毛霉蛋白酶的组分特性及对大豆蛋白水解的研究
潘进权 罗晓春 谢明权
(华南理工大学生物科学与工程学院,广州 510641)
摘 要 毛霉是腐乳酿造的主要微生物之一,其分泌的蛋白酶对大豆蛋白具有较高的水解效率以及对蛋白水解物良好的脱苦效果,因此在大豆蛋白水解加工方面显示出很好的应用前景。本研究采用多种蛋白纯化的方法从毛霉胞外分离纯化出三种不同的蛋白酶组分。在探讨了各组分蛋白酶性质的基础上,考察了各种蛋白酶组分对大豆蛋白的水解效果。结果显示,纯化得到的碱性蛋白酶组分Pb1对大豆蛋白具有相对较强的水解能力,而酸性蛋白酶对大豆蛋白水解能力较差,碱性蛋白酶与酸性蛋白酶之间具有良好的协同作用。
关键词 雅致放射毛霉 蛋白酶 性质 大豆蛋白 水解
中图分类号:TS201.2 文献标识码:A 文章编号:1003-0174(2009)05-0031-05
毛霉是腐乳发酵生产的主要菌种之一,在腐乳生产工艺中其主要作用是分泌蛋白酶水解豆腐胚内的大豆蛋白。已有的研究发现,腐乳成品中的蛋白质主要是以多肽的形式存在,具有相当高的水解程度,并且已经从中分离出多种具有生理活性的多肽[1-2];而对众多腐乳产品的感官分析也表明,腐乳产品通常不具有一般蛋白水解物所特有的苦味。综合以上两点来看,毛霉蛋白酶在解决植物蛋白(尤其是大豆蛋白)水解方面存在的技术难题,如水解率低、水解产物具有强烈的苦味等具有很大的潜力。
与其它真菌(如米曲霉、青霉、红曲霉等)相类似,毛霉由于长期在高蛋白的培养基上生长驯化,因此,它具有合成及分泌多种胞外蛋白酶的能力[3],而且其胞外蛋白酶系对于大豆蛋白具有很好的适应性,显示出相当高的水解效率[4]。然而,对毛霉胞外蛋白酶系的深入研究却一直以来为国内外学者所忽视,仅有极少量的报道初步探讨了毛霉胞外蛋白酶的构成,以及粗酶液对大豆蛋白的水解效果,几乎没有报道深入到该蛋白酶系的组分构成以及各组分的催化特性。为了较全面的了解毛霉胞外蛋白酶系的构成,本研究深入探讨了毛霉胞外蛋白酶系的组分构成,各蛋白酶组分的催化特性以及对大豆蛋白的水解特性以期为毛霉胞外蛋白酶的应用提供借鉴。
基金项目:广东省科技计划项目(2006A10602001),广州市科技攻关项目(2006Z3-E0701)
收稿日期:2008-05-26
作者简介:潘进权,男,1978年出生,博士,酶与发酵工程
通讯作者:罗晓春,男,1977年出生,讲师,酶与发酵工程1 材料与方法
1.1 材料与试剂
雅致放射毛霉AS3.2778:实验室保藏菌种。
DEAE-Sepharose、C M-Sepharose、Phenyl-Sepharose、Sepharose6B:Pharmacia公司;大豆分离蛋白(蛋白含量87.35%):哈尔滨高科大豆食品有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 蛋白酶活性测定
采用Folin酚法[5]:1.5mL离心管中加入0.3mL 适当稀释的酶液及0.3mL 1.5%酪蛋白(溶于0.02mol/L,pH9.5的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液), 40 反应l0min,再加0.6m L0.4mo1/L的三氯乙酸终止反应,静置15min后14000g离心10min,取上清液0.6mL,加入3mL0.4mol/L的碳酸钠溶液及0.6mL福林酚试剂,于40 显色20min,于680nm测其吸光值,根据标准曲线计算酶活单位。
酶活定义:试验条件下,每分钟水解酪蛋白释放1 g当量酪氨酸所需的酶量定义为1个活力单位。
1.2.2 聚丙稀酰胺凝胶电泳[6]
利用SDS-Page检测纯化后的蛋白酶纯度,采用14%分离胶,5%浓缩胶。
1.2.3 水解度的测定
采用甲醛滴定法[7-8]:取5mL水解样品,加入60m L蒸馏水,用0.1000m ol/L NaO H调节到pH8.20,加入20mL己中和的甲醛,然后用0.1000m o1/LNaOH标准溶液滴定到pH9.20,记录消耗NaOH的体积V1。
2009年5月
第24卷第5期
中国粮油学报
Journal of the Chinese Cereals and Oils Association
Vol.24,No.5
May2009
用蒸馏水代替样品,操作方法相同,测得空白体积V0。
样品中游离氨基的量/mmol/L=10000.1 (V1-V0)/5.0
样品水解度DH=[10000.l(V1-V0)/5.00/ C-0.33]/7.8100%
式中:C为样品中蛋白浓度/g/L;0.33为大豆蛋白中游离氨基浓度/mmol/g;7.8为每克大豆蛋白的肽键当量数/mmol/g。
1.2.4 干麸曲的制备
称取8g干麸皮加入到250mL的三角瓶中,按干麸皮与水1!0.9的比例加入自来水并混匀配制成发酵培养基(其中添加少量的辅助营养物质),灭菌后接种一环经活化的斜面孢子,置于24 培养48h。取出发酵好的麸曲,捣散后于40 烘干,即得到了干麸曲。
1.2.5 粗酶的提取
称取一定量的干麸曲加入10倍质量的0.3m ol/L 氯化钠溶液,混匀后于40 水浴中抽提1.5h,纱布过滤后在7000g,4 离心10min,取上清即得到了粗酶液。
1.2.6 毛霉碱性蛋白酶的纯化路线
硫酸铵盐析(收集40%~85%的沉淀),用0.02mol/L,pH7.5的Tris-HCl缓冲液溶解?DEAE -Sepharose阴离子交换?C M-Sepharose阳离子交换?Phenyl-Sepharose疏水层析?Sepharose6B凝胶层析?纯化的碱性蛋白酶组分Pb1。
1.2.7 毛霉酸性蛋白酶的纯化路线
硫酸铵盐析(收集40%~85%的沉淀),用0.05 mol/L,pH5.0醋酸缓冲液溶解?C M-Sepharose阳离子交换(得到两个不同的活性组分)?两组分分别进行Phenyl-Sepharose疏水层析?纯化出两个酸性蛋白酶组分Pal和Pa2。
1.2.8 毛霉蛋白酶各组分的催化特性
参考文献[9],主要考察了温度、pH及抑制剂对毛霉蛋白酶活性的影响;温度和pH对毛霉蛋白酶稳定性的影响。
1.2.9 毛霉碱性蛋白酶对大豆蛋白的水解
自然pH条件下的水解试验:用蒸馏水配制浓度为5%的大豆分离蛋白(SPI),并用Na OH溶液调节到pH9.5,然后在沸水浴中热处理15min。冷却后按酶与底物比1000u/g加入蛋白酶Pb1,然后置于50 水浴条件下酶解,测定大豆蛋白水解度的变化。
固定pH条件下的水解试验:用0.1mol/L pH9.5NaHCO3-Na2CO3缓冲液配制浓度为5%的大豆分离蛋白(SPI),在沸水浴中热处理15min。冷却后按酶与底物比1000u/g加入蛋白酶,然后置于50 水浴条件下酶解,测定大豆蛋白水解度的变化。
1.2.10 毛霉酸性蛋白酶对大豆蛋白的水解
自然pH条件下的水解试验:用蒸馏水配制浓度为5%的大豆分离蛋白(SPI),并调节到pH6.5,然后在沸水浴中热处理15min。冷却后按酶与底物比1000u/g加入蛋白酶Pa1或Pa2,然后置于50 水浴条件下酶解,测定大豆蛋白水解度的变化。
固定pH条件下的水解试验:用0.1mol/L pH6.5磷酸盐缓冲液配制浓度为5%的大豆分离蛋白(SPI),在沸水浴中热处理15min。冷却后按酶与底物比1000u/g加入蛋白酶Pa1或Pa2,然后置于50 水浴条件下酶解,测定大豆蛋白水解度的变化。
1.2.11 复合蛋白酶对大豆蛋白的水解
工艺一:配制浓度为5%的大豆分离蛋白(SPI),调节到pH6.5,然后在沸水浴中热处理15min。冷却后按酶与底物比1000u/g分别加入蛋白酶Pb1及Pa1,然后置于50 水浴条件下酶解5h,测定大豆蛋白水解度的变化。
工艺二:配制浓度为5%的大豆分离蛋白(SPI),用NaOH溶液调节到pH9.5,然后在沸水浴中热处理15min。冷却后按酶与底物比1000u/g加入蛋白酶Pb1,然后置于50 水浴条件下酶解2.5h。用稀酸缓慢调节到pH6.5左右,按酶与底物比1000u/g加入酸性蛋白酶Pa1,继续水解到2.5h,测定全过程大豆蛋白水解度的变化。
工艺三:配制浓度为5%的大豆分离蛋白(SPI),用NaOH溶液调节其pH到9.5,然后在沸水浴中热处理15min。冷却后按酶与底物比1000u/g加入蛋白酶Pb1,然后置于50 水浴条件下酶解2.5h(通过连续滴加稀NaOH的方法控制反应体系的pH)。用稀酸缓慢调节到pH 6.5左右,按酶与底物比1000u/g加入酸性蛋白酶Pa1,继续水解到2.5h,测定全过程大豆蛋白水解度的变化。
2 结果与分析
2.1 毛霉蛋白酶的纯化及电泳鉴定
如图1所示,纯化出的三种毛霉蛋白酶组分均已达到电泳纯。毛霉酸性蛋白酶(Pa1和Pa2)是该菌种的主要胞外分泌蛋白,其含量远高于碱性蛋白酶(Pb1)组分。电泳显示这三种蛋白酶的分子质量非
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常接近,其中碱性蛋白酶的相对分子质量为32000,两种酸性蛋白酶Pa1和Pa2的相对分子质量分别为35000和34000
。
注:1蛋白质marker,2粗酶液,3纯化的Pa1,
4纯化的Pa2,5纯化的Pb1图1 蛋白酶的SDS-Page
2.2 毛霉蛋白酶各组分的性质
如表1所示,纯化出的蛋白酶Pb1组分是一碱性蛋白酶,该蛋白酶在pH 9.5、60 的条件下有最大催化活性,在pH 6.0~10.0、低于40 的条件下有很好的稳定性。与绝大多数碱性蛋白酶相似,PMSF 可以完全抑制该蛋白酶的活性,显示Pb1属于丝氨酸蛋白酶家族。Pa1和Pa2均是酸性蛋白酶,在50 有最大催化活性,其最适作用pH 分别在5.5和4.5,与报道的青霉P-1007酸性蛋白酶的最适作用pH 相同[10]
,而普遍高于已报道的其他真菌类酸性蛋白酶,如黑曲霉酸性蛋白酶(pH 3.5)[11],宇佐美曲霉酸性蛋白酶(pH 2.5)[12]
,米曲霉酸性蛋白酶(pH 4.0)[13]
。与以上报道的真菌酸性蛋白酶相似,Pepstatin 可以完全抑制Pa1和Pa2的活性,说明Pa1与Pa2属于天冬氨酸蛋白酶家族。
表1 毛霉蛋白酶各组分的性质
蛋白酶组分最适作用pH 最适作用温度/ 热稳定性/ 稳定pH 范围蛋白酶类型Pb19.560<40 6.0~10.0丝氨酸蛋白酶P a1 5.550<40 4.0~7.0半胱氨酸蛋白酶P a2
4.5
50
<40
4.0~7.0
半胱氨酸蛋白酶
2.3 碱性蛋白酶组分对大豆蛋白的水解
探讨了碱性蛋白酶对大豆分离蛋白(SPI)的水解效果,结果如图2所示。在两种不同模式下(自然pH 和固定pH )进行的水解试验,SPI 的最终水解度不同:固定pH 条件下SPI 的最终水解度高于自然pH 条件。不过,两种情况下SPI 的水解度具有非常相似的变化趋势:在水解的初期(1h 内)SPI 的水解度随
时间迅速增加,随后SPI 的水解速度减缓并趋于终
止。这主要有两个方面的原因:(1)随着SPI 的水解,形成了大量形式多样的小肽,而某些小肽对蛋白酶具有竞争抑制作用,这在一定程度上削弱了反应体系的酶活。这是固定pH 条件下SPI 水解度趋于稳定的主要原因;(2)在自然pH 条件下进行的水解试验,随着水解的进行反应体系的pH 会迅速下降,并趋于稳定(如图3所示)。而pH 的降低将直接会导致碱性蛋白酶活性的降低。也正是由于这一原因从而导致了自然pH 条件下SPI 的最终水解度低于固定pH 条件下的水解。
从Pb1对SPI 的水解效果来看,在SPI 浓度5%,酶与底物比1000u/g 的条件下,50 水解5h,SPI 的水解度可以达到14.5%左右,这一结果高于已有的文献报道[14]
(采用同类检测方法)。结果表明,毛霉碱性蛋白酶对大豆蛋白确实有相对较强的水解能力。
2.4 酸性蛋白酶组分对大豆蛋白的水解
探讨了毛霉酸性蛋白酶Pa1和Pa2对SPI 的水解效果,结果见图4和图5,在试验条件下Pa1与Pa2对SPI 具有相近的水解效果,而两者的水解效率均比Pb1低。这可能与蛋白酶的催化作用位点(即肽键选择性)有关。一般而言,酸性蛋白酶的肽键选择性相对较窄,在底物蛋白上的酶切位点较少;而碱性蛋白酶的肽键选择性相对较宽泛,在蛋白底物上具有较多的酶切位点。另一个重要原因可能与底物蛋白的分散性有关,特别是对于酸性蛋白酶,由于试验条件
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第24卷第5期潘进权等 毛霉蛋白酶的组分特性及对大豆蛋白水解的研究
的pH 与SPI 的等电点(pH 4.5左右)相近,SPI 在酸性环境中非常难溶解,在这种情况下酶与底物难以接触,从而导致水解效率较低。也正是由于这一原因,在酸性蛋白酶的水解试验中采用了pH 6.5的试验条件。此外还发现,在两种模式下(自然pH 和固定pH)进行的水解试验,其最终的结果基本上没有什么大的区别,这可能是由于在偏酸性的条件下进行水解时,水解产生的小肽基本上不会影响到体系的pH 变化,即不会出现pH 变化影响蛋白酶活性的情况,
因此两种模式下的水解效果基本相同。
2.5 大豆蛋白的复合酶解
众多的研究显示,多种蛋白酶的复合作用效果往往优于单一蛋白酶[15-16]
。其原因主要是由于不
同类型蛋白酶的底物专一性通常存在一定的互补性,因此它们在一定程度上可以互相解除水解过程中形成的小肽对蛋白酶的竞争抑制作用。为了探讨这一作用,我们考察了毛霉酸性蛋白酶与碱性蛋白酶在不同方式下对SPI 的复合水解效果,结果如图6所示。
比较三种不同水解工艺可以看出,复合酶解工艺一的水解效果最差,SPI 的最终水解度仅达到8.5%。其原因主要来自两个方面:(1)碱性蛋白酶在偏酸性条件下的酶活较低,没能充分发挥其水解能力;(2)当起始条件为偏酸性时,SPI 难以溶解分散,影响了底物与酶的充分结合。而工艺三则能很好的
弥补以上两个缺陷:首先,起始的碱性条件使碱性蛋
白酶充分发挥作用;其次,通过碱性蛋白酶的预水解,改善了SPI 在偏酸性条件下的溶解性,有利于酸性蛋白酶与底物的充分结合,提高的酸性蛋白酶的水解效率。因此,复合酶解工艺三的水解效果最好,SPI 最终水解度可以达到21%左右。另外,综合分析以上试验结果可以看出,来源于同一毛霉的酸性蛋白酶与碱性蛋白酶确实具有一定的协同效果,两种蛋白酶的复合作用效果略优于单一蛋白酶作用效果之和。
注:1Pb1对SPI 的水解曲线(起始pH 6.5),2Pa1对SPI 的水解曲线(起始pH 6.5),3复合水解工艺一,复合水解工艺二,4复合水解工艺三
图6 大豆蛋白的复合酶解曲线
3 结论
与其他真菌相似,毛霉胞外蛋白水解系统也是由多种不同的蛋白酶所构成。结合多种层析方法从毛霉发酵麸曲中分离纯化出三种不同的蛋白酶组分,其中包括一种碱性蛋白酶和两种酸性蛋白酶。分析表明,碱性蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶,在
pH 9.5、60 有最大催化活性;两种酸性蛋白酶都属于半胱氨酸蛋白酶,最适作用温度为50 ,其最适作用pH 分别在5.5和4.5。
SPI 的水解试验结果显示,毛霉碱性蛋白酶对SPI 具有相对较强的水解能力。在底物浓度5%,酶与底物比1000u/g 的条件下,50 水解5h,SPI 的水解度可以达到14.5%左右,高于已有的文献报道(采用同类检测方法)。复合水解试验结果表明,毛霉酸性蛋白酶与碱性蛋白酶之间存在一定的协同作用效果,两种蛋白酶的复合水解效果优于单一蛋白酶水解效果之和。
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Characterization of Proteases from Actinomucor elegans and
Application in Hydrolysis of Soy Protein
Pan Jinquan Luo Xiaochun Xie Mingquan
(School of Bioscience and Bioengineering,South China University of Technology,Guangzhou 510641)Abstract Proteases from mucor species,the predominant mic roorganisms used in the fermentation of sufu,had shown a good market prospect in the production of soy-polypeptides for their high hydrolysis efficiency to soy protein and debittering effect to the hydrolysate.To explore these enzymes,three proteases,including one alkaline protease and two acidic proteases,were purified from the fermented whea t bran by Actinomucor elegans AS 3.2778using the methods of am monium sulfate precipitation,ion exchange chromatography,hydrophobic chromatography and size exclusion chromatogra phy,and their properties were also investigated.The evaluation experiment of hydrolysis ability indicates that the purified alkaline protease has relatively high hydrolysis efficienc y to soy protein and there is a significant synergistic effect between the alkaline protease and the acidic protease.
Key words Actinomucor elegans ,protease,characterization,soy protein,hydrolysis
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第24卷第5期潘进权等 毛霉蛋白酶的组分特性及对大豆蛋白水解的研究
酶的特性综述 酶通常是指由活细胞产生的、具有催化活性的生物大分子，大多数酶是蛋白质，少数是RNA，另有一些需要辅助因子的辅助。酶的特性主要体现在这几个方面： 一、高效性 1、酶的高效性是和非酶的催化剂比较而言。主要是指催化能力，蛋白质（环境适宜）的催 化能力是普通化学催化物质的10^5—10^8倍。生物分子之间的反应首先要进行分子碰撞接触，如果在没有酶作用的情况下，分子主要靠自然的热运动来随机进行接触，这样的几率比较小，而在酶的作用下，由于酶和作用底物有特异性结合位点，相当于把反应需要的分子给拉到一起去了，所以这样的效率要高很多。 2、酶的高效性实验探究 材料： 新鲜猪肝研磨液（含有H2O2酶)、3%的FeCl3溶液（催化过氧化氢分解的化学催化剂）、清水、试管5支、试管架、酒精炉、线香、打火机、量筒 步骤： 1、在5支试管中分别加入5mLH2O2溶液，依次编号置于试管架上。 2、在1号试管中加入一定量的清水；2号试管中加入与清水等量的新鲜猪肝研磨液；3号试管中加入等量的3%的FeCl3溶液；4号试管中加入经过高温煮过的等量的新鲜猪肝研磨液；5号试管中加入高温煮过的FeCl3溶液。 3、用点燃但无火焰的线香插入试管检验。 现象： 氧气量效果 1号：—无催化作用 2号：﹢﹢高效催化 3号：﹢低效催化 4号：—无催化作用 5号：﹢低效催化 结论：过氧化氢酶比FeCl3催化剂高效。酶具有高效性。
二、专一性 酶对所作用的底物有严格的选择性。一种酶仅能作用于一种物质，或一类分子结构相似的物质，促其进行一定的化学反应，产生一定的反应产物，这种选择性作用称为酶的专一性。 酶的专一性是指酶对底物及其催化反应的严格选择性。通常酶只能催化一种化学反应或一类相似的反应，不同的酶具有不同程度的专一性，酶的专一性可分为三种类型：绝对专一性、相对专一性、立体专一性；也可分为：结构专一性和立体异构专一性。 如过氧化碳氢酶只能催化过氧化氢分解，不能催化其他化学反应。细胞代谢能够有条不乱的进行，与酶的专一性是分不开的。 探究酶的专一性的实验 序 号 项目 试管 1 2 1 注入可溶性淀粉2mL / 2 注入蔗糖溶液/ 2mL 3 注入新鲜淀粉酶溶液2mL 振荡 4 60℃温水保温 5 min 5 加斐林试剂1mL 振荡 6 将试管下部放入60℃热水 中 2 min 7 观察实验结果有砖红色沉淀无砖红色沉淀结 论 淀粉酶只能催化淀粉水解，不能催化蔗糖水解 三、多样性 酶的种类很多，大约有5000多种，其中可以通过食用补充的酵素达2000多种；形态上主要有三种：专业级酵素为酵素胶囊，其次为酵素粉，而液体酵素含量低、效价低、易腐败而安全性较差一些，食用风险较高。 四、温和性
(翻译)酶法水解原淀粉 摘要：原淀粉颗粒存在半微晶结构能抵抗淀粉酶的水解，但是当淀粉糊化时很容易被水解和转化为糖和糊精。影响酶在体内和体外水解的速率和历程的各因素是相互关联的，在这方面的研究也是很复杂的。本文试图讨论一下这方面的问题并给读者提供一些跟这些特征有关的重要信息资源，文章中的每个不同的标题都可以转换成一个综述，因此应该根据文章素材选择性的阅读。 内容 1.引言. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.颗粒大小. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.颗粒形状. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.混合颗粒. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.直链淀粉的含量. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.脂质的量. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.磷酸盐含量. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8.结晶度和双螺旋. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9.结构. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10.环境. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11.糊化. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12.淀粉酶的来源. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13.其它影响因素. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14.结论. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.引言： 加工过的淀粉已经从半微晶的结构转变为无定型结构，而原淀粉则不然，因此原淀粉颗粒可以抗酶解，淀粉类食品在烹调时可以保存较高的营养价值。细菌、真菌、植物、动物和人类生产的α-淀粉酶（尽管不一定有相同的化学结构）是一种内切酶，从分子内部任意的水解α-1, 4键，可以降低淀粉分子的分子量（直链淀粉和支链淀粉）。经过大量的水解，淀粉最终转化为糖和糊精，称为各种DE糖浆，在这里，水解能力是以水解产物（每单位质量）当作葡萄糖量来结算的。商业葡萄糖浆就是利用这种方法生产的，过去葡萄糖浆的生产多用无机酸来水解淀粉，酶处理可以生产更高质量的产品。 如上所述，α-淀粉酶在自然界中到处都存在。许多动物（包括人类）是在唾液或胰腺中分泌酶的，许多动物的胰腺（该胰腺进入人类的十二指肠）将食品淹没时，利用其中的淀粉酶将淀粉水解，此时所生成的任何葡萄糖都可以被小肠直接吸收，刷状缘酶（生产麦芽糖的麦芽糖酶和水解糊精α-1,6键的糊精酶）和α-淀粉酶使葡萄糖的消化过程继续进行，更多的葡萄糖被人体吸收。考虑到α-淀粉酶水解淀粉颗粒的产物，读者会提到更多细节性的工作。没有被消化的淀粉被输送到动物的大肠内，在肠内被肠内菌群发酵（产生气体），热量以短链脂肪酸的形式释放随可能被吸收掉。据一些作者（Dobreva and Ivanova, 1989).）报道直链和支链淀粉水解的方式是不同的。 α-淀粉酶水解原淀粉的控制与水解机制将在下面进行论述。 很多评论是建立在体外研究的基础上的，这些研究与体内研究有着不同的的动力
中图分类号:TQ645.9+9;文献标识码:A;文章篇号:1007-2764(200401-0012-032 大豆蛋白水解液脱苦的研究 朱海峰 1 班玉凤 1 周克仲 2 (1.沈阳工业大学辽阳校区化工学院,辽阳 111003 (2.辽阳石油化纤公司,辽阳111003 摘要:大豆蛋白酶解常常会产生苦味,蛋白质水解物苦味肽的苦味是长期困扰其应用的问题。本文研究了酶法与微生物法对大豆蛋白水解液脱苦的效果。结果表明:采用端肽酶黑曲霉酸性蛋白酶(3000u/g与内切酶枯草杆菌碱性蛋白酶(Alcalase 2.4L协同作用水解大豆蛋白可有效降低水解液苦味,并且由酿酒酵母对水解液进一步处理后,大豆蛋白水解液的苦味降至更低。 关键词:大豆蛋白水解液;脱苦;黑曲霉酸性蛋白酶;酿酒酵母 大豆蛋白是植物性食物中氨基酸组成比例最合理的蛋白质。通过水解大豆蛋白制成蛋白肽混合物可以提高大豆蛋白的加工性能、营养性以及生理保健功能。但水解后,原来处于蛋白质内部的疏水性氨基酸就会暴露出来,使水解产物呈现出一定的苦味,限制了水解产物的最终应用,因此必须将苦味消去。脱苦的主要方法有选择性分离法、掩盖法、膜分离法、和酶法。文献中报道的在大豆蛋白水解液中多采用活性炭吸附法或活性炭吸附法与包埋法结合法进行脱苦 [1~2], 但在脱苦过程中营养成分会有所损失。本文在制取大豆蛋白肽工艺中采用酶法和微生物法来脱除大豆蛋白水解液的苦味。 1 材料与方法 1.1 实验原料及药品 枯草杆菌(Alcalase 碱性蛋白酶 2.4L :食品级 (酶活力 2.4AU/g ,丹麦 NOVO 公司出品;
黑曲霉酸性蛋白酶:食品级 (酶活力 3000u/g,北京房山酶制剂厂出品; 大豆蛋白(含水量 7.35%,蛋白质含量 69.6% :市售; 酿酒酵母:大连理工大学生化实验室提供; 其它试剂为国产试剂。 1.2 实验仪器 精密酸度计:pHS-2型,上海雷磁仪器厂; 台式离心机:80-1型, 江苏省金坛市医疗仪器厂; 超级恒温水浴:501型,上海市实验仪器厂; 水夹套式三口玻璃发酵罐:250ml ,自加工; 磁力搅拌器:78-1型,国华电器有限公司。收稿日期:2003-10-29 作者简介:朱海峰(1970~ ,男,讲师,研究方向为生物酶催化 1.3 工艺流程 大豆蛋白→酶解→灭酶→离心→水解液→脱苦→脱色→ 浓缩→喷雾干燥 1.4 实验方法 1.4.1 酶解反应 将大豆蛋白在 105℃下干燥至恒重,称取一定量上述原料加入发酵罐 (置于磁力搅拌器上 , 按照设计的底物浓度向发酵罐中补适量自来水。连接发酵罐和超级恒温水浴,启动磁力搅拌器和超级恒温水浴,然后在搅拌下以一定方式加入蛋白酶(单酶或双酶进行水解。水解结束后,水解液经过高温灭活(95℃下加热 5min ,在 4000 r/min的条件下离心 10min ,取适量上清液供分析用,同时小心取出全部残渣经充分干燥后用于测定降解率 HR 。 HR 定义为:(底物投料量-剩余残渣量 /底物投料量。 1.4.2 蛋白质水解度(HD 测定 根据文献[3~5]介绍的甲醛滴定法测定。水解度的定义为在水解过程中打开的肽键占蛋白质肽键总数的百分比。
实验二雅致放射毛霉产蛋白酶培养基本的确定 1、种子培养基（实验老师准备4个100ml种子） 培养基组成： 100ml：豆粕粉3g，饴糖0.5g，酵母膏0.1g，MgSO40.2g，KH2PO40.2g。 高压灭菌锅，121℃，20min灭菌。灭菌操作完毕，将上述物品并洗耳球转入超净台，接种前20min进行紫外空气灭菌。 接种前4小时从冰箱取出1支菌种，在25℃条件下活化。在超净台内，以无菌生理盐水洗涤菌种斜面。孢子悬浮液以每瓶10ml的接种量，接入种子培养基。从超净台取出接好的种子三角瓶，转入摇床，在28℃、250rpm的条件下培养14～16小时，至种子瓶内呈粘稠浆糊状为止。 2、产酶培养基确定（学生确定，每组做三瓶，250ml三角瓶中装100ml培养基） 2.1培养基的配制，每班分六组，各组分别选择以下六种培养基配方： （1）基础培养基：（100ml）豆粕粉3g，蔗糖0.8g，酵母膏0.1g，MgSO4 0.36g，KH2PO4 0.12g，CaCl2 0.1g。（第一组） （2）第二组，将基础培养基中蔗糖按成等例葡萄糖； （3）第三组，将基础培养基中蔗糖按成等例马铃薯淀粉； （4）第四组，将基础培养基中去掉酵母膏； （5）第五组，将基础培养基中去掉豆粕粉，并将酵母膏添加量增至0.5％。 （6）第六组，将基础培养基中去掉MgSO4和CaCl2。 2.2培养基灭菌 高压灭菌锅，121℃，20min灭菌。冷却至室温，将上述物品并洗耳球转入超净台，接种前20min进行紫外空气灭菌。 2.3接种 冷却到室温开始接种，接种量10％，然后在在28℃、250rpm的条件下培养18小时，至发酵液颜色变深、澄清为止。 2.4蛋白酶活力测定 根据各组测定酶活结果，比较确定最适培养基组成。 （1）定义：1 g固体酶粉，在一定温度和pH值条件下，1 min水解酪素产生1 ug酪氨酸为一个酶活单位，以u/g表示。 （2）原理：蛋白酶在一定温度与pH条件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。根据吸光度计算其酶活力。 （3）试剂和溶液 ①三氯乙酸c（CCl3.COOH）=0.4 mol/L：称取三氯乙酸32.7 g，用水溶解并定容至500 mL ②磷酸缓冲溶液（pH=7.5）适用于中性蛋白酶：称取磷酸氢二纳（Na2HPO4·12H2O）3.01 g 和磷酸二氢纳（NaH2PO4·2H2O）0.25 g，加水溶解并定容至500 mL。 ③ 100 ug/mL L—酪氨酸标准溶液：
大米蛋白质的酶法水解及其性质研究注 王章存姚惠源 (江南大学食品学院,无锡214036) 摘要本文通过三种蛋白酶催化反应动力学特性的比较,确定用碱性蛋白酶Alcalase作为水解大米分离蛋白的酶制剂,并通过正交试验分别获得高溶解性、高发泡性、高乳化性大米蛋白水解物的酶反应条件。本实验所得到的大米蛋白水解物最大溶解度为50.2%,最大发泡力为50m L,最大乳化力为73.6mL/g。 关键词大米蛋白蛋白酶蛋白质水解 0前言 大米蛋白以其合理的氨基酸组成、较高的生物利用率及特有的低敏性等特点被视为优质蛋白质11-32。而在味精和淀粉生产中的大量副产品蛋白质未被充分利用,其主要原因是大米蛋白的水溶性较差,为此大米蛋白的开发利用被列入国家十五科技攻关课题。目前国内外对大米蛋白的提取多采用碱溶技术。作者认为对大米蛋白的开发利用宜首先获得高纯度大米蛋白,然后采用不同的改性方法使其适用于不同的用途。为此作者曾制备蛋白含量达90%的大米分离蛋白粉。当然该分离蛋白的物化功能尚不能满足食品加工的需要。为此本文探讨酶法水解大米分离蛋白(RPI)改善其物化功能性的技术措施。 1材料和方法 1.1材料 大米分离蛋白:由本实验室制备,蛋白质含量89.5%,粗灰分1.2%。 蛋白酶为诺维信公司产品,酶制剂品种是Pro-tamex,Alcalase和Neutrase(标示每g酶活力分别为1. 5,3.0和1.5安森单位)。 市售纯正花生油。 1.2试验方法 1.2.1三种蛋白酶的比较(复合酶Protamex、碱性酶 注:国家十五科技攻关项目 收稿日期:2003-03-11 王章存:男,1963年出生,博士研究生,副教授,粮油食品生物技术研究Alcalase、中性酶Neutrase) 配制5%的大米分离蛋白的悬浊液(pH值为7.0、7.5、7.0分别用于复合酶P(Protamex)、碱性酶A(A-l calase)和中性酶N(Neutrase)试验),酶的用量分别为0.1%(E/S),于50e下保温,每隔30min取样一次,沸水浴中灭酶3min,离心(1000r/min@5min)后,测定上清液中蛋白质含量。 1.2.2酶水解反应条件的优化 采用正交试验方法,以获得高溶解性、高发泡性、高乳化性的蛋白水解物为目的,考查的影响因子是蛋白浓度、酶添加量和反应时间。 每组试验结束后在45e以下真空浓缩和干燥。所得产物用于溶解、发泡和乳化性能指标的测定。1.2.3测定方法 蛋白质含量测定:采用Folin-酚试剂法142。 蛋白质溶解度:以上清液中蛋白质含量占反应体系中蛋白总量的百分比表示。 起泡性测定:取3g样品加50mL去离子水,用0.05mol/LNaOH或HCl调pH7后搅拌30min,再加去离子水至100mL作为测试液(水温为35e),于1000r/min转速下搅拌3min,立即测定泡沫体积。放置30min后测定下层析出液体的体积,以判断泡沫的稳定性。 乳化性测定152:取1%的蛋白质溶液50mL加入纯花生油,并用电导仪监测至电导率下降为零时停止加油,此时滴加花生油的总量即为该蛋白质样品的最大乳化量,以每g蛋白质乳化油的毫升数表示(mL/ g)。 2003年10月第18卷第5期 中国粮油学报 Journal of the Chinese Cereals and Oils Association Vol.18,No.5 Oct.2003
酶水解法应用于高淀粉含量食品中亚硝酸盐测定 ----样品前处理方法的探讨 [摘要]：针对GB 5009.33-2010《食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中，高淀粉含量样品在样品前处理时常因淀粉糊化导致过滤液含有可溶性淀粉而呈现浑浊，影响测定结果。文章通过采用α-淀粉酶温水水解样品后水浴加热提取亚硝酸盐作为前处理方法。排除滤液浑浊的干扰，旨在提高检测结果的准确度。结果表明：加标回收率为97.5%--99.1%，相对标准偏差（RSD）＜10.0%，结果准确，精密度高。 [关键词]：婴幼儿米粉；亚硝酸盐；α-淀粉酶 目前检测食品中亚硝酸盐的检验依据是GB 5009.33-2010 《食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》[1]，该标准第一法为离子色谱法，样品在经过沉淀蛋白质、除去脂肪后，再使用几种固相萃取柱（碳十八柱、银柱、钠柱）提取，这些萃取柱价格较高，使用中还需要固相萃取装置，在基层单位不容易开展。该标准第二法为分光光度法（亚硝酸盐采用盐酸萘乙二胺法），该法适用于腌腊肉类、酱卤肉类、腌菜类等食品，该标准第三法为乳及乳制品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定。 在实际工作中，各种肉制品和乳制品都能很好的采用相应的检验依据，得到良好的实验结果。但是当遇到婴幼儿米粉时，无论采用第二法或第三法测定，均不能得到透明的过滤液，在样品前处理的试验过程中发现在加入亚铁氰化钾与乙酸锌溶液后，沉淀不完全，过滤液中任然含有可溶性淀粉而呈现浑浊，严重影响测量结果。 文章通过采用α-淀粉酶温水水解样品后再水浴加热提取亚硝酸盐，作为
样品的前处理方法。
解决了在检测过程中由于过滤液浑浊进而影响比色的困扰，取得满意的结果。 1 试验部分 1. 1 原理 1.2仪器 7200 型分光光度计，上海尤尼柯。 1.3试剂 α-淀粉酶，亚硝酸钠标准溶液5μg/mL，饱和硼砂溶液: 50 g / L ; 乙酸锌溶液:220 g /L ; 亚铁氰化钾溶液: 106 g / L ;对氨基苯磺酸溶液：4 g/ L;盐酸萘乙二胺溶液: 2 g / L。 1.4 操作步骤 1.4.1样品处理 取样品10 g 于150 mL烧杯中, 加α-淀粉酶0. 2 g ,搅拌均匀, 加入约60度的蒸馏水100 mL, 再次搅拌均匀, 静置10~ 15 min, 加入50g/ L饱和硼砂溶液12. 5 mL, 将试样转移至250 mL 容量瓶中, 于沸水浴中加热15 min, 取出冷却后分别加入220 g / L 乙酸锌溶液5 mL, 106 g / L亚铁氰化钾溶液5 mL,加水至刻度, 摇匀, 放置30 min, 过滤, 滤液备用。同时做试剂空白。 1.4.2 测定 取25.00 mL样品处理液于50 mL具塞比色管中,另取0. 00, 0. 20, 0. 40,0. 60, 0. 80, 1. 00, 1. 50, 2. 00, 2. 50 mL亚硝酸钠标准溶液, 分别置于50 mL 具塞比色管中。于标准管与试验管中分别加入对氨基苯磺酸溶液2 mL, 混匀静置3 ~5 min, 再加入盐酸萘乙二胺溶液1mL, 加水至刻度, 混匀静置15 min, 用
实验一：从毛霉中提取蛋白酶及分离方案 组员：周云线周丽玲陆江妙 1 实验原理 毛霉又叫黑霉、长毛霉接合菌亚门接合菌纲毛霉目毛霉科真菌中的一个大属。以孢囊孢子和接合孢子繁殖菌丝无隔、多核、分枝状，在基物内外能广泛蔓延，无假根或匍匐菌丝，在高温、高湿度以及通风不良的条件下生长良好。毛霉常出现在酒药中，能糖化淀粉并能生成少量乙醇，产生蛋白酶，有分解大豆蛋白的能力，我国多用来做豆腐乳、豆豉。许多毛霉能产生草酸、乳酸、琥珀酸及甘油等，有的毛霉能产生脂肪酶、果胶酶、凝乳酶等。工业中利用其蛋白酶以酿制腐乳、豆豉等。皮革工业的脱毛和软化已大量利用蛋白酶，既节省时间，又改善劳动卫生条件。蛋白酶还可用于蚕丝脱胶、肉类嫩化、酒类澄清等。 酶活定义：在4 0℃， p H7.2条件下， 1分钟内水解酪蛋白产生 l微克酪氨酸所需的酶量为1个蛋白酶活力单位。蛋白酶水解络蛋白，其产物络氨酸能在碱性条件下使福林-酚试剂还原，生产钼蓝与钨蓝，在680nm下测定其吸光度，可求得蛋白酶活力。考马斯亮蓝是一种染料，在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色。蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收，其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。 蛋白质在水中的溶解度受到溶液中盐浓度的影响。一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶。而在盐浓度升高到一定浓度后，蛋白质的溶解度又随盐浓度的升高而降低，这种现象称为盐析。在蛋白质的盐析中，硫酸铵最为常用，这是由于硫酸铵在水中的溶解度最低而且温度系数小不影响酶活性，分离效果好。 2 仪器 恒温培养箱、振荡摇床、恒温振荡器、离心机、722分光光度计、pH计、恒温水浴锅 3培养基 斜面培养基PDA培养基：称取200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水1000mL 煮沸半个小时或高压蒸煮20分钟，纱布过滤，再加10-20g葡萄糖和17-20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，每试管约5-10mL（视试管大小而定），121℃）灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。 固体培养基：麸皮10g，水12mL，自然pH值，适量装入250mL三角瓶中，l2l℃灭菌30min后趁热及时摇散，备用。 液体培养基：蛋白胨20g、葡萄糖10g、氯化镁2g、磷酸二氢钾2g，250mL锥
毛霉是腐乳发酵生产的主要菌种，在腐乳生产工艺中其主要作用是分泌蛋白酶水解豆腐胚内的大豆蛋白。腐乳成品中的蛋白质主要是以多肽的形式存在的，具有相当高的水解程度，并且已经从中分离出多种具有生理活性的多肽[1-2]。而对众多腐乳产品的感官分析也表明，腐乳产品通常不具有一般蛋白水解物所特有的苦味。综合以上 结果来看，毛霉蛋白酶在解决大豆蛋白水解率低、水解物的苦味等难题方面具有很大的潜力。毛霉虽然在发酵工业中的应用有着悠久的历史，但是对这类菌种胞外蛋白酶系的研究却并未完全开展。仅有极少数学者对该菌种的发酵产酶特性及粗酶的催化、水解特性进行过探讨[3-5]。然而，毛霉由于长期受到高蛋白环境条件的驯化， Catalytic and kinetic properties of one protease from Mucor PAN Jin-quan (Life Science and Technology School,Zhanjiang Normal University,Zhanjiang 524048)Abstract:One protease was purified from extracellular of Actinomucor elegans AS3.2778and its catalytic and kinetic properties were also investigated.The results show that the purified protease was one alkaline serine protease,which has relatively higher activity at pH8.5～9.5and 60℃,and is stable at pH6.0~9.0at ＜45℃.At 40℃,the kinetics of casein hydrolysis by the protease fit the Mchaelis-Mentonequation:V=22.8S S+8.857,and the energy of activation (Ea)of this hydrolysis reaction below 45℃is 44.09kJ.The protease was unstable at 50℃,and the kinetics of deactivation fit the model:a=exp(－0.218t). Key words:Actinomucor elegans;protease;catalytic properties;kinetics 潘进权 (湛江师范学院生命科学与技术学院，湛江524048) 摘要：从雅致放射毛霉胞外分离纯化出一蛋白酶组分，以酪蛋白为底物对其催化特性及动力学 进行了分析。结果表明：该蛋白酶组分是一种碱性丝氨酸蛋白酶；在pH8.5～9.5、60℃具有最大催化活性，在pH6～9和低于45℃具有很好的稳定性；在40℃该蛋白酶水解酪蛋白的反应符合米氏方程：V=22.8S S+8.857；在4～45℃的范围内，该蛋白酶水解酪蛋白反应的活化能Ea 为44.09 kJ ；该蛋白酶在50℃不稳定，其热失活规律符合一级指数衰减动力学模型：a=exp(－0.218t)。关键词：雅致放射毛霉；蛋白酶；催化特性；动力学 中图分类号：TS 201.2 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2010)11-0036-05 毛霉蛋白酶的催化特性及 动力学研究 收稿日期：2010-03-13 基金项目：广东省自然科学基金项目(9452404801001943)。 作者简介：潘进权(1978—)，男，博士，讲师，主要从事酶与发酵工程相关领域的研究工作。 ·36 ·
毛霉制腐乳 1腐乳的发现 早在公元5世纪的北魏古籍中，就有关于腐乳生产工艺的记载“于豆腐加盐成熟后为腐乳”。 明李晔的《蓬栊夜话》亦云：“黟（移）县人喜于夏秋间醢腐，令变色生毛随拭之，俟稍干……” 千百年来，腐乳一直受到人们的喜爱。这是因为经过微生物的发酵，豆腐中的蛋白质被分解成小分子的肽和氨基酸，味道鲜美，易于消化吸收，而腐乳本身又便于保存。腐乳品种多样，如红豆腐乳、糟腐乳、醉方、玫瑰红腐乳、辣腐乳、臭腐乳、麻辣腐乳等。品种虽多，但酿造原理相同。 2制腐乳的原因——其意想不到的功用 发酵豆制品营养丰富，易于消化，在发酵过程中生成大量的低聚肽类，具有抗衰老、防癌症、降血脂、调节胰岛素等多种生理保健功能，对身体健康十分有利。 具有降低血液中胆固醇浓度、减少患冠心病危险的功能。发酵豆制品中含有丰富的苷元型异黄酮，它是大豆和豆腐中原有的异黄酮经发酵转化的，但比原有的异黄酮功能性更强，且更易吸收。60克豆豉、60克豆酱或100克腐乳就含有50毫克的高活性异黄酮，达到美国食品与药物管理局推荐预防冠心病的每日摄取量。 具有降血压功能。国外已经用大豆蛋白化学分解的办法生产降血压肽的保健食品，我们的实验发现中国的传统豆豉、腐乳就含有高活性的降血压肽。其实大豆在发酵时，微生物要首先把大豆蛋白分解为更小的分子，这就是所谓的肽。 具有预防骨质疏松症功能。发酵豆制品中的大豆异黄酮能提高成骨细胞活性，促进胰岛素样生长因子的产生，从而防止骨质疏松症。日本的营养调查发现：每天喝豆酱汤或吃发酵豆制品的人，骨质疏松症患病率明显降低，尤其是老人和妇女。 豆腐中含有的抗氧化成分，如维生素E、异黄酮等酚类物质，以及一些肽类，使豆腐具有清除自由基的能力，而经过发酵制得的腐乳清除自由基能力比豆腐高5～10倍，比番茄、葡萄等果蔬还高10多倍。 豆豉含有大量能溶解血栓的纳豆激酶，还富含一些能产生大量B族维生素和抗菌素的细菌，被称为是最有效的防治老年心血管疾病、保持血管健康的食品。 发酵豆制品具有防治老年性痴呆症的功效。人体产生的乙酰胆碱酯酶是分解神经末端传达物质的酶，现代医学认为它的存在与老年痴呆症发病有关。笔者在和日本专家的共同研究中发现，我国腐乳具有明显乙酰胆碱酯酶抑制活性。也就是说，发酵的腐乳，对防治老年性痴呆症有效。 3毛霉制腐乳 3.1原理 毛霉是一种丝状真菌，广泛分布于土壤、空气中，也常见于水果、蔬菜、各类淀粉食物、谷物上，引起霉腐变质。它的菌丝可分为直立菌丝和匍匐菌丝。繁殖方式为孢子生殖，新陈代谢类型为异养需氧型。应用于腐乳等发酵工艺。 毛霉在腐乳制作中的作用：在豆腐的发酵过程中，毛霉等微生物产生的蛋白酶能将豆腐的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸，脂肪酶可将脂肪水解为甘油和脂肪酸。 传统腐乳的生产中，豆腐块上生长的毛霉来自空气中的毛霉孢子，而现代的腐乳生产是在无菌条件下，将优良毛霉菌种直接接种在豆腐上，这样可以避免其他菌种的污染，保证产品质量。 豆腐乳是我国独特的传统发酵食品，是用豆腐发酵制成。民间老法生产豆腐乳均为自然发酵，现代酿造厂多采用蛋白酶活性高的鲁氏毛霉或根霉发酵。豆腐坯上接种毛霉，经过培
饲料研究FEED RESEARCH NO .6,2011 5 脂肪酶特性与应用 陈倩婷广州博仕奥集团 饲料资源不足一直是我国养殖业面临的一个大问题，在耕地和水资源严重紧缺的情况下，粮食产量很难提高。我国动物生产中饲料转化率低，猪、鸡和奶牛等的饲料转化率均比国际先进水平低0.3 %~0.6 %，使饲料资源不足的问题更加严峻。饲料用酶制剂的开发和应用极大的缓解了饲料资源的不足，酶制剂在饲料工业中的有效应用使得饲料工业和养殖业安全、高效、环保和可持续发展成为可能。 目前研究较多的饲用酶制剂有蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶、纤维素酶及植酸酶等。脂肪酶也是一种重要的酶制剂，它能够水解脂肪（三脂酰甘油或三酰甘油）为一酰甘油、二酰甘油和游离脂肪酸，最终产物是甘油和脂肪酸。 产物脂肪酸为动物体生长和繁殖提供能量，部分中链脂肪酸能抑制肠道有害微生物，改善肠道菌落环境，从而促进消化，起到类似抗生素的作用，脂肪酶在常温常压下反应，反应条件温和，转化率高，具有优良的立体选择性，不易产生副产物，避免因化学催化法而带来的有害物质，不会造成环境污染，因此，在食品、皮革、医药、饲料和洗涤剂等许多工业领域中均有广泛的应用。 1 脂肪酶的特性 1.1 脂肪酶的来源 脂肪酶按其来源主要分为3类：1）动物源性脂肪酶，如：猪和牛等胰脂肪酶提取物；2）植物源脂肪酶，如：蓖麻籽和油菜等；3）微生物源性脂肪酶。由于微生物种类多、繁殖快且易发生遗传变异，具有比动植物更广的作用pH、作用温度范围及底物专一性，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，所以，微生物脂肪酶是主要的研究对象。产微生物脂肪酶菌种的研究主要集中在真 菌包括，根霉、黑曲霉、镰孢霉、红曲霉、黄曲霉、毛霉、犁头霉、须霉、白地霉、核盘菌、青霉和木霉；其次是细菌，如：假单胞菌、枯草芽抱杆菌、大肠杆菌工程菌、无色杆菌、小球菌、发光杆菌、黏质赛氏杆菌、无色杆菌、非极端细菌和洋葱伯克霍尔德菌等；另外还有解酯假丝酵母和放线菌。1.2 特性1.2.1 催化特性 脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。其催化特性在于：在油水界面上其催化活力最大，溶于水的酶作用于不溶于水的底物，对均匀分散的或水溶性底物不作用，反应在2个彼此分离的完全不同的相的界面上进行。Macrae 等研究表明：在油水界面上油脂量决定脂肪酶活性，增加乳化剂量，可提高油水界面饱和度，从而提高脂肪酶活性，增加油水界面面积，可承载更多脂肪酶分子，也可增加催化反应速率。而在水体系中，大多数脂肪酶活性很低或没有活性。 由于脂肪酶在非均相体系中表现出的高催化活性，且在酶催化反应中不需要辅酶，所以可利用非水相中的脂肪酶催化完成各种有机合成及油脂改性反应，如：酯化、酸解、醇解、转酯、羟基化、甲基化、环氧化、氨解、酰基化、开环反应和聚合等反应。 1.2.2 底物特异性 不同来源脂肪酶对底物不同碳链长度和饱和度脂肪酸表现出不同反应性，圆弧青霉和金黄色葡萄球菌脂肪酶水解短链(低于C 8)脂肪酸所形成的三脂酰甘油，黑曲霉和根霉对中等长链(C 8~C 12)脂肪酸形成的三脂酰甘油有强烈特异性，猪葡萄球菌脂肪酶偏爱磷脂为底物，也可以水解脂肪酸链长短不一的各种油脂。解脂无色杆菌对饱和脂肪酸表现出 收稿日期：2011 - 05 - 09
实验五毛霉的扩大培养及腐乳制作 一、实验目的 （1）掌握豆腐乳发酵的工艺过程。 （2）观察豆腐乳发酵过程中的变化。 二、实验原理 豆腐坯上接种毛霉，经过培养繁殖，分泌蛋白酶、淀粉酶、谷氨酰胺酶等复杂酶系，在长时间后发酵中与腌坯调料中的酶系、酵母、细菌等协同作用，使腐乳坯蛋白质缓慢水解，生成多种氨基酸，加之由微生物代谢产生的各种有机酸与醇类作用生成酯，形成细腻、鲜香的豆腐乳特色。 三、实验材料 1 菌种 毛霉斜面菌种 2 材料 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、无菌水、豆腐坯、甜酒酿、白酒、黄酒、食盐。 3 仪器和器具 接种针、小刀、带盖广口玻瓶、显微镜、恒温培养箱。 四、实验方法 1. 孢子悬液制备 （1）毛霉菌种的扩繁。将毛霉菌种接入斜面培养基，于25℃培养，培养至菌丝和孢子生长旺盛，备用。 （2）孢子悬液制备。于上述斜面上加入少量无菌水，用接种环搅碎菌丝，供接种使用。 2. 接种孢子 用刀将豆腐坯划成块，然后把划块的豆腐坯均匀放在，块与块之间间隔2cm。将孢子悬液涂在豆腐坯上再用喷枪向豆腐块上喷洒孢子悬液，使每块豆腐周身沾上孢子悬液。 3. 培养与晾花 将放有接种豆腐坯的笼格放入培养箱中，于20℃左右下培养，并观察毛霉生长情况。44~48h后，菌丝顶端已长出孢子囊，腐乳坯上毛霉呈棉花絮状，菌丝下垂，白色菌丝已包围住豆腐坯，此时将笼格取出，使热量和水分用失，坯迅速冷却，其目的是增加酶的作用，并使霉味散发。 4. 装瓶与压坯 将冷至20℃以下的坯块上互相依连的菌丝分开，用手指轻轻地每块表面揩涂一遍，使豆腐坯上形成一层皮衣，装入玻璃瓶内，边揩涂边沿瓶壁呈同心圆方式一层一层向内侧放，摆满一层稍用手压平，撒一层食盐，使平均含盐量约为16%，如此一层层铺满瓶。下层食盐用量少，向上食盐逐层增多，腌制中盐分渗入毛坯，
酶水解法测定玉米中淀粉含量方法的探讨 刘海明，王旭艳 承德避暑山庄企业集团有限责任公司质检部，河北、承德067500 摘要：测定玉米中淀粉含量的方法很多，我们按GB/T5514－2008[1]标准用酶水解法对玉米中的淀粉含量进行测定，由于测定结果偏低、偏差较大，我们对此标准中的关键环节的条件进行了实验调整。并对实验中存在的问题进行了分析和探讨，对玉米淀粉含量的准确测定起到重要的作用，希望给同行的朋友带来帮助。 关键词：玉米淀粉含量酶水解 前言：玉米淀粉是淀粉的主要品种，占世界淀粉总量80%，广泛用于食品、制糖、发酵、医药和化工等，玉米淀粉主要在玉米胚乳中，由单一的葡萄糖分子脱水聚合而成的，葡萄糖分子以a-1,4一糖苷键,a-1,3一糖苷键、a-1,6一糖苷键链接而成的天然物质，质量分数在70%～80%之间，淀粉含量的测定方法有酸水解法，酶水解法和旋光法等，我们主要探讨一下酶水解法，依据是GB/T5514－2008标准方法，为保证淀粉含量测定的准确性，对标准中的相关环节进行了实验，对标准方法中存在的问题和不足之处一一分析，提出了问题的解决办法，为进一步完善本标准提出了建议。供大家商榷。 正文： 1 实验原理：试样经除去脂肪及可溶性糖类后，其中淀粉经淀粉酶水解成小分子糖，再用盐酸水解成还原性单糖，最后按GB/T5009.7测定还原糖，并折算成淀粉含量。 2 实验试剂（除非另有说明，均使用分析纯试剂）： 2.1 淀粉酶溶液:称取耐高温a-淀粉酶0.5 g，加100 mL水溶解，临用现配 2.2 碘溶液:称取 3.6 g碘化钾溶于20 mL水中，加人1.3 g碘，溶解后加水稀释至100 mL。 2.3 甲基红指示液:称取0.1 g甲基红用95%乙醇溶液定容至100mL 2.4 6mol/L盐酸:取浓盐酸100mL加水至200mL, 2.5 200g/L氢氧化钠溶液。 2.6 水:应符合GB/T 6682中三级水的要求。 2.7 碱性酒石酸铜甲液：称取15g硫酸铜(CU S04?5H2O)及0.050g 亚甲基蓝，溶于水中并定容至1000 mL.保存于棕色瓶中。 2.8 碱性酒石酸铜乙液：称取50 g 酒石酸钾钠和75 g 氢氧化钠，溶于水中，再加入4g亚铁氰化钾，完全溶解后，用水定容至1000 mL，贮存于橡胶塞玻璃瓶内. 2.9 葡萄糖标准溶液（1mg/mL）：称取1 g(精确至0.0001 g) 经过98－100℃干燥2h 的葡萄糖，加水溶解后加入5mL盐酸，并以水定容至1000 mL. 此溶液每毫升相当于1.0mg葡萄糖。 3 材料与方法 3.1 材料 3.1.1玉米：本单位收购的玉米，产地：东北和承德，种类：粉质和胶质玉米。 3.1.2酶制剂：酶活力为14万U/mL耐高温a一淀粉酶 3.2 实验仪器设备 3.2.1 粉碎机:粉碎样品，使其完全通过孔径0.45 mm(40目)筛。 3.2.2 回流冷凝装置: 接受瓶为250 mL 3.2.3 天平:分度值0.001g 3.2.4 三角瓶:150mL 3.2.5 容量瓶:250mL 3.2.6 分样筛：孔径0.45 mm(40目) 3.3 实验方法
大豆蛋白的组成 大豆, 蛋白 根据蛋白质的溶解性进行分类，大豆蛋白可分为两大类：清蛋白（非酸沉蛋 白）和球蛋白（酸沉蛋白）。 根据蛋白质分子大小，用超离心沉降法对水解浸出脱脂粕所得的蛋白进行测定，按溶液在离心机中沉降速度来分，可分为四个组分，即：2S，7S,11S，15S （S为沉降系数），每一组分是一些重量接近的分子混合物。如果将每一组分的蛋白质进一步分离，可以获得蛋白质单体或相类似的蛋白质。 主要成分是7S和11S，占全部蛋白质的70%以上。约有80%的蛋白质分子量在 10万以上。 （1）2S组分：低相对分子质量的2S组分含有胰蛋白酶抑制素、细胞色素C和两种局部检定的球蛋白等，在N-末端结合有天冬氨酸。这些低相对分子量的蛋白通常存在于乳清中，常常需要进行加热以消除不良作用而有利于消化。（2） 7S组分：7S组分有四种不同种类的蛋白质组成，即：血球凝集素、脂肪氧化酶、β-淀粉酶和7S球蛋白，其中7S球蛋白所占的比例最大。占7S组分 的1/3，占大豆蛋白总量的1/4。 7S球蛋白是一种糖蛋白，含糖量约为5%，其中3.8%甘露糖，1.2%的氨基葡萄糖。与11S球蛋白相比，色氨酸，蛋氨酸，胱氨酸含量略低，赖氨酸含量较高，因此7S蛋白更能代表大豆蛋白氨基酸的组成。 据分析，7S蛋白质是一个具有9个亚基的四元结构。7S多肽是紧密的折叠起来的，其中α-螺旋，β-折叠型和不定型绕圈装等亚基结构，分别占5%，35%和60%。在三级结构中，一个分子只有3个色氨酸残基侧链，全部处于分子表面，35个酪氨酸残基侧链几乎全部处于分子内部的疏水区；4个胱氨酸残基侧链中每2个结合在一起，形成-S-S-结合。 （3）11S组分：组分比较单一，到目前为止只发现一种11S球蛋白。 11S球蛋白也是一种糖蛋白，只不过糖的含量比7S少得多，只有0.8%。11S球蛋白含有较多的谷氨酸、天冬酰胺的残基以及少量的谷氨酸、色氨酸和胱氨酸，它的二级结构与7S球蛋白几乎没有什么区别。在三级结构中，一个分子有86个酪氨酸残基侧链和23个色氨酸残基侧链，，其中有34-37个酪氨酸、10个色氨酸处于立体结构的表面，其余的则处于立体分子的疏水区域。另外，在一个分子中，大约有44个胱氨酸残基侧链，其中一部分以-SH基形式存在，一 部分以-S-S-形式存在。 11S组分有一个特性，即冷沉性。脱脂大豆的水浸出蛋白液在0-2℃水中放置后，约有86%的11S组分沉淀出来，利用这一特征可分离浓缩11S组分。
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大豆分离蛋白酶法改性研究进展 作者：肖怀秋， 李玉珍， 兰立新， 李继睿， XIAO Huai-qiu， LI Yu-zhen， LAN Li-xin，LI Ji-rui 作者单位：湖南化工职业技术学院应用化学系,株洲市,412004 刊名： 酿酒 英文刊名：LIQUOR MAKING 年，卷(期)：2007,34(5) 参考文献(21条) 1.刘艳秋;陈光Protamex复合蛋白酶水解大豆分离蛋白的研究[期刊论文]-食品科学 2005(06) 2.Wendee ChiangD Function properties of soy protein hydrolysate producedfrom a continuous membrane reactor system 1999 3.Jin-Yeol Lee;Hyun Duck Lee;Cherl-Ho Lee Characterization of hy drolysatesproduced by mild-acid treatment and enzymatic hydrolysis of defatted soybean flour 2001(34) 4.Nakai s Sturcture-relationship of food proteins with and emphasis on the importance of protein hydrophobicity 1983(04) 5.S Petruccelli;M C Anon Relationship between the Method of Obtention and the Structural and FunctionalProperties of Soy Protein Isolates.l.Structural and Hydration properties 1994 6.赵国华;明建;陈宗道酶解大豆分离蛋白乳化特性的研究[期刊论文]-中国粮油学报 2002(02) 7.陶红;梁歧双酶水解降低大豆寡肤苦味研究[期刊论文]-食品工业科技 2003(zk) 8.张梅;周瑞宝;马智刚醇法大豆浓缩蛋白酶法改性研究[期刊论文]-中国油脂 2003(12) 9.M QI Solubility and Emulsifying Properties of Soy Protein Isolates Modified by Parcreatin[外文期刊] 1997(06) 10.Sook Y Kim Functional Properties of Proteolytic Emzyme Modified Soy Protein Isolate 1990 11.WU Wu Hydrophobicity,Solubility,and Emulsifying Properties of Soy Protein Peptides Prepared by Papain Modification and Ultrafiltration[外文期刊] 1998(07) 12.郭永;张春红大豆蛋白改性的研究现状及发展趋势[期刊论文]-粮油加工与食品机械 2003(07) 13.Zheng Guo;Anders F Vikbjerg;Xuebing Xu Enzymatic modification of phospholipids for functional applications and human nutrition[外文期刊] 2005(23) 14.刘欣;徐红华;李铁晶微生物蛋白酶改性大豆分离蛋白的研究进展[期刊论文]-大豆通报 2005(04) 15.潘进权;刘耘大豆多肽研究概况[期刊论文]-粮油加工与食品机械 2004(07) 16.Garcia M C Composition and Chracterization of soybean and related products 1997(04) 17.Katsumi Studies on the coagulation of soymilk-protein by commercial proteinase 1987 18.卢阳;王凤翼;孔繁东大豆蛋白酶水解物抗氧化性的研究[期刊论文]-大连轻工业学院学报 2001(04) 19.刘大川;杨国燕酶改性大豆分离蛋白的制备及产品功能性的研究[期刊论文]-中国油脂 2004(12) 20.高安全;姬学亮;张二琴大豆蛋白酶法改性研究[期刊论文]-开封大学学报 2004(03) 21.刘景顺;黄纪念;谭本刚大豆分离蛋白的改性研究 1997(04) 本文链接：https://www.doczj.com/doc/256161370.html,/Periodical_nj200705020.aspx