细胞克隆形成实验 This manuscript was revised by the office on December 22, 2012
细胞克隆形成实验 当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。每个克隆含有50以上的细胞，大小在0.3-1.0mm之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力。各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。 细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大：一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。 实验方法： 平板集落形成实验、软琼脂集落形成实验 (a)平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞 (b)软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。 平板克隆形成实验基本步骤：
1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。 2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。 3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。 4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。 克隆形成率 =（克隆数/接种细胞数）×100% 平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。 平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。 软琼脂培养克隆形成试验基本步骤：
一２０１９,３５(２)中国人兽共患病学报 C h i n e s e J o u r n a l o f Z o o n o s e s D O I :１０．３９６９/j ．i s s n ．１００２－２６９４．２０１８．００．２３７ 论一著 我国利什曼原虫伽师株有毒力和无毒力前鞭毛体 定量蛋白质组学比较分析 危芙蓉,高春花,汪俊云,杨玥涛,石一锋 国家自然科学基金项目(N o ．８１４７２９２３)通讯作者:汪俊云,E m a i l :w a n g j y ＠n i p d ．c h i n a c d c ．c n ;O R C I D :００００Ｇ０００１Ｇ５３２３Ｇ０７２１作者单位:中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所,卫生部寄生 虫病原与媒介生物学重点实验室,国家级热带病国际联合 研究中心,世界卫生组织疟疾二血吸虫病和丝虫病合作中 心,上海一２０００２５摘一要:目的一应用定量蛋白质组学方法比较我国利什曼原虫伽师株有毒力和无毒力前鞭毛体蛋白表达的差异.方法 将分离于我国新疆伽师县黑热病患者婴儿利什曼原虫J S ５有毒力株前鞭毛体和无毒力株前鞭毛体经酶解后进行液相色谱串 联质谱(L i q u i d c h r o m a t o g r a p h y Ｇt a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y ,L C ＧM S /M S )的非标记(L a b e l Ｇf r e e )定量分析,利用M a x Q u a n t 软件查库,进行L a b e l Ｇf r e e 非标定量(L F Q )分析;每个样品重复３次质谱分析,只有１次有L F Q 值的蛋白舍弃.结果一本研究共 鉴定蛋白３９９４个,有毒力和无毒力株间差异蛋白为２９８个(差异倍数＞１．２或差异倍数＜０．８３,P ＜０．０５) ,其中利什曼原虫有毒力株前鞭毛体特有表达蛋白１５个,无毒力株前鞭毛体特有表达蛋白２３个,二者间表达丰度有显著差异蛋白２６０个, 其中有毒力前鞭毛体表达上调蛋白(高表达)７８个,表达下调蛋白(低表达)１８２个.这些差异表达蛋白中已鉴定功能的蛋白分别涉及糖与脂质代谢二核酸代谢二压力反应二细胞骨架形成二细胞周期与增殖等生物功能.结论一利什曼原虫伽师株有毒力株和无毒力株前鞭毛体蛋白质组的表达存在差异,为筛选和鉴定与利什曼原虫感染相关关键分子奠定了基础. 关键词:利什曼原虫;有毒力株;无毒力株;比较蛋白质组学;差异蛋白;表达 中图分类号:R ３８２．２一一一文献标识码:A 一一一文章编号:１００２－２６９４(２０１９)０２－００９７－０６C o m p a r a t i v e p r o t e o m i c s a n a l y s i s o f t h e v i r u l e n t p r o m a s t i g o t e s a n d a v i r u l e n t p r o m a s t i g o t e s o f a L e i s h m a n i a s t r a i n f r o mJ i a s h i ,X i n j i a n g ,C h i n a W E IF u Ｇr o n g ,G A O C h u n Ｇh u a ,WA N GJ u n Ｇy u n ,Y A N G Y u e Ｇt a o ,S H IF e n g (N a t i o n a l I n s t i t u t e o f P a r a s i t i cD i s e a s e s ,C h i n e s eC e n t e r f o rD i s e a s eC o n t r o l a n dP r e v e n t i o n ;L a b o r a t o r y o f P a r a s i t e a n dV e c t o rB i o l o g y ,M i n i s t r y o f P u b l i cH e a l t h ,N a t i o n a lC e n t e r f o r I n t e r n a t i o n a lR e s e a r c ho nT r o p i c a lD i s e a s e s ,WH OC o l l a b o r a t i n g C e n t r e f o rM a l a r i a ,S c h i s t o s o m i a s i s a n dF i l a r i a s i s ,S h a n g h a i ２０００２５,C h i n a )A b s t r a c t :W e a n a l y z e d t h e p r o t e i n a b u n d a n c e d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e v i r u l e n t p r o m a s t i g o t e s a n d a v i r u l e n t p r o m a s t i g o t e s i n t h e s a m e L e i s h m a n i a s t r a i nb y c o m p a r a t i v e p r o t e o m i c s m e t h o d ．T r y p t i cd i g e s t so f t o t a l p r o t e i n sw e r ea n a l y z e du s i n g l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y Ｇt a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y (L C ＧM S /M S ),f o l l o w e db y L a b e l Ｇf r e e q u a n t i t a t i v e d i f f e r e n t i a l e x p r e s s i o n a n a l y s i s ．T h eM Sd a t aw e r e a n a l y z e dw i t h M a x Q u a n t s o f t w a r e (v e r １．３．０．５)a g a i n s t d a t a b a s e ．T h em a s s s p e c t r o m e t r i c a n a l y s i so f e a c h s a m p l ew a s r e p e a t e d f o r t h r e e t i m e s ．O n l y t h e p r o t e i n s t h a tw e r e p r e s e n t i n a l l t h r e e r e p l i c a t e s (L F Qi n t e n s i t y )f o r a t l e a s t o n e c o n d i t i o nw e r e i n c l u d e d i n t h e d a t a s e t ．T h i s s t u d y r e s u l t e d i n t h e i d e n t i f i c a t i o no f ３９９４p r o t e i n s a c r o s s ２s a m p l e s ．O f t h e s e ,２９８d i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e d p r o t e i n s (r a t i o ＞１．２o r r a t i o＜０．８３,P ＜０．０５)w e r e i d e n t i f i e d i n a t l e a s t t w o o f t h e t h r e e t e c h n i c a l r e p l i c a t e sw i t h t w oo rm o r eL F Qi n t e n s i t y n u m b e r c o n s i d e r e d ．A m o n g t h e s e d i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e d p r o t e i n s ,１５p r o t e i n sw e r e u n i q u e l y i n t h e v i r u l e n t p r o m a s t i g o t e s ,２３p r o t e i n s i n t h e a v i r u l e n t p r o m a s t i g o t e s ．O f ２６０d i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e d p r o t e i n sw e r e t h e s a m e i n t h e t w o g r o u p s ,a m o n g w h i c h １６２p r o t e i n sw e r e d o w n Ｇr e g u l a t e d a n d ７８p r o t e i n sw e r e u p Ｇr e g u l a t e d b a s e d o n p r o t e i n a n n o t a t i o n ．S o m e o f t h e i d e n t i f i e dd i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e d p r o Ｇt e i n sw e r ed e m o n s t r a t e da n dt h e y i n v o l v e d i nb i o l o g i c a l f u n c Ｇt i o n ss u c ha s g l u c o s ea n dl i p i d m e t a b o l i s m ,n u c l e o t i d ea c i d m e t a b o l i s m ,s t r e s s r e s p o n s e ,c y t o s k e l e t o n ,c e l l c y c l e a n d p r o Ｇl i f e r a t i o n ．I t i s e v i d e n t t h a t d i f f e r e n t p r o t e i n e x p r e s s i o n p r o f i l e o ft h ev i r u l e n t p r o m a s t i g o t e sa n da v i r u l e n t p r o m a s t i g o t e si n t h e s a m e L e i s h m a n i a s t r a i n a n d t h i s f i n d i n g m a y l a y t h e f o u n Ｇd a t i o n f o rs c r e e n i n g a n di d e n t i f i c a t i o no f t h ek e y l e i s h m a n i a l ７９
机密提醒：这份文件及其传真件、复印件所包含的机密或法律保护信息是只提供给这份文件上所指定的个人或机构。如果您不是预定接受者，我们提醒您严禁以披露、拷贝、散发或任何形式利用这份文件及其传真件、复印件的内容。如果您错误的接收到这份文件及其传真件、复印件，请立即通知我们以便我们可以安排文件及其传真件、复印件返还并不会让您负担任何费用。 第 1 页 共 1 页 细胞克隆形成实验 一、 当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。每个克隆含有50以上的细胞，大小在0.3-1.0mm 之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力。各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。[晶莱生物] 二、实验方法 平板集落形成实验、软琼脂集落形成实验 (a)平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞 (b)软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。 三、注意事项 (a)琼脂对热和酸不稳定，若反复加热，容易降解而产生毒性，且硬度下降。因此高压灭菌后应进行分装； (b)细胞在进行克隆形成实验时要求有95%以上的分散度，否则结果的准确度会受到很大影响； (c)软琼脂与细胞混合时温度不能超过40℃，否则将会烫伤/死细胞； (d)接种时细胞密度适度，不可过高。 细胞在低密度、非贴壁状态条件下培养，生存率明显下降，永生细胞系/株克隆形成率可达到10%以上，但初代培养细胞和有限传代细胞系克隆形成率仅为0.5%-5%，甚至无法形成单个克隆。因此，为了提高克隆形成率，有时需要在培养基中添加胰岛素、地塞米松等促克隆形成物质。 细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大，一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。并且克隆形成率与接种密度有一定关系，做克隆形成率测定时，接种细胞一定要分散成单细胞悬液，直接接种在碟皿中，持续一周，随时检查，到细胞形成克隆时终止培养。 四、周期 1-2个月
猪瘟病毒蛋白的结构与功能 李 军 杨 威3 陈凤莲 赵 武 (广西兽医研究所 广西南宁 530001) 猪瘟是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一种急性、热性和高度接触性的病毒性传染病。猪瘟因其流行广泛、发病率和死亡率高,给许多国家的养猪业造成巨大的经济损失,在世界动物卫生组织制定的《国际动物卫生法典》中,它被列为A类16种法定传染病之一;在我国制定的《家畜家禽防疫条例实施细则》中也被列为一类传染病。当前猪瘟防治主要还是依赖于疫苗,虽然猪瘟疫苗的使用降低了猪瘟的发病率和死亡率,但是CSFV持续性感染导致的免疫失败,使人们开始把研究重点转向对病毒与宿主相互作用的研究。反向遗传学技术的出现,为我们了解病毒的基因结构、蛋白功能、基因重组提供了技术平台,得以从整个基因组水平来研究错综复杂、相互关联的基因组和蛋白组,这使得CSFV的病原学研究取得了新突破。本文现将国内外近年来对CSFV基因结构、病毒蛋白功能上的研究作一综述。1 病毒的基因组结构 CSFV是一种有囊膜的正链单股RNA病毒,与牛病毒性黏膜腹泻病毒(BVDV)和羊边界病毒(BDV)同属黄病毒科瘟病毒属成员。CSFV基因组大小约12.3kb,5’非编码区由373个核苷酸组成,含有RNA复制所需的顺式作用元件和一个帽不依赖性翻译所需的内部核糖体进入位点;3’非编码区约由229～244个核苷酸组成,参与RNA的复制。CSFV 只编码一个大约3900氨基酸残基的多聚蛋白开放阅读框(ORF),该多聚蛋白在翻译过程中和翻译后,在病毒编码的蛋白酶和宿主细胞酶的作用下,分解成为4个结构蛋白(C、E rns、E1和E2)和8个非结构蛋白(N pro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)。 2 病毒的蛋白 CSFV蛋白在病毒基因组的编码顺序为:N pro、C、E rns、E1、E2、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。N pro、C、E rns、E1、E2、P7和NS2蛋白对于病毒RNA复制是非必需的,NS3、NS4A、NS4B和NS5A形成复制复合体与具有RNA依赖性RNA聚合酶活性的NS5B共同参与病毒RNA的复制。 2.1 N pro蛋白 N pro蛋白由168个氨基酸残基组成,分子量为23K Da,是一种具有蛋白水解酶活性的半胱氨酸蛋白酶。N pro是CS2 FV中最先翻译的非结构蛋白,能在Cys168与Ser169间自我裂解,产生自己的C端,成为成熟的病毒蛋白。G lu22、His49和Cys69是保持N pro蛋白水解酶活性所必需的氨基酸残基。Tratschin等(1998)用鼠的泛素基因替换CSFV的N pro基因,证明了N pro对病毒在传代细胞内的复制是非必需的。Mayer D等〔1〕将猪瘟中等毒力株Alfort/187和强毒株Eystrup的N pro基因分别缺失后感染猪,结果猪产生了高水平的抗体并可以抵抗强毒的攻击。用疫苗株Riems的N pro基因置换强毒株Eystrup的N pro基因,得到重组病毒仍然为强毒株。因此, N pro只是CSFV的一个毒力相关基因,对CSFV各毒株的毒力不起决定作用。 Ruggli N等〔2,3〕对CSFV干扰宿主细胞抗病毒机制进行了研究,发现CSFV感染巨噬细胞后,可以抑制poly(IC)诱导巨噬细胞产生IFN-α/β,缺失了N pro基因的病毒,虽然在生长特性和蛋白表达水平上与野型病毒相似,但是失去了抑制 细胞产生IFN-α/β的能力。 La Rocca S A等〔4〕研究了N pro抑制细胞产生IFN-α/β的机制,发现N pro可以对参与IFN-α/β转录的干扰素调节因子3(IRF-3)起到抑制作用。在辛德毕斯病毒感染的细胞,可以观察到IRF-3从细胞质移位到细胞核,启动IFN-α/β的转录;而CSFV感染的细胞却与未受感染的细胞相似,虽然也有IRF-3穿梭于细胞核与细胞质间,但IRF-3主要定位在细胞质内。随后的研究证实,N pro蛋白是通过蛋白酶体降解途径降解IRF-3〔5〕。这些结果表明N pro有助于CS2 FV逃避机体的天然免疫,建立持续性感染。 2.2 C蛋白 C蛋白由99个氨基酸残基组成,分子量为14K Da,是CSFV的衣壳蛋白,其N端由有蛋白水解酶活性的N pro蛋白在Ser169处切割产生,其C末端是宿主细胞的信号肽酶在Ala265处切割产生〔6〕。C蛋白除了与病毒基因组RNA结合,保护病毒RNA外,还具有转录调节作用。C蛋白通过自身的核定位序列KKKGKV进入细胞核,激活热休克蛋白基因的启动子,启动热休克蛋白的转录。热休克蛋白作为一种伴侣分子,它的大量表达有助于病毒蛋白的折叠和病毒粒子的装配。 2.3 E rns蛋白 2.3.1 E rns蛋白的结构:E rns蛋白是分子量为26K Da的囊膜糖蛋白,由227个氨基酸残基组成(G lu268-Ala494),有9个潜在的N-糖基化位点。多肽链中的9个半胱氨酸残基维持蛋白结构,其中Cys438起着维系E rns二聚体的作用,van G ennip H G等〔7〕将E rns的Cys438突变为Ser后,E rns单体不能形成二聚体,降低了病毒粒子与SK-6细胞表面受体硫酸乙酰肝素的亲和力,影响了病毒的复制效率。 2.3.2 E rns蛋白的RNase活性:Schneider等(1993)报道了 E rns具有RNase活性,RNase活性最适p H为6.0～6.5,最适温度为55℃,酶活性不受Ca2+、Mg2+或EDTA(1mM)的影响。E rns对DNA没有活性,只作用于单链RNA,对富含U序列活性最高。E rns蛋白的His297和His346是酶的催化位点, His297和His346的突变虽然不会影响病毒在细胞中的增殖,但可使E rns丧失RNase活性,导致病毒毒力减弱,而且His297的缺失则可直接导致病毒无感染性。由于E rns具有RNase活性,在体外试验中,它不仅可以完全抑制刀豆素A 诱导的淋巴细胞增殖,还可以导致淋巴细胞凋亡。因此,E rns 的RNase活性不仅影响了病毒的毒力,而且还可能是CSFV 发生持续性感染的原因。 2.3.3 E rns蛋白在CSFV侵入中的作用:Hulst M M等(1997)的研究表明,CSFV感染传代细胞SK-6是通过其两个囊膜糖蛋白E rns和E2分别作用于细胞表面的不同受体来进行的。首先是E rns与细胞表面受体的不可逆结合介导了病毒的吸附;其次是E2与细胞表面特异性受体的可逆结合介导病毒的穿入。CSFV Brescia株在SK-6细胞上连续传代后,位于E rns内的476位氨基酸由不带电荷的丝氨酸突变为带正电荷的精氨酸,病毒通过这种突变可以更好地吸附在细胞表面带负电荷的硫酸乙酰肝素上,提高了病毒的复制效率,其毒力只是轻微减弱或没有改变〔8～11〕。巨噬细胞表面 3为通讯作者。 基金项目:广西自然科学基金(桂科自0728103)。 ? 9 6 ? 《上海畜牧兽医通讯》 2007年第6期
第三章病毒习题 填空题： 1．病毒的存在范围是病毒能够感染并在其中复制的___宿主种类和组织细胞种类___。 2．从原核生物中分离的病毒统称噬菌体，它们包括___噬菌体___、___噬蓝(绿)藻体___和___支原体噬菌体___等。 3．病毒属名的词尾是___virus___、科名的词尾是___viridae___、亚科名的词尾是___virinae___，目名的词尾是___virales___。 4．纯化的病毒制备物应保持其___感染性___和___理化性质的均一性___。 5．血凝抑制试验是根据特异性的病毒抗体与病毒表面蛋白作用可能抑制___病毒的血细胞凝集___性质设计的。 6．螺旋对称病毒体的直径是由___蛋白质亚基的大小___决定的，而其长度则是由___病毒核酸分子的长度___所决定的。 7．病毒蛋白质根据其是否存在于毒粒中分为___结构蛋白___和___非结构蛋白___两类。 8．病毒包膜糖蛋白是由多肽链骨架与寡糖侧链，通过___β-N-糖苷键___将糖链的___N-乙酰葡萄糖胺___与肽链的___天冬酰胺残基___—连接形成。 9．由一步生长曲线可获得病毒繁殖的两个特征性数据，即潜伏期和裂解量。前者为___病毒吸附于细胞到子代病毒释放___所需的最短的时间，后者为___每个受染细胞释放的子代病毒___的平均数目。 10．病毒的复制过程依其发生事件顺序分为以下___吸附___、___侵入___、___脱壳___、___病毒大分子合成___和___装配与释放___5个阶段。 11．动物病毒进入细胞的方式包括___移位___、___内吞___、___病毒包膜与细胞质膜融合___、___依赖抗体的增强作用___等。 12．动物病毒基因组DNA转录产生的初始转录要经过包括___5’末端加帽___、___3’末端聚腺苷化___、___甲基化___和___拼接___等修饰才能成熟为功能性mRNA。 13．病毒的非增殖性感染有___流产感染___、___限制性感染___和___潜伏感染___3种类型。 14．流产感染的发生或是由于病毒感染的细胞是___非允许细胞___或是由于感染的病毒是___缺损病毒___。 15．有生物活性的缺损病毒包括___干扰缺损病毒___、___卫星病毒___、___条件缺损病毒___和___整合的病毒基因组___4类。 16．溶源性转变是指原噬菌体所引起的溶源性细菌除免疫性外的其他表型的改变，包括___细胞表面性质的改变___和___致病性转变___。 17．根据病毒感染机体所引起症状的明显程度，可分为___显性感染___和___隐性感染___o 18．毒力是特定的病毒___致病性的强弱___，它是___病毒株___的特征。 19．亚病毒包括___类病毒___、___卫星病毒___、___卫星RNA ___和___朊病毒___。 20．动物病毒感染抑制宿主细胞DNA复制的原因是___为病毒DNA合成提供前体___、___为病毒DNA合成提供宿主细胞结构和／或复制蛋白___和___细胞蛋白质合成被抑制的次级效应___。 选择题（4个答案选一）： 1．病毒显著区别于其他生物的特征是( (2) )。 (1)具有感染性 (2)独特的繁殖方式 (3)体积微小 (4)细胞内寄生 2．病毒纯化方法均是根据病毒的基本理化性质建立的，包括( (2) )。 (1)病毒的核酸是DNA或是RNA (2)病毒的主要化学组成是蛋白质 (3)病毒含有脂类和糖类 (4)病毒体积微小 3．病毒物理颗粒计数方法测定的是( (3) )。 (1)有活力的病毒数量 (2)无活力的病毒数量 (3)有活力的病毒与无活力病毒数量的总和 (4)致病性的病毒数量 4．描述螺旋对称壳体特征的参数有( (2) )。 (1)核酸的相对分子质量 (2)螺旋长度与直径 (3)螺旋的外观 (4)蛋白质亚基大小 5．ssRNA能够按照它的极性或意义分为( (2) )。 (1)感染性核酸和非感性核酸 (2)正链RNA、负链RNA和双意RNA (3)反意RNA和正意RNA (4)基因组RNA 和非基因组RNA 6．以下病毒中在细胞核内复制的有( (1) )。 (1)腺病毒 (2)痘病毒 (3)小RNA病毒 (4)嗜肝DNA病毒 7．T4噬菌体的的装配包括的亚装配过程有( (3) )。 (1)2个 (2)3个 (3)4个 (4)5个 8．构成机体病毒感染的因素包括( (2) )。
细胞克隆形成实验 当单个细胞在体外增殖6 代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。每个克隆含有50 以上的细胞，大小在0.3-1.0mm 之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力。各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。 细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大： 一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。 实验方法： 平板集落形成实验、软琼脂集落形成实验 (a) 平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞 (b) 软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。 平板克隆形成实验基本步骤： 1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DME培养液中备用。 2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL37°C预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37C 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2?3周。 3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用 PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10?30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。 4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。 克隆形成率=(克隆数/接种细胞数)X100% 平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。
第三章病毒和亚病毒 一、名词解释 噬菌斑：由于噬菌体的作用而使布满细菌细胞的菌苔上，出现肉眼可见的一个个透亮的小圆斑。 噬菌体：原核生物的病毒。 病毒：是微生物中最小的生命实体，组成简单，由核酸（DNA或RNA）和一种或少数多种蛋白质组成的非细胞生物。 是一类比较原始的、有生命特征的、能够自我复制和严格细胞内寄生的非 细胞生物。 溶源细胞：在没有任何外来噬菌体感染的情况下，极少数溶源细胞中的原噬菌体偶尔也可恢复活动。 温和噬菌体：能导致溶源性发生的噬菌体。 烈性噬菌体：噬菌体在短时间内能连续完成吸附→侵入→增殖（复制与生物合成）→成熟（装配）→裂解（释放）五个阶段而实现其繁殖的噬菌 体，称为烈性噬菌体。 原噬菌体：某些温和噬菌体侵染细菌后，其核酸整合到宿主细菌染色体中。 处于整合状态的噬菌体DNA称为原噬菌体。 类病毒：是一类只含RNA一种成分、专性寄生在活体的分子病原体。 一步生长曲线：定量描述烈性噬菌体生长规律的实验曲线。 逆转录病毒：能编码逆转录酶的RNA病毒。病毒RNA基因组可逆转录为病毒DNA，并整合在宿主染色体中一同复制。 裂解量：平均每个宿主细胞裂解后产生的子代噬菌体数。 双层平板法：先在培养皿中倒入底层固体培养基，凝固后再倒入含有宿主细菌和一定稀释度噬菌体的半固体培养基。培养一段时间后，计 算噬菌斑的数量。 效价：每毫升试样中所含有的具侵染性的噬菌体粒子数。 壳体：包在髓核外面的一层蛋白质膜。
阮病毒：不含核酸的传染性蛋白分子，能引起宿主体内的同类蛋白分子发生与其形似的构象变化，而使寄主致病。 壳粒：组成壳体的形态结构单位。 核壳：病毒核酸加上包围的蛋白质衣壳。 包膜：大多数动物病毒，核衣壳外由蛋白或糖蛋白与脂肪所形成类脂（来自寄主）双层外膜，称为包膜。 刺突：糖蛋白在膜上形成各种形状的突起，称刺突。 潜伏期：指噬菌体的核酸侵入宿主细胞后至第一个成熟噬菌体粒子释放前的一段时间。 卫星病毒：是一类存在于某专一病毒粒（辅助病毒）的衣壳内，并完全依赖后者才能复制自己的小分子RNA病毒。 溶源性：当温和噬菌体侵入宿主细胞后，DNA整合到宿主基因组上，随着宿主DNA 复制而复制，但不合成蛋白质，宿主细胞不裂解，继续进行正常 的分裂现象。 自发裂解：在没有任何外来噬菌体感染的情况下，极少数溶源细胞中的原噬菌体偶尔也可恢复活动，进行大量的复制成为营养噬菌体核酸，并接着成 熟为噬菌体粒子，引起宿主细胞裂解。 溶源转变：当温和噬菌体感染其宿主而使之发生溶源化时，因噬菌体的基因整合到宿主的基因组上，而使后者获得了除免疫性以外的新性状 的现象，称为溶源转变。 包涵体：表达外源基因的宿主细胞。 二、填空题 1.病毒分为真病毒（简称病毒）和亚病毒分子，后者又分为类病毒、拟 病毒、卫星病毒、卫星RNA 和朊病毒。 2.病毒直径很小，通常用nm 作为度量单位，最大的病毒为似菌病毒和一 种海洋原生病毒，最小的病毒为猪圆环病毒（PCV）和长尾鹦鹉喙羽病 毒（PBFDV），病毒、细菌和真菌个体直径比约1：10：100 。
猪瘟病毒 猪瘟（swine fever）是猪的一种急性、接触性传染病，是猪的最主要的传染病之一，该病1883年首先发现于美国，死亡率可以达到80%～90%，往往给养猪业造成严重的经济损失。 1、形态 猪瘟病毒粒子直径为34～50nm，有20面体对称的核衣壳，内部核心直径约30nm，病毒粒子略呈圆形，具有脂蛋白囊膜，病毒粒子表面有脆弱的纤突结构。猪瘟病毒可以通过各种除菌滤器。 2、理化特性 猪瘟病毒不耐热，56℃下60分钟即可被灭活，60℃10分钟就会丧失感染力。猪瘟病毒在pH5～10之间比较稳定，低于pH3时病毒滴度下降较快。 猪瘟病毒对乙醚、氯仿和去氧胆酸盐敏感，迅速丧失感染性，对胰酶有中度敏感性。二甲基亚砜（DMSO）对病毒中的脂质和脂蛋白有稳定作用，10%的二甲基亚砜（DMSO）溶液中的病毒对反复冻融一定的耐受性。 3、抗原性 大多数资料认为猪瘟病毒只有一个血清型，国外发现了一些猪瘟的血清学变变种，不易被猪瘟特异性抗体所中和，但至今未确定其稳定的抗原型。 目前分离到了许多慢性猪瘟变异株和低毒力毒株，这些毒株通常免疫原性很差，不能产生明显的血清中和抗体，在用强毒攻击时，往
往呈现厌食和高热等症状，但很少死亡。弱毒疫苗株可以完全保护猪不受这些变异株的感染。 猪瘟病毒和牛粘膜-腹泻病毒（BVDV）具有公共的可溶性抗原，实验证明二者有交叉血清学反应，猪感染BVDV后可以表现为在一定程度上抵抗猪瘟强毒的攻击，有学者认为BVDV是猪瘟病毒的一个特殊的血清学变种，对猪已经减毒，但充分适应于牛和绵羊。 4、培养特性 猪瘟病毒能够在猪肾细胞、猪睾丸细胞、犊牛睾丸细胞和其他许多哺乳动物细胞内增殖。病毒成分在胞浆内合成和装配后释放到细胞外，细胞培养物中病毒的传播呈三种方式：一是被感染细胞释放病毒通过培养液感染新的易感细胞，二是被感染细胞通过有丝分裂将病毒传染给子代细胞，三是通过细胞间桥在细胞之间传播病毒。 许多研究者试用不同种类的细胞，主要是猪源细胞在体外增殖病毒，证明骨髓、睾丸、肺、脾、肾细胞及白细胞均能增殖病毒，经过鸡胚传代的猪瘟病毒可以在鸡胚成纤维细胞内生长。猪瘟兔化弱毒株可以在犊牛睾丸细胞和羔羊肾细胞内增殖。感染性最强的是PK-15、PK-2a、ST等几株猪肾和猪睾丸传代细胞系。新合成的病毒大多吸附或结合于细胞之上，仅有约1%的病毒存在于培养液之中。 我国中监所专家周泰冲等人通过将石门系猪瘟强毒在兔体内连续传几百代后培育成功了猪瘟兔化弱毒株，国际上称为中国C株，用于疫苗生产，取得了良好的效果，欧洲一些国家利用该弱毒疫苗株扑灭了本国的猪瘟。
细胞克隆形成实验 当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。每个克隆含有50以上的细胞，大小在0.3-1.0mm之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力。各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。 细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大： 一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。 实验方法： 平板集落形成实验、软琼脂集落形成实验 (a)平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞 (b)软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。 平板克隆形成实验基本步骤： 1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。 2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。 3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。 4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。 克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100% 平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料
猪瘟病毒 猪瘟（swine fevｅr）是猪的一种急性、接触性传染病，是猪的最主要的传染病之一，该病１88３年首先发现于美国，死亡率可以达到80%~90%,往往给养猪业造成严重的经济损失。 1、形态 猪瘟病毒粒子直径为３4~50ｎm,有20面体对称的核衣壳,内部核心直径约30nm，病毒粒子略呈圆形，具有脂蛋白囊膜,病毒粒子表面有脆弱的纤突结构。猪瘟病毒可以通过各种除菌滤器。 2、理化特性 猪瘟病毒不耐热，５6℃下60分钟即可被灭活,6０℃１０分钟就会丧失感染力。猪瘟病毒在ｐH5~１0之间比较稳定,低于pH3时病毒滴度下降较快。 猪瘟病毒对乙醚、氯仿和去氧胆酸盐敏感,迅速丧失感染性,对胰酶有中度敏感性。二甲基亚砜(DMSＯ)对病毒中的脂质和脂蛋白有稳定作用，１0%的二甲基亚砜（DMSＯ）溶液中的病毒对反复冻融一定的耐受性。 ３、抗原性 大多数资料认为猪瘟病毒只有一个血清型,国外发现了一些猪瘟的血清学变变种,不易被猪瘟特异性抗体所中和,但至今未确定其稳定的抗原型。 目前分离到了许多慢性猪瘟变异株和低毒力毒株,这些毒株通常免疫原性很差,不能产生明显的血清中和抗体,在用强毒攻击时，往往
呈现厌食和高热等症状，但很少死亡。弱毒疫苗株可以完全保护猪不受这些变异株的感染。 猪瘟病毒和牛粘膜-腹泻病毒（ＢＶＤＶ）具有公共的可溶性抗原,实验证明二者有交叉血清学反应，猪感染BVＤV后可以表现为在一定程度上抵抗猪瘟强毒的攻击,有学者认为ＢVＤV是猪瘟病毒的一个特殊的血清学变种,对猪已经减毒,但充分适应于牛和绵羊。 4、培养特性 猪瘟病毒能够在猪肾细胞、猪睾丸细胞、犊牛睾丸细胞和其他许多哺乳动物细胞内增殖。病毒成分在胞浆内合成和装配后释放到细胞外，细胞培养物中病毒的传播呈三种方式：一是被感染细胞释放病毒通过培养液感染新的易感细胞,二是被感染细胞通过有丝分裂将病毒传染给子代细胞,三是通过细胞间桥在细胞之间传播病毒。 许多研究者试用不同种类的细胞,主要是猪源细胞在体外增殖病毒,证明骨髓、睾丸、肺、脾、肾细胞及白细胞均能增殖病毒,经过鸡胚传代的猪瘟病毒可以在鸡胚成纤维细胞内生长。猪瘟兔化弱毒株可以在犊牛睾丸细胞和羔羊肾细胞内增殖。感染性最强的是ＰＫ-15、PK－２a、SＴ等几株猪肾和猪睾丸传代细胞系。新合成的病毒大多吸附或结合于细胞之上,仅有约１％的病毒存在于培养液之中。 我国中监所专家周泰冲等人通过将石门系猪瘟强毒在兔体内连续传几百代后培育成功了猪瘟兔化弱毒株，国际上称为中国Ｃ株，用于疫苗生产，取得了良好的效果，欧洲一些国家利用该弱毒疫苗株扑灭了本国的猪瘟。
、概念、概念 1、细胞系（Cell Line）：原代培养舞经首次传代成功即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系（Lineage of Cells）所组成。 2、细胞株（Cell Strain）：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物称为细胞株。细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。如果不能继续传代或传代数有限，称为有限细胞株（finitecell strain）；如果可以连续传代，称为连续细胞株（continuous cell strain）。对于人类肿瘤细胞，在体外培养半年以上，生长稳定，并连续传代的即可称为连续性株或系。 二、建立细胞系（或株）的要求 什么样的体外培养群可被认可为己鉴定的细胞，视具体情况而定，无统一规定。对于用作原代培养的细胞只要供体均一，取材部位及组织种类等条件稳定即可，如用做长期培养，特别是反复传代的细胞，常需做如下说明： 1、组织来源：细胞供体所属物种，来自人体或者动物； 个体性别、年龄；取材的器官或组织。 如系肿瘤组织，应说明临床和病理诊断，以及病历号等。 2、细胞生物学检测： 了解细胞一般和特殊的生物学性状，如细胞一般形态，特异结构，细胞生长曲线和分裂指数，倍增时间，接种率等。 如为肿瘤细胞，为说明来源于原肿瘤组织并保持恶性，须做软琼脂培养，异体接种致瘤和对正常组织侵润力等实验。 3、培养条件和方法；应说明细胞系（或株）适应的生存环境，即指明使用的培养基、血清种类、用量以及适宜PH值。 三、若干细胞建株的要点及基本过程 （一）肿瘤细胞培养技术要点 1、取材：材料主要来源于外科手术或活检瘤组织，取材时避免用坏死组织，要挑选瘤细胞集中和活力较好的部位，瘤性转移淋巴结或胸腹水是较好的培养材料。取材后尽快培养，因故不能立即培养者，可冻存。其培养方法及冻存方法同前述正常组织。 2、成纤维细胞排除：在肿瘤组织中常混杂有一些成纤维细胞，培养时能与瘤细胞同时生长，并常压过癌细胞，导致癌细胞生长受阻以至消失，应仔细排除。 排除方法常有：机械刮除法、反复贴壁法、消化排除法、胶原酶消化法等。 3、提高肿瘤细胞培养存活率和生长率 根据实验经验，肿瘤细胞在体外不易培养，建立能传代的肿瘤细胞系更为困难。一般当肿瘤组成或细胞被原代培养后，要经过对新环境的适应才能生长，因此不能局限于一般培养法，须采用一些特殊措施。如：用适宜底物，鼠尾胶原底层及饲细胞底层等。用细胞生长因子，根据细胞种类不同选用不同的促细胞生长因子，如胰岛素、氢化可的松，雌激素等。也可以考虑动物媒介培养。 （二）人类淋巴母细胞建株方法 l、4ml肝素抗凝血于离心管中，加入2ml RPMI 1640。 2、混匀后沿管壁缓慢加到预置有4ml淋巴细胞分离液的液面上静置30min。 3、1500rpm，15min，吸取白细胞层（第二层）于另一离心管中。 4、加RPMI 1640 5ml洗涤白细胞两次。 5、将白细胞接种至1ml RPMI 1640培养基中，加入10μl环胞霉素和100μl的EBV（EB病毒）液，混匀。 6、水浴摇床，40次/分，37℃，3hr。 7、1500rpm，15min。将细胞接种至1ml培养基中（内含谷氨酰胺1mM／ml）加入10μl环胞霉素，轻轻混匀，37℃培养。 8、5天后观察细胞转化和生长情况，决定是否半量换液。一般半量换液l—2次，并维持环胞霉素的浓度。