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酸性成纤维细胞生长因子应用于眼科
疾病的研究进展
董玉萍１。钱焕文２
（１北京武警总队第二医院，北京１０００３８；２军事医学科学院）
【关键词］酸性成纤维细胞生长因子；眼组织；视神经损伤
［中图分类号］Ｒ８５６．７７［文献标识码］Ａ［文章编号］１００２－２６６Ｘ（２００９）０８－０１１１－０３
酸性成纤维细胞生长因子（ａＦＧＦ）是一种具有多方面功能的活性蛋白，不但可以促进创伤修复，而且具有保护心肌、神经及局部缺Ｊ１ｉＬ等作用，在治疗帕金森氏综合症、急性脊柱扭曲性损伤等多种临床应用方厩具有巨大潜力。研究表明，ａＦＧＦ还对视觉系统的神经、组织、细胞有重要影响。本文就ａＦＧＦ及视神经保护、眼科疾病治疗中的应用作一综述。
１ａＦＧＦ特征
ａＦＧＦ最初由Ｔｈｏｍａｓ于１９８４年从牛脑中分离纯化得到，且在肾脏和脑组织含量最丰富。人的ａＦＧＦ基因位于第４号染色体上，为单拷贝基因，由两个大的内含子和ｉ个外显子组成。ａＦＧＦ蛋白由１５４个氨基酸残基组成，分子量约１５０００～１８０００Ｄａ，等电点５～７，呈酸性。其蛋白质的二级结构包括了１２条不平行Ｂ链组成的ｉ叶草结构。组成亚结构折叠单位的４条１３链，连结为稳定的统一体。ａＦＧＦ生物学特性与其多肽链序列中的多个功能区域有关，三维晶体结构测定ａＦＧＦ的主要功能区，包括肝素结合区、受体结合区和核转位区。这些结构区域与ａＦＧＦ的生物学特性密切相关。ａＦＧＦ通过激活ａＦＧＦ酪氨酸激酶受体（ａＦＧＦＲ），形成复合体行使生物学功能，这个过程需要肝素的参与。
１．１肝素结合区肝素结合区是碱性氨基酸的富集区，这些带正电荷的碱性残基很可能在与带负电荷的肝素结合中发挥作用。ＦＧＦ、肝素、ＦＧＦＲ胞外域的分子模型表明：１０～１２Ｂ折叠可能在ＦＧＦ与肝素一ＦＧＦＲ胞外域复合体的相互作用中扮演重要角色。甘氨酸盒（ＧＩＰＶＲＧ）决定了ａＦＧＦ与肝素硫酸盐一ＦＧＦＲ复合体结合的特异性…。１９９３年，Ｍａｒ－ｇａｌｉｔ建立了肝素与ａＦＧＦ的蛋白三维结构模型，认为人ａＦＧＦ的１２６．１３３位氨基酸序列在肝素与ａＦＧＦ的结合中起着决定性的作用。此外，２２．２７、１１３．１２０和１３６也是肝素结合的基本位点。肝素可增加ａＦＧＦ的稳定性，防止ａＦＧＦ被热、极端ｐＨ变性和蛋白酶所水解。
１．２受体结合区晶体结构分析发现，ａＦＧＦ与ＦＧＦＲＤ２作用位点位于三维结构中的１３１、Ｂ２／Ｂ２转角、１３３／ｐ４环、Ｂ９、１３１０／１３１１环、１３１２；与Ｄ３作用的位点位于Ｎ／１３ｓ和Ｎ端的５—９位氨基残基。
１．３核转位区Ｎ端２ｌ一２７位的Ａｓｎ—Ｔｙｒ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ—Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ序列对ａＦＧＦ的丝裂原活性十分重要，此序列被称为核定位序列（ＮＬＳ），也称为核转位区。删去该序列后ａＦＧＦ诱导ＤＮＡ合成和细胞增生的能力丧失，但仍能与ＦＧＦ受体结合并诱导受体介导的酪氨酸磷酸化和ｃ—ｌｏｓ蛋白的表达。
１。４作用机制ａＦＧＦ通过与ＦＧＦＲ结合，启动丝裂原活化蛋白激酶（ＭＡＰＫ）信号通路，可以刺激成纤维细胞、血管内皮细胞和神经细胞的生长。ＭＡＰＫ途径是调节各种细胞趋化应答、分化、分裂的重要途径，是细胞增殖、分化等信息传递途径的交集点和共同通路。Ｈａｄａｒｉ等悼’证实，ＦＲＳ２０作为ＦＧＦ信号传导中的中介物质，扮演了发挥ＦＧＦ功能过程中的一个至关重要的角色。位于ＦＲＳ２Ａｈ的酪氨酸磷酸化位点起着介导ＦＧＦ生物活性的作用。近来研究表明，ｎｍ—ｈａＦＧＦ可竞争取代ａＦＧＦ与ＮＩＨ３Ｔ３细胞膜上的ａＦＧＦ受体结合，但不改变细胞膜上ａＦＧＦ－受体的总结合位点数，对受体无阻断作用，证明ｎｍ．ｈａＦＧＦ仍与受体结合，ＭＡＰＫ信号通路并无中断。在无血清培养条件下，衰老的牛视网膜色素上皮细胞由于合成和分泌内源性ａＦＧＦ，使细胞凋亡降低，而细胞外信号调节激酶（ＥＲＫ）阻断剂、ａＦＧＦ抗体或ＦＧＦＲＩ抗体均可导致凋亡增加。ａＦＧＦ基因转染的ＲＰＥ细胞分泌ａＦＧＦ，可通过上调ＦＧＦＲｌ和ＥＲＫ２及ｂｃｌ．ｘ表达来抵抗无血清培养的ＲＰＥ细胞的凋亡。ａＦＧＦ保护凋亡的作用不依赖于其促有丝分裂活性，不仅如此，在蛋白改构后，Ｂｉｎ．ｈａＦＧＦ的抗凋亡能力还显著地增强，其机制可能是通过上调ｂｅｌ－２的蛋白水平和下调ｂａｘ的蛋白水平，从而抑制光感受器细胞发生凋亡Ｈ１。
２与眼组织关联
２．１ＦＧＦ与角膜ＦＧＦ在角膜中的分布依赖于ＦＧＦ的浓度、基膜的构成、细胞的通透性、局部所含肝素量等Ｈ１。角膜上皮对于ＦＧＦ在眼部的扩散仍是个屏障，去掉角膜上皮层，ＦＧＦ在眼中扩散较快。ＦＧＦ在眼组织的浓度有两个高峰，一是滴药后１０～３０ｍｉｎ在眼前段出现，二是滴药后８ｈ在眼前段再现，至４８ｈ消失。ＦＧＦ能促进角膜上皮细胞、内皮细胞以及基质细胞的增殖。储备在基膜和细胞外基质中的ＦＧＦ对角膜伤口的修复起着积极的作用，但同时由于其不断地释放，对角膜新生血管的形成也是一个不可忽视的诱因。因为ＦＧＦ对血管内皮细胞有明显的促增殖作用，可刺激角膜缘的血管向角膜基质中生长。另外，有报道，巨噬细胞能产生ＩＬ．Ｉ、ＴＮＦ．ｄ和ｂＦＧＦ，这就进一步说明当角膜有炎症浸润时，
１１１
万方数据
易导致角膜新生血管。
２．２ＦＧＦ与玻璃体Ｓｉｖａｌｉｎｇａｍ等”１收集３６例眼底病变玻璃体切割术后所得的玻璃体，其中包括１７例增殖性糖尿病视网膜病变（ＰＤＲ）、１０例视网膜脱离（ＲＤ）、５例黄斑皱襞和４例其他跟底病变，测定其玻璃体中ｂＦＧＦ的含量，浓度超过３０ｎｇ／ｍｌ的ＰＤＲ８例、ＲＤ２例、其他眼底病变１例，无一例黄斑皱襞。结果表明，在某砦眼底病变，尤其是增殖性视网膜病变与ＦＧＦ关系密切，即某些眼底病变导致ＦＧＦ水平升高，ＦＧＦ反过来又加剧眼底病变的发展。
２．３ＦＧＦ与视网膜ＦＧＦ在视网膜主要分布在色素上皮层、光感受细胞层、内外丛状层、神经纤维层。Ｂａｒｉｒｄ从牛视网膜中提取出ａＲＤＧＦ和ＤＲＤＧＦ，根据氨基酸顺序分析，ｃｔＲＤＧＦ与牛脑来源的ａＦＧＦ，ｐＲＤＧＦ与牛脑垂体来源的ｂＦＧＦｔ。分相似，而且二者分子量和生物活性基本相同。Ｄｅｊｕａｎ等∞１认为ＦＧＦ使视网膜毛细血管的内皮细胞摄入３Ｈ一胸苷增多，而且当视网膜缺血时会释放ＦＧＦ样生长因子。
３ａＦＧＦ与眼组织疾病
临床上一些眼组织疾病，如青光眼、高眼压和外伤性视神经病变等都是以视功能进行性下降为临床特征的常见致肓性眼病，可引起视神经的损伤；ａＦＧＦ可促进受损视神经的有效修复再生，从而发挥视神经保护作用。视神经损伤的最终结局是视网膜神经节细胞（ＲＧＣｓ）的死亡。研究结果表明，青光眼患者中ＲＧＣｓ的死亡方式是凋亡，高眼压或其他途径引起ＲＧＣｓ的轴索损伤使视神经纤维轴浆流中断，致神经营养因子的供给中断，从而导致ＲＧＣｓ溃变、凋亡。ＦＧＦ对神经细胞生长、增殖、再生及功能特性的表达均有重要调节作用，对ＲＧＣｓ有保护作用。
作为最早发现的成纤维细胞生长因子，国内外很多学者都开展了ａＦＧＦ对神经的保护功能的研究。ａＦＧＦ对中枢神经系统多种神经元有营养作用，在体内ａＦＧＦ能促进受损伤神经细胞的恢复，使其轴突生长，胞体增大。其作用机理有三方面：一是抑制神经细胞兴奋性氨基酸，尤其是谷氨酸的释放，减轻细胞毒性损害；二是稳定神经细胞膜Ｌ型钙通道，减少钙内流；三是ａＦＧＦ能刺激神经生长因子（ＮＧＦ）表达和分泌，发挥强烈的神经营养作用。视神经损伤后的修复和再生实际上就是中枢神经系统的修复和再生问题。Ｌｉｐｔｏｎ等¨¨将出生后的大鼠ＲＧＣｓ经过荧光素标记后进行培养，发现ａＦＧＦ联合肝素对轴突的起始和延长都有促进作用，提示ａＦＧＦ在神经元的生长过程起着有效的作用。Ｃｕｅｖａｓ等¨１以视网膜缺Ｉｆ｝Ｌ大鼠模型为研究对象，经全身给药ａＦＧＦ，组织学结果发现，接受ａＦＧＦ动物的ＲＧＣｓ和视网膜内核层细胞较对照组减少的数量少，提示在视网膜缺血时ａＦＧＦ可作为一个天然的保护因子。
胡世凤等一１研究表明，ａＦＧＦ和改构体ａＦＧＦ均对颈动脉窦神经末梢损伤有明显的保护作用，并具有一定的量效关系。Ｆｕ等¨驯实验证实，改构体和野生型ａＦＧＦ对大鼠缺血导致的肠上皮细胞损害有保护作用。改构型和野生型ａＦＧＦ均能有效地减轻肠道ＩＲ损伤造成的肠道通透性的改变和远】１２
山东医药２００９年第４９卷第８期
离器官（肝脏、肾脏和心脏）的损伤，加快了修复过程，进一步证明了ａＦＧＦ的促修复作用不依赖于其促分裂活性，而通过其非促分裂激素样活性和其他相关作用，启动信号转导机制而诱导多种细胞分化、增殖，具有营养和保护神经元，促进损伤修复，诱导缺血区廊管形成等多方面的作用析对肠缺ｆＩｉＬ一再灌注损伤后肝、肾损害起到保护作用。
４展望
ａＦＧＦ作为多种细胞的丝裂原，其多效性被用于临床时可能会引起意料之外的组织、细胞生长。ａＦＧＦ可以促进正常细胞，甚至肿瘤细胞的大母增殖，所以临床应用受到了较大限制，体内用药成为ａＦＧＦ临床应用的瓶颈，这也是ａＦＧＦ发现最早却至今未在临床得到广泛应用的原因。因此，ａＦＧＦ的临床使用在时间和空间上受到严格控制。而且，ａＦＧＦ的剂量一效应关系也不可忽视，一方面ａＦＧＦ剂虽增加町促进侧枝循环增加血液灌注，另一方面新生血管壁的高通透性可能因高浓度ａＦＧＦ与胞内其他因子协同作用，促成原生质组分穿过血管壁造成渗漏，要使ａＦＧＦ有效发挥作用必须使二者保持平衡。另外，要注意ａＦＧＦ治疗的稳定性和效果评价，以及体内各种因子的协同作用问题。通过尝试多种细胞因子的联合应用，将ａＦＧＦ的功能发挥到极致。
ａＦＧＦ基因改构的成功，使ｎｍ—ｈａＦＧＦ促细胞分裂活性基本消失，且初步实验证实ｎｍ—ｈａＦＧＦ对视网膜损伤有保护修复作用，为其在临床上的应用提供了可能。随着对ｎｍ－ｈａＦ－ＧＦ作用机制及用药方式的进一步研究，通过科学的实验动物和临床应用研究，相信它将会对人类眼组织疾病损伤修复作出重大贡献。
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（收稿日期：２００８—１１－０１）
急性脑梗死偏瘫早期康复训练的
疗效观察及护理
谢生转
（海南省人民医院，海南海１＝／５７０３１１）
脑卒中是危害人类健康的常见病，目前在我国城市居民死因中居首位，其致残率高。２００２年４月～２００８年６月，我们对６９例急性脑梗死偏瘫早期患者实施综合康复训练，取得了良好效果。
临床资料：选择我院收治的急性脑梗死偏瘫患者１０９例，其中语言功能障碍４８例，经头颅ＣＴ或ＭＲＩ确诊，瘫肢肌力０～１Ｉ级。所有患者分为两组，康复组６９例，男５７例、女１２例，年龄５２～８７岁、平均７２岁；对照组４０例，男３２例、女８例，年龄５４～８２岁、平均７ｌ岁。
方法：①心理护理：脑卒中常引起患者语言交流障碍和行走不便，使患者产生自卑、孤独、抑郁、急躁等心理表现，影响疾病的康复；护士应关心、同情患者，耐心细致地对患者进行健康教育，使其了解康复训练的方法、意义和效果，增强自信心，积极配合各项训练。②床上体位：ａ．仰卧位：患侧＾ｊ：肢稍外展，肘、腕关节伸直，掌心朝上，手指分开或握一毛巾，在患侧肩、髋、膝部的后方分别放一小枕或软垫，使这些部位稍垫起，膝关节微屈在患侧小腿下外侧垫一小枕，踝关节保持９００，足趾向上，以防肢体挛缩、关节僵硬、畸形。ｂ．健侧卧位：患侧上肢放于体前一软枕上，患肩向前屈约９０。，患侧－Ｆ肢稍屈髋、屈膝放于体前的软枕上，踝关节保持９０。，健侧上、下肢放在舒服的位置上，保持髋微伸和膝微屈。Ｃ．患侧卧位：患侧上肢充分向前伸，肩关节向前屈曲约９００，腕关节伸直，掌心朝七，手指分开，患侧Ｆ肢伸展，健侧上肢自然放在体侧，健侧下肢稍屈髋屈膝放于体前软枕上。③功能康复训练：两组早期均采用脱水剂、降低颅内、减轻脑水肿、改善脑细胞代谢、营养神经细胞、扩张脑血液等治疗后，康复组经观察生命体征平稳，神经系统症状不再发展２４ｈ后，即进行强化功能锻炼。ａ．痪侧上肢锻炼：依次外展、内收、内旋、外旋、上举、肘关节屈伸，前臂旋前、旋后；腕关节背伸，腕屈、内旋、外旋，指关节屈伸、内收、外展、拔伸等活动，２杉ｄ，每个关节活动５～１０遍。患者自我辅助训练，取仰卧位。双上肢伸直，双手＋指交叉握手并上举至头顶，反复练习此功能１０～１５遍。也可以向左、右方向摆动上肢。正确握手方式：双手掌心相对，十指交叉，患侧拇指在健侧拇指上方。ｂ．痪侧下肢锻炼：双手用力抬起瘫痪下肢，使髋关节内收、外展、内旋、外旋，然后握住患者小腿，双手用力使患者下肢屈膝、屈髋，最后活动踝关节，使其背屈、左右旋转等，２次／ｄ，每个关节活动５～ｌＯ遍。患者自我辅助训练，取仰卧位，屈髋屈膝，双足平放于床面，双下肢负覆，将臀部抬离床面１０一１５遍，如不能自己完成，可由家人帮助固定瘫侧肢体。Ｃ．加强健侧肢体活动：鼓励患者用健肢带动患肢作主动运动。对完全瘫痪者指导训练其对瘫肢进行意念运动，同时与按摩、针灸、理疗相结合。ｄ．日常生活、活动训练：强调患者使用患侧负重活动。ｅ．语言功能训练：早期让患者听收音机、录音带等，随着听觉语言的逐渐恢复，鼓励患者开口说话，扩士训练时要耐心，不要急于求成。训练由简到繁，由易到难，直至能自由交谈。对照组不按上述方法进行训练，但病情稳定后可在他人搀扶下下床活动，如站立、行走等，无强制措施。
结果：治疗２周后，康复组生活能完全自理者３０例，大部分能自理者３４例，大部分需协助者５例；而对照组分别为９、１９、９例，其生活不能自理者２例，语言功能恢复较好者３２例，其余均有不同程度的恢复，但对照组不如康复组。
讨论：脑卒中的康复治疗基于神经系统只有可塑性和功能重组原理，本文结果显示，治疗后康复组患者瘫肢肌力恢复较对照组快，提示早期康复训练对促进脑卒中患者神经功能恢复有积极有效的作用；对照组患者虽未行康复训练指导，但患者仍可在他人搀扶下下床活动，而这种锻炼只注重下肢却忽略了上肢，故下肢功能恢复比上肢好。
脑卒中早期康复是否得当，直接影响患者后期的康复效果及生存质量，静卧不能预防再发和解除其他危及生命的因素，还会使患者的精神和身体急速衰竭，早期开始康复治疗可及早解决患者的身心障碍。而护士在综合康复护理中是具体的实施者，应熟练掌握各种训练方法并综合应用，示范动作要正确，耐心指导。通过疏导、支持、鼓励，使患者尽快适应角色，由被动治疗模式变为积极主动配合康复锻炼，使各种功能得到最大程度的恢复，从而缩短住院日，减少并发症，降低至残率，对提高患者生存质量，减轻家庭和社会负担有着重要的意义。
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万方数据
碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）神经再生 1975年Gospodarowicz首先报道运用理化方法从牛的大脑和垂体中分离纯化出碱性成纤维细胞生长因子（Basic Fibroblast Growth Factor，bFGF）。80年代，bFGF的氨基酸序列得到澄清。90年代，国内外相继运用基因工程方法成功获得重组bFGF，有力推动了关于bFGF的研究。系列研究证实，bFGF能刺激和调节血管内皮细胞、上皮细胞、成肌细胞、成骨细胞和神经胶质细胞等多种起源于中胚层、神经外胚层的细胞分化增殖，在胚胎发育、组织愈合中起重要作用。神经方面，关于bFGF的研究集中在中枢神经，发现其神经活性广泛，能保护神经元，促进突起增生，提示在周围神经再生方面的研究意义。现参考近年来bFGF与神经再生的相关文献作一综述。 一、内源性bFGF正常情况下的表达和神经损伤后的变化 (一)中枢神经：正常情况下，内源性bFGF以微量分布于脑、垂体和下丘脑等器官，已证实星形胶质细胞、垂体滤泡及部分神经细胞能分泌bFGF，在海马皮质、中脑、纹状体和小脑颗粒细胞均有其受体。神经损伤后，早期就能观察到内源性bFGF表达增多，是神经损伤后早期反应之一。 叶诸榕用原代培养的大鼠大脑星形胶质细胞作成机械损伤模型，观察发现bFGF在损伤后2小时开始表达，12小时达高峰，2天后开始回落，星形胶质细胞胞体肥大，突起粗大。崔建忠运用Northern杂交、组织学方法动态观察大鼠颅脑弥漫性损伤后bFGF的基因表达和组织学改变，结果发现轻度损伤后12小时，重度损伤后4小时，bFGF基因表达增加，均于第3天达到高峰。Grothe〔1〕研究脊髓神经节bFGF及其Ⅰ型受体（FGFR-1)的表达时发现，正常情况下，bFGF和FGFR-1的mRNA在脊神经节均有表达，原位杂交显示星形胶质细胞产生bFGF，而感觉神经元表达FGFR-1，提示旁分泌作用；坐骨神经损伤后，L4～6感觉神经元bFGF的表达在1天内即上调，7天达高峰，28天后恢复，FGFR-1的变化则不明显。 (二)周围神经：Grothe〔1〕和Meisinger〔2〕1997年报道了bFGF及其受体在周围神经的表达和损伤后变化的研究结果，而此前该领域未见报道。该研究发现，正常情况下，大鼠坐骨神经FGFR-1 mRNA表达高于bFGF mRNA。坐骨神经损伤后，FGFR-1和bFGF的mRNA 在损伤远、近端均于不同的时相点上调，并有时间依赖性；bFGF的表达具有自身正反馈特点，且不影响FGFR-1。这一实验说明，与在中枢神经一致，内源性bFGF表达增多同样是外周神经损伤后的早期反应。 神经损伤后bFGF表达上调的意义是什么?不少学者将bFGF运用于神经细胞培养和神经损伤模型，发现bFGF具有广泛的促神经再生作用，提示bFGF表达增多是神经损伤后的修复反应，且可能具有始动意义。 二、外源性bFGF促进神经再生 (一)中枢神经 (1)离体试验：端礼荣在原代培养的大鼠胚胎中脑神经细胞中加入bFGF，观察发现细胞微团集落形成率明显增加，不同剂量的bFGF表现量效关系，图像分析见神经细胞突起增多，连接丰富呈网状。Miyagawa运用bFGF于原代培养的海马神经元轴突损伤模型，观察发现实验组较对照组轴突增生、突起增多。Himmelseher〔3〕进一步研究了不同浓度的bFGF对如上模型的作用，结果未用bFGF的对照组神经元存活65%，运用不同剂量bFGF的试验组神经元变性均减少，10 mg／L组存活神经元达85%，神经突起亦增多、增长。 由上述试验可见，bFGF能促进培养的神经细胞增生，神经细胞损伤后运用bFGF，变性死亡减少，神经突起增生，说明bFGF在体外具有促进、保护神经细胞的作用。Malgrane 〔4〕研究大鼠背根神经节神经元对神经毒性药物的反应时发现：bFGF不但能刺激轴突再
成纤维细胞的最新用途 一、自体成纤维细胞除皱整形技术的研究应用进展 1、培养的成纤维细胞去皱技术在整形外科上的应用 2005年Anon道在2002年ChelseWestminster医院用Isoagen治疗85％烧伤病人取得了被称为“接近奇迹”的效果。病人康复后说：“瘢痕的皮肤整个不再正常，但治疗后很多的活力回到了她脸上，朋友们见到她认为又回到了她自己，我不能想象有可能用任何其他的方法。” 2、作用原理： 注射培养的自体成纤维细胞制剂能促进软组织的强化作用和促进组织的再生用于除皱和软组织的缺陷，胶原蛋白的氨基酸组成和结构，具有组织细胞的支持功能，是构成皮肤的支架。胶原分子在成纤维细胞内合成并分泌到细胞外，在细胞内先合成多肽链，继之，3条前α链集聚，生成前胶原，即胶原分子的前体。前胶原分子分泌到细胞外间隙内以后受到限制性蛋白水解作用，消除分子的伸展肽而软化为胶原。在细胞外间隙内消除伸展肽后，胶原分子自发地排到成纤维。胶原交联后，纤维获得了所需的张力强度。注射培养的自体成纤维细胞制剂增加了皮肤成纤维细胞，促进胶原分子的合成、交联，使皮肤恢复弹性，皱纹消失。 二、成纤维细胞成骨作用的研究 1、成纤维细胞在骨折愈合中的成骨作用 成纤维细胞在骨缺损等特殊环境下同成骨细胞一起参与成骨过程。Chai
Parrasad]等通过电镜发现成纤维细胞分泌合成胶原纤丝,并在胶原纤丝内沉积钙盐结晶,在纵形排列的胶原纤丝内可以看到64 OA的周期带。软骨细胞合成分泌的是Ⅱ型胶原;而成纤维细胞及成骨细胞合成分泌的是Ⅰ型胶原,两种细胞合成分泌的Ⅰ型胶原,无论在形态上,还是在生化结构上是完全一样的。成纤维细胞形成基质小泡,并引起小泡内的钙盐沉积。钙化的基质小泡形成毛球状钙球,钙球合并融合成为骨组织。金大地在骨缺损修复的超微结构中发现了不同发育阶段的成纤维细胞的成骨现象。 2、作用原理： 在骨折愈合实验及成纤维细胞体外培养实验研究中均已被证实。成纤维细胞在骨折修复中不仅对早期形成的纤维骨痂起到固定作用;在以后阶段中,纤维骨痂中的成纤维细胞两种途径演变为骨组织,成为两种相互联系的细胞。体外培养成纤维细胞证实,成纤维细胞不仅能分泌胶原、软多糖等基质成份,在细胞胞浆内及培养液中, ALP活性检测均为阳性,且能分泌大量骨小结节。成纤维细胞的固有发生性只有在特殊环境特殊需要的条件下才能表现出来;一些成骨因子在成纤维细胞骨化过程中起到诱导作用。这就提示我们在骨诱导因子的作用下,成纤维细胞不仅参与骨折愈合,在病理状态下,这种具有游走性的成纤维细胞可能发生局部浸润及成为组织病理性钙化和骨化的原因之一。
1856年，实现红豆杉细胞培养生产紫杉醇的突破。 1885年，Roux温生理盐水培育鸡胚组织； 1887年，培养皿（英文：Petri dish）由在德国生物学家罗伯特·科赫手下工作的细菌学家朱利斯·理查德·佩特里（Julius Richard Petri，1852－1921）于1887年设计，故也称为“佩特里皿”。是一种用于细胞培养的实验室器皿，由一个平面圆盘状的底和一个盖组成，一般用玻璃或塑料制成。 1902年，植物细胞培养是在植物组织培养技术基础上发展起来的。1902年Haberlandt 确定了植物的单个细胞内存在其生命体的全部能力(全能性)，使成为植物组织培养的开端。 其后，为了实现分裂组织的无限生长，对外植体的选择及培养基等方面进行了探索。 1906年，Beebe和Ewing用盖片悬滴培养法，以动物血清做培养基，培养狗淋巴细胞存活了72 小时。现代细胞培养是从Harrison(1907)和Carrel(1912)两人开始的。Harrison参考前人经验，创建了盖片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法。 1907年，哈里森(Harrison)在无菌条件下用淋巴液作培养基，培养蛙胚神经组织存活数周，并观察到神经细胞突起的生长过程，由此创建了盖片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法，奠定了动物组织体外培养的基础。 1910-1912年，Carrel采用无菌操作、更新培养基、传代，完善了悬滴培养法； 1912年，Haberlandt的学生Kotte和美国的Robins在根尖培养中获得了组织培养的成功。Kotte采用了无机盐、葡萄糖、蛋白胨、天冬酰胺，及添加各种氨基酸的培养基。 1915年，昆虫细胞培养的鼻祖是德国人forhardBendict（1878—1958），发表了有关昆虫细胞培养的第一篇文章。 1923年，Carral设计创立了卡氏瓶培养法，用此法可根据需要随时更换培养液，既有利于组织不断生长，又可以运用不同种类的营养液培养不同的细胞，极大地推动了当时组织培养研究。 在培养基方面，Earle在1948年设计了含有碳酸氢钠等盐类的Earle氏盐溶液，Hank’s在1949年设计了Hank’s氏盐溶液。 Earle、Dulbecco等于1943年创建单层细胞培养法，首建长期传代的L-细胞系；1948年Sanford创建单细胞分离培养法，获L-细胞纯系。 1948年，体外细胞毒性试验细胞毒性实验它是利用体外细胞培养的方法，测定细胞溶解，抵制细胞生长的毒性作用来评价生物材料的潜在细胞毒性。 1948年，RosenBluth等首次报道利用鼠成纤维细胞培养来筛选聚合物，开始了细胞毒性试验评价生物材料的生物相容性的研究与应用工作。 1950年，Enders及其同事发表了第一篇关于在培养细胞中生长病毒的报告，开拓了以动物病毒为研究对象的新领域。作为大规模细胞培养，Copsik等人成功的进行了有关仓鼠肾细胞（BHK）的悬浮培养。
利用组织块可以成功地培养得到原代培养的人皮肤真皮成纤维细胞。培养中应该注意以下事项： ①一般皮肤主要取白手术过程中切除的部分组织，方法似外科取断层皮片手术操作，但组织一般2—3cm 即可，注意取材时不要用碘酒消毒．此外，不要切取太厚，要尽量去除皮下组织，如果皮下脂肪太厚会影响组织块的贴壁，不易于日后细胞的游出． ②尽量去除表皮，如有表皮未被完全剔除，则可能造成表皮细胞竞争生长，最为常见的为角质形成细胞的污染，它可以和成纤维细胞共同生长．虽说在今后的传代培养时可通过细胞纯化方法适当去除，但这种混和生长状态会对后续实验产生影响．所以，一旦发现细胞污染，应立即停止实验，重新培养． ③在剪切组织块时要注意保持组织块湿润，可向其表面滴加几滴培养液，要始终保持其成湿润状态，这一点要特别注意而且十分重要．剪切时要掌握好时间，尽量在短时间内完成． ④组织块在最初贴壁时不是很牢固，所以开始加液不应太多，以刚刚浸没组织块为易，特别要注意，在最初几天时要减少移动培养瓶次数，避免过多晃动而造成组织块脱壁，最好在开始3 d内不换液．⑤文献报告成纤维细胞培养多在CO 培养箱内进行，培养箱内环境为CO 浓度50 ml／L，湿度95％，培养瓶为开放式．因其湿度，温度及氧气与人体内实际情况较为接近，所以适合成纤维细胞的成长．但开放式培养的同时也增加了细胞培养污染的机率，所以，可以根据
自己实验室的条件选用合适的培养方法，如半开放式和充气后密闭瓶口，其效果也十分理想．但同时要密切观察培养液的pH变化，以保持适宜的酸碱度． ⑥细胞培养失败的最常见原因是污染，其中以微生物污染最常见，污染一旦明确，多数将无法救治，应尽快弃之，以防止污染扩大，影响其他细胞．因此，应在各个阶段严格遵守无菌操作原则，把好每一关口，尽可能禁止其他污染的物品进入操作环节，以避免造成时间、人力、物力的浪费．
幽丕医药呈塑竺生筮垒２鲞箜墨翅 酸性成纤维细胞生长因子应用于眼科 疾病的研究进展 董玉萍１。钱焕文２ （１北京武警总队第二医院，北京１０００３８；２军事医学科学院） 【关键词］酸性成纤维细胞生长因子；眼组织；视神经损伤 ［中图分类号］Ｒ８５６．７７［文献标识码］Ａ［文章编号］１００２－２６６Ｘ（２００９）０８－０１１１－０３ 酸性成纤维细胞生长因子（ａＦＧＦ）是一种具有多方面功能的活性蛋白，不但可以促进创伤修复，而且具有保护心肌、神经及局部缺Ｊ１ｉＬ等作用，在治疗帕金森氏综合症、急性脊柱扭曲性损伤等多种临床应用方厩具有巨大潜力。研究表明，ａＦＧＦ还对视觉系统的神经、组织、细胞有重要影响。本文就ａＦＧＦ及视神经保护、眼科疾病治疗中的应用作一综述。 １ａＦＧＦ特征 ａＦＧＦ最初由Ｔｈｏｍａｓ于１９８４年从牛脑中分离纯化得到，且在肾脏和脑组织含量最丰富。人的ａＦＧＦ基因位于第４号染色体上，为单拷贝基因，由两个大的内含子和ｉ个外显子组成。ａＦＧＦ蛋白由１５４个氨基酸残基组成，分子量约１５０００～１８０００Ｄａ，等电点５～７，呈酸性。其蛋白质的二级结构包括了１２条不平行Ｂ链组成的ｉ叶草结构。组成亚结构折叠单位的４条１３链，连结为稳定的统一体。ａＦＧＦ生物学特性与其多肽链序列中的多个功能区域有关，三维晶体结构测定ａＦＧＦ的主要功能区，包括肝素结合区、受体结合区和核转位区。这些结构区域与ａＦＧＦ的生物学特性密切相关。ａＦＧＦ通过激活ａＦＧＦ酪氨酸激酶受体（ａＦＧＦＲ），形成复合体行使生物学功能，这个过程需要肝素的参与。 １．１肝素结合区肝素结合区是碱性氨基酸的富集区，这些带正电荷的碱性残基很可能在与带负电荷的肝素结合中发挥作用。ＦＧＦ、肝素、ＦＧＦＲ胞外域的分子模型表明：１０～１２Ｂ折叠可能在ＦＧＦ与肝素一ＦＧＦＲ胞外域复合体的相互作用中扮演重要角色。甘氨酸盒（ＧＩＰＶＲＧ）决定了ａＦＧＦ与肝素硫酸盐一ＦＧＦＲ复合体结合的特异性…。１９９３年，Ｍａｒ－ｇａｌｉｔ建立了肝素与ａＦＧＦ的蛋白三维结构模型，认为人ａＦＧＦ的１２６．１３３位氨基酸序列在肝素与ａＦＧＦ的结合中起着决定性的作用。此外，２２．２７、１１３．１２０和１３６也是肝素结合的基本位点。肝素可增加ａＦＧＦ的稳定性，防止ａＦＧＦ被热、极端ｐＨ变性和蛋白酶所水解。 １．２受体结合区晶体结构分析发现，ａＦＧＦ与ＦＧＦＲＤ２作用位点位于三维结构中的１３１、Ｂ２／Ｂ２转角、１３３／ｐ４环、Ｂ９、１３１０／１３１１环、１３１２；与Ｄ３作用的位点位于Ｎ／１３ｓ和Ｎ端的５—９位氨基残基。 １．３核转位区Ｎ端２ｌ一２７位的Ａｓｎ—Ｔｙｒ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ—Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ序列对ａＦＧＦ的丝裂原活性十分重要，此序列被称为核定位序列（ＮＬＳ），也称为核转位区。删去该序列后ａＦＧＦ诱导ＤＮＡ合成和细胞增生的能力丧失，但仍能与ＦＧＦ受体结合并诱导受体介导的酪氨酸磷酸化和ｃ—ｌｏｓ蛋白的表达。 １。４作用机制ａＦＧＦ通过与ＦＧＦＲ结合，启动丝裂原活化蛋白激酶（ＭＡＰＫ）信号通路，可以刺激成纤维细胞、血管内皮细胞和神经细胞的生长。ＭＡＰＫ途径是调节各种细胞趋化应答、分化、分裂的重要途径，是细胞增殖、分化等信息传递途径的交集点和共同通路。Ｈａｄａｒｉ等悼’证实，ＦＲＳ２０作为ＦＧＦ信号传导中的中介物质，扮演了发挥ＦＧＦ功能过程中的一个至关重要的角色。位于ＦＲＳ２Ａｈ的酪氨酸磷酸化位点起着介导ＦＧＦ生物活性的作用。近来研究表明，ｎｍ—ｈａＦＧＦ可竞争取代ａＦＧＦ与ＮＩＨ３Ｔ３细胞膜上的ａＦＧＦ受体结合，但不改变细胞膜上ａＦＧＦ－受体的总结合位点数，对受体无阻断作用，证明ｎｍ．ｈａＦＧＦ仍与受体结合，ＭＡＰＫ信号通路并无中断。在无血清培养条件下，衰老的牛视网膜色素上皮细胞由于合成和分泌内源性ａＦＧＦ，使细胞凋亡降低，而细胞外信号调节激酶（ＥＲＫ）阻断剂、ａＦＧＦ抗体或ＦＧＦＲＩ抗体均可导致凋亡增加。ａＦＧＦ基因转染的ＲＰＥ细胞分泌ａＦＧＦ，可通过上调ＦＧＦＲｌ和ＥＲＫ２及ｂｃｌ．ｘ表达来抵抗无血清培养的ＲＰＥ细胞的凋亡。ａＦＧＦ保护凋亡的作用不依赖于其促有丝分裂活性，不仅如此，在蛋白改构后，Ｂｉｎ．ｈａＦＧＦ的抗凋亡能力还显著地增强，其机制可能是通过上调ｂｅｌ－２的蛋白水平和下调ｂａｘ的蛋白水平，从而抑制光感受器细胞发生凋亡Ｈ１。 ２与眼组织关联 ２．１ＦＧＦ与角膜ＦＧＦ在角膜中的分布依赖于ＦＧＦ的浓度、基膜的构成、细胞的通透性、局部所含肝素量等Ｈ１。角膜上皮对于ＦＧＦ在眼部的扩散仍是个屏障，去掉角膜上皮层，ＦＧＦ在眼中扩散较快。ＦＧＦ在眼组织的浓度有两个高峰，一是滴药后１０～３０ｍｉｎ在眼前段出现，二是滴药后８ｈ在眼前段再现，至４８ｈ消失。ＦＧＦ能促进角膜上皮细胞、内皮细胞以及基质细胞的增殖。储备在基膜和细胞外基质中的ＦＧＦ对角膜伤口的修复起着积极的作用，但同时由于其不断地释放，对角膜新生血管的形成也是一个不可忽视的诱因。因为ＦＧＦ对血管内皮细胞有明显的促增殖作用，可刺激角膜缘的血管向角膜基质中生长。另外，有报道，巨噬细胞能产生ＩＬ．Ｉ、ＴＮＦ．ｄ和ｂＦＧＦ，这就进一步说明当角膜有炎症浸润时， １１１ 万方数据
成纤维细胞的成骨作用 成纤维细胞经诱导可以形成骨组织，由于成纤维细胞直接参与了骨折愈合过程中纤维性骨痂的形成，其自身又具备被诱导成骨的能力，在体外大量培养扩增成纤维细胞，并施以有效的诱导因素(如上皮细胞、TNG-α和BMP等)使其具备成骨效能，然后与合适的生物材料载体复合，同时使该复合体在体外或体内保持良好的成骨能力并进行一定程度的成骨，则有望获得具有一定的生物力学支撑强度而成骨作用又保持活跃的“活骨”复合体，用以替代自体骨或异体骨回植体内治疗难以自身修复的较大的骨缺损，这无疑将为骨缺损的修复治疗开辟一条新的有辉煌前景的道路。 成纤维细胞修复受损心脏 美国研究人员通过对成纤维细胞进行重新编程，使其直接变成心肌细胞来修复受损的心脏。该方法一旦在人体试验中获得成功，再生的心肌组织将可用以修复因自然衰老和心脏停搏导致的损伤，同时还可避免干细胞疗法的安全隐患。该研究发表在《细胞》杂志上。 重组人类成纤维细胞生长因子 重组人类成纤维细胞生长因子研究具有非常重要的理论和实用意义，它有助于阐明分子水平的免疫调节机理，有助于疾病的预防、诊断和治疗，特别是利用基因工程技术生产的重组细胞因子已用于治疗肿瘤、感染、炎症、造血功能障碍等，并收到良好疗效，具有非常广阔的应用前景。 在炎症期，重组人类成纤维细胞生长因子对创伤细胞有明显的趋向活性，刺激成纤维细胞，血管内皮细胞等向创伤部位移动。当细胞迁移至损伤部位时，开始进入增殖和修复期，其中最关键的步骤之一是肉芽组织的形成，肉芽组织的本质是大量的毛细血管和丰富的成纤维细胞，重组人类成纤维细胞生长因子正是成纤维细胞、血管内皮细胞及血管平滑肌细胞的高效促生长剂，能够强烈促进新生毛细血管的形成，显著增加肉芽组织毛细血管数量和血液流量，改善创面微循环，为组织修复提供所必须的氧及丰富的营养物质；同时重组人类成纤维细胞生长因子对损伤组织部位神经纤维的再生也有显著的促进作用，加速损伤组织功能的恢复；成纤维细胞也是合成胶原的主要细胞，而胶原是肉芽组织中细胞间质的主要成份，重组人类成纤维细胞生长因子通过调控胶原的不断合成、分泌、改构和更新，而不断改善修复组织的结构和强度。
大规模细胞培养技术简介 大规模培养技术应用简介通过大规模体外培养技术培养哺乳类动物细胞是生产生物制品的有效方法。上世纪60-70 年代，就已创立了可用于大规模培养动物细胞的微载体培养系统和中空纤维细胞培养技术。近十数年来，由于人类对生长激素、干扰素、单克隆抗体、疫苗及白细胞介素等生物制品的需求猛增，以传统的生物化学技术从动物组织获取生物制品已远远不能满足这一需求。随着细胞培养的原理与方法日臻完善，动物细胞大规模培养技术趋于成熟。 所谓动物细胞大规模培养技术( large-scale culture technology )是指在人工条件下(设定ph、温度、溶氧等) ，在细胞培养工厂 (Cosmo Cat.No. 1101-400 or 1101-800 )或生物反应器( bioreactor )中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。目前可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、cho(中华仓鼠卵巢) 细胞、BHK-21( 仓鼠肾细胞)、Vero 细胞(非洲绿猴肾传代细胞，是贴壁依赖的成纤维细胞)等，并已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克隆抗体等产品。 在过去几十年来，该技术经有了很大发展，从使用转瓶(roller bottle) 、CellCube 等贴壁细胞培养，发展为一次性细胞培养工厂( Made by Cosmo )或生物反应器 (Bioreactor )进行大规模细胞培养。第一代细胞培养技术核心问题是难以产业化或者说是规模化生产：一是在工艺生产时不能大规模制备产品；二是非批量生产容易导致产品质量的不均一性；三是难以对同批生产进行生产和质量控制。 随着生物技术的发展，迫切需要大规模的细胞培养，特别是培养表达特异性蛋白的哺乳动物细胞，以便获得大量有用的细胞表达产物。采用玻璃瓶静置或旋转瓶的培养方法，已不能满足所需细胞数量及其分泌产物。因而必须为工业化生产开创一种新的技术方法。自70 年代以来，细胞培养用生物
实验-小鼠成纤维细胞的原代培养 一.实验目的 1. 掌握哺乳动物细胞原代培养与传代培养中的取材、消化及无菌操作等基本实验技术和操作过程。 2 ?熟悉在倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况的方法。 3?了解细胞原代培养与传代培养的原理和方法。 二.实验原理 自17世纪下半叶Robert Hooke提出"细胞”概念直至20世纪中叶，细胞培养(CeIl CUltUre )才逐渐发展起来。现代生命科学以及相关领域的研究前提是细胞的维持和增殖，因此，细胞培养不仅是细胞生物学的密不可分的组成部分，而且已经成为生物化学、生物物 理学、遗传学、免疫学、肿瘤学、生理学、分子生物学和神经科学、甚至临床医学的重要内容。细胞培养也是细胞生物学延伸至相关学科的一条主要途径。 如今，细胞培养已经成为生命科学和医学研究最常用的基础技术之一。 细胞培养是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下，使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。细胞培养的直接目的是维持或扩增细胞数量。依据取材于动物组织或培养细胞，细胞培养分为原代培养和传 代培养。 1 .原代培养(Primary CUItUre )是从供体取得组织或细胞后在体外进行首次培养直至成功地进行首次传代之前的培养。但实际上通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。原代培养是建立细胞系的第一步，其最基本的方法有两种：组织块培养法和消化 培养法。 组织块培养法是指直接从机体取下组织和器官，通过组织块直接长出单层细胞，该培养法是最常用的原代培养方法，其将刚刚离体的、生长活力旺盛的组织剪成小块接种在培养瓶 中作为实验材料，一天后细胞可从贴壁的组织块四周游出并生长。组织块培养法操作过程简 便、易行，培养的细胞较易存活，适用于一些来源有限、数量较少的组织的原代培养。 消化培养法利用酶或机械方法将组织分散成单个细胞后，在不加任何粘附剂的情况下，直接移植在培养瓶壁上，加入培养基立即进行培养的方法。该方法主要使用生物化学手段将 较小体积的动物组织中妨碍细胞生长的间质加以分解、消化，使组织中结合紧密的细胞连接 松散、相互分离，细胞失去与间质的连接，活细胞从组织中释放出来形成含单细胞或细胞团的悬液，分散的细胞易与外界进行新陈代谢互动，在短时间内即可贴壁生长成片。胰蛋白酶
鸡胚成纤维细胞培养 1、准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、 75%酒精擦拭手至肘部。 2、布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3、选胚：取9-10日龄鸡胚，（注：鸡胚日龄越小，形成细胞活力越好，但产量较低）用新 洁尔灭消毒蛋壳10分钟后放净化台。用碘酒、酒精消毒蛋壳。用镊子打开气室。 4、用另一套镊子将壳膜打开将鸡胚夹起去头、爪、眼，放灭菌生理盐水中。 5、把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先 置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 6、剪切：用眼科剪把组织切成1~2毫米大小的块，以便于消化。 7、处理组织：将已剪碎的组织碎片倒入一个带玻璃珠的灭菌三角瓶中，其中加入0.25%的 胰酶，10个胚约7ml，或加组织消化液，一个胚1ml（组织消化液以及胰酶的配置见微生物指导）结扎瓶口或塞以胶塞。 8、消化：将其置入37℃水浴箱中或用恒温水浴，消化中应不停摇动，如用电磁恒温搅拌器 消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。消化10－15分钟。一般约12分钟。视鸡胚日龄大小而定。越小消化时间越短。见组织松软即可。一般不可消化时间太长否则容易导致细胞活力不足。 9、分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织 已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，加入0.5％的含5％犊牛血清双抗的的水解乳蛋白Hank，s液少许。（制法见微生物试验实习指导），用力震摇，或用吸管吹打。 使细胞分散，脱落。然后用纱布过滤或随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清（可以不离心吸掉上清），加入适量含有血清的培养液。 10、计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培 养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。分装在细胞培养瓶中。视细胞多少而定加入培养基。 培养基为0.5％的含5％犊牛血清双抗的的水解乳蛋白Hank，s液. 11、将其置入co2细胞培养箱中，37度。瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易 生霉菌，每次换液时需要换新塞。培养24小时进行观察。一般在24－48小时可形成单层细胞。 传代 1. 倾倒培养瓶内旧培养液。 2. 向瓶内加入胰蛋白酶和EDTA混合液少许，以能覆满瓶底为限。 3. 置温箱中2~5分钟，当发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，立即终止消化。 4. 吸除消化液，向瓶内注入Hanks液数毫升，轻轻转动培养瓶，把残余消化液冲掉。注意加Hanks液冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松动的细胞冲掉流失，如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用Hanks液冲洗，直接加入培养液。 5. 用吸管吸取营养液轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。 6. 计数板计数后，把细胞悬液分成等份分装入数个培养瓶中，置温箱中培养。
随着生物学，特别是分子生物学技术的发展，给美容化妆品行业带来了全新的发展机遇，护肤品已经从精细化工美容、植物美容向生物美容、基因美容发展。作为生物护肤品的主要成分生物活性多肽大部分是细胞生长因子，它们在体内含量极微，但生物活性极高，对多种细胞生理功能和代谢活动发挥生物调节作用，直接或间接地影响多种类型细胞的生长、分裂、分化、增殖和迁移，在美容护肤、整形外科、烧伤溃疡以及各种皮肤病的伤口修复与愈合中有重要作用。 1．生物活性多肽的生物学效应 添加到美容护肤品中的各种生物活性多肽，都是与存在于靶细胞上的特异受体相结合而发挥作用，其主要生物学效应为：趋化诱导炎症细胞，刺激靶细胞增殖和分化，促使靶细胞合成分泌细胞外基质如胶原等。生物活性多肽对胚胎发育、组织再生以及创伤愈合的作用远不止促进细胞分裂和分化作用，还涉及到生物活性物质的合成和分泌、免疫应答，甚至在细胞生长的抑制方面也起重要作用。近年来的研究发现，多种活性多肽在体内皆可诱导血管形成，它们可直接与上皮细胞膜表面特异性受体结合而刺激血管上皮游走和有丝分裂，也可间接通过巨噬细胞介导分泌活性物质促进内皮细胞复制和趋化游走，诱导血管增生。 生物活性多肽具有调节t细胞、b细胞、组织细胞、郎格罕氏细胞和真皮树突的形成、发育、代谢等功能，并影响它们的迁移和生长速率。同时也刺激结缔组织、角化细胞、成纤维细胞和巨噬细胞等分泌细胞因子、淋巴因子、血清蛋白、胞外蛋白和基质多糖。在胚胎发育期，活性多肽通过调节相同或不同类型细胞的活动而参与组织器官形成的调节；对于发育成熟的组织器官，创伤后引发的器官受损、功能削弱，或由于缺少促生长多肽而引起的细胞活力减弱及衰老，活性多肽有显著的修复重建功能。 2．与皮肤有关的生物活性多肽 到目前为止，研究发现的生物活性多肽有几十种，其中有不少已被添加到美容护肤品中，与美容护肤及皮肤软组织损伤修复关系密切的主要有： 成纤维细胞生长因子(fgf)：包括酸性 (afgf)和碱性 (bfgf)两种。酸性成纤维细胞生长因子(afgf)属于成纤维细胞生长因子(fgf)家族的成员，是一种多功能的细胞生长因子，对中胚层来源的多种细胞有营养和促分裂、分化作用。上皮细胞、真皮细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、神经细胞、成肌细胞、成骨细胞等均有afgf的受体，afgf对这些细胞都可以发挥作用。来源于中胚层和神经外胚层的多功能细胞因子，是作用极强的有丝分裂原，对血管内皮细胞、成纤维细胞、成肌细胞、造骨细胞等都有促分裂作用，并通过其趋化作用和促细胞迁移作用使巨噬细胞、间充质细胞、内皮细胞、成纤维细胞等向创伤部位聚集，启动创伤愈合过程；修复肽直接作用于受损的细胞组织，能促进成纤维细胞生长，促进胶原细胞、角质细胞分裂、增殖，使皮肤深层损伤组织迅速修复，加速伤口愈合，对皮肤组织的各种创伤（包括晒后紫外线灼伤，痤疮，换肤后的脱皮、发红，果酸等导致的皮肤灼伤及磨削后深层肌肤损伤等）的修复具有突出的效果。同时，生物活性肽(afgf)在延缓皮肤衰老及提供皮肤养分、促进皮肤细胞新生、消除皮肤皱纹等方面有着重要的作用。另外，生物活性肽还可以调节细胞分泌，高效为肌体提供营养，提高肌体免疫力，补充肌肤养分供应，在皮肤受到外界刺激时，自动释放激活人体防御系统，抑制黑色素生成，控制油脂分泌，在使肌肤细胞维持正常状态、保持肌肤活力等方面起着重大作用。
成纤维细胞生长因子及其与受体作用机制 的研究进展1 姜媛媛，任桂萍，王文飞，郝建权，李德山 东北农业大学生命科学学院生物制药教研室，哈尔滨（150030） E-mail：deshanli@https://www.doczj.com/doc/254963802.html, 摘要：成纤维细胞生长因子(FGF)是一类多肽类物质，其中大多数成员可与肝素结合发挥作用。目前已知FGF至少包括23个因子，即FGF1～23。部分FGF家族成员N末端有大约3O个氨基酸残基组成的典型信号肽序列，可以分泌到细胞外。FGF家族成员是一类生理功能较广泛的生长因子，功能包括促进细胞有丝分裂、趋化与血管生成、促进中胚层和神经外胚层细胞的存活与生长等。本文根据最近的研究成果对 FGF因子及其受体研究进展做一综述，并主要对FGF因子特征及其研究趋势进行了探讨。 关键词：FGF，FGF受体，肝素 中图分类号:Q74 引言： 成纤维细胞生长因子最早是从脑和垂体的提取液中发现的，该物质是一种能促进成纤维细胞生长的多肽类活性物质，可以通过与细胞膜特异性受体结合对细胞生长进行调节。从70年代中期到目前已进行了大量广泛的研究，目前已知FGF至少包括23个因子，它们在一级氨基酸序列上有一定的同源性，并有类似的生物学功能，且广泛存在于体内多种组织中。FGF对中胚层和神经外胚层来源的细胞具有十分明显的促细胞分裂增殖作用，并且在机体内的胚胎发育、细胞生长分化、创伤组织愈合及肿瘤发生发展中起着十分重要的作用。 1. 成纤维细胞生长因子（FGF）家族 成纤维生长因子（Fibroblast growth factor, FGF）又被称为肝素亲和生长因子(Heparin binding growth factor, HBGF)，是一类通过与细胞膜特异性受体结合发挥作用的多肽分子。现已知FGF家族至少包括23个成员，即FGF1～FGF23。FGF家族成员之间的氨基酸序列同源性约为25%～50%，其每个成员都有140个氨基酸的中轴，该中轴在不同的成员中有高度的同源性。结构分析表明，此中轴折叠成12条逆向平行的β链，它们又进一步形成圆柱状的结构。部分FGF家族成员N末端有大约3O个氨基酸残基组成的典型信号肽序列，使得它们可通过内质网一高尔基复合体的经典(即自分泌和旁分泌)途径被分泌到细胞外，但其中也有部分FGF则因本身缺乏信号肽结构，不能向外分泌，只能在细胞受损时释放[1]。多数FGF（如FGF3～8、10、15、17～19、21～23）的N末端具有典型的信号肽序列。而FGF16和FGF20虽然没有明确的信号肽序列却也能高效地分泌到细胞外[12]。FGF1 和FGF2也缺乏信号肽序列和正常的分泌途径，却也能出现在胞外基质，推测两者可能来自受伤的细胞，或者通过与内质网-高尔基体通路不同的细胞脱颗粒机制释放至胞外的。此外，FGF 11～14没有典型的信号肽序列，因此认为这些FGF是在胞内发挥作用[13]。由于FGF家族成员之间的氨基酸序列有25％～50％的同源性，分子结构有一定的共性，故FGF不同分子之间的生物学效应既有相似性，又有各自的特点[1-3]。 FGF1(aFGF)和FGF2(bFGF)是最先被发现，也是迄今为止研究最充分的两个成员，因其1本课题得到黑龙江省科技厅重点攻关项目（编号：2006G0461-00）的资助。
成纤维型细胞：在培养中的细胞凡形态与成纤维细胞类似时，皆可称之为成纤维细胞。本型细胞由形态与体内成纤维细胞的形态相似而得名，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞中央有卵园形核，胞质向外伸出2-3 厘米个 长短不同的突起，除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间质起源的组织细胞常呈本类形态生长。 培养细胞的纯化 【我是小米2】培养细胞的纯化： 1、自然纯化 即利用某一种类细胞的增殖优势，而排挤其他细胞生长，靠自然的增值潜力最后留下生长优势细胞，去除其他细胞。有些恶性肿瘤细胞可以通过此方法，自然纯化建立细胞系。 2、人工纯化 （1）酶消化法 在消化培养细胞时，常是成纤维细胞先脱壁，而上皮细胞要消化相当长的时间才脱壁，特别是在原代培养和培养早期这种差别尤为明显，因而可以利用这种差异采用多次差别消化方法将上皮细胞和成纤维细胞分开。 （2）机械划除法 原代培养成功后，上皮细胞和成纤维细胞所数都同时出现，混杂生长。这种混杂生长常常分区成片，每种细胞都以小片或区域性分布的方式生长在瓶壁上。因此可以采用机械的方法去除不需要的细胞。 （3）反复贴壁法 成纤维细胞与上皮细胞相比，其贴壁过程快，大部分细胞常能在短时间内大约 10－30min完成附着过程，而上皮细胞大部分在短时间内不能附着或附着不稳定，稍加振荡即浮起，这样可以利用此差别来纯化细胞。 （4）克隆法 采用细胞克隆法将细胞分成单个细胞，使之分别生长成克隆，选择出所需要的克隆。 （5）培养及限定方法 某些细胞在生长过程中必须存在或必须去除某种物质，否则无法生长，可以利用这种技术来纯化细胞。
（6）流式分选 brdu 【sxtyzyq2】除了Brdu能用于抑制成纤维细胞的生长，便宜易买到的 【snany】阿糖孢苷效果不是特别理想 【cl1202】我在SD大鼠胃粘膜壁细胞原代培养的文献中看到的：成纤维细胞大量生长是壁细胞分离培养失败的常见原因。培养基中加入血清会刺激成纤维细胞而抑制壁细胞生长，对壁细胞可能还有一定的毒性作用。为了减少成纤维细胞的生长，先加入含有胎牛血清（100ml/L）的培养液，时差贴壁30-45分钟，除去成纤维细胞，然后再换用无血清的培养液进行培养。不知道你有没有用？试试吧。 【sxtyzyq2】买sigma公司的brdu然后把它配成终浓度为1 mmol/l然后1ml 培养液中加入5微升就可抑制成纤维细胞 【gfeng8078】我是养心肌原代，也需要抑制成纤维细胞，请问各位大侠，5-brdu 用多大的浓度？ 【cheerfulness】养心肌原代最初24h培养液中加入终浓度为0.1mmol/L的brdu 【gfeng8078】你是怎么样达到0.1mmol/L的浓度呀，由于有培养液的存在，加了Brdu进去，自然就稀释了？我想把Brdu溶解于DMEM中然后一起抽滤，可是有报道说这对Brdu的药效有影响 【jiangbin1230】请问用组织块贴壁法能培养出肠的成纤维细胞吗？我试过很多次了，一个皿就只有零散的一二十个成纤维细胞，都是柱状上皮细胞，是否由于正常组织太少不能培养出啊？能帮帮忙吗？ 【sdf771214】请问成纤维细胞的帖壁时间一般是多少?我养的是内皮细胞,如何时差帖壁啊? 【victoh】不同来源的成纤维细胞在不同培养支撑介质上的贴壁时间应该是不一样的，此外也还受到其他一些因素的影响，至于上皮细胞，其本身种类就更加复杂了 上皮细胞 【warmbull】我现在正在做的培养，但发现有几瓶细胞可能是被成纤维细胞（长梭形、透明细胞）污染了，后来成纤维细胞抑制了色素上皮细胞的生长。现在又出现了这种情况，请问各位大侠，有什么办法可以除去杂细胞？还有，我养的色素上皮细胞生长增殖很缓慢，有的甚至慢慢萎缩，会是什么原因呢？
细胞生物学实验报告 细胞原代培养 姓名： 学号： 班级： 专业： 同组成员： 一、实验原理
细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养。由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。同时也为以后传代培养创造条件。 原代培养的方法： 1、组织块法在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。用Hanks 液洗涤2—3次，自然沉淀。用吸管吸去上清液。将组织块贴于培养瓶进行培养。 2、酶消化法将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的%的胰蛋白酶。370C磁棒搅拌消化20－30分钟。然后终止消化。用几层无菌纱布过滤。取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养。 取材注意事项： 取材要注意新鲜和保鲜。取材应严格无菌。取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。 二、实验目的 1、理解细胞原代培养原理 2、熟悉细胞原代培养方法与过程 3、了解细胞原代培养的应用 4、独立进行细胞原代培养操作 三、实验材料 手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶、试管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯。 动物：9-12日龄的鸡胚蛋 四、实验步骤
人酸性成纤维细胞生长因子1(aFGF-1)酶联免疫酶联免疫分析分析分析 试剂试剂盒使用说明书盒使用说明书盒使用说明书 本试剂盒仅供研究使用。 检测范围检测范围：： 96T 1.5pg/ml-40pg/ml 使用目的使用目的：： 本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中酸性成纤维细胞生长因子1(aFGF-1)含量。 实验原理 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人酸性成纤维细胞生长因子1(aFGF-1)水平。用纯化的人酸性成纤维细胞生长因子1(aFGF-1)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入酸性成纤维细胞生长因子1(aFGF-1)，再与HRP 标记的酸性成纤维细胞生长因子1(aFGF-1)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB 显色。TMB 在HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的酸性成纤维细胞生长因子1(aFGF-1)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中人酸性成纤维细胞生长因子1(aFGF-1)浓度。 试剂盒组成 1 30倍浓缩洗涤液 20ml ×1瓶 7 终止液 6ml ×1瓶 2 酶标试剂 6ml ×1瓶 8 标准品（80pg/ml ） 0.5ml ×1瓶 3 酶标包被板 12孔×8条 9 标准品稀释液 1.5ml ×1瓶 4 样品稀释液 6ml ×1瓶 10 说明书 1份 5 显色剂A 液 6ml ×1瓶 11 封板膜 2张 6 显色剂B 液 6ml ×1/瓶 12 密封袋 1个 标本标本要求要求 1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融 2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP ）活性。 操作步骤 1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀 释。 40pg/ml 5号标准品 150μl 的原倍标准品加入150μl 标准品稀释液 20pg/ml 4号标准品 150μl 的5号标准品加入150μl 标准品稀释液 10pg/ml 3号标准品 150μl 的4号标准品加入150μl 标准品稀释液 5pg/ml 2号标准品 150μl 的3号标准品加入150μl 标准品稀释液 2.5pg/ml 1号标准品 150μl 的2号标准品加入150μl 标准品稀释液
成纤维细胞 科技名词定义 中文名称：成纤维细胞 英文名称：fibroblast 定义： 普遍存在于结缔组织中的一种中胚层来源的细胞。分泌前胶原、纤连蛋白和胶 原酶等细胞外基质成分，伤口愈合过程中可迁移到伤口进行增殖。 所属学科：细胞生物学（一级学科）；总论（二级学科） 本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 百科名片 疏松结缔组织中的成纤维细胞 成纤维细胞（fibroblast）是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的 间充质细胞(mesenchymalcell) 分化而来。成纤维细胞较大，轮廓清楚， 多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，其细胞核呈规则的卵圆形，核仁
大而明显。根据不同功能活动状态，可将细胞划分成成纤维细胞和纤维细胞，成纤维细胞功能活动旺盛，细胞质弱嗜碱性，具明显的蛋白质合成 和分泌活动，在一定条件下，它可以实现跟纤维细胞的互相转化。成纤维 细胞对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损以及骨创伤的修复有着十分 重要的作用。 目录 细胞的功能活动状态划分 来源 特征 创伤修复 分离培养 原代培养 展望 展开 编辑本段 细胞的功能活动状态划分
根据不同的功能活动状态，将细胞分为成纤维细胞和纤维细胞二型：成纤维细胞乃是功能活动旺盛的细胞，细胞和细胞核较大，轮廓清楚，核仁大而明显，细胞质弱嗜碱性，具明显的蛋白质合成和分泌 活动；纤维细胞（fibrocyte）功能活动不活跃，细胞轮廓不明显，核 小着色深，核仁不明显，细胞质少。此二型细胞可互相转化。[1] 编辑本段 来源 成纤维细胞：数目最多，胞体大，为多突的纺锤形或星形的扁平 细胞，细胞核呈规则的卵圆形，细胞轮廓不清。 成纤维细胞摄取所需的氨基酸，如脯氨酸和赖氨酸等，在粗面内质网的核蛋白体上合成前α多肽链（proalphapolypeptidechain ），多肽链输送到高尔基复合体后，组成前胶原分子（procollagen ）。前 胶原分子由分泌囊泡带到细胞表面，然后通过胞吐作用释放到细胞 外。在前胶原肽酶催化下，将每一前α多肽链的尾段除去，成为原胶 原分子（tropocollagen ）。许多原胶原分子成行平行排列，结合成具 有周期性横纹的胶原原纤维。由胶原原纤维互相结合形成胶原纤维。 编辑本段 特征 成纤维细胞是结缔组织中最常见的细胞，由胚胎时期的间充质细 胞(mesenchymalcell)分化而来。在结缔组织中，成纤维细胞还以其成熟状态—纤维 细胞(fibrocyte)的