当前位置:文档之家 > 生化实验论文

生化实验论文

生化实验论文

小鼠肝脏过氧化氢酶

制备与测定

小组成员:李朋(10011140010)

邱方洲(10011140016)

武浩(10011140020)

谢黎(10011140022)

2010级一大班法医

2012年1月3日

生化实验论文

生化实验论文

实验目的

熟悉并掌握生化四大技术—离心、层析、比色、电泳。

熟悉并掌握分离纯化小鼠过氧化氢酶和测定其含量的技术和方法。

实验原理

匀浆原理:分离纯化某一种蛋白质时,首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的

天然状态,不丧失活性,所以要根据所提取蛋白质的性质采用适当的方法将组织和细胞破碎。过氧化氢酶在乙醇、氯仿等有机溶剂中溶解度很小,而脂质在有机溶剂中溶解度较大,通过加入有机溶剂可实现过氧化氢酶与脂质的分离。过氧化氢酶在乙醇、氯仿等有机溶剂中稳定性好,不易变性,而某些杂蛋白在有机溶剂中稳定性差,容易变性。根据上述原理选择0.05mol/L,pH4.0醋酸-乙醇缓冲液以及氯仿作为匀浆缓冲液,通过匀浆法破碎肝组织细胞,匀浆液离心后脂质分配到有机相中,部分杂蛋白则沉淀下来,而过氧化氢酶主要存在于上清液中,分离出上清液即获得过氧化氢酶的粗提液。

盐析原理:蛋白质在高浓度盐溶液中由于水化膜被破坏而溶解度降低。通过向过氧化氢酶粗提液中加入适当浓度的中性盐,使过氧化氢酶呈盐析状态,而部分杂蛋白呈盐溶状态, 离心后过氧化氢酶主要存在于沉淀中,弃去上清收集沉淀,即可实现过氧化氢酶与部分杂蛋白的分离。

透析原理:采用20%乙醇、0.1mol/L pH4.7醋酸缓冲液、0.1mol/L NaCl溶液为透析液,对产物进行透析处理。在该透析条件下,过氧化氢酶溶

解度变小,以沉淀形式析出,但不变性。透析过夜后离心,过氧化氢酶主要存在于沉淀中,但沉淀中也可能含有少量变性的杂蛋白。选择0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液复溶沉淀,则过氧化氢酶溶解,而变性的杂蛋白不能溶解,从而实现过氧化氢酶与部分杂蛋白的分离。

层析原理:凝胶层析法主要根据混合物中分子大小不同的各种物质,随流动相流经作为固定相的凝胶层析柱时,各种物质分子扩散移动速度不同使混合物中各种物质得到分离的技术。采用sephadexG-200葡聚糖凝胶层析柱可以实现过氧化氢酶与其他分子量杂蛋白的分离,通过监测洗脱液在407nm (过氧化氢酶特征性吸收波长)和280nm 波长下的光吸收值变化,合并收集OD407nm 和OD280nm 重叠峰值管,即可获得纯化后的过氧化氢酶。

米氏常数测定原理:底物浓度与反应速率之间的关系可用V=][]

[max S K S V m 表示,图形为矩形双曲线如下

生化实验论文

生化实验论文

将此式取倒数可得

][][1max S V S K V m +=,以V 1和][1S 作图可得一直线

由图可知该直线与横轴的截距为-m K 1

。找出一系

列的点,将点还原为直线,即可求出Km

点的取法:设置不同的底物浓度,加入酶的量相同,反应相同的时间,找出反应后过氧化氢的量,分解的底物可以求得,用它来表示反应速率。剩余的过氧化氢用高锰酸钾滴定。

2KMnO 4+5H 2O 2+3H 2SO 4=2MnSO 4+K 2SO 4+5O 2+8H 2O

蛋白质浓度测定原理:蛋白质中的酪氨酸等与酚试剂之磷钼酸、磷钨酸作用产生蓝色化合物,其颜色深浅与蛋白质含量成正比。Lowry 法测定蛋白质可分为两个步骤:

1、在碱性溶液中,蛋白质与铜离子发生反应Cu2++蛋白质→Cu-蛋白质

2、Cu-蛋白质使试剂中的磷钨酸-磷钼酸还原成为蓝色化合物,测定光吸收值就可以推算出蛋白质的含量。试剂中的碳酸钠有缓冲作用,使溶液的pH始终保持在10左右,显色最深。福林-酚法的灵敏度高、蛋白质浓度测定范围是25~250μg/ml.但此法实际上是蛋白质中酪氨酸和色氨酸等与试剂的反应,因此他受蛋白质氨基酸组成的影响,即不同蛋白质中氨基酸组成的不同会使显色强度有所差别;此外,样品中酚类及柠檬酸的干扰会使结果偏高。低浓度的尿素(约0.5%左右)、胍(约0.5%左右)、硫酸钠(1%)、硝酸钠(1%)、三氯醋酸(0.5%)、乙醇(5%)、丙酮(0.5%)对显色无影响,上述物质浓度高时必须做校正曲线。

SDS-PAGE测定分子量原理:在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠SDS,则蛋白质分子电泳的迁移率主要取决于分子量大小Mr,而与本身所带的电荷量和形状无关。具体公式:lgMW=(A+B)Rf

实验步骤:

(一)、组织匀浆法制备过氧化氢酶粗提液

1.颈椎脱臼处死6只小鼠,取肝脏约6g;

2.加入预冷匀浆缓冲液51ml,用组织捣碎

机匀浆3min,取200μL,匀浆液留样放

入冰箱-20℃保存;

3.冰浴下缓慢加入3ml氯仿,再次匀浆

1min;匀浆液离心(4℃,

7500rpm,30min)弃沉淀,收获上清液

44ml于锥形瓶中;

4.取匀浆上清液120μL,加入40μL 4×电

泳上样Buffer,沸水浴5min,备用于

SDS-PAGE检测(-20℃保存),另取200

μL匀浆后上清液-20℃保存。

(二)、盐析与透析法初步纯化过氧化氢酶

1.冰浴搅拌状态下向肝脏匀浆上清液缓慢

滴加7mlNa2SO4,继续用玻璃棒手动冰浴

搅拌1h;

2.将盐析溶液离心(4℃,7500rpm,10min)

弃上清保留沉淀;

3.用24ml磷酸缓冲液溶解沉淀15min,离

心(4℃,5000rpm,10min)弃沉淀保留

上清液;

4.取盐析后上清液120μL,用40μL 4×电

泳上样Buffer,沸水浴5min,备用于

SDS-PAGE检测,-20℃保存;

5.将透析袋至于沸水浴5min,清洗晾凉后

备用;

6.将上清液放入透析袋中,置于透析液中

两周,中途更换一次透析液;

7.两周后取透析袋中浑浊溶液离心(4℃,

7500rpm,10min)弃上清保留沉淀;

8.用3ml磷酸缓冲液溶解沉淀15min,离心

(4℃,4000rpm,10min)弃沉淀保留上

清液;

9.取上清液120μL,用40μL 4×电泳上样

Buffer制样沸水浴5min,备用于

SDS-PAGE检测,于-20℃保存;

10.将透析袋至于沸水浴5min,清洗晾凉后

备用;

11.将收获的上清液放入处理后的透析袋中

置于75%的甘油中包埋浓缩2h,待样品

浓缩至1.2ml收样,置于-20℃保存。(三)、凝胶层析法进一步纯化过氧化氢酶

1.凝胶的处理(预先处理好);

2.装柱(取一支层析柱,于底部填塞薄棉,

将层析柱垂直夹于铁架台,于柱中加入

缓冲液5cm,使用前将凝胶混匀顺玻璃

棒缓慢注入柱中,待其自然下沉,凝胶

床至少2/3柱高);

3.平衡(磷酸缓冲盐溶液流洗,控制流速

5-10滴/min);

4.浓缩样品;

5.加样(用吸管吸取待分离的浓缩液1.2ml,

在接近凝胶床表面处沿柱壁缓慢加入);

6.洗脱(用磷酸盐缓冲液保持流速);

7.收集及检测(样品下降至底部5cm开始

用试管收集流出液,每管收集2ml,收集

管依次在407nm和280nm波长下测吸

光度值,绘制洗脱曲线);(如图1)

8.收获纯化产物(收集OD407nm和

OD280nm重叠峰值管);

9.取2ml纯化后存样于-20℃保存,备于蛋

白质浓度和Km值测定;

10.取层析样品60μL,用20μL 4×电泳上

样Buffer制样,沸水浴5min,备用于

SDS-PAGE检测,于-20℃保存。(四)、Lowry法测定纯化的过氧化氢酶浓度

1.选择标准蛋白:选择与待测样品(层析后

的纯化样品)相同或组成类似的蛋白质

作为标准蛋白溶液。

2.标准蛋白溶液的配制:将标准蛋白经凯氏

定氮法准确测定其蛋白质含量,再用无

离子水配制成0.1mg/ml的储存液。

3.实验结果表1所示配成不同浓度的标准

蛋白组,编上号码,以第一管为空白管,

在分光光度计上测定650nm处的光密度

值。

4.以各标准溶液浓度为横坐标,各管的光

密度值为纵坐标作图,绘制标准曲线。(如

图2)

5.测定样品蛋白:取试管两支,一支放1ml

稀释的层析后纯化样品和1ml试剂AB

混合液,另一支放1ml生理盐水和1ml

试剂AB混合液,两者均混匀后在50℃

水浴保温10分钟,冷却,再各加入试剂

C 3ml立即混匀,置于50℃水浴中保温

20分钟,冷却后测定650nm波长处的光

密度值。

(五).双倒作图法测定纯化的过氧化氢酶米氏常数

1.稀释匀浆后和层析后样品各1000倍(5

μL-5ml)

2.过氧化氢的浓度再标定:取清洁锥形瓶2

支,各加0.04mol/L的过氧化氢溶液

2.0ml和25%硫酸 2.0ml。分别用

0.002mol/L高锰酸钾滴定至微红,记录

滴定毫升数去平均值,计算过氧化氢的

摩尔浓度。

3.反应测速:取干燥的50ml锥形瓶5只,编

号后操作。终止反应:血液加入后立即

计时10分钟,到时立即加入25%硫酸

2.0ml,边加边摇,终止酶促反应。

4.滴定:用标准0.002mol/L高锰酸钾滴定,

记录各瓶耗高锰酸钾的ml数。

5.计算

(1).反应瓶中过氧化氢浓度计算

[S]=H2O2摩尔浓度*H2O2的ml数/3.0 (2).反应速度计算

V=H2O2的摩尔浓度*加入H2O2毫升数

-0.002*2.5*消耗KMnO4的ml数

=加入的H2O2的毫摩尔数-剩余的H2O2

的毫摩尔数

(3).求Km值(如图3)

(六).SDS-PAGE法测定纯化的过氧化氢酶分子量

1.凝胶的制备:(预先处理好)

2.蛋白质样品的处理:将蛋白质溶解在蛋

白质样品溶解液中,在100℃加热2-5

分钟。蛋白质的最后浓度一般为

0.05-1mg/ml.

3.加样

4.电泳

5.剥胶和固定(垂直柱形电泳)

6.染色和脱色

7.蛋白质的定量(如图4)

实验结果:

小鼠肝脏过氧化氢酶分离纯化

溶液体积(m l)

(m

g/m

酶活Km 分

量IU/

ml

(I

U/m

g)

%

l )

匀浆产物44

2.7

-----------------

---

57,891

层析产物2 0.205 10 20 48.

78

------

0.0795

图2

图3

试验中的几个注意事项

1)使用离心机要注意平衡,平稳,对称,牢

固,缓慢,以防止损伤离心机。

2)手动玻璃匀浆器助溶时,要注意缓慢旋转

推移,时间稍微长一些,使溶解的更充分。

3)使用分光光度计前,要记得调零。

4)装柱时,避免出现断层,干胶。实验必须

保证试管,量筒,吸管等的清洁,以避免

试剂之间的污染,影响实验结果。

5)匀浆制备中快慢交替,防止温度过高对过

氧化氢酶产生影响

6)洗脱速度不可过快,以防样品带扩散

结果误差分析

本次实验结果与理论数值基本符合,但稍有误差。可能因为:

①使用的仪器内有杂质,仪器老化

②滴加的试剂与酶没有充分接触

③酶因为操作时温度稍高部分会失活

④拿出离心管时稍微晃动使沉淀与上清液混合

⑤层析时收集的液滴大小不均造成吸光度测量误差

⑥滴定时计时不准确,滴定终点人为判断不一致

⑦滴定前过氧化氢分解或稍被硫酸污染

⑧周围环境中的杂蛋白影响,可能因为实验时间过长造成酶活性降低

实验讨论

1.盐析时,为什么要在冰浴搅拌的状态下,且要缓慢滴加?

答:常温下,酶的活性有损伤。搅拌和缓慢

滴加,是防止局部盐浓度过高,使杂蛋白析

出。

2.为什么匀浆、透析中用醋酸缓冲液,而盐析、凝胶层析中用的都是磷酸缓冲液?

答:醋酸缓冲液的缓冲范围的pH值在4.7

左右,过氧化氢酶在pH为4.7左右的溶液

中溶解度极小,而磷酸缓冲液的缓冲范围的

pH值在7.8左右,过氧化氢酶在7.8左右的

溶解度很大,醋酸缓冲液是使过氧化氢酶沉

淀,而磷酸缓冲液是使过氧化氢酶溶解,这

两种缓冲液的作用目的不一样。

3.层析时为什么用OD280与OD407双重比色?

答:OD280是普遍蛋白质的紫外吸光峰值,OD407是过氧化氢酶的特异紫外光吸收峰值。两次比色双重保证了能准确选择含有过氧化氢

酶的收集管。

参考文献

《现代医学实验技术(下)》--------------人民卫生出版社段惠军主编

生化实验论文
生物化学实验论文 萌发小麦种子中淀粉酶酶学性质研究 姓名: 班级: 学号: 萌发...
生化论文
生化论文_生物学_自然科学_专业资料。果蔬成分生化分析———萝卜和盘菜的成分分析...
生化实验论文
分类号: Q78 编号: 生物化学大实验实验论文 指导教师: 学专年生: 业: ...
生化实验论文
生化实验论文 小鼠肝脏过氧化氢酶 的制备与测定小组成员:李朋(100111400...
基础生物化学实验论文1
基础生物化学实验论文——黄瓜的品质分析 XXXXX 学院 XXXXX 班 XXX...
生理生化实验论文—连
生理生化实验论文—连_其它_职业教育_教育专区。《植物生理学研究法》 (设计实验...
基础生化实验论文
基础生物化学实验论文 学院: 班级: 姓名: 学号: 常见蔬菜营养成分对比分析及...
生物化学实验课程论文
生物化学实验论文 论文题目:牛奶中活性物质的鉴定与测量 实验地点:生命科学学院 ...
生化实验报告
生化实验报告 ——— 作者: ——— 日期: ??? 实验一 过氧化物酶同工 生化实验报告 ——— 作者: ———...
生物化学实验实验报告
生物化学实验实验报告 基础生物化学实验论文 ——马铃薯的成分分析 课程名称:基础...
生化实验报告
生化实验报告 实验一 过氧化物酶同工酶的分离提取一、实验目的 1、初步掌握蛋白质...
生化实验实验报告
生化实验 实验报告 姓名: 学号: 专业: 班级: 实验班级: 单位: 指导老师: . . 实验 1 多酚氧化酶(PPO)的分离提取 一、实验原理: 多酚氧化酶(PPO)能够......
生化实验报告模版
生物化学实验报告姓 名: 郭玥 学号: 3120100021 专业年级: 201...
生化实验报告 实验
生化实验报告 实验 实验一 考马斯亮蓝 G-250 染色法测定蛋白质的含量(p2...
生物化学实验黄瓜论文
基础生物化学实验论文 题目:黄瓜中蛋白质、维生素 C、还 原糖的测定 1.摘要: ... 2 2.前言: ... 基础生物化学实验论文 题目:黄瓜中蛋白质、维生素 C、还......
生化实验报告 生物化学实验报告 姓名: 吴瑞 学号: 3120016004 专业...
生化实验报告资料
生物化学实验报告 姓 名: 吴瑞 3120016004 2012 级临床医学(妇...
v1.0 可编辑可修改生物化学实验报告姓 名: 吴瑞学 号: 04 专业年级: ...
生化实验报告
实用文档 生物化学实验报告 姓名: 吴瑞 学号: 3120016004 专业年级...
生化实验报告
. 生物化学实验报告姓 名: 吴瑞学 号: 3120016004 专业年级: 2...