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微生物固定化技术与载体结构的研究

何延青1,刘俊良1,杨平2,高永1

(11河北建筑工程学院城市建设系,张家口　075024;21陕西第十二棉纺织厂,宝鸡市　721005)

摘要:分析微生物固定化的一般方法、常用固定化载体的特性;并通过实验研究固定化微生物颗粒处理微污染水的净水效能,分析载体结构对微生物固定化微生物活性的影响.关键词:微生物;固定化技术;载体;结构

中图分类号:X172　文献标识码:A 文章编号:025023301(2004)增刊20101204

基金项目:2002年河北省普通高等学校博士科研资助基金计划

(B2002205)

Immobilization T echnology and Construction of C arrier

HE Yan 2qing 1,L IU J un 2liang 1,YAN G Ping 2,G AO Y ong 1

(11Department of Urban Construction Hebei Institute of Architecture and Civil Engineering ,Zhangjiakou 075024,China ;21Shaanxi 12th Cotton Textile Plant ,Baoji 721005)

Abstract :Analysis the general method of microorganism immobilization and the character of the common used carrier ;And study the removal efficiency using the immobilized microorganism grain to treat micro 2polluted ,analysis the influence of the carrier constrction on the microorganism immobilization and the activity of the immobilized microorganism.K ey w ords :microorganism ;immobilization technology ;carrier ;construction

随着酶工程(Enzymatic Engineering )的兴起和在环境污染生物治理中的应用,世界上有许多国家都在积极研究酶固定化的各种方法.而在研究固定化酶的同时,由于从生物体内提取酶操作复杂,费有较高,固定化微生物细胞逐步被人们研究和应用.特别是将筛选出来具有某些特殊功能的高效菌种固定化后,微生物细胞不易流失,并可以根据具体的处理要求,控制反应器内的生物量和传质面,因而处理效能大大增强.为此针对微污染水源水的特点,利用生物工程技术从自来水中筛选、驯化出能够去除水中微污染有机物的工程菌[1,2],然后将其固定化,用固定化生物颗粒处理水中微污染有机物[3～5],并据水中高锰酸盐指数去除率的变化情况研究载体结构对微生物固定化及其与处理效能关系的影响.1　固定化技术111　固定化方法

目前经常采用的生物固定化方法主要有:吸附法、包埋法、交联法和共价结合法,各种固定化方法和载体都各有特点[6],见表1.

微生物细胞的固定化方法以包埋法和吸附法最为常用.包埋法是将微生物封闭在天然高分子多糖类或合成高分子凝胶的网络中,从而使微生物固定化.其特点是可以将固定化微生物制成各种形状(球状、块状、圆柱状、膜状、布状、管状等),但包埋法制

得的固定化微生物对传质有一定的影响.吸附法是

将微生物细胞附着于固体载体上,微生物细胞与载体之间不起化学反应,并且具有操作简单、固定化条件温和、细胞活性损失小、载体可以反复使用等优点,所以被广泛应用和深入研究.本实验用物理吸附的方法将培养驯化的工程菌固定化.

表1　各种固定化方法的比较

Table 1　Comparison of immobilization methods

性能

交联法吸附法共价结合法包埋法

制备的难易适中易难适中结合力强弱强适中活性保留低高低适中固定化成本适中低高低存活力无有无有适用性小适中小大稳定性高低高高载体的再生不能能不能不能空间位阻较大小较大大

吸附法固定化微生物细胞时,p H 值、细胞壁的

组分、载体的性质等均影响细胞与载体之间的相互作用.用吸附法固定微生物细胞是一个十分复杂的过程.只有当细胞的性质、载体的特征及细胞与载体间的相互作用等参数配合恰当时才能形成稳定的微生物细胞2载体复合物,应用于实际系统.112　载体

第25卷增刊2004年6月

环境科学ENV IRONM EN TAL SCIENCE

Vol.25,Sup.J une ,2004

作为微生物载体应有利于微生物的固定化和生

长繁殖,保持较多的生物量;有利于微生物代谢过程中所需氧气和营养物质以及代谢产生的废物的传质过程.颗粒状活性炭及许多天然或烧结材料如陶粒、沸石、炉渣、麦饭石、焦炭等因其比表面积大、空隙率高等特点是常用的载体[6].表2是几种颗粒载体的物理化学特性(粒径1175～2125mm ).

不同颗粒的物理化学特性是有区别的,有的甚

表2　几种颗粒的物理化学特性的比较

Table 2　Comparison of physico 2chemical characteristics of grains

名称物理性质

主要化学元素组成/%

比表面积/m 2?g -1

总孔体积/cm 3?g -1松散容重/g ?L -1

产地Na

其它

活性炭

960019345太原

页岩陶粒319901103976北京115

21156315615710砂子0176010171393北京21830124161845016922914沸石014601027830山西4125111418127401281011415158炉渣019101049975太原0179111331145315841138197麦饭石0188010081375

蓟县5123

0146

20132501380184

22186焦炭

1127

01063

587

北京

25175

40123

34102

至相差较大.例如活性炭的比表面积最高,达960m 2/g ,远远高于其它材料;总孔体积也以活性炭为最高,达019cm 3/g ,其它几种颗粒的总孔体积则相对较小;颗粒的松散容重以砂子最大,为1393g/L.各种颗粒化学组成均以Al 和Si 为主要成分,两者之和达60%～80%,这些颗粒的碱性成分所构成的微环境有利于微生物的生长,因为微生物

在代谢过程中往往有有机酸的生成.

综合各种因素,即考虑颗粒的比表面积,又考虑其总孔容积,同时还要考虑微孔、过渡孔和大孔各自所占比率等等.本着价格低廉和就地取材的原则,选择页岩陶粒和活性炭作为微生物固定化的载体.本实验选用的活性炭和陶粒的特性见表3和表4.

表3　活性炭的特性及技术指标

Table 3　Characters of activeted carbon and technical index

粒度<

/mm 水分

强度

/%酸碱

度p H 比表面积

/m 2?g -1

总孔容积

/cm 2?g -1

微孔面积

表观密度

/g ?cm -2

碘吸附值

/mg ?g -1

苯酚吸附

/mg ?g -1

四氯化碳

吸附率/%

410

≤5≥

≥7

950±50

0185

0142

0145～0165

700～900

140

32～42

表4　页岩陶粒的理化特性

Table 4　Physico 2chemical characters of ceramsite

物理性质

化学成分/%

粒度

/mm 比表面积/m 2?g -1堆积容重/g ?L -1

总孔容积

/cm 2?g -1

孔隙率

/%SiO 2Al 2O 3FeO CaO MgO 烧失量

2～5

311～412

890

0110

7516

61～66

19～24

410～910

015～110

110～210

510

2　工程菌的固定化

实验工艺流程如图1所示.

原水配水箱(高倍稀释)生物柱砂滤柱出水

为了比较陶粒和活性炭作为载体形成固定化微生物颗粒处理微污染水的净水效能,如图1用相同的4根有机玻璃柱(直径150mm ,高116m ,填料高100cm )并列为2组,每组分别是一个处理单元,由微生物载体柱和砂滤柱构成,2组并联运行.

工程菌的固定化用循环式接种法.在柱4和柱

图1　实验工艺流程

Fig.1　Technical process Technical process

201环境科学25卷

6两个载体柱中分别装入适当的陶粒和活性炭,经

一定时间的浸泡和反复冲洗,为微生物的生长繁殖及稳定吸附创造良好的环境条件.然后采用循环式接种方式,即以已培养驯化好的高浓度的工程菌菌液浸泡液体4h 后放出,间隔4h 后再次接种,如此循环反复,经过5次循环反复之后,接入与流出载体的菌液浓度已相差不多,载体对工程菌的吸收量已接近饱和.

3　固定化微生物颗粒的运行效果311　实验方法和测定项目

如图1所示,将固定化微生物活性炭柱4和固定化微生物陶粒柱6反冲洗,冲掉颗粒表面附着的微生物细胞.在柱5和柱7装入沙子.为了模拟微污染水源水条件,用一定量的生活污水经高温消毒、高倍稀释后的配水进行实验.配水的高锰酸盐指数在2～5mg/L ,有个别超过5mg/L 的情况.原水经泵同时分别流经生活活性炭柱、砂滤柱和生物陶粒柱、砂滤柱,测定进出水的高锰酸盐指数,分析比较其运行效果.

实验运行条件:温度为室温;p H 为中性;生物处理柱HR T 为20min ;滤速为10m/h.

测定项目:主要通过高锰酸盐指数[7]来测定水中有机物的去除率,比较不同处理方法的运行效果.312　运行效果及分析固定化微生物颗粒处理微污染水试验连续运行2年多,根据不同状态分阶段不连续监测,从2000年11月份到2000年12月份对固定化生物活性炭与陶粒进行了试验,高锰酸盐指数及其去除率的变化规律见图2和图

图2　高锰酸盐指数变化规律

Fig.2　Change of COD Mn

从图2看出,固定化生物活性炭柱出水的高锰酸指数始终低于固定化生物陶粒性.固定化活性炭的净水效能要比陶粒好.见表3和表4,尽管陶粒的

粒径小于活性炭,但活性炭的比表面积950m 2/g ,远远高于页岩陶粒的比表面积311～412m 2/g ;活性炭

的总孔体积达0185m 3/g ,而陶粒仅为0110m 3/g.另外活性炭的吸附量还与细孔的构造和分布有关.活

性炭的细孔分为大孔(孔径10-1～10

μm ),过渡孔(10-2～10-1μm )和微孔(10-3～10-2μm ).对液相吸附来讲,大孔的作用是为吸附质提供通道,使之扩散到过渡孔和微孔中去;过渡孔既是吸附质进入微孔的通道,又是大分子污染物的主要吸附位置;微孔通过过渡孔吸附小分子物质

,吸附量主要靠微孔来

图3　高锰酸盐指数去除率变化规律

Fig.3　Change of COD Mn removal

实现的.对微生物的固定化来讲,固定化细菌主要集

中于颗粒活性炭的大孔中,而不能进入微孔中,这些存在于大孔中的细菌可将活性炭表面和大孔中吸附的有机物降解掉,使活性炭表面的有机物浓度相对降低,造成炭粒内存在一个由内向外减少的浓度梯度,促使水中有机物向活性炭表面扩散.而且,虽然细菌不能进入过渡孔和微孔,但它分泌的酶和辅酶却能渗入,与孔隙内吸附的有机物作用,使其从吸附位上解脱下来被细菌利用,这就构成了活性炭吸附和微生物降解的协同作用.所以,生物活性炭对有机物的去除容量是由吸附和生化二者叠加而成的,比活性炭单纯吸附的容量要大得多,相应地也大大延长了活性炭的使用寿命.

而陶粒没有活性炭这样复杂的孔隙结构.陶粒表面粗糙,不规则,表面主要是一些开孔大于015

μm 以上的较大的孔构成,相互之间不连通.而细菌的直径为015～110

μm ,所以,陶粒表面有利于微生物附着生长,微生物生长繁殖逐渐层状聚积形成生物膜,靠生物膜中微生物对有机物进行降解,降低原水中的高锰酸盐指数.生物膜的形成和聚积却影响了陶粒的物理吸附能力.

从图3高锰酸盐指数去除率的变化规律更明显

01增刊环境科学

地看出二者运行过程中的不同,两柱在运行初期高锰酸盐指数的去除率比较高,但变化也比较大,说明初期的运行不稳定.因为开始运行时配水比例把握不准,原水浓度较高且不稳定,同时固定化之后的工程菌也需要一个在新环境下的适应期.但固定化工程菌用的是新活性炭和新陶粒,所以运行初期它们的物理吸附能力较强,高锰酸盐指数的去除率较高.随后随着原水高锰酸盐指数的平稳,固定化生物活性炭柱的高锰酸盐指数的去除率趋于平稳,且较高,平均为42%.而固定化生物陶粒柱的高锰酸盐指数的去除率则有一个变化过程:11月30号到12月3号陶粒柱的高锰酸盐指数去除率较低,12月3号反冲洗之后高锰酸盐指数去除率有所提高.运行20d 之后高锰酸盐指数去除率又有明显下降.这次实验没有进行反冲洗,

除率又逐渐回升,只不过提高的速度和幅度都较为缓慢.这是由于随着生物膜的生成、增长,陶粒表面被覆盖,使得陶粒的物理吸附作用下降,同时由于生物膜的聚积老化,高锰酸盐指数去除率降低.反冲洗之后由于陶粒的物理吸附作用和新的生物膜的形成使得高锰酸盐指数去除率提高.在不进行反冲洗情况下,由于陶粒表面的生物膜有一个自然的附着、生长、成熟、老化、脱落、新的生物膜的再生成的过程,即运行过程中生物膜的自然更新.所以在运行中,陶粒柱高锰酸盐指数的去除率会有一个逐渐降低又缓慢回升的过程.由实验得到陶粒表面生物膜生长、成熟、老化的一个周期大约14～19d.另外,陶粒的化学成分中所含的Al3+和Mg2+等金属离子也可能会影响陶粒中吸附的微生物的生物活性,从而影响水中有机物的降解.生物陶粒对微污染水中高锰酸盐指数的去除率平均为1818%.4　结论

(1)固定化生物活性炭可稳定、高效地去除水中的微量有机物,对微污染水中高锰酸盐指数的去除率平均42%,明显优于生物陶粒,固定化生物陶粒对微污染水中高锰酸盐指数的去除率平均为1818%.

(2)固定化微生物颗粒的吸附性能不仅取决于比表面积、总孔体积、孔隙率等参数,孔隙的构造和分布、表面化学特性等对颗粒的吸附特性产生重要影响,甚至起决定性作用.

(3)活性炭是微生物的优良载体,活性炭上的生物活性高,生物活性炭对水中有机物的去除是吸附作用和微生物的降解作用的协同作用的结果.陶粒的化学成分中所含的Al3+和Mg2+等金属离子可能会影响陶粒中吸附的微生物的生物活性,从而影响水中有机物的降解.

参考文献:

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401环境科学25卷

微生物固定化载体5.10

微生物固定化载体固定化微生物技术是将特选的微生物固定在选证的载体上，限制或定位于一定的空间区域．使其高度密集并保持生物活性，在适宜条件下能够快速、大量增殖的现代生物技术。固定化微生物具有生物浓度易控制、耐毒害能力强、菌种流失少、产物易分离、运行设备小型化等特点。近年来固定化微生物技术的研究非常活跃，发展很快，已遍及环境保护、食品工业、化学分析、能源开发、医学和制药等多种领域，并得到了广泛的应用。同时，对载体材料的性能也提出了更高的要求。载体材料的性能对固定化微生物功能的发挥起着至关重要的作用，有关固定化载体材料的研究也就显得非常重要 1.微生物固定化对载体材料的要求载体材料的主要作用是为微生物提供栖息和繁殖的稳定环境。根据所固定的微生物种类以及固定化方法与工艺的不同，需要制备不同的周定化载体材料。制备合适的载体材料是固定化细胞技术的关键，在选择和制备载体材料时，必须考虑所固定微生物的生理习性及其应用的环境条件。一般情况下。理想载体应该具有以下特征：(1)载体对细胞呈惰性，对微生物无毒害；(2)具有高的载体活性，固定化细胞密度大；(3)力学强度和化学稳定性好，耐微生物分解；(4)操作简便，易于成型；(5)底物和产物的扩散阻力小，具有良好的传质性能；(6)微生物的活性回收率要高，能较长时间使用和重复使用；(7)原料易得，成本低。 2.固定化载体材料的种类 2.1天然载体材料天然无机类载体材料主要有沙粒、沸石、硅藻土等。天然有机载体材料的究和应用较多，它们主要是天然多糖类材料，如纤维素及其衍生物、琼脂、角叉莱胶、海藻酸盐、卡拉胶。 2.2合成高分子载体该类材料应用较多的主要是聚乙烯醇、聚乙二醇、聚氨酯、羧甲基纤维素等。 2.3人工无机载体材料

固定化微生物

1 引言随着石油工业的迅速发展油气田开发对土壤的污染越来越严重。石油污染土壤已经是石油及石化企业的重要污染之一，其中的石油污染物对人体及环境具有很高的毒害作用。土壤污染不仅会破坏其自身结构、改变其物理化学性质，而且会影响作物的产量和品质，并通过食物链危害人类的健康和生命。因此，修复污染土壤，保障人类健康，已引起各国政府及环境学家的广泛关注，成为当前国内外环保研究的热点。 2 石油污染土壤的现状及危害随着国民经济的迅速发展，人们对石油的需求不断增加，石油的勘探开发、运输及炼制过程中，石油污染问题日益凸显，特别是土壤污染日趋严重。据报道，目前世界石油总产量每年约有22亿t，其中约有800万t石油进入环境已造成污染，我国石油年产量已超过1亿t，每年新污染土壤10万t，其中每年有近60万t石油进入环境，污染了土壤、地下水、河流和海洋[fll。石油污染土壤主要由于石油的泄漏和排放引起的，一般集中在油田、油库、炼油厂周围，对土壤的污染大多集中在20cm左右的土壤表层[f2l。我国许多油区污染严重，例如陇东油区年产原油约200万吨是中国第二大油田的中心区，石油污染面积正在逐年扩大，目前石油污染面积SOO}l000hm2，在重污染区，土壤原油含量高达3510mg/kg，高出临界值(200mg/kg) 17.6倍。因此，修复石油污染土壤，加快土壤的修复和治理显得尤为重要。石油是一种成分极其复杂的混合物，主要是由各种不同的碳氢化合物组成，还含有少量的氧、氮、硫、氯、硅和磷等非金属元素以及少量的重金属元素成分。石油通常指原油和石油初加工产品(包括汽油、煤油、柴油、重油、润滑油等)及各类油的分解产物，主要包括烷烃、环烷烃和芳香烃、烯烃等，其中多环芳香烃类物质被认为具有严重的致癌、致突变、致畸作用，其形态包括气体、挥发性液体、高沸点液体以及固体等[[3,4] o 石油进入土壤后，影响土壤环境质量，严重威胁着生态环境、食品安全和人身健康: 1）石油吸附在土壤颗粒表面堵塞土壤孔隙，降低了土壤透水性，改变土壤有机质的组成、结构和物理化学性质，引起土壤有机质的变化如碳磷比;

微生物育种技术研究进展

微生物育种技术研究进展摘要：生物育种是运用遗传学原理和技术对某种具有特定生产目的的菌株进行改造，去除不良性质，增加有益新性状，以提高产品的产量和质量的一种育种方法。微生物的育种技术已从常规的突变和筛选技术发展到基因诱变、基因重组和基因工程等，育种技术的不断成熟，大大提高了微生物的育种效果。但是有时候微生物育种也不是单一的一种方法，有的是需要多种方法综合使用。本文将各种微生物育种技术进行总结和细致分析。关键词：微生物育种；诱变育种；基因重组育种；基因工程育种 1.常规育种常规育种是以不经过人工处理，利用微生物自发突变为基础，从中筛选出具有优良性状菌株的一种育种方法一般情况下，由于DNA的半保留复制以及校正酶系的校正作用和光修复、切除修复、重组修复、诱导修复等作用，发生自然突变的几率特别低，一般为106～1010/BP，而且用于工业生产的菌株的性状往往由单一或少数基因控制，所以常规育种时间较长，工作量较大。，通过常规育种提高菌种生产能力、筛选高产菌株的效率较低，效果不明显。因此在生产实践中，常规育种的主要目的是用来纯化、复壮、稳定菌种。 2. 诱变育种 1927年MILLER发现X-射线能诱发果蝇基因突变之后人们发现其他一些因素也能诱导基因突变，并逐渐弄清了一些诱变因素的机理，为微生物诱变育种提供了前提条件根据育种需要，有目的地使用诱变因素，可使菌株的基因发生突变以改良其生产性状.凡能诱发基因突变，并且突变频率远远超过自发突变的物理因子或化学物质被称为诱变剂。根据诱变剂的不同可以将诱变育种的方法分为：有物理因子诱变育种和化学因子诱变育种。，前者包括激光、X-射线、"r-射线、快中子等)后者主要是烷化剂（包括EMS、EI、NMU、DES、MNNG、NTG等），天然碱基类似物，亚硝酸和氯化锂在物理诱变因素中，紫外线比较有效、适用、安全，其他几种射线都是电离性质的，具有穿透力，使用时有一定的危险性,化学诱变剂的突变率通常要比电离辐射的高，并且十分经济，但这些物质大多是致癌剂，使用时必须十分谨慎.目前，多种诱变剂的诱变效果、作用时间、方法都已基本确定，人们可以有目的、有选择地使用各种诱变剂，以达到预期的育种效果. 2.1物理因子诱变 2.1.1 UV 所有传统的物理诱变手段中，使用得最为普遍的就是紫外线辐照，它是诱发微生物突变的一种非常有用的工具。对于紫外线的的作用有很多解释，但研究最清楚的是它可引起DNA结构的变化，尤其是可使DNA分子形成胸腺嘧啶二聚体，即两个相邻的嘧啶共价连接，二聚体的出现会减弱氢键的作用，引起双键结构变形，就可能影响胸腺嘧啶(T)和腺嘌呤(A)的正常配对，破坏了腺嘌呤的正常掺人，复制就在这一点上突然停止或错误地进行。如果错误地进行复制，且在新形成的链上有一个改变了的碱基次序，则在随后的复制过程中，碱基次序已改变的DNA链照常进行复制，产生了一个在两条链上碱基次序都是错误的分子而引起突变归J。利用紫外诱变的方法可选育出大量产量高，活性强的菌种，由于其设备简单，诱变效率高，操作安全而被广泛应用。白兰芳等用紫外线单因子处理、光复活处理西罗莫司产生菌Streptomyces hygro—scopicus得到了一正变株UV-8-61，效价比出发菌株提高了2—3倍。近些年来紫外线作为一种基本的诱变因子，也常常和其他一些诱变因子联合作用于微生物而提高诱变效果。胡永兰等用UV和DES(硫酸二乙酯)复合处理梧宁霉素产生菌，得到一株较高的突变株，效价比出发菌株提

结构化需求分析方法

结构化分析（SA）方法结构化开发方法(Structured Developing Method)是现有的软件开发方法中最成熟，应用最广泛的方法，主要特点是快速、自然和方便。结构化开发方法由结构化分析方法(SA法)、结构化设计方法(SD 法)及结构化程序设计方法(SP 法)构成的。结构化分析(Structured Analysis，简称SA 法)方法是面向数据流的需求分析方法，是70 年代末由Yourdon,Constaintine 及DeMarco 等人提出和发展，并得到广泛的应用。它适合于分析大型的数据处理系统，特别是企事业管理系统。 SA 法也是一种建模的活动，主要是根据软件内部的数据传递、变换关系，自顶向下逐层分解，描绘出满足功能要求的软件模型。 1 SA 法概述 1.SA 法的基本思想结构化分析(Structured Analysis，简称SA 法)是面向数据流的需求分析方法，是70年代由Yourdon,Constaintine 及DeMarco 等人提出和发展，并得到广泛的应用。结构化分析方法的基本思想是“分解”和“抽象”。

分解：是指对于一个复杂的系统，为了将复杂性降低到可以掌握的程度，可以把大问题分解成若干小问题，然后分别解决。图4 是自顶向下逐层分解的示意图。顶层抽象地描述了整个系统，底层具体地画出了系统的每一个细节，而中间层是从抽象到具体的逐层过渡。抽象：分解可以分层进行，即先考虑问题最本质的属性，暂把细节略去，以后再逐层添加细节，直至涉及到最详细的内容，这种用最本质的属性表示一个自系统的方法就是“抽象”。 2.SA 法的步骤 ⑴建立当前系统的“具体模型”; 系统的“具体模型”就是现实环境的忠实写照，即将当前系统用DFD 图描述出来。这样的表达与当前系统完全对应，因此用户容易理解。 ⑵抽象出当前系统的逻辑模型;

微生物固定化技术的发展及其在污水处理的研究

微生物固定化技术的发展及其在污水处理的研究摘要：微生物固定化技术是一种有效的废水处理技术，通过对固定化技术方法的介绍以及不同载体选择的对比，分析评价了微生物固定化在废水处理的国内外应用研究现状，并针对相关问题提出了今后的研究和发展方向。关键字：固定化技术载体材料废水处理微生物 Abstract:Immobilized microorganism technique is a kind of effective wastewater treatment technology. Based on the technique of immobilization method introduction and different carrier choose contrast.TAnalysis and evaluation the immobilized microorganism technology applied to various kinds of wastewater treatment both in China and abroad are summarized. Aiming at its relevant problems, its future research and developing directions are brought forward. Key words: immobilization technique Carrier material wastewater treatment microorganism 微生物固定化技术是从二十世纪60年代开始迅速发展起来的一项新技术，至今已经形成了较为完备的理论和方法。微生物固定化技术是指通过利用化学或物理手段将游离的微生物或酶，定位于限定的空间区域内，使之不溶于水，但仍能保持其生物活性且在适宜的条件下还可以增殖，是一种可以反复使用的技术[1]。这项技术最初利用于工业发酵，20世纪70年代后期，随着水环境污染的日益严重，研究一种高效、快速，能连续处理的生物处理废水系统的要求日益迫切，国内外开始应用微生物固定化技术来处理废水，从此微生物固定化技术在污水处理中得到广泛的应用[2,3]。与普通悬浮生物处理法相比，采用微生物固定化技术有以下优点[4]：（1）有利于提高生物反应器内微生物浓度和纯度，提高处理负荷、减少处理装置容积；（2）污泥产量少，利于反应器的固液分离；（3）可选择性地固定优势菌种，稳定性强，提高难降解有机物的降解效率；（4）抗毒物毒能力强；（5）对水质及pH的变化有较好的稳定性。这些优点使微生物固定化技术在国内外废水处理领域中备受重视，特别是在难降解和有毒废水处理中表现出更大的潜力。 1、微生物固定化的分类微生物细胞固定化的方法多种多样，任何一种限制细胞自由流动的技术都可以用来对微生物细胞进行固定化。按照固定载体及其作用方式不同，主要有共价结合固定化、吸附固定化、包埋固定化和交联固定化四大类[5]。 1.1共价结合法共价结合法就是是细胞表面上官能团和固相支持物表面的反应基团形成化学共价健连接。用共价键固定酶，载体与酶的结合牢固，不易脱落，但限制了微生物的活性，半衰期较长。但由于化学共价法结合操作与控制复杂苛刻，反应剧烈，常常引起酶蛋白高级结构发生变化，因此，一般细胞活性回收较低。能够用于共价法固定的酶蛋白上的功能基因中，最常用的是氨基和羧基。对于共价偶联反应的选择一般应考虑酶蛋白上供共价结合的功能基团必须不影响酶的催化活性，反应条件应尽可能温和，最好在水溶液中反应。偶联反应应该对酶蛋白上某一类功能基团有很高的专一性，而对其他功能基团或水溶液几乎无副反应。共价反应的主要方法有酰化反应法、芳化和烷基化反应法、溴化氰法、重氮化反应法以及硅烷基化法等。 1.2吸附法吸附法又称载体结合法，根据载体特性可分为物理吸附和离子交换吸附。物理吸附是使用具有高吸附能力的物质，如硅胶、活性炭、多孔玻璃、碎石、卵石、焦炭、硅藻土、多孔砖等吸附剂，将微生物吸附在表面使其固定化。离子吸附是利用微生物在解离状态下离子健合作用而固定于带有相反电荷的离子交换剂上，常见的离子交换剂有DEAE -纤维素、CM-纤维素等。吸附法是依据带电的

生物分子固定化方法

生物传感器中生物组分的固定化方法生物传感器由两部分组成: 生物敏感元件和信号转换器。生物传感器的选择性主要取决于敏感材料的选取，而灵敏度的高低则与转换器的类型、生物组分的固定化技术等有很大的关系。因此固定化技术的发展是提高传感器性能的关键因素之一。生物传感器要呈现良好的工作性能, 其固定化技术应满足以下条件: (1) 固定化后的生物组分仍能维持良好的生物活性； (2) 生物膜与转换器须紧密接触，且能适应多种测试环境； (3) 固定化层要有良好的稳定性和耐用性； (4) 减少生物膜中生物组分的相互作用以保持其原有的高度选择性。为了研制廉价、灵敏度高而且选择性好的生物传感器，固定化技术已成为研究者们努力探求的目标。经过近20年的不懈探索，已建立了对各种不同生物功能材料的固定化方法。物理吸附法此法是通过生物分子的极性键、氢键、疏水键的作用将生物组分吸附于不溶性的惰性载体上。文献已经报道了一些材料可用作吸附其它材料的载体，比如，石墨粉［25］、石墨-聚四氟乙烯［26］、活性碳［27］、离子交换树脂［28］等。物理吸附法的特点是方法简便、操作条件温和，缺点是生物分子与载体表面的结合力弱，在表面进行任意取向的不规则分布，因此使制得的生物传感器容易发生生物分子的脱落和泄漏，从而造成传感器的灵敏度低，重现性差。包埋法将生物组分与合成高分子经溶剂混合而使生物组分包埋于其中，制成敏感膜的方法称作包埋法。采取的包埋方式通常包括凝胶包埋法和胶囊包埋法二种形式［29,30］。。包埋法的优点是操作条件比较温和，膜的孔径和形状可随意控制，对生物组分活性的影响较小，缺点是需控制很多实验因素，而且生物组分在聚合物膜内的活性会受到影响。共价键合法将生物组分通过共价键与电极表面结合而固定的方法称作共价键合法。该法是利用基体表面进行活化处理，然后与生物组分偶联，从而使生物组分结合到基体表面。活化的方法有：烷基化法［31］、高碘酸氧化法［32］、迭氮法［33］等。该法的优点是通过形成特殊键将生物组分进行固定，因此生物组分不易发生泄漏，并且改善了生物分子在表面的定向，但缺点是操作复杂，成本高，而且生物组分易失活。化学交联法化学交联法是在交联剂(具有两个或两个以上功能团的试剂) 的作用下，生物分子间发生共价结合，也可将生物组分直接与载体共价交联。最常用的交联剂是戊二醛［35］。该法的优点是生物组分的固定比较牢固，不易脱落，缺点是反应难以控制，扩散阻力大，所需的生物样品量多。电化学聚合法电化学聚合法是通过将聚合物单体和生物组分同时混合于电解液内，通过恒电位

微生物研究技术与方法重点大全要点

第一章绪论课程主要内容： 1、微生物学研究技术发展 2、微生物材料的准备 3、微生物研究中的物理化学方法基础 4、微生物的观察与微生物分析法 5、细胞破碎方法及亚细胞物质分离 6、微生物育种技术 7、固相化技术与生物传感器 8、免疫学技术 9、微生物学研究的分子生物学技术微生物学研究技术发展：微生物学是整个生物学中第一门具有一套自己独特操作技术的学科，其技术的发展主要包括： 1、显微镜术和制片染色技术 2、消毒灭菌技术和无菌操作技术 3、纯种分离和克隆化技术 4、合成培养基技术；选择性和鉴别性培养技术 5、突变型标记和筛选技术；深层液体培养技术 6、菌种保藏技术 7、原生质体制备和融合技术 8、各种DNA重组技术等第二章微生物材料的准备第一节灭菌、消毒、除菌与无菌操作掌握知识要点：原理、方法、生物活性物质的除菌无菌操作：意识、个人卫生、环境卫生、灭菌、接种等操作、保存一、几个基本概念控制害菌的措施： 1）杀灭法： ○1灭菌：彻底杀灭（杀菌、溶菌）——一切微生物 ○2消毒：部分杀灭——仅杀灭病原菌 2）抑制法： ○1防腐：抑制霉腐微生物 ○2化疗：抑制宿主体内的病原菌 1、灭菌：采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。例如：高温灭菌、辐射灭菌等。 2、消毒：消除毒害，即传染源、致病菌。一种采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人体或动、植物有害的病原菌，而对被消毒的对象基本无害的措施。例如：

常用的对皮肤、水果、饮用水进行药剂消毒的方法对啤酒、牛奶、果汁和酱油等进行消毒处理的巴氏消毒法 1）巴氏消毒法（pasteurization） 2）煮沸消毒法采用在100℃下煮沸数分钟的方法，一般用于饮用水的消毒。 3、防腐：利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，即通过抑菌作用防止食品、生物制品等对象发生霉腐的措施。防腐的方法： ①低温：利用4℃以下的各种低温（0，－20，－70，－196℃）保藏食物、生化试剂、生物制品或菌种等。 ②缺氧：可采用抽真空、充氮或二氧化碳、加入除氧剂等方法来有效防止食品和粮食等的霉腐、变质而达到保鲜的目的。除氧剂的种类很多，是由主要原料铁粉再加上一定量的辅料和填充剂制成，对糕点等含水量较高的新鲜食品有良好的保鲜功能。 ③干燥：采用晒干、烘干或红外线干燥等方法对粮食、食品等进行干燥保藏，是最常见的防止霉腐的方法；在密封条件下，用生石灰、无水氯化钙、无氧化二磷、氢氧化钾（或钠）或硅胶等作为吸湿剂，也可很好的达到食品、药品和器材等长期防霉腐的目的。 ④高渗：通过盐腌和糖渍等高渗措施来保存食物，是在民间早就流传的有效防霉腐的方法。 ⑤高酸度：在我国和韩国等具有悠久历史的泡菜，就是利用乳酸菌的厌氧发酵使新鲜蔬菜产生大量乳酸，借这种高酸度而达到抑制杂菌和防霉腐的目的。 ⑥高醇度：用白酒或黄酒保存食品，在我国有悠久传统，如：醉蟹、醉麸、醉笋和黄泥螺等产品，都是特色风味食品。 ⑦加防腐剂：在有些食品、调味品、饮料、果汁或工业器材中，可加入适量的防腐剂或防霉剂来达到防霉腐的目的，如：用苯甲酸来使酱油防腐；用尼泊金作墨汁防腐剂；用山梨酸、脱氢醋酸作化妆品防腐剂；用二甲基延胡索酸（DMF）作食品、饲料的防腐剂。 4、化疗——化学治疗利用具有高度选择毒力即对病原菌具高度毒力而对宿主基本无毒的化学物质来抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，借以达到治疗该宿主传染病的一种措施。用于化学治疗目的的化学物质称化学治疗剂，包括磺胺类等化学合成药物、抗生素、生物药物素和若干中草药中有效成分等。要点： 1.灭菌：利用物理、化学方法杀死物体表面、内部全部的微生物。 2.消毒：杀死物体表面或内部有害微生物或使其钝化，使致病微生物不致病。 3.除菌：利用物理方法除去物体表面的微生物。

微生物固定化技术

固定化微生物技术是将特选的微生物固定在选证的载体上，使其高度密集并保持生物活性，在适宜条件下能够快速、大量增殖的生物技术。这种技术应用于废水处理，有利于提高生物反应器内微生物(尤其是特殊功能的微生物)的浓度，有利于微生物抵抗不利环境的影响，有利于反应后的固液分离，缩短处理所需的时间。利用固定化微生物技术提高废水处理效率的工艺方法也被称作"生物增效"，其适用的领域非常广泛，例如:化粪池、隔油槽、排水管、城市污水处理厂以及工业废水…等。一般而言，针对特殊污染源，来自天然环境的微生物消耗很快、效率低下，即使有快速的繁殖能力仍不足以负荷。因此，生物增效的作业过程还是依循自然的方式，向目标添加定制的、具有已知降解能力的微生物制剂(固定化微生物)，处理效果则有明显的提升。现在所研究的生物吸附剂的固定化方法主要有以下几种: 1吸附法吸附法一般依靠生物体与载体之间的作用，包括范德华力、氢键、静电作用、共价键及离子键，两者间的屯电位，在微生物体和载体的相互作用中起重要作用。常用的吸附载体有活性炭、木屑、多孔玻璃、多孔陶瓷、磁铁矿、硅藻土、硅胶、纤维素、聚氨醋泡沫体、离子交换树脂等。它是一种简单易行、条件温和的固定化方法，但用它固定的生物体不够牢靠，容易脱落。 2交联法交联法又称无载固定化法，是一种不用载体的工艺，通过化学、物理手段使生物体细胞间彼此附着交联。化学交联法它一般是利用醛类、胺类等具有双功能或多功能基团的交联剂与生物体之间形成共价键相互联结形成不溶性的大分子而加以固定，所使用的交联剂主要有戊二醛、聚乙烯酞胺、表氯醇等等。物理交联法在是指在微生物培养过程中，适当改变细胞悬浮液的培养条件(如离子强度、温度、pH值等)，使微生物细胞之间发生直接作用而颗粒化或絮凝来实现固定化，即利用微生物自身的自絮凝能力形成颗粒的一种固定化技术。 3包埋法在微生物的固定化方法中，以包埋法最为常用。它的原理是将生物体细胞截留在水不溶性的凝胶聚合物孔隙的网络中，通过聚合作用或通过离子网络形成，或通过沉淀作用，或通过改变溶剂、温度、pH值使细胞截留。凝胶聚合物的网络可以阻止细胞的泄露，同时能让基质渗入和产物扩散出来。包埋材料可以分为两大类:

6学技术及其在环境微生物研究中的应用

分子生态学技术及其在环境微生物研究中的应用张于光!，李迪强!!，肖启明" （!#中国林业科学院森林生态环境与保护研究所，北京!$$$%!；"#湖南农业大学生物安全科技学院，湖南长沙&!$!"’）摘要分子生态学作为一门新兴的学科已经成为国内外科学家关注和研究的热点。目前的分子生态学技术主要有核酸杂交分析技术、特异性()*扩增技术、+,-序列分析、基因芯片技术等。这些技术在环境微生物研究中的应用主要包括对微生物多样性的研究、种群结构和动力学的研究、代谢活性的研究以及在全球气候变化中对微生物影响的研究。最后，对环境微生物的分子生态学研究进行了展望。关键词分子生态学；环境微生物；基因芯片；全球气候变化中图分类号.%/%#%文献标识码-文章编号!$$012$"!（"$$0）$01$$’21$& !"#$%&#’()%"#"*+,$%-."#"*+’./012344#5%’15".5. ).65(".7$.1’#!5%("85"#"*+91&/+ 34-,567897:;9!，<=+>8?>:;9!，@=-A.>8B>;9" （!!"#$%&’(&)*$%+,&-!+#./)&#!0)&%*,%!12/#*$*3,45!&’(&)*$%)6，7*/8/#9!$$$%!； "!1&--!&’0-4#%0)&%*,%!:;#4#39)/,!<#/.!124#9$24&!$!"’） 3821(’%1-C:D7E9F G;>;9C7D H F I J，B G K F I7K:E F I G K G9L M:C D F I G B F:M G J E F C F:E I M C N G J J M:J O E F P P G E K O P>O F C I>F;8 J>C J C’:J J F;J>G;#-J N E F C F;J，B G K F I7K:E F I G K G9L J F I M;G K G9L B:>;K L>C;7I K F>I:I>O M L D E>O>Q>;9O F J F I J>G;，()*:B N K>R>8 I:J>G;，+,-C F?7F;I F:;:K L C>C，9F;F I M>N，:;O G J M F E J F I M;G K G9L#S M F L:E F7C F O>;B>I E G D>G K G9L C J7O L B:>;K L>;B>8 I E G D>:K O>T F E C>J L，I G B B7;>J L C J E7I J7E F:;O O L;:B>I C，B F J:D G K>I:I J>T>J L，:;O J M F>B N:I J G R9K G D:K I K>B:J F I M:;9F C J G B>I E G G E9:;>C B C#S M F N E G C N F I J G RB G K F I7K:E F I G K G9L J F I M;G K G9L C J7O L P:C:K C G O>C I7C C F O# :$+;"(/2B G K F I7K:E F I G K G9L；F;T>E G;B F;J:K B>I E G D F；9F;F I M>N；9K G D:K I K>B:J F I M:;9F 分子生物学及其技术的发展和变革为生态学的研究开辟了新途径，分子生物学与生态学的交叉领域，越来越引起人们的重视，分子生态学便应运而生，微生物分子生态学是其中的重要分支。应用分子生态学技术，研究者不必培养微生物，而可以直接对环境微生物进行分析来达到目的。分子生态学技术在环境微生物研究中的应用始于"$世纪’$年代中期，近年来在土壤、环境、海底沉积物、动物肠道等微生物生态系统的研究中得到了快速的发展，已经成为最富有活力的生态学科前沿领域之一。 <环境微生物+,-的获得从自然环境中直接分离微生物核酸，对不能培养的微生物的检测、对决定选择微生物或自然条件下重组基因的命运、对揭示基因型的多态性和在微生态中的变化都是很重要的［!］。目前从环境样品中提取+,-的方法主要有"种。首先是细胞提取法。最初的报道是从土壤中提取细菌+,-，这种方法包括用不同的离心速度从土壤颗粒中分离细菌，然后溶解提取的细胞提取+,-，最后纯化+,-。4G K D F;等以该方法为基础提取的+,-纯度足够可以对土壤细菌群落特定基因型进行探针检测，以及对提取+,-进行U G7J M F E;分析和限制性酶分析［"］。第"种方法是直接溶解法。该方法是由提取沉积物+,-发展而来［/］。直接溶解后在缓冲液中用碱提取+,-，用乙醇沉淀、)C)K浓度梯度离心等纯化提取的+,-。环境样品中提取+,-总是同时提取了腐殖物质的+,-，因而干扰了+,-的检测和收稿日期："$$&1$/1"$ 作者简介：张于光男，博士。现主要从事环境微生物分子生态学研究。项目来源：国家“十五”科技攻关项目（"$$!V-0!$V!$）；林业局重点项目“自然保护区社会经济生态价值研究” !通讯作者 2’ 微生物学杂志"$$0年%月第"0卷第0期W A X*,-