 2F GF21融合基因
。
图1 PCR 扩增产物
Fig 11 The amplified product by PCR
Lane 1:DNA marker DL 2000;Lane 2:SUMO 2F GF21.
212 重组表达载体的构建及在大肠杆菌BL21中
的表达 将SUMO 2F GF21基因连至p ET20b 中,
构建表达载体p ET20b 2SUMO 2F GF21,小量提取转化菌质粒,经B am H Ⅰ和X ho Ⅰ双酶切后,在1000和750bp 中间可见SUMO 2F GF21片段(图2),与理论预期值864bp 基本一致,表明已成功
地构建重组表达载体。重组表达质粒经北京三博远
志公司测序,结果证实其序列与理论序列一致。将
重组表达质粒p ET20b 2SUMO 2F GF21转化至大肠
杆菌BL21(Rosetta )中,经014mmol ?L -1IP T G 诱导后,经12%SDS 2PA GE 分析显示,在相对分子质量约33000附近可见目的蛋白带(图3),与理论预期值相符合,而且表达量随诱导时间
的增加而增加,4h 表达量达到最高,5h 表达量有所下降。见图4
。
图2 重组表达载体p ET20b 2SUMO 2F GF21的双酶切分析
Fig 12 Analysis of recombinant p ET20b 2SUMO 2F GF21digested with B am H Ⅰand X ho Ⅰ
Lane 1:DNA marker DL 2000;Lane 2:SUMO 2F GF21
fragment.
图3 诱导表达蛋白SDS 2PA GE 分析
Fig 13 SDS 2PA GE analysis of transformants induced by IPT G
Lane 1:Protein marker ;Lane 2:Control ;Lane 3:Transformant s induced by IP T
G.
图4 融合蛋白在大肠杆菌中的表达
Fig 14 Expression of f usion protein in E 1coli BL21
Lane 1:Protein marker ;Lane 2:Control ;Lane 3-7:1,2,3,4,5h after induced by IP T G ,respectively.
3
8王会岩,等1 人成纤维细胞生长因子221基因的克隆表达及蛋白的纯化
213 蛋白可溶性表达的确定及免疫印迹分析 将
表达菌体经超声破碎后。8000r ?min -1离心
30min ,收集上清液及沉淀。沉淀用等体积的裂解液溶解,上清和沉淀同时进行12%SDS 2PA GE 电泳分析,在上清中看到目的条带,而沉淀中目的条带很少。见图5
。
图5 融合蛋白的可溶性分析
Fig 15 Solubility analysis of f usion protein
Lane 1:Protein marker ;Lane 2:Control ;Lane 3:4h after induced by IP T G;Lane 4:Supernatant of frost t hawing ;Lane 5:Precipitation of frost t hawing.
为了进一步鉴定F GF21蛋白,以F GF21的多克隆抗体进行Western blotting 分析。重组蛋白能与F GF21的多克隆抗体特异性结合,而与对照未发生结合。见图6
。
图6 F GF21的Western blotting 分析结果
Fig 16 The results of Western blotting analysis of F GF21
214 重组蛋白的纯化及F GF21蛋白的纯化 重组
蛋白经过阴离子交换层析、Ni 金属亲和层析、Sep hadex G 50纯化后,通过SDS 2PA GE 进行纯度分析。纯化的重组蛋白经SUMO 蛋白酶酶切、Ni 金属亲和层析和Sep hadex G 50纯化,SDS 2PA GE 分析显示纯度在95%以上。见图7
。
图7 F GF21蛋白的SDS 2PA GE 分析
Fig 17 SDS 2PA GE analysis of F GF21protein.
Lane 1:Protein marker ;Lane 2:F GF21;Lane 3:SUMO 2F GF21.
3 讨 论
本研究通过PCR 方法获得了SUMO 2F GF21融合基因,其大小与理论预期值864bp 相符。将其连接至表达载体p ET20b ,通过B am H Ⅰ和X ho Ⅰ双酶切鉴定,约在864bp 处可见一条清晰条带,由此证实已成功地构建重组表达载体p ET20b 2SUMO 2F GF21将该重组表达载体转化至大肠杆菌BL21(Rosetta )中,经IP T G 诱导,SDS 2PA GE 分析,在相对分子质量约33000附近可见
融合蛋白表达带,与理论预期值相符[9]。融合蛋白表达量随诱导时间的延长而增加,4h 表达量达到最高,5h 以后表达量有所下降。通过Western blotting 分析证实,表达的融合蛋白具有与F GF21的多克隆抗体反应的活性。为了进一步验证分子伴侣融合表达蛋白的活性,本研究将该工程菌经过阴离子交换层析、Ni 金属亲和层析、Sep hadex G 50除盐以及进行SUMO 蛋白酶酶切,再进行纯化,结果表明纯度在95%以上;该蛋白经蛋白质N 末端序列分析,结果显示:前5个氨基酸分别为HPIPD ,与理论氨基酸序列一致,可以用于以后的细胞实验和动物实验。
本研究成功地利用分子伴侣构建融合表达F GF21的原核表达载体,获得了表达F GF21融合
蛋白的基因工程菌,改进了礼来公司[10]的包涵体表达,避免了纯化过程中的变性和复性以及表达产物活性低等问题,建立了发酵和纯化工艺,使大量生产F GF21蛋白成为可能,为今后进一步研制治疗2型糖尿病的新药奠定了基础。
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48吉林大学学报(医学版) 第36卷 第1期 2010年1月
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成人与青少年正畸矫治效果的临床观察
北华大学口腔医学院(吉林吉林132013) 顾晓琪,李 东,郭 晶北华大学附属医院(吉林吉林132013) 王发生 吉林省吉林市口腔医院(吉林吉林132013) 金 怡
1 资料与方法
111 一般资料 成人错牙合畸形患者67例,平均年龄21168岁,疗程6～36个月,平均18136个月,治疗完成后随访32例,平均随访时间316年。青少年患者130例,平均年龄12101岁,疗程6～22个月,平均13146个月,治疗完成后随
访74例,平均随访时间213年。
112 治疗方法 牙列拥挤者可选用邻面片切方法或将澳丝在弓丝末端弯制阻挡曲,解除拥挤或视情况减数拔牙,关闭拔
牙间隙。牙弓前突采用减数拔牙的方法,关闭间隙内收前牙。前牙反牙合可考虑下颌减数拔牙治疗,后牙反牙合可展开上颌后牙并配合颌间交互牵引治疗。开牙合患者可利用唇弓的位置使上下前牙向牙合平面靠拢;牙间隙患者可用带有牵引圈的唇弓内收关闭间隙,有牙齿缺失者可集中散在间隙,再进行义齿修复。
113 疗效判断标准 显效:牙列排列整齐,具有显著疗效;有效:症状明显改善,矫治有效;无效:症状无改善或治疗中
断,矫治无效。
2 结 果
青少年需拔牙患者拔牙间隙关闭平均时间(4123±1102)月,130例患者治疗总疗程(13114±2106)月,显效
86115%(112/130),有效12131%(16/130),无效1154%(2/130),稳定性73108%(95/130);成人需拔牙患者拔牙间
隙关闭平均时间(6191±1136)月,67例患者治疗总疗程(17148±2113)月,显效71164%(48/67),有效25137%
(17/67),无效2199%(2/67),稳定性94103%(63/67)。成人拔牙间隙关闭时间、治疗疗程较青少年长,青少年的有效
率高于成人,但成人的稳定性明显高于青少年(P <0105)。
3 讨 论
成人矫治的原因:成人患者主动配合正畸治疗,但治疗的动机和心态更为复杂。而儿童多半是父母、亲属督促其就诊。成人与青少年的差异:成人的生长发育趋于稳定,生物学反应降低,所以成人骨骼对正畸力的反应较青少年慢;成人全身健康状况较青少年复杂,患有牙体疾病、牙周疾病、颞下颌关节疾病的成人患者数量高于青少年,成人这些疾患会给正畸治疗带来一定的困难,需要联合治疗。对于成人错牙合畸形患者需要减数拔牙时应结合临床患者具体情况,如果牙周健康状况良好时,矫治方案和青少年患者没有差别;如果牙周条件差,要先行治疗牙周,待牙周稳定后根据牙槽骨的病变情况确定针对性的治疗计划,拔牙要慎重,主张尽量小范围移动牙齿。成人较青少年更担心治疗的效果与风险,因此要将治疗的潜在危险,可能出现的治疗反应等明确告知患者。正畸后成人稳定性占94%,青少年的稳定性占73%,本文作者认为:与青少年智齿萌出对牙弓的影响有关,当第3恒磨牙发育萌出时,尤其是前倾和水平阻生时,有向前推压之力可能引起复发,因此应密切注意第3恒磨牙发育萌出情况,必要时及时拔除,以得到稳定的保持效果。成人生长发育趋于稳定,牙齿小范围移动,只要经良好的保持,完成牙周组织的改建,矫治效果也更稳定。综上所述,成人正畸正在不断发展和完善,在今后临床中要不断改进矫治器,提高矫治技术,同时要加强对成人正畸治疗目标和远期疗效的进一步观察。
5
8王会岩,等1 人成纤维细胞生长因子221基因的克隆表达及蛋白的纯化
绿色荧光蛋白G F基因 的克隆表达和粗提取 SANY标准化小组 #QS8QHH-HHGX8Q8-GNHHJ8-HHMHGN#
绿色荧光蛋白(G F P)基因的克隆、表达和粗提取 南方医科大学 2011预防医学（卫生检验检疫） 摘要 目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。方法：从 DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞 BL-21中，用LB培养基对转化后的进行扩大培养。用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。 关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取 目录
1 前言 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿
色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。1962 年，下村修等分离纯化了水母中发光蛋白水母素，并发现一种绿色的荧光蛋白。1974 年，他们分离得到了这个蛋白，当时称绿色蛋白，以后称绿色荧光蛋白(GFP)[1] GFP 作为一种新的报告基因，其优点在于①荧光强度高，稳定性高；②GFP 分子量小，易于融合，适用于多种转化方式，对受体无毒害，安全可靠；③不需要反应底物与其他辅助因子，受蓝光激发产生绿色荧光，尤其适用于体内的即时检测； ④GFP 不具有种属依赖性，在多种原核和真核生物细胞中都表达；⑤通过替换一些特殊氨基酸，可以使之产生不同颜色的光，从而适应不同的研究需要。近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化，以及细胞的分离与纯化等研究领域[ 2～3]。采用GFP 作为标记基因，可直接收集转化细胞供实验，缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记，为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有效的手段[ 4、5 ]。采用基因工程手段生产GFP标记的方法，可建立一种简便、快速的免疫诊断技术[6]。 质粒转化进入大肠杆菌（Escherichia coli）感受态细胞是分子克隆的关键步骤[7]，是基因克隆以及DNA文库构建等研究中一项重要的常规操作。目前，感受态 法，该方法操作简单、容易掌握、重复性好、转化率 细胞的制备主要采用CaCl 2 高，可广泛应用于一般的实验室。其原理是Ca2+ 破坏细胞膜上的脂质阵列，并与膜上多聚羟基丁酸化合物、多聚无机磷酸形成复合物以利于外源DNA的渗入[8]。 大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产
毕业设计/论文 开题报告 课题名称红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析类别毕业论文 系别城市建设学院 专业班生物工程0701班 姓名于凯 评分 指导教师 华中科技大学武昌分校
华中科技大学武昌分校学生毕业论文开题报告
癌活性，对于治疗卵巢癌、乳腺癌等疗效突出。但是由于含量少、提取困难等诸多因素，高纯度紫杉醇价格昂贵，每公斤200万元人民币左右。因此，近年来国内外许研究人员、实验室和公司一直试图通过生物合成、化学合成、微生物提取、组织和细胞培养、寻找类似物等途径来解决紫杉醇的药源短缺问题。 研究紫杉醇的生物合成，尤其一些限速反应步骤机理的阐明对于人为定向的提高合成效率，克隆重组形成关键酶基因从而提高紫杉醇的产量意义重大。从理论上来说这是一个好方法，但是紫杉醇的合成途径非常复杂，涉及到多种酶以及很多分支途径，单纯依靠转化一、两种限速酶基因，只能保证转入的限速酶表达量提高，使之不再是限速因素，但其它阶段对于最终产量的限制依然存在，而且同时转入多种基因的可行性非常低，这种方法的缺陷很明显。 若采用化学合成，如从红豆杉植物中分离得到的巴卡亭Ⅲ经过四步化学过程可合成紫杉醇，为合成紫杉醇提供了新途径[5]。但化学合成从实质意义上说还没有取得彻底的突破，目前还不具备应用价值。 如果从共生真菌中直接提取紫杉醇，能够利用真菌生长速度快的优势，但目前分离的菌株无论从种类还是数量上都远不够工业化的要求，而且还存在很多不确定因素[1]。生产紫杉醇的微生物大多是与红豆杉共生的真菌，其紫杉醇含量极微，并且这些真菌的培养和大规模发酵困难，菌株衰退也是一个难题。 另外，红豆杉愈伤组织和细胞培养生产紫杉醇是研究的热点之一，是工厂化大规模生产紫杉醇的重要手段之一。但运用植物组织、细胞培养技术生产紫杉醇仍处在实验室阶段，如何获得高含量、产紫杉醇稳定的愈伤组织一直都是组织培养、细胞培养生产紫杉醇的关键。 1.1.3关于MYB基因 ①MYB基因 目前，在几乎所有的真核生物中都发现了与禽类逆转录病毒癌基因和细胞原癌基因c-MYB相似的基因，它们的编码产物在结构和功能上具有高度保守的DNA结合域，是一类转录因子[6]。在植物中首先从玉米中克隆了含有MYB结构域的转录因子C1基因，之后在植物中发现的MYB相关基因的数量迅速增加[7]。
青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析 周xx,xx 班级 摘要 广泛逆境胁迫蛋白(USPs)参与碳缺乏、缺氧、干旱和高盐 等多种非生物胁迫, 但在植物中的研究尚不深入。本文通 过RACE-PCR 的方法获得青杄PwUSP2基因的cDNA 全长, 共987 bp ,其中编码区723 bp ,共编码240个氨基酸。利用 生物信息学工具对其理化性质、二级结构和三级结构进行 分析,结果显示,该蛋白理论分子质量为26.84 kDa ,理论等 电点为4.61,有丝氨酸和苏氨酸结合位点,为非跨膜的亲水 蛋白。PwUSP2具有USP 家族典型的UspA 结构域,但无典 型的A TP 结合位点G-2X-G-9X-G[S/T]。RT-qPCR 分析表明, PwUSP2在青杄花粉、果实、种子、成熟叶、幼叶、成茎中 均有表达,在果实中表达量较高。同时,PwUSP2在脱落酸 (ABA )、茉莉酸甲酯(MeJA )等非生物胁迫下表达量有明显 变化,推测PwUSP2可能参与青杄对逆境胁迫的响应。 材料与方法 青杄植 物材料 实验结果 通过RACE-PCR 方法获得PwUSP2基因的末端序列,与EST 序列拼接后获得完整的cDNA 序列全长。PwUSP2基因cDNA 序列全长共987 bp , 编码区共723 bp , 共编码240个氨基酸。 在85 bp 处为起始密码子ATG , 805 bp 处为终止密码子TGA , 968 bp 处为Poly(A)20尾巴。 青杄PwUSP2 全长cDNA 的获得 生物信息 学分析 组织特异 性表达 胁迫 处理 PwUSP2在不同非生物胁迫下的表达模式不同。PwUSP2受4℃低温诱导,表达量上调,且在12 h 表达量达到最高,在42℃热激胁迫下, PwUSP2呈现不同的表达模式,表达量呈整体下降趋势。 PwUSP2在ABA 胁迫下表达量出现下降, 与42℃热激胁迫模式相似,而在MeJA 胁迫下,PwUSP2基因受到诱导, 表达量显著上调。 ABA 和MeJA 胁迫下PwUSP2的表达分析 在NaCl 胁迫下, PwUSP2基因的表达量先上升后下降,同时PwUSP2基因的表达受干旱胁迫诱导上调。 温度胁迫下PwUSP2的表达分析 NaCl 和干旱胁迫下PwUSP2的表达分析 讨论 目前,在细菌和植物中,只有少数USPs 基因被克隆和分离,且部分参与了多种逆境胁迫。PwUSP2是广泛逆境胁迫蛋白,本研究结果显示其在多种逆境胁迫下存在表达差异,对不同胁迫的反应时间也存在差别,暗示其可能广泛参与多种逆境胁迫响应。PwUSP2在抗逆过程中的具体功能, 以及参与的信号转导路径和调控机制仍有待于研究。 林学院第五届学生学术论坛
第6卷第4期(专辑) 2002年12月 生命科学研究 Life Science Research Vol.6No.4(Suppl.) Dec.2002基因克隆技术的研究进展X 钟军,李,官春云 (湖南农业大学油料作物研究所,中国湖南长沙410128) 摘要:为能快速而准确地克隆目的基因,综述了一些基因克隆常用技术,包括差异表达基因分离技术、转座子标签技术、图位克隆技术、同源序列技术、表达序列标签技术的原理、应用及应用潜力,并对其作了简要的评价. 这些技术有利有弊,应根据不同的实验目的和水平来选择相应的技术. 关键词:基因;克隆;差异表达基因分离技术;转座子标签技术;图位克隆技术;同源序列技术;表达序列标签技术 中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:1007-7847(2002)S1-0148-05 Advances in Gene Cloning Technique ZHONG Jun,LI Xun,GUAN Chun-yun (T he Oil Crop Institute of H unan Agriculture University,Chan gsha410128,H unan,China) Abstract:To clone candidate gene quickly and correctly,advances about gene cloning included map-based cloning, transposon tagging,homology-based candidate gene method,expressed sequence tagging methods and some differen-tially expressed gene clone method are introduced and appraised.Because of the advantages and disadvanta ges of those techniques,various technique should be selected according special purpose and level. Key words:gene;clone;differentially e xpressed gene clone method;transposon tagging;map-based cloning;ho-mology-based candidate gene method;e xpressed sequence ta gging method (Li f e Science Research,2002,6(Suppl):148~152) 克隆基因的途径有两种,正向遗传学和反向遗传学途径.前者是依据目标基因所表现的功能为基础,通过鉴定其产物或某种表型突变而进行的;后者则着眼于基因本身,通过特定的序列或在基因组中的位置进行.近几十年来,许多重点实验室致力于植物基因的克隆,到1992年取得了突破性进展.基因的克隆一般采用下列技术:差异表达基因分离技术、转座子标签技术、表达序列标签技术、图位克隆技术和同源序列技术等. 1差异表达基因分离技术 1.1扣除杂交技术 扣除杂交技术的原理是用有特异性表达基因的目标样提取mRNA经逆转录形成cDNA探针,与无特异性表达基因的参照样的过量mRNA或cDNA杂交,经两轮充分杂交后,移去杂交分子和过量的无特异性表达基因的参照样mRNA或cD-NA,将不形成杂交体的有特异性表达基因的目标样cDNA纯化富集、扩增,建立相应cDNA文库即为差异表达基因cDNA文库.此技术最早是由Lamar和Palmer于1984年提出[1],他们先用超声波打断雌性小鼠的DNA,用Mbo1完全消化雄性小鼠DNA;将两者一起变性、复性,再将产物克隆入表达载体的Bam H I位点中,只有那些两端有GATC序列的基因才能被克隆入载体,这样就达到了扣除两者共有序列的目的,并得到雄性小鼠 X收稿日期:2002-06-11;修回日期:2002-10-14 作者简介:钟军(1973-),女,湖南沅江人,博士研究生,从事分子遗传学研究.Tel:+86-0731-*******,E-mail:zhhjp@s https://www.doczj.com/doc/248072724.html,
青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析 周xx,xx班级 摘要 广泛逆境胁迫蛋白(USPs)参与碳缺乏、缺氧、干旱和高盐 等多种非生物胁迫, 但在植物中的研究尚不深入。本文通 过RACE-PCR的方法获得青杄PwUSP2基因的cDNA全长, 共987 bp,其中编码区723 bp,共编码240个氨基酸。利用 生物信息学工具对其理化性质、二级结构和三级结构进行 分析,结果显示,该蛋白理论分子质量为26.84 kDa,理论等 电点为4.61,有丝氨酸和苏氨酸结合位点,为非跨膜的亲水 蛋白。PwUSP2具有USP家族典型的UspA结构域,但无典 型的A TP结合位点G-2X-G-9X-G[S/T]。RT-qPCR分析表明, PwUSP2在青杄花粉、果实、种子、成熟叶、幼叶、成茎中均有表达,在果实中表达量较高。同时,PwUSP2在脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)等非生物胁迫下表达量有明显 EST 968 bp处为Poly(A)20尾巴。 PwUSP2全cDNA的核苷酸序列及推导的氨基酸序列PwUSP2在不同非生物胁迫下的表达模式不同。PwUSP2 受4℃低温诱导,表达量上调,且在12 h表达量达到最高,在 42℃热激胁迫下, PwUSP2呈现不同的表达模式,表达量呈整 体下降趋势。 ABA和MeJA胁迫下PwUSP2的表达分析 在NaCl胁迫下, PwUSP2基因的表达量先上升后下降, 同时PwUSP2基因的表达受干旱胁迫诱导上调。 温度胁迫下PwUSP2的表达分析 NaCl和干旱胁迫下PwUSP2的表达分析 讨论 目前,在细菌和植物中,只有少数USPs基因被克隆和 分离,且部分参与了多种逆境胁迫。PwUSP2是广泛逆境胁 迫蛋白,本研究结果显示其在多种逆境胁迫下存在表达差 异,对不同胁迫的反应时间也存在差别,暗示其可能广泛参 与多种逆境胁迫响应。PwUSP2在抗逆过程中的具体功能, 以及参与的信号转导路径和调控机制仍有待于研究。 林学院第五届学生学术论坛
基因克隆载体上的各种常用蛋白标签 蛋白标签(proteintag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。 美国GeneCopoeia(复能基因)为客户提供50多种蛋白标签，可以满足客户的不同需求，包括各种最新型的标签，如：SNAP-Tag?、Halo Tag?、AviTag?、Sumo等;也提供齐全的各种常用标签，如eGFP、His、Flag等等标签。 以下是部分蛋白标签的特性介绍，更加详细的介绍可在查询产品的结果列表里面看到各种推荐的蛋白标签和载体。 TrxHIS His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测;二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点： 标签的量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能; His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性; His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究; His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。 可应用于多种表达系统，纯化的条件温和; 可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 Flag标签蛋白 Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK)，同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点： FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。 融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。 FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。
第九讲目的基因的克隆 中国科学院遗传与发育生物学研究所 2017年8月
目录 一、基因克隆的一般概念 1．基因克隆定义 2．“克隆”的不同含义 3．基因克隆的过程 4．DNA片段的产生与分离 5．基因文库 二、基因克隆与分离的实验策略 1．物理策略 2．生物策略 3．克隆样品的选择 4．基因文库库容测算 三、cDNA基因克隆 1．概述 2．cDNA文库的构建 3．低丰度mRNA之cDNA克隆 4．稀少mRNA的cDNA克隆 5．全长cDNA的合成 6．cDNA克隆的优越性 四、基因组DNA克隆
1．cDNA克隆的局限性 2．基因组DNA克隆的优越性 3．构建基因组文库的载体类型五、基因定位定隆 1．基因定位克隆概述 2．RFLP分子标记 3．RFLP作图原理与步骤 4．染色体步移 5．大尺度物理图谱的构建
目的基因的克隆 一、基因克隆的概念 1．基因克隆的定义 基因克隆亦叫做DNA克隆(DNA cloning)，它是指将外源基因或DNA片段插入到克隆载体的分子上，构成重组的DNA群体，并转化到寄主细胞进行复制和繁殖，以便从大分子DNA或DNA片段混合物中分离纯化目的基因或特定DNA片段的实验操作，叫做基因克隆。严格地说，基因克隆应叫做DNA克隆，因为被克隆的是基因组的全部(理论上)的DNA片段，而并不是所有的DNA片段都编码有基因。 *要注意基因克隆与基因分离两者在概念上的差别！完成了基因克隆并不等于完成了基因的分离！尽管两者之间存在密切的相互关系。因此在日常交谈中或是一般文字叙述中，甚至于某些正式有关文件中，常把“基因克隆”与“基因分离”等同使用，不作区分，是不妥当的。 *有时我们所说的基因克隆，即所谓的“分子克隆”(Molecular cloning)，实质上包含着目的基因的分离与鉴定两个主要的内容，基因克隆的全过程包括如下四个步骤：
3 结果与分析 3.1质粒提取 用醋酸铵法提取pET-28a 和pEGFP-N3质粒后，进行琼脂糖电泳检测质粒是否提取成功。得到电泳结果，如图一所示，3、4号泳道有明显清晰的条带说明pEGFP-N3提取成功。1、2泳道同样有明显清晰的条带，说明pET-28a 提取成功。 3.2 双酶切 用BamH1和Not1分别对pEGFP-N3和pET-28a 双酶切。1、2号泳道为pEGFP-N3的酶切结果，如图二所示，电泳会得到两条带，说明pEGFP-N3酶切成功。4号泳道为pET-28a 的酶切产物的电泳有明显条带，证明酶切成功。 3.3 抗性筛选 通过氯化钙法制备DH5α感受态细胞，用热激发将pET-28a-GFP 转入DH5α感 图 1 pET-28a 和pEGFP-N3质粒提取电泳图 1、2泳道为pET-28a 电泳结果 3、4号泳道为pEGFP-N3电泳结果 图 2 BamH1、Not1双酶切 pEGFP-N3和pET-28a 1、2号泳道为pEGFP-N3酶切产物 3号泳道为pEGFP-N3原始质粒 4号泳道为pET-28a 酶切产物 5号用泳道为pET-28a 原使质粒
受态细胞。转化重组质粒后涂平板，进行重组质粒的抗性筛选。因为28a中含有 抗卡那基因，所以筛选后可以得到含28a的重组质粒。从图中可以看出1号平板 长出较多菌落，说明DH5α感受态细胞存活。2号平板无菌落生长，说明DH5α中 不含抗卡那基因。3号板生长出较少菌落，证明卡那有活性。4号板无菌落生长。 失败原因其一可能是在倒了第一个平板加入卡那后，由于倒平板速度太慢，导致 培养基凝固，影响了卡那的浓度和活性。其二可能是在转化过程中，离心后，弃 上清的过程中，将沉淀和上清混在了一起，影响了溶液的浓度。 图3重组质粒转化DH5α感受态细胞 1号图为不含卡那的阴性对照 2号图为含卡那的阴性对照 3号图为含卡那的自提pET-28a的阳性对照 4号图为含卡那的连接产物结果 3.4PCR鉴定 经PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增成功，得到电泳结果如图 四所示，结果表明，1、2泳道的条带约为700bp，说明成功扩增出含有GFP的基 因。DNA电泳检验扩增片段,选出能够得到700bp左右片段的阳性克隆。 图4阳性重组菌的PCR鉴定 1、2号泳道为重组质粒转化结果
题目：绿色荧光蛋白（GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达 李宏远 2014236053 立题依据： 随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展和广泛应用, 人们根据自己的意愿有目的、有计划、有根据、有预见地将外源基因导入动物细胞内, 使外源基因进行表达、阐明基因表达的调控机理或者通过与染色体基因组进行稳定整合，将生物性状传递给子代动物的研究方兴未艾[1]。 1.选材：大肠杆菌 大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产目的蛋白等优点。而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌中蛋白量的30 %，因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。 2.基因标记技术 基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而引起了科学家的广泛关注，现已被普遍应用到分子生物学研究的各个方面。荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白[2]。
3.绿色荧光蛋白 从水母(Aequorea victoria)体内发现的发光蛋白。分子质量为 26kDa，由238个氨基酸构成，第65～67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团，是主要发光的位置。其发光团的形成不具物种专一性，发出荧光稳定，且不需依赖任何辅因子或其他基质而发光。绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因。 【实验目的】 研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。 【研究意义】 研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。根据电泳结果及荧光现象得出结论，重组质粒在大肠杆菌体内成功诱导表达。 GFP的应用特点 检测方便：不需要外加底物和辅助因子，用内眼就可以观察到，在长紫外光照射下特别漂亮，以此作为标记，观察表达产物。
作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014， 40（6）： 1027-1034 http：//https://www.doczj.com/doc/248072724.html,/ ISSN 0496-3490； CODEN TSHPA9 E-mail： xbzw@https://www.doczj.com/doc/248072724.html, 本研究由辽宁省科技厅农业攻关项目（2011208001）资助。 * 通讯作者（Corresponding author）： 李文利， E-mail： biolwl@https://www.doczj.com/doc/248072724.html, 第一作者联系方式： E-mail： yh4018@https://www.doczj.com/doc/248072724.html, Received（收稿日期）： 2013-09-26； Accepted（接受日期）： 2014-01-12； Published online（网络出版日期）： 2014-03-24. URL： http：//https://www.doczj.com/doc/248072724.html,/kcms/detail/11.1809.S.20140324.1336.013.html DOI： 10.3724/SP.J.1006.2014.01027 一个快速响应干旱的F-box 基因的克隆和表达分析 尹 恒 余琴鸯 安利佳 李文利* 大连理工大学生命科学与技术学院， 辽宁大连 116024 摘 要： F-box 是Skp1-Cullin1-F-box （SCF）型泛素连接酶E3的重要组成部分， 在泛素化介导的蛋白质降解中选择性识别靶蛋白。本文从谷子苗期干旱胁迫条件下构建的转录组文库中克隆了与耐旱早期响应相关的F-box 基因， 命名为SiFBX （GenBank 登录号为KC252635.1）。该基因全长510 bp， 编码170个氨基酸。蛋白质结构预测表明， 该蛋白含有丰富的精氨酸、亮氨酸、丝氨酸， 缺少跨膜结构域及信号肽序列。系统进化分析表明， 该基因与已报道的EID1和FBW4亲缘关系较近。在该基因上游1.9 kb 序列处， 预测到启动子的核心序列及与多种逆境胁迫相关的调控序列。荧光定量PCR 分析表明， 该基因分别在正常干旱、PEG 和ABA 诱导下， 表达量出现显著变化。 关键词： 谷子； 干旱响应； F-box； gRT-PCR Cloning and Expression Analysis of an F-box Gene （SiFBX ） Rapidly Respon-sive to Drought Stress YIN Heng， YU Qin-Yang， AN Li-Jia， and LI Wen-Li * School of Life Science & Biotechnology， Dalian University of Technology， Dalian 116024， China Abstract： F-box proteins， components of the Skp1-Cullin1-F-box （SCF） protein E3 ubiquitin ligase complex， serve as the variable component responsible for substrate recognition and recruitment in SCF-mediated proteolysis. The anti-drought relative gene of SiFBX （GenBank accession number KC252635.1） which belongs to the F-box super family was cloned from foxtail millet （Se-taria italic ）. The full-length cDNA of SiFBX was 510 bp， which encoded 170 amino acid residues. Protein analysis and structure predication showed that it has a higher proportion of arginine （R）， leucine （L）， and serine （S） and a lack of trans-membrane do-mains and signal peptide. Phylogenetic analysis demonstrated that SiFBX has similarity with EID1 and FBW4. Many abiotic stress-related cis -acting elements and transcription factors were discovered in the 1.9 kb upstream region of SiFBX . The results of real-time PCR showed that there were remarkable changes in the expectation level of SiFBX for the treatments with PEG ， wa-ter-withholding， and ABA. Keywords： Setaria italica ； Drought response； F-box protein； qRT-PCR 研究表明， 泛素化蛋白连接酶E3对植物生长发育和逆境胁迫响应等过程中的关键步骤具有重要的调控作用[1]， Skp1-Cullin1-F-box （SCF）型蛋白复合物是E3中研究最深入的一类。F-box 蛋白也是真核细胞中一大类蛋白质家族， 包含了一个35～60个氨基酸组成的F-box 结构域， 在SCF 型E3介导的蛋白降解中， 起着靶蛋白识别和稳定SCF 复合物的作用。F-box 蛋白结构域的N-端部分与SKP 结合， 通过其C-端部分与靶蛋白结合发挥作用。在F-box 蛋白结 构域的下游， 常常伴随一些重要的次级元件， 如LRR （leucine-rich repeat）、WD repeat 、亮氨酸拉链结构等[2]。 Shinozaki 等[3]首先在拟南芥基因组序列中发现了近700个编码F-box 蛋白的基因， 占基因组编码总蛋白的3%左右。Jain 等[4]也在水稻基因组中发现了687个F-box 蛋白， 根据F-box 蛋白C 端的不同将其分为10大类亚家族。对功能已知的F-box 蛋白深入研究表明， F-box 蛋白几乎参与所有的植物生长发
基因克隆技术 摘要：基因克隆技术是分子生物学的核心技术，其目的是获得某一基因或DNA 片段的大量拷贝，用于深入分析基因的结构与功能，并可达到人为改造细胞以及物种遗传性状的目的。本论文主要从以下几个方面来介绍基因克隆技术：目的基因的获得、目的基因和载体的连接、重组分子的扩增和鉴定。 关键词：目的基因；限制性内切酶；克隆；重组分子 ABSTRACT：Gene cloning technology is the core of molecular biology technology, its purpose is obtain a gene or DNA fragments of the copy, used for in-depth analysis the structure and function of genes, and may achieve human cells and the transformation of the species genetics purpose.This thesis mainly from the following several aspects to introduce gene cloning technology: the purpose of the gene for the purpose, genes and carrier, restructuring of the molecules connected amplification and identification. Keywords：purpose gene;restriction endonuclease;clone;restructuring molecules 基因克隆是70年代发展起来的一项具有革命性的研究技术，可概括为∶分、切、连、转、选。“分”是指分离制备合格的待操作的DNA，包括作为运载体的DNA和欲克隆的目的DNA；“切”是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA，或者切出目的基因；“连”是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来，形成重组的DNA分子；“转”是指通过特殊的方法将重组的DNA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增；“选”则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体。基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。 1. 目的基因的获得 目的基因是指所要研究或应用的基因，也就是将要克隆或表达的基因。获得目的基因是分子克隆过程中最重要的一步。基因工程流程的第一步就是获得目的DNA片段,。所需目的基因的来源, 不外乎是分离自然存在的基因或人工合成基因。常用的方法有PCR 法、化学合成法、cDNA法及建立基因文库的方法来筛选[1] 1.1 PCR方法
Cloning and expression of peroxisomal Ascorbate Peroxidase gene from wheat Yaping Chen,Huazhong Wang,Xiue Wang,Aizhong Cao&Peidu Chen* State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement,Nanjing Agricultural University, Nanjing210095,People’s Republic of China;*Author for correspondence(Phone:+86-25-84396026;E-mail: pdchen@https://www.doczj.com/doc/248072724.html,) Accepted24October2005 Key words:peroxisomal ascorbate peroxidase,powdery mildew,SSH,wheat Abstract A full-length cDNA encoding wheat peroxisomal ascorbate peroxidase(pAPX)was cloned by Suppression Subtractive Hybridization(SSH)and in silico approach.The cDNA was1027bp in length and contained a complete ORF of876bp,which encodes a protein of292amino acid residues.Its deduced amino acids sequence had84%identity with that of pAPX from barley.The gene was designated as Ta-pAPX.The Ta-pAPX homologous genes were mapped on wheat chromosome7A and7D using Chinese Spring nulli-tetrasomic lines analysis.Northern analysis indicated that,after inoculation by Erysiphe graminis Dc.f.sp. tritici,the expression of Ta-pAPX gene in Yangmai5was enhanced,but its expression in wheat-Haynaldia villosa6VS/6AL translocation lines changed a little.The results implied that Ta-pAPX may be related to susceptibility of wheat to powdery mildew.The complete coding sequence of Ta-pAPX was cloned into an expression vector pET32(a+)and a protein with the same deduced molecular weight(MW)was expressed in E.coli BL21(DE3),which showed ascorbate peroxidase activity. Abbreviations:APX–ascorbate peroxidase;ESTs–expressed sequence tags;IPTG–isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside;MW–molecular weight;ORF–open reading frame;pAPX–peroxisomal ascorbate peroxidase;SSH–Suppression Subtractive Hybridization. Introduction Ascorbate peroxidase(APX),found in higher plants,cyanobacteria,and algae[1],is the key enzyme in degradation hydrogen peroxide.So far, at least?ve APX isoforms have been identi?ed in plants:cytosolic isoforms,mitochondria isoforms, peroxisomal/glyoxysomal isoform and two chlo-roplastie isoforms,one in stroma and the other associated with the thylakoid membranes,all of which catalyze the reaction: 2ascorbate peroxidasetH2O2! 2monodehydroascorbatet2H2O APXs activity increased in response to a num-ber of stress conditions,such as drought[2],salt [3],high temperature[4]and pathogen infection [5].Relationship between di?erent stress condi-tions and changes of APX activity were observed. Powdery mildew caused by E.graminis DC.f.sp.tritici is one of the most serious diseases of common wheat in China and many other countries.The Triticum aestivum(‘‘Yangmai5’’)–Haynaldia villosa6VS/6AL translocation line carrying powdery mildew resistance gene Pm:21 confers e?ective resistance to all current powdery mildew races.To investigate the mechanism of Molecular Biology Reports(2006)33:207–213 DOI10.1007/s11033-005-4536-1óSpringer2006
基因工程实验设计 题目：绿色荧光蛋白基因(gfp)的克隆及表达 专业：生工1001 ：会淼 2013年3月13 实验目的：研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。 实验方法; 通过分别将DH-5α (pEGFP-N3)和DH-5α(pET-28a)提取质粒、酶切并连接形成重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入E.coli DH-5α感受态细胞中进行转化,通过限制性核酸切酶Not I与Bam H1和PCR对所建质粒进行分析鉴定后, 通过转化的方法把含绿色荧光蛋白（GFP）外源基因转入大肠杆菌体BL-21进行表达，再用IPTG诱导GFP基因表达，如果可以看到显现绿色，判断GFP基因在大肠杆菌中成功表达。 1.材料与方法： 1.1.1 实验材料 克隆菌E.coli DH-5a、表达菌BL-21为本实验室收藏菌种，质粒 pET-28a 和 pEGFP-N3，引物，限制性切酶 Bam H1、 Not Ⅰ 1.1.2 仪器设备 Eppendof离心机、电泳仪、电子天平、台式离心机、控温磁力搅拌器、调温电热套pH计、冰箱、台式冷冻恒温振荡器、紫外灯、生物洁净工作台、电热恒温水温箱、琼脂糖凝胶电泳电泳装置、凝胶成像分析系统、酒精灯、培养皿、、移液枪、枪头、接种环、酒精棉球、灭菌枪头、平板封口膜、离心管 1.1.3 试剂及溶液 分装后于121 ℃高压灭菌20 min。（LB固体培养基是在液体LB中加琼脂粉至1 %）； 溶液Ⅰ 50 mL 葡萄糖50 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0) 25 mmol/L EDTA (pH 8.0) 10 mmol/L 121℃高压灭菌 15 min后置于0~4℃贮存； 溶液Ⅱ 100 mL NaOH 0.2 mol/L
学号：班级：姓名： 《生物化学与生物分子学实验》 ——分子生物学设计性实验开题报告 实验课题：绿色荧光蛋白的基因克隆及表达 指导老师： 作者姓名： 所在院系： 小组编号： 小组成员： 完成时间：
成都医学院 Cheng Du Medical College 题目：绿色荧光蛋白（GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达 立题依据： 随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展和广泛应用, 人们根据自己的意愿有目的、有计划、有根据、有预见地将外源基因导入动物细胞内, 使外源基因进行表达、阐明基因表达的调控机理或者通过与染色体基因组进行稳定整合，将生物性状传递给子代动物的研究方兴未艾[1]。 1.选材：大肠杆菌 大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产目的蛋白等优点。而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌中蛋白量的30 %，因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。 2.基因标记技术 基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而引起了科学家的广泛关注，现已被普遍应用到分子生物学研究的各个方面。荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白[2]。 3.绿色荧光蛋白 从水母(Aequorea victoria)体内发现的发光蛋白。分子质量为 26kDa，由238个氨基酸构成，第65～67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团，是主要发光的位置。其发光团的形成不具物种专一性，发出