第31卷第12期2011年12月
环境科学学报Acta Scientiae Circumstantiae
Vol．31，No．12Dec．，2011
基金项目：天津市应用基础及前沿技术研究计划项目（No．11JCZDJC25000）
Supported by the Tianjin Research Program of Application Foundation and Advanced Technology （No．11JCZDJC25000）作者简介：汪志荣（1965—），女，教授（博士），
E-mail ：wangzr@tjut．edu．cn ；*通讯作者（责任作者）Biography ：WANG Zhirong （1965—），female ，professor （Ph．D．），E-mail ：wangzr@tjut．edu．cn ；*Corresponding author
汪志荣，高琼，马传鑫，等．2011．MTT 法测定大肠杆菌活菌数实验研究［J ］．环境科学学报，
31（12）：2642-2650Wang Z R ，Gao Q ，Ma C X ，et al ．2011．Experimental study on the application of MTT colorimetric method in counting live Escherichia coli ［J ］．Acta Scientiae Circumstantiae ，31（12）：2642-2650
MTT 法测定大肠杆菌活菌数实验研究
汪志荣*
，高琼，马传鑫，李燕妮天津理工大学环境科学与安全工程学院，天津300384收稿日期：2011-02-25
修回日期：2011-03-27
录用日期：2011-04-12
摘要：实验分析MTT 比色法中的工作波长、反应时间、MTT 用量、菌龄、二甲基亚砜（DMSO ）等因素对大肠杆菌活细菌计数的影响．同时，通过与平板计数对比，确定了MTT 细菌计数的可行性．结果表明，当细菌数在107 109cell ·mL －1范围内时，双波长MTT 法可用于检测大肠杆菌的活菌数量，最佳反应时间为60min ，MTT 溶液用量200μL ，溶解剂DMSO 用量1mL ，且该方法对菌龄不敏感．OD 510－690值与细菌浓度C 呈良好的正向线性关系，其可决系数在0．99以上．关键词：MTT ；双波长测定；大肠杆菌；活菌计数文章编号：0253-2468（2011）12-2642-09中图分类号：X172
文献标识码：A
Experimental study on the application of MTT colorimetric method in counting live Escherichia coli
WANG Zhirong *，GAO Qiong ，MA Chuanxin ，LI Yanni
School of Environmental Science and Safety Engineering ，Tianjin University of Technology ，Tianjin 300384Received 25February 2011；
received in revised form 27March 2011；
accepted 12April 2011
Abstract ：Experimental studies were conducted on the influences of working wavelength ，reaction range of microbial cell number ，reaction time ，concentration of MTT ，cell age of Escherichia coli （E．coli ），DMSO in the MTT colorimetric method （MTT method ），etc．for determining live E．coli．Compared with dilution －plate method ，the MTT method was a viable method for counting live E．coli ，provided the number of bacteria was in the range 107cell ·mL －1 109cell ·mL －1．The best working parameters were reaction time 60minutes ，MTT 200μL and DMSO 1mL．The method was insensitive to cell age of E．coli．The correlation between the values of OD 510－690and the microbial cell number was above 0．99．Keywords ：MTT ；dual wavelength measurement ；Escherichia coli ；live germ counting
1引言（Introduction ）
在研究细菌在土壤中的行为特征，尤其是研究致病微生物对地表水、土壤与地下水的污染问题时，
了解细菌的活性与数量是尤为重要的．常见的细菌计数方法有平板稀释法、MPN 法、血球板计数法、自动菌数测定仪法、浊度法、菌体干重法等（马
绪荣等，
2000；王婷婷等，2008）．对于研究细菌在土壤迁移过程中的行为特征而言，这些方法各有缺
点，存在如不能及时反映菌体生长情况，不能区分细胞是否存活，耗时长，易受培养基成分与代谢产
物性质影响等不足（魏洪刚等，2002）．因此，有必要
探索一种能克服上述问题的活菌计数法．
MTT 比色法（简称“MTT 法”，MTT 全称为3-（4，5-Dimethylthiazol-2-yl ）-2，5-diphenyltetrazolium bromide ，中文化学名3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐，
商品名为噻唑蓝）是1983年由Mosmann 提出的一种检测细胞存活与生长的方法（Mosmann ，1983）．其原理是利用活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan ）并沉积在细胞中，而死细胞不产生琥珀酸脱氢酶，通过建立甲臜生成量与活细胞数量的关系，从而获得活细胞数量的一种测量方法．在具体测量过程中，用二甲基亚砜（DMSO ）
12期汪志荣等：MTT法测定大肠杆菌活菌数实验研究
溶解甲臜，测量溶液在一定波长下的光吸收值，间接反映活细胞数量．研究表明，在一定细胞浓度范围内，光吸收值与活细胞数成正比（Gerlier et al．，1986；杨浩等，2002）．
MTT法具有工作量小、操作简便、快速、重复性好等优点，该方法已广泛应用于真核细胞（肿瘤和真菌细胞）活性检测、生物因子活性检测、肿瘤细胞药敏检测、抗肿瘤药物大规模筛选、真菌药敏实验、细胞毒性试验等方面（基因时代，2009）．但在细菌方面的应用较少，尤其在进行活菌计数方面的研究还相对较少，例如，魏鸿刚等（2002）使用该方法检测了细菌PBW1的活菌数；王栩等（2005）与杨翠云等（2009）应用MTT法检测了大肠杆菌的活菌数；任娇蓉等（2007）应用MTT法检测了革兰氏阴性杆菌QC的活菌数；黄立坤等（2008）应用该方法研究了保加利亚乳杆菌1．8501菌株和嗜热链球菌3．8501菌株的活菌数；王忠朝等（2010）用MTT法检测了伴放线菌嗜血菌的活菌数．同时，通过这些研究探讨了实验条件，如反应时间、MTT用量、干扰物等对MTT法测定细菌活菌数的影响，得出了光吸收值与活菌数之间的线性关系，说明MTT比色法可以进行细菌的活菌计数，但需要进一步详细研究各种影响因素对MTT法测定的影响．赵承彦等（2000）对MTT显色反应条件进行了分析，同时，针对甲臜在不同溶剂中的溶解特性及吸收峰的分析结果也有所涉及（Mosmann，1983；Huamin et al．，2002）．大肠杆菌是重要的微生物研究材料，也是重要的环境污染指示菌，研究其活菌菌数的测定方法是一项重要工作．由于很多科学研究过程中需要实时了解细菌的数量变化及存活情况，而平板稀释法测活菌数时工作量大、耗时长，不能满足实验的要求．因此，本文在参考相关研究的基础上，针对现用于动物细胞活细胞计数的MTT法，系统研究各种影响因素（工作波长、不同干扰物、反应时间、MTT用量、DMSO、菌龄）对MTT法测定的影响，探究用MTT法快速准确检测大肠杆菌活菌数的方法．
2材料与方法（Materials and methods）
2．1材料
试验用细菌为大肠杆菌，购自天津科技大学微生物菌种保藏管理中心．培养基：10g蛋白胨，5g氯化钠，3g牛肉膏，1000mL蒸馏水．MTT溶液：称取100mg MTT于50mL小烧杯中，加20mL PBS（0．0l mol·L－1，pH=7．2），充分溶解，用0．22μm微孔过滤器除菌，分装于1．5mL EP管中，4?避光保存，两周内使用．PBS溶液：8g氯化钠，1．15g磷酸氢二钾，0．2g磷酸二氢钾，用去离子水定容至1000mL，用精密pH计调节pH=7．2，溶液浓度为0．01 mol·L－1，121?灭菌15min，室温保存．生理盐水：8.5g氯化钠，用去离子水定容于1000mL，121?灭菌30min．二甲亚砜（DMSO）为北京索莱宝科技有限公司产品．
实验用仪器包括全自动酶标仪、96孔板、灭菌锅、培养箱、水浴摇床、pH计、冷冻离心机、微量离心机、移液枪和超净工作台．
2．2方法
2．2．1细菌培养取浓度为109cell·mL－1的大肠杆菌1mL接种于100mL的培养基中，37?、140 r·min－1条件下培养18 20h后，即达到对数生长后期时，在3000r·min－1条件下离心10min，重复3次后用生理盐水洗涤菌体，加入生理盐水制成菌悬液．2．2．2MTT比色法测定活菌实验条件确定MTT 比色法测定活菌数量时，首先需要确定最佳工作波长、有效测定范围、各种干扰物的影响、最佳反应条件及标准曲线的制备等．
吸收峰确定：将菌悬液按1?2、1?4比例稀释，取原液和稀释菌液，加入96孔平底培养板中，每孔100μL，并按每孔20μL加MTT溶液，放于37?恒温箱中（大肠杆菌为原核细胞，其最适生长温度为37?，因此，琥珀酸脱氢酶与MTT反应温度为37?，在此温度下酶的活性最大，有利于反应的进行），60min后取出，加100μL DMSO后测定波长400 700nm范围内间隔5nm的光密度值（OD），以OD最大时的波长作为最适检测波长．空白为100μL生理盐水+20μL MTT+100μL DMSO．各浓度至少3个平行．
干扰物对测定结果的影响：对实验过程中接触到的介质进行干扰实验，以DMSO为参比，将灭菌培养基、死菌体（将活菌液在100?水浴中煮30 min）、生理盐水作为干扰物，用MTT法分别测定吸光值．每组实验至少6个平行．
测量范围的确定：取菌悬液按10倍浓度稀释9个梯度，用MTT法测定不同浓度菌液的OD，分析该方法的测定范围．
最佳反应条件的确定及标准曲线的绘制：将菌悬液对倍稀释，测原样、1?2、1?4、1?8、1?16、1?32、
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1?64、1?128和1?256各稀释菌液的OD．
将稀释液加入到96孔平底培养板中，每孔100μL ，各做5个复孔．按每孔10μL 或20μL 加入MTT 溶液，放入37?恒温箱中分别于20、40、60、90min 后取出，在不加入和加入100、150μL DMSO 的条件下，测定最佳波长下的OD．同时用平板计数法测定各稀释度下的菌落数，建立菌落数与OD 间的关系（方案见表1）．
表1
实验条件确定方案
Table 1
The program of the experimental conditions
试验编号
菌液/μL MTT 溶液
/μL
反应时间
/min DSMO 用量/μL 方案1方案2方案31100102001001502100104001001503100106001001504100109001001505100202001001506100204001001507100206001001508
100
20
90
100
150
不同菌龄细菌的影响：将大肠杆菌分别培养12h （对数生长前期）、24h （稳定生长期）、36h （稳定生长末期）后采用MTT 法测量OD ，平板法测定活菌数．绘制细菌浓度C 与OD 变化图，分析不同菌龄的菌数与OD 关系的统计学含义．数据分析处理采用SPSS 12．0与Origin 软件．3实验结果与分析（Results and analysis ）
3．1
吸收峰的确定
图1为3种浓度菌液（原液、
1?2和1?4稀释液）与MTT 反应后的波长扫描图．从图1可以看出，甲臜在520 620nm 范围内有较宽广的吸收峰，没有明显的特异性吸收峰，且不同浓度菌液条件下的吸
收峰也有一定变化．
分析原因可能有：①实验过程中使用的试剂，
如MTT 、
DMSO 可能在400 700nm 范围内有特异性的吸收峰，对甲臜的吸收产生干扰，因此，需要对
实验试剂的吸收峰加以测定；②MTT 与细菌产生的脱氢酶反应不完全，甲臜形成的量较少，因此，
增加
图1
不同DMSO 用量条件下各浓度菌液的吸收峰特征
Fig．1
The absorption peak features of bacterial concentration under different DMSO content
4
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12期汪志荣等：MTT 法测定大肠杆菌活菌数实验研究
MTT 与细菌反应时间，使反应更加完全；③实验过程中发现，加入DMSO 后沉淀溶解分散在整个反应体系中，但随着放置时间的延长，培养板底部又重新积聚黑色沉淀，上清液颜色渐浅，因此，反应体系的不均匀也会导致扫描结果的不确定性．所以，需要增加DMSO 的用量，让甲臜完全溶于DMSO 内，使整个反应体系均一．3．1．1背景吸收的影响
以生理盐水+DMSO 为
空白，生理盐水+MTT +DMSO 作为MTT 检测，用MTT 法在400 700nm 范围内测定各个波长下的
吸光值；同时，以超纯水为空白，检测DMSO 在400 700nm 的吸收峰，扫描结果见图2．从图2可以看出，MTT 仅在410nm 处有一峰值，峰尾在480nm 处．DMSO 在400 700nm 间的吸收极小，基本可以忽略．由此可知，MTT 与DMSO 本身对甲臜的吸收没有影响
．
图2
MTT 与DMSO 吸收峰特征
Fig．2
The absorption peak features of MTT and DMSO
3．1．2
不同反应时间对吸收峰的影响图3为20
μL MTT 溶液与0μL DMSO 或100μL DMSO 在反
应时间为20、
40、60、90min 条件下的波长与OD 关系．表2为各反应时间及加入不同DMSO 量条件下
的吸收峰对比．显然，从图3可以看出，加入DMSO 为0μL 条件下，随着反应时间的延长，甲臜的吸收峰无变化，维持在650nm 处；但OD 值却有差异，其
中，反应60min 后的OD 值最大．而加入DMSO 100μL ，不同反应时间的最大吸收峰略有变化，但其波型一致，均平缓，在500 610nm 范围内有宽阔
的吸收峰；反应90min 后，
OD 值达到最大．由此可以看出，反应时间对甲臜的吸收峰没有影响，但对OD 值有明显的影响
．
图3
不同反应时间的吸收峰特征
Fig．3The absorption peak features under different reaction time 表2不同DMSO 加入量及不同反应时间条件下的吸收峰Table 2
The absorption peak under different content of DMSO and reaction time
反应时/min
吸收峰/nm
未加DMSO
加DMSO 100μL 加DMSO 150μL 20645580*、61040650515*、57060550、645*
530、575（585）、
625*90
650
515、550、570*
510*、570
注：*为吸收峰中OD 值最大的吸收峰．
3．1．3
DMSO 用量对吸收峰的影响对比3种
DMSO 用量条件下的OD 值发现，不加DMSO 的反应体系呈蓝绿色，加入DMSO 后反应体系呈紫色，增加DMSO 的用量使甲臜颗粒在整个反应体系中
的溶解量增加，
紫色越深，甲臜溶解越完全．从图1及表2可见，加入DMSO 后，甲臜的吸收
峰由单一的650nm ，分散为多个不同的吸收峰（515、570、610nm ）；由一个较为明显的峰值变为平
缓的吸收区域，且OD 都有所下降；增加DMSO 的用
量后，吸收区域的分布范围变窄，基本分布在500 570nm 之间（加入100μL DMSO ，吸收区域分布在500 650nm 之间）；吸收峰主要分布在530、570、640nm 处，向左发生了偏移，在510nm 处产生了比较明显的吸收峰．并且不同浓度吸收峰差异不大，基本稳定在510nm 和570nm 处．
通过以上实验发现，甲臜在510 650nm 处有
比较宽的吸收峰，在510、570、640nm 处有最大的吸收．该结果与已有的实验结果基本吻合（魏洪刚等，
2002）．
5
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3．1．4
最大吸收峰的确定以上实验分析显示，反
应时间只影响OD 值，与最大吸收峰的位置无关；而是否使用DMSO 及使用量对吸收峰有比较明显的影响．
在实验过程中，甲臜处于水和DMSO 的混合体系，两种液体会相互干扰影响甲臜溶解，进而对其吸收峰产生影响；此外，随反应时间的延长会使得甲臜颗粒在液相体系中重新聚集．因此，为消除影响，在反应完全后，12000r ·min －1离心10min ，分离甲臜颗粒与MTT （200μL ）溶液和生理盐水，加1mL DMSO 于甲臜中，立即测定吸收峰．图4对比了两种方法吸收峰的测量值并且得出了离心后的最大吸收峰．
由图4和表3可以看出，离心后使原方法（见
2．2．2节所述）扫描的吸收曲线在510 630nm
之
图4
离心法与原方法测定的最大吸收峰
Fig．4
The maximum absorption peak of the centrifugation and original method
间有较宽的吸收区间，并出现了具有特异性、单一的吸收峰，且该吸收峰不随菌液浓度的变化而改变，有良好的稳定性．综上，MTT 方法测量大肠杆菌活菌数时，最大吸收峰为510nm．
表3
离心后的最大吸收峰
Table 3
The maximum absorption peak after the centrifugation
平行实验编号
最大吸收峰/nm
原液1?2稀释液
1?4稀释液
150551051525105055103510
505510
平均
510
3．2
干扰物对测定的影响
各干扰物对MTT 法测定的吸光值的影响如表4
所示．从表中发现，不同干扰物对MTT 法均有影响，其中，无菌培养基与无菌生理盐水的影响较小，而死菌体（沸水浴中加热30min ）对实验的影响很大，OD 510可以达到0．2甚至更大．根据MTT 测定原理，死菌不产生甲臜，分析其原因是灭菌不完全或死菌增加浊度引起．因此，死菌体对MTT 法的干扰不容忽视．3．2．1
灭菌时间对OD 510值的影响表4显示了灭菌30、
40、50、60min 后MTT 法检测的OD 510值，其中，
CK 为MTT 法空白（生理盐水+MTT ）的OD 510值．由表4可知，随着灭菌时间的延长，
OD 510值有所下降，但下降十分有限，可排除灭菌不完全对OD 510
的影响．
表4
不同干扰物和灭菌时间对OD 510的影响
Table 4
The influence on OD 510of disruptors and sterilization time
重复次数
各种干扰物影响下的OD 510值
DMSO 培养基生理盐水死菌体不同沸水浴时间下的OD 510值
CK 30min 40min 50min 60min 1－0．0010．007－0．0230．1750．0070．1760．1800．1600．18020．0020．013－0．0240．1830．0040．1790．1800．1790．1913－0．0040．011－0．0250．198－0．0020．1760．1750．1830．17540．0010．014－0．0210．241－0．0060．1940．2160．1800．15950．0030．006－0．0260．237－0．0090．2170．1870．1990．1126－0．0010．013－0．0180．2080．0070．2090．1600．1830．155平均值
0．011
－0．023
0．207
0．192
0．183
0．181
0．162
3．2．2
离心处理和双波长消除死菌对MTT 法的干
扰
采用上述扫描波长改进方法，加MTT 法（200μL ）振荡均匀，灭菌60min ，12000r ·min －1离心10min ，吸取上清液，加1mL DMSO 充分溶解沉淀，
空白为DMSO ，测OD 510值（表5）．表5结果显示，
OD 510值略有下降，但干扰仍不可忽略．分析MTT 法的干扰因素有：①细菌菌体沉淀影响透过率；②培养板各孔不平或杂质沉淀，特别是重复利用细胞
6
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12期汪志荣等：MTT法测定大肠杆菌活菌数实验研究
板．因此，可考虑采用双波长测定，即选择一参考波长作为本底（MTT在此及以上波长吸收很小）消除以上因素影响．
由图4可知，甲臜在690nm以上吸收值很小．取690nm为参考波长，空白为DMSO，用甲臜的OD
510
减去背景吸收OD690，即OD510－OD690（以下记为OD510－690）（表5）．表5结果显示，双波长测量可明显降低死菌对MTT法的影响（70% 80%）
表5离心处理和双波长消除死菌的影响
Table5Centrifugation and dual wavelength to eliminate the influence of dead cells
重复次数OD值（离心处理）
CK OD510
OD值（双波长MTT法）
CK OD510CK OD690OD510－690减小幅度
10．0010．1500．0710．1590．0560．1040．04273．6% 20．0020．1400．0760．1650．0590．1160．03578．8% 30．0050．1400．0600．1660．0480．1070．04572．9% 4－0．0030．1400．0570．1740．0460．1110．05071．3% 5－0．0040．1320．0600．1870．0490．1410．03481．8%平均值00．1400．0610．1590．0490．1060．04074．8%
3．2．3干扰物对OD测定的影响综合考虑各种干扰物的影响，以DMSO为参比，空白板、生理盐水、上清液、死菌体（100?水浴60min或高压灭菌30min）、灭菌培养基作为干扰物测定的OD
510－690
值如表6所示．表6结果显示，除死菌体对实验的干扰较大之外，其他干扰物对MTT法的干扰都可忽略，其中，高压灭菌比水浴锅灭菌效果稍好．对比表6和表4可知，考虑各干扰物的影响后，实验测量精度大大提高．
表6不同干扰物对MTT法（双波长测定）OD510－690值的影响
Table6The influence on the values of OD510－690of the disruptors（dual-wavelength measurement）
重复次数
OD510－690
CK空白板生理盐水上清液高压灭菌水浴锅灭菌培养基
10．0020．0030．0040．0070．0360．0420．009 20．0050．0040．0020．0070．0350．014 3－0．002－0．00200．0050．0380．0450．014 4－0．0020．0010．0020．0060．0400．0500．007 5－0．0020．00400．0070．0280．0340．003 6－0．001－0．0040．0010．0080．0350．0400．006平均值00．0010．0020．0070．0350．0410．009
3．3测量范围的确定
将菌悬液按10倍浓度稀释9个梯度，测定其OD
510－690
值，测量结果如表7所示．对不同浓度菌液的OD510－690进行多重方差分析，菌液浓度为101、
表7不同浓度梯度菌液的OD510－690值
Table7The OD510－690value of different concentration gradient of bacteria
重复次数
不同菌液浓度（cell·mL－1）下的OD510－690值
1．00?1091．00?1081．00?1071．00?1061．00?1051．00?1041．00?1031．00?1021．00?101
12．7500．3550．0340．0050．0060．005－0．0030．0030．006 22．6060．3530．0310．0090．0070．0120．0030．0080．006 32．6920．3270．0340．0070．0080．0090．0040．0010．006 42．9470．3270．0310．0050．0020．005－0．001－0．0020．004 52．6290．3360．0380．0060．0060．00800．0030．006 62．7610．3250．0280．0040．0020．005－0．004－0．0030．026平均值2．7310．3370．0330．0060．0050．007－0．00020．0020．009
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102、103、104、105、106cell ·mL －16组数据的样本均数
两两之间均无显著差异，这6组数据均与107
、108、109cell ·mL －1组的数据有显著性差异；菌液浓度为
107、108、109cell ·mL －1组的样本之间均有显著性差
异，由此可知，当菌液浓度低于106cell ·mL －1时，对OD 510－690值的变化影响不显著，因此，MTT 法对大肠杆菌活菌数的检测范围为107 109
cell
·mL －1．值得提出的是，
考虑与不考虑各种干扰物的影响，MTT 法的测量范围没有变化．3．4最佳反应条件的确定
不同菌种因活性不同，其反应时间也不一样．
将菌悬液对倍稀释，分别稀释为1?2、
1?4、1?8、1?16、1?32、1?64、1?128的稀释液，分别取菌悬液1mL 加
入到微量离心管中，加入MTT 溶液（100μL 和200μL ）振荡均匀，37?分别反应20、40、60、90min ，然后加入1mL 的DMSO ，并消除各干扰物的影响后立即测定OD 510－690值．图5和表8显示了不同反应条件下菌液浓度C 与OD 510－690值之间的关系．由图5和表8分析可知，在测量范围内，
C 与O
D 510－690值均呈正向线性关系．加入200μL MTT 溶液试验组的可决系数较100μL MTT 溶液试验组升高显著；同时，随着反应时间延长，甲臜的生成量增大，反应60min 时甲臜可达到最大值，并且此时C 与OD 510－690的线性关系最佳
．
图5不同反应条件下菌落数与OD 510－690之间的线性关系
Fig．5
The linear relationship between bacterial concentration and OD 510－690
表8
菌液浓度C 与OD 510－690的关系
Table 8The relationship of bacterial concentration C and OD 510－690
MTT 加入量
/μL
反应时间/min OD 510－690=a ?C +b a b R 2100
201．2179－0．04150．9945401．2595－0．03140．9986601．5504－0．05880．986490
1．4733－0．0510．9895200201．1711－0．02830．9959401．1308－0．02760．9967601．1006－0．01870．998290
1．3635
－0．0401
0．9966
实验过程中发现，加入100μL 和200μL MTT 溶液，反应一定时间后上清液分别为白色和黄色，这说明加入100μL MTT 溶液时，MTT 反应尚不完全，可能造成MTT 与脱氢酶反应不完全．
综上分析，加入200μL MTT 溶液，反应60min 后反应体系分散较为均一，且有较好的线性关系，可作为MTT 方法的最佳反应实验条件．3．5不同菌龄细菌对MTT 法的影响
由于实验中加入的MTT 是过量的，因此，MTT 与琥珀酸脱氢酶的氧化还原反应所生成的甲臜量
取决于琥珀酸脱氢酶的量与活性．对于不同生长阶段的细菌来说，其琥珀酸脱氢酶的量与活性可能会不同．因此，分析不同生长阶段的细菌对MTT 法的测量结果的影响是必要的．
将大肠杆菌培养12h （对数生长前期）、
24h （稳定生长期）、36h （稳定生长后期）后，用MTT 法测定OD 510－690值，分析各菌龄的菌液浓度与OD 510－690的关系（图6）．表9为菌龄对菌液浓度与OD 510－690线性关系的斜率变化．
8
462
12期汪志荣等：MTT法测定大肠杆菌活菌数实验研究
表9菌龄对直线斜率的影响
Table9The strain age impact on the slope of C OD510－690
菌龄/h
6个平行试验的回归曲线斜率
实验1实验2实验3实验4实验5实验6
平均
120．95740．92460．90271．01410．93961．00370．9936 240．96660．95970．93600．96960．98640．94900．9962
360．95290．93630．94560．95240．95830．96070．
9930
图6不同菌龄的菌液浓度与OD510－690关系Fig．6The relationship between strian age and C OD510－690
图6和表9显示，菌体在不同生长阶段OD
510－690
都与细菌浓度呈线性关系，且各直线基本重合，斜率接近．方差分析（表10）表明，F＜F0．05，3组数之间无显著差异，因此可以认定，MTT法对大肠杆菌的菌龄不敏感，适用于检测各菌龄的大肠杆菌．
表10不同菌龄线性关系式斜率的方差分析
Table10Variance analysis of the slope of C OD510－690来源自由度平方和均方F F0．05（4/24）因子20．004410．00221
误差150．012520．00083
总和172．643．68
4结论（Conclusions）
1）研究表明，双波长MTT法测定大肠杆菌活菌数可获得稳定的单一吸收峰，也可消除干扰物，特别是死菌的影响．该方法与平板计数法的测定结果具有一致性，同时具有快速实时、简便、稳定的特点．2）双波长MTT法测定大肠杆菌活菌数最佳工作条件为：菌液1mL，MTT用量0．2mL，培养温度37?，反应时间60min，DMSO用量1mL，最佳工作波长510nm，以690nm作为参考波长．
3）MTT法在用于测量大肠杆菌的活菌数时，大肠杆菌的活菌浓度在107 109cell·mL－1范围内时，吸光值OD510－690与活菌数C线性关系显著，其关系式为：OD510－690=1．006C－0．0187，可决系数大于0.99．该范围比一般的测定范围106 108cell·mL－1宽广．
4）研究表明，不同菌龄的大肠杆菌的活菌数与OD
510－690
值之间的线性关系不随菌龄而发生变化，说明MTT适用于检测不同阶段的大肠杆菌．但对于其他细菌，是否适用MTT法还有待进一步研究．
责任作者简介：汪志荣（1965—），女，工学博士，教授，研究方向为水土资源与环境．E-mail：wangzr@tjut．edu．cn．
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