纳豆激酶基因的克隆与表达组员：赖小辉彭铭烨张星胡振冬
刘永权罗顺宋縯
?主讲：赖小辉
制作：刘永权
?技术支持：宋縯彭铭烨
资料搜集：张星罗顺
胡振冬
?同学们知道纳豆是什么东西么？
?不知道的同学现在来科普下吧！
?纳豆自中国秦汉以来开始制作。传入日本后成为日本最常见的传统发酵食品之一，由黄豆通过纳豆菌（枯草杆菌）发酵制成，具有黏性，不仅保有黄豆的营养价值、富含维生素K2、提高蛋白质的消化吸收率，更重要的是发酵过程产生了多种生理活性物质，具有溶解体内纤维蛋白及其他调节生理机能的保健作用。调查指出日本人食用纳豆的历史已超过一千年。【来源：维基百科】
?那什么又是纳豆激酶呢？
?纳豆激酶(nattokinase简称NK)是一种枯草杆菌蛋白激酶，是在纳豆发酵过程中由纳豆枯草杆菌(Bacillus subtilisl natto)产生的一种丝氨酸蛋白酶。具有溶解血栓，降低血粘度，改善血液循环，软化和增加血管弹性等作用。
?1980年在纳豆中被发现，由275个氨基酸按照固定排列方式组成，分子量是27724，有分解血栓的独特功能，活性效果用固有单位Fu表示。【来源：百度百科】
?利用PCR方法从分泌纳豆激酶的枯草杆菌基因组DNA中扩增得到了纳豆激酶基因, 并测定其核苷酸序列。利用基因重组技术构建了纳豆激酶基因的表达载体, 并在大肠杆菌中进行了表达。SDS-2聚丙烯酰胺凝胶电泳表明, 表达蛋白占菌体蛋白的15.2% , 琼脂糖-纤维蛋白平板法测出表达产物具有溶解血栓活性。
?1-1菌株和载体
?枯草杆菌(Bacillus subtilis ) , 受体菌E. coliJ M 103, E coli N 4830; 质粒载体pU C 19, 表达载体pR IT 2T 均为本室保存
?1-2工具酶与试剂
?限制性核酸内切酶E coRI , SalI T4 DNA连接酶, PCR 试剂盒, DNA / Hind III Marker , 蛋白质分子量标准均购自P r om ega 公司; 尿激酶, 纤维蛋白原, 凝血酶购自卫生部生物制品检验所; 其它生化试剂均为国产或进口分析纯
1-3寡核苷酸引物的设计合成
?根据EijiI CHISH MA【3】
?发表的纳豆激酶基因
?编码区序列设计合成了PCR 扩增所需的两个引物?5′ 引物:
5′CGCTGAATTCATGGCGCAATCTGTTCCT 3′?3′ 引物:5′AGGCGTCGACTTATTGGCAGCTGC TTG3′
?1-4枯草杆菌基因组D NA 的提取
?取100 m l 过夜培养的枯草杆菌, 4℃离心收集?菌体, 按文献[ 4 ] 方法提取高分子量基因组DNA
1-5目的基因的PCR 扩增, 克隆
?以基因组DN A 为模板, 进行PCR 扩增, 循环
?参数为: 94℃变性60 s, 55℃退火60 s, 72℃延伸90s, 反应35个循环, 最后72℃延伸10 m i n , 将PCR 产物
?与质粒pU C 19分别用E coR I/Sal I双酶切, 纯化后
?按2-1比例连接, 22℃连接4 h , 连接液转化感受态E.
?col i J M 103 细胞, 筛选阳性重组子, 提取重组子质粒
1-7重组表达载体构建
?从pU C 192 N K 质粒上切下N K (n a t t o k i n a se ) 基因, 与经过E co R I/ S alI 双酶切的pR I T 2T 质粒DN A 以2 ÷1 比例混合后, 加T 4 DN A 连接酶于22℃连接4 h , 连接液转化感受态E. col i N 4830细胞, 筛选阳性重组子, 提取其质粒, 并用E coRI/ S alI进行酶切鉴定
?1-8表达产物的鉴定
?挑取阳性重组子培养过夜, 次日按2% 接种量转接到SOB 培养液中, 30℃培养至A 600 = 1.0 ～2.0,立即升温到42℃, 振荡培养90 min , 离心收集菌体,用1×SDS 裂解液裂解, 采用SDS2 PA GE 法鉴定表达产物
1-9表达产物的活性测定
?采用纤维蛋白平板法测定纳豆激酶活性L 用一定量的纤维蛋白原, 凝血酶和琼脂糖制成琼脂糖纤维蛋白平板, 以不同浓度的尿激酶作为标准品, 各取10 L加样到平板上, 诱导表达菌体1 ml 菌液超声裂解后取10 L裂解液加到平板上, 37℃温箱中放置18h , 取出后用卡尺测量出标准品和检品的溶圈直径,以其乘积表示, 从而计算出检品的活性, 相当于尿激酶单位数
结果
?2-1基因组D NA 的提取
?所提取的基因组DN A 经紫外检测和琼脂糖凝胶电泳鉴定, A 260 /A 280 = 1 . 82, 基因组分子量大于50kb , 所测得的DN A 的纯度与分子量大小均适合PCR 反应
?2-2目的基因PCR 扩增与克隆
?以基因组DN A 为模板进行PCR 扩增, 35个循环后, 将PCR 产物用1% 琼脂糖凝胶电泳, 以K DNA /Hind i 为Marker , 在824 bp 处有一条明显的特异性扩增带.将
2-3纳豆激酶基因的序列分析
?以重组质粒为模板进行全自动测序结果表明, 我们所克隆的纳豆激酶基因的编码区含有824bp 核苷酸, 正确编码274个氨基酸, 其中含有27个氨基酸的S D 序列1与已发表的纳豆激酶基因序列比较, 由于在822 bp 与823 bp 间缺失一碱基C , 致使由CA A编码的谷氨酰胺275变成AAT 编码的天冬酰胺, 导致一个氨基酸的编码错误L 核苷酸序列和氨基酸序列的同源性达99.8% 和99.6%
?2-4重组表达质粒的构建
?按方法所述, 共获得8 个转化子, 阳性重组子2个提取其质粒, 用E coRI/S al I酶切下一条与PCR 产物一样大小的基因片段
2-5 重组表达质粒在大肠杆菌中的表达及SDS-PAGE 法鉴定
?按方法118 所述进行热诱导表达, 取115 m l 菌液4℃离心收集菌体, 用1 ×S D S 裂解液裂解后, 采用SDS2PAGE 方法进行分析, 结果表明在56 k D 处有一条明显的融合蛋白表达带L 我们所用的表达载体为ProteinA 融合型, P r o te i n A 分子量为29 k D ,纳豆激酶的分子量为27 k D , 与报道的结果一致, 薄层扫描结果表明, 表达蛋白占菌体蛋白的15.2% ?2-6表达产物的活性鉴定
?参照方法部分所述, 以尿激酶为标准品, 所测表达产物的溶圈直径为165192L 结果可见, 1 m l 菌液得到的菌体裂解后所释放的纳豆激酶溶栓活性介于60 U～80 U 尿激酶单位之间
相关拓展
? 1.番茄红素
?1-1 营养价值番茄红素是植物中所含的一种天然色素。主要存在于茄科植物西红柿的成熟果实中。它是目前在自然界的植物中被发现的最强抗氧化剂之一。科学证明，人体内的单线态氧和氧自由基是侵害人体自身免疫系统的罪魁祸首。番茄红素清除自由基的功效远胜于其他类胡萝卜素和维生素E，其淬灭单线态氧速率常数是维生素E的100倍。它可以有效的防治因衰老，免疫力下降
引起的各种疾病。因此，它受到世界各国专家的关注。
1-2生物合成途径
?生物合成途径类胡萝卜素生物合成可经由不同的途径，在真菌和植物细胞胞液/内质网上，由乙酰CoA经羟甲基戊二酰-CoA途径合成的. 在细菌与植物质体中由磷酸甘油醛与丙酮酸经1-脱氧木酮糖-5-磷酸途径合成.形成的异戊烯基焦磷酸经多次缩合生成第一个类胡萝卜素八氢番茄红素，再经脱氢、环化、羟基化、环氧化等转变为其它类胡萝卜素
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班级：姓名：学号：成绩： 第七章微生物遗传试题 一．选择题：1、A;2、B;3、D;4、A;5、B;6、C;7、A;8、B;9、A;10、D;11、A;12、D;13、B;14、D;15、A;16、C 1、已知 DNA 的碱基序列为 CATCATCAT，什么类型的突变可使其突变为：CTCATCAT 答：( ) A.缺失 B.插入 C.颠换 D.转换 2、不需要细胞与细胞之间接触的基因重组类型有：答：( ) A. 接合和转化 B. 转导和转化 C. 接合和转导 D. 接合 3、将细菌作为实验材料用于遗传学方面研究的优点是：答：( ) A. 生长速度快 B. 易得菌体 C. 细菌中有多种代谢类型 D. 所有以上特点 4、在 Hfr 菌株中：答：( ) A. F 因子插入在染色体中 B. 在接合过程中，F 因子首先转移 C. 在接合过程中，质粒自我复制 D.由于转座子是在DNA分子间跳跃的，因此发生高频重组 5、以下碱基序列中哪个最易受紫外线破坏？答：( ) A. AGGCAA B. CTTTGA C. GUAAAU D. CGGAGA 6、在大肠杆菌 (E.coli) 的乳糖操纵子中，基因调节主要发生在__________ 水平上。答：( ) A. 转化 B. 转导 C. 转录 D. 翻译 7、转座子 ___________。答：( ) A. 能从 DNA 分子的一个位点转移到另一个位点 B. 是一种特殊类型的质粒 C. 是一种碱基类似物 D. 可引起嘌呤和嘧啶的化学修饰 8、当F+ F-杂交时答：( ) A. F因子几乎总不转移到F+细胞中 B. F-菌株几乎总是成为 F+ C. 基因重组的发生频率较高 D. F因子经常插入到F-细胞染色体上 9、在 U 形玻璃管中，将一滤片置于二株菌之间使之不能接触，在左臂发现有原养型菌出现，这一现象不是由于：答：( ) A . 接合 B. 转化 C. 普遍转导 D. 专性转导 10、细菌以转化方式进行基因转移时有以下特性：答：( ) A. 大量供体细胞的基因被转移
连接产物 ●重组分子 ●未连接的载体分子 ●未连接的D N A片段 ●载体的自连 ●含有错误插入片段的重组D N A分子 1转化—细菌吸收D N A的方式 自然界中，转化并不是细菌获取遗传信息的主要方式。 细菌必须经过物理或化学处理后可提高吸收D N A的能力，经过这样处理的细菌称为感受态。 1.1大肠杆菌感受态的制备 ●感受态细胞(Competent cells): 受体细胞经过一些特殊方法的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。 1.1大肠杆菌感受态的制备 ●在冷的盐溶液中转化效率提高。一般利用50m M的C a C l2，或者氯化铷。 –原理：与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，并发生收缩，使细胞膜出现孔隙。 ●42°C热激处理。 1.2筛选转化细胞 1n g的p U C8可以产生1000-10000个转化子，意味着只吸收了0.01%的D N A分子。 1.3其他的转化方法 ●电穿孔驱动的完整细胞转化（电激转化法） ●接合转化 ●微注射法 ●λ噬菌体的转染 ●P E G介导的细菌原生质体转化 1.3其他的转化方法 ●电激转化 –受体细胞在脉冲电场作用下，细胞壁上形成一些微孔通道，使得D N A分子直接与裸露的细胞膜脂双层结构接触，并引发吸收过程。 –可以转化较大的质粒，适用于所有的细菌。 1.3其他的转化方法 ●接合转化 –是由接合型质粒完成的。 –涉及到三种菌株的混合：受体菌、含有接合质粒的辅助菌以及含有待转化重组质粒的供体菌。
–重组质粒和接合质粒必须有相容性。 1.3其他的转化方法 ●P E G介导的细菌原生质体转化 –高渗溶液中细菌培养至对数生长期 –溶菌酶的等渗液处理，形成原生质体。 –加入D N A样品和聚乙二醇等渗液 –离心除去聚乙二醇，固体培养。 ●适用于芽孢杆菌和链霉菌等革兰氏阳性菌、酵母、霉菌甚至植物。 表5-1大肠杆菌5种常用转化方法的比较 2重组子的鉴定 ●利用插入失活选择p B R322重组 ●载体：含有β-半乳糖苷酶基因l a c Z的调控序列和头146个a a的编码序列 ●宿主：缺失了l a c Z’基因，可编码β-半乳糖苷酶C端序列 ●α-互补：l a c Z基因上缺失近操纵基因区段的突变体可以与带有完整的近操纵基因区段的β- 半乳糖苷酶隐性突变体之间实现互补。 ●转染：是将纯化的噬菌体D N A通过热激的方法转化感受态大肠杆菌的过程。 ●体外装配i n v i t r o p a c k a g i n g：将重组的λ分子装配成头-尾结构的病毒粒子。 ●体外装配 –c o s位点突变的噬菌体的单品系系统 –另一种系统需要两种缺陷品系。一个是基因D的突变体，另一个是基因E的突变体。 3.1噬菌斑 ●λ形成的是真正的噬菌斑。 ●M13引起细菌生长的减慢，而使细菌的浓度低于周围细胞。 4重组噬菌体的鉴定 ●利用插入失活鉴定 ●λ噬菌体的c I基因的插入失活 ●利用S p i表型选择 ●根据λ基因组的大小筛选 4.1利用插入失活鉴定 4.2λ噬菌体的c I基因的插入失活 4.3利用S p i表型选择 4.4根据λ基因组的大小筛选 λ装配系统，只有37k b-52k b的D N A分子可以进入头部结构。 思考题
高校中微生物学的主要研究方向有：资源与应用微生物学 病原微生物学 微生物发酵与代谢工程 生物防治微生物学 环境微生物学 真菌学
微生物分子遗传与功能基因组学 海洋微生物学 1.资源与应用微生物学 微生物资源是地球上三大生物资源之一，微生物资源开发与利用具有重要的意义。许多高校已经把它作为一个独立的研究方向，并且也形成了各自的研究特色。 中科院微生物所，有微生物资源前期开发国家重点实验室，主要研究方向为微生物资源收集、微生物分类和功能评估、极端环境微生物。该所有中国科学院院士5名，拥有一支具有国际竞争力的研究队伍，仪器装备达到了国际先进水平。该所的微生物菌种保藏中心所保藏的菌种数量在国内首屈一指，真菌标本馆的标本数量则为亚洲之最。 云南大学，有教育部微生物资源研究开发重点实验室，主要研究领域有：放线菌生物学,微生物资源学,菌根生物学, 极端环境微生物学,其中放线菌方面研究处于全国先列，重点开展极端（重点是高温、高盐碱）环境或各种特殊环境(植物内生或海洋)下的放线菌资源收集、保存及分类学、系统学、生态学、生物地理学及其应用价值评估（活性筛选、代谢产物化学及酶学等）研究。 广西大学，有广西亚热带生物资源保护利用重点实验室，主要研究方向是，利用广西省丰富的微生物资源发掘、鉴定和克隆具有特殊用途微生物的功能基因，并对重要功能基因进行改造和利用；发现、分离和克隆农作物抗病虫功能基因、构建抗病虫作物新种质。 中国农业大学，有农业部农业微生物资源及其应用重点实验室，主要研究领域有微生物分类及系统发育、微生物生理及遗传学、发酵工程、药用及食用真菌、环境微生物学、分子病毒学和分子免疫学等，微生物学专业师资力量雄厚，有中国科学院院士李季伦教授等多名著名教授。 四川大学，微生物学为省级重点学科，拥有资源微生物及微生物生物技术四川省重点实验室，主要研究方向：资源微生物，天然产物，生态环境保护。 西北农林科技大学，拥有西北农林科技大学微生物研究中心，主要研究方向之一微生物资源多样性及利用研究，包括极端环境条件微生物的菌种资源、基因资源及多样性研究；根瘤菌为主的固氮微生物多样性及利用。 华南理工大学，主要研究华南地区丰富的微生物资源，包括微生物资源的采集和开发利用，进行微生物菌种筛选和改造，重点应用在工业、农业等领域的研究。 河北大学，有河北省微生物多样性研究与应用实验室。 黑龙江大学，有微生物资源挖掘与利用和微生物产品开发与制备方向的研究。 山西大学微生物资源与生态方面的研究等。
第一章基因工程概论 第一节基因工程的基本概述 一、基因工程的基本概念 1、基因工程的基本定义： 按照预先设计好的蓝图，利用现代分子生物学技术，特别是酶学技术，对遗传物质DNA 直接进行体外重组操作与改造，将一种生物（供体）的基因转移到另外一种生物（受体）中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。 广义基因工程：DNA重组技术的产业化设计与应用。分为上游和下游技术。 2、上游技术：外源基因重组、克隆和表达的设计与构建（狭义基因工程） 3、下游技术：含有外源基因的生物细胞（基因工程菌或细胞）的大规模培养以及外源基因的表达、分离、纯化过程。 基因工程又称为：gene manipulation, gene cloning, recombinant DNA technoglogy, genetic modification, new genetics, molecular agriculture 二、基因工程的基本过程： 1、材料的准备：目的基因、载体、工具酶和受体细胞（宿主）的准备。用限制性内切酶分别将外源DNA和载体分子切开。 2、目的基因与载体DNA的体外重组，形成重组DNA分子。 3、重组的DNA分子引入受体细胞，并建立起无性繁殖系。 4、筛选出所需要的无性繁殖系，并保证外源基因在受体细胞中稳定遗传、正确表达。 进一步可将基本步骤概括为：切、接、转、增、检［步骤演示］
图1-1 基因工程的基本步骤 三、基因工程的基本原理： 主体战略思想是外源基因的高效表达，可从四方面达到目的： 1、利用载体DNA在受体细胞中独立于染色体DNA而自主复制的特性与载体分子重组，通过载体分子的扩增提高外源基因在受体细胞中的剂量，借此提高宏观表达水平。 2、筛选、修饰重组基因表达的转录调控元件：启动子、增强子、上游调控序列、操作子、终止子。 3、修饰和构建蛋白质生物合成的翻译调控元件：序列、密码子。 4、工程菌（微型生物反应器）的稳定生产及增殖。 第二节基因工程的发展 一、基因工程的诞生 基因工程是一项新兴的工程技术，它的诞生需要理论和技术上的支持： 1. 理论上的三大发现： 证明了生物的遗传物质是DNA（基因工程的先导） DNA的双螺旋结构和半保留复制机理 遗传信息的传递方式（中心法则）和三联体密码子系统的建立 2. 技术上的三大发现 限制性内切酶和DNA连接酶的发现（标志着DNA重组时代的开始） 载体的使用 1970年，逆转录酶的发现。 1973年，C o h e n等获得了抗四环素和新霉素的重组菌落T c r N e r，标志着基因工程的诞生。 二、基因工程的发展： 1. 1972-1976年，日本人，somatostatin； 2. 1978年，美国人，生长激素基因（HGH）； 3. 1980年，美国/瑞士人，a干扰素－基因； 4. 1984年，日本人，白细胞介素2（IL-2）； 三、基因工程的腾飞： 1. 1982年，美国人，大鼠生长激素基因转入小鼠； 2. 1983年，美国人，Ti质粒导入植物细胞（细菌Neor基因） 3. 1990年，美国人，腺苷脱氨酶（ADA）基因治疗，重度联合免疫缺陷症（SDID） 4. 1991年，美国倡导，人类基因组计划109bp，15年时间30亿USD； 5. 1997年，美国人，威尔英特克隆多利绵羊
浙江大学2005–2006学年秋季学期 一、填空题（25分）评分标准：每格1分 1.细菌按其形态不同可分为球菌，杆菌和螺旋菌，而球菌又可分为单球菌，双球菌，四联球菌，八叠 球菌，链球菌和葡萄球菌。 2.DNA是脱氧核糖核苷酸组成的大分子，在组分上它含有腺嘌呤脱氧核糖核苷酸（A）、鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸（G）、胞嘧 啶脱氧核糖核苷酸（C）、胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸（T）。 3.生物降解性的评价方法有测基质生物氧化率，测基质生化呼吸线，测BOD5/COD Cr的比值。 4.水体富营养化主要是由于水体中氮（N）、磷（P）增加而引发__藻类____大量繁殖而引起的，该现象发生在海洋中称 为赤潮，发生在淡水中则称为水华。 5.废水脱氮处理是通过硝化作用将NH4+-N氧化成NO x——N，然后通过反硝化作用使NO x——N还原成N2而实现的，参 与两过程的微生物称为硝化细菌 nitrification 和反硝化细菌 denitrification，它们的营养型分别属于化能无机营养型和化能有机营养型。 二、是非题（15分）正确“√”，错误“×” 1.在分离土壤真菌时，要在马铃薯—蔗糖培养基中加入链霉素溶液以抑制细菌的生长，这种培养基称为鉴别培养 基。（×） 2.在废水生物处理中微生物主要是以游离菌体的形式存在于构筑物中，只有少数是以菌胶团的形式出 现。（×） 3.在自然界氮素物质循环中，微生物参与了每个转化过程，这对农业生产和环境保护都起着极为有利的作 用。（×） 4.蓝细菌和光合细菌都能进行产氧的光合作用（×） 5.一种COD浓度在20,000mg/L的有机废水，因其BOD/CODcr = 0.2，所以不宜用生物处理法来处理。（×） 6.原生动物是最原始、最低等、结构最简单的多细胞动物。（×） 7.紫外线杀菌力很强，但穿透力很弱，所以只能用于接种室和开刀房等的空气和物体表面的灭菌。（√） 8.微生物在10分钟被完全杀死的最低温度称为致死温度。（√） 9.在中性和微碱性土壤中以细菌和放线菌占优势，而在微酸和酸性土壤中则以真菌占优势。（√） 10. 转导是指受体菌直接吸收来自供体菌的游离DNA片段，并整合到自己的基因组中，从而获得供体菌的部分遗传性状的过 程。（×） 11.根霉和毛霉无性繁殖形成孢囊孢子，有性繁殖形成子囊孢子。（×） 12.培养好氧微生物的试管用棉花塞，其目的是防止杂菌污染，也可用橡皮塞代替它。（×） 13. 发酵是厌氧微生物获得能量的主要方式，发酵过程中有机物质既是被氧化的基质，其中间产物又是最终电子受体，如乙 醇发酵，乳酸发酵等。（√） 14.内源呼吸线是指在不投加基质的条件下，微生物处于内源呼吸状态时利用自身细胞物质作为呼吸基质，其耗氧量随时间而变 化绘制的曲线。（√） 15.类病毒只有一种核酸和蛋白质，所以它是一种分子生物。（×） 三、名词解释（用英语回答，20分）评分标准：每题4分 1.Microorganism
1.1基因工程概述（第1课时） （一）DNA 重组技术的基本工具 编制：张统省 审核：秦磊 校对：王曼 【学习目标】 1.简述基因工程的诞生过程和发展历程； 2.简述基因工程的概念 3.举例说出基因工程的工具 【自学质疑】 一、回顾： 1．遗传的物质基础是什么？ 2．生物体遗传的基本单位是什么？ 3．为什么生物界的各种生物间的性状有如此大的差别呢？4．生物的性状是怎样表达的？ 5．各种生物的性状都是基因特异性表达的结果，那么，人类能不能改造基因 呢？使原来本身没有某一性状的生物而具有某个特定的性状呢？ 6．各种生物间的性状千差万别，这是为什么呢？ 二、导学 1．基因工程的概念： 2. DNA 重组技术的基本工具 来源：主要从 中分离 功能：能够识别双链DNA 分子的某种特定核苷酸序列， 限制性内切酶 并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷 （分子手术刀） 酸二酯键断开。 错位切 切割方式 平 切 黏性末端 切割后的DNA 末端： 平末端 功能：将切下来的DNA 片段拼接成新的DNA 分子 DNA 连接酶 T4 DNA 连接酶：既能“缝合”双链DNA 片段互补的黏性末端， （分子缝合针） 种类 也能“缝合”双链DNA 片段的平末端 E ·coli DNA 连接酶：只能将双链DNA 片段互补的黏性末端连接 ①能在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制 条件：②有一个至多个限制酶切点， 基因进入受体细胞的载体 ③有特殊的遗传标记基因，便于筛选。 （分子运输车） 质粒（常用） 种类： λ噬菌体的衍生物 动植物病毒 【质疑讨论】 1．什么是基因工程？ 2．、基因工程的工具酶有几种？分别是什么？ 3．基因的剪刀是什么？有什么作用特点？结果怎么样？ 4．基因的针线是什么？其主要作用是什么？ 5．基因的运输工具是什么？有什么作用？ 6．运载体必须具备的条件是什么？最常用的运载体是什么？ 7．质粒的结构是什么？质粒上会存在某些标记基因，这些标记基因有什么用途？ 8.要想将某个特定基因与质粒相连，需要用几种限制性内切酶和几个DNA 连接酶处理？ 质粒的特点： ①质粒是基因工程中最常用的运载体； 最常用的质粒是大肠杆菌的质粒； ②是细菌染色体外（即拟核DNA 外） 能自我复制的小型环状DNA 分子；质粒 的大小只有普通细菌染色体的1%左右； ③存在于许多细菌及酵母菌等微生物中； 质粒的存在对宿主细胞生存没有决定性 的作用； ④质粒的复制只能在宿主细胞内完成。 （自身细胞中也可） 【矫正反馈】 1．在基因工程中，科学家所用的“剪刀”、“针线”和“载体”分别是指( ) A.大肠杆菌病毒、质粒、DNA 连接酶 B.噬菌体、质粒、DNA 连接酶 C.DNA 限制酶、RNA 连接酶、质粒 D.DNA 限制酶、DNA 连接酶、质粒 2．不属于质粒被选为基因运载体的理由是 （ ） A ．能复制 B.有多个限制酶切点 C ．具有标记基因 D ．它是环状DNA 3．质粒是基因工程中最常用的运载体，它的主要特点是 ①能自主复制 ②不能自主复制 ③结构很小 ④蛋白质 ⑤环状RNA ⑥环状DNA ⑦能“友好”地“借居” A ．①③⑤⑦ B ．①④⑥ C ．①③⑥⑦ D ．②③⑥⑦
一、名词解释 引物、克隆、探针、转化率、重组率、基因工程、分子克隆技术、限制性核酸内切酶 、基因工程 基因工程是指重组 技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组 技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。 、基因表达 是指细胞在生命过程中，把储存在 顺序中遗传信息经转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子 、限制性核酸内切酶 能特异性识别双链 某段特殊序列，并切割 双链的酶，主要存在于原核细菌中，主要作用是保护自身 不受限制，及破坏外源 使之迅速降解 、重组率：重组率 含有外源 的重组分子数 载体分子总数 在常规实验条件下，重组率一般为 ；重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大简化 重组的后续操作 、探针 一小段单链 或 片段，用于检测与其互补的核酸序列，双链 加热变性成为单链，
随后用放射性同位素 常用 、荧光燃料或酶标记成为探针 连接酶的酶活性 在最佳反应条件下 反应 ，完全连接 （ 片段）所需的酶量 二、选择题 、重组乙肝疫苗是 由重组酵母或重组 工程细胞表达的乙型肝炎表面抗原，经纯化、灭活及加入佐剂吸附制成。前者为重组酵母乙型肝炎疫苗，后者为重组 乙型肝炎疫苗 、基因工程用于药物筛选模型的战略 、控制质粒拷贝数的意义是使外源蛋白在细胞内更稳定 、酵母作为受体，比大肠杆菌的优势在于 大肠：原核 酵母：真核，具有多种细胞器，在用于生产需加工分泌的蛋白质时比大肠杆菌有优势 、分子杂交的化学本质是形成氢键 、 定点突变 的方法是 碱基的添加、删除、点突变
思考题 第二章分子克隆工具酶 1简述基因工程研究用的工具酶的类型和作用特点。 常用的工具酶 硝基序列内部进庁切割 DrU逵接癖 DT?A 1 i HaSe 将两条以上的纯性HA方子咸序喪傕化昭成磷酸二酣键逢接战一6盘傢 DNAJSt 合BBl DNA PDIytoeraSe 1通?u≡ιg'掰遥一蝎如械昔≡κ???板. 从3'方向令咸新生的互补谜 专一懺降解RMA 内切械肢晦.4?M4tl?或双1?DNA 2?说明限制性内切核酸酶命名原则(举例)
第八章植物基因工程 基因工程：在基因的水平上改造生物的技术体系，是指在体外对生物DNA进行剪切、加工，把不同亲本的DNA分子重新组合，并把它引入细胞中表达出具有新的遗传特性的生物这一过程。 植物基因工程：又称植物遗传转化/转基因，是将外源基因转移到植物细胞内，并稳定地整合、表达与遗传的技术。目的是改变植物性状，培育高产、优质high yield、抗逆新品种/系；或者利用转基因植物/细胞来生产外源基因的表达产物。 植物转基因研究的用途： 1）理论研究：如基因功能分析； 2）实践应用：如作物遗传改良。 基因工程的基本内容 1）目的基因的分离； 2）目的基因与载体连接； 3）重组分子转入寄主细胞并繁殖； 4）阳性克隆的筛选； 5）从阳性克隆中提取已扩增的目的基因； 6）目的基因克隆到表达载体，导入寄主细胞并表达。 植物基因工程的一般流程 目的基因的分离→表达载体的构建→植物遗传转化→转化体的筛选、鉴定与植株再生→转基因植物的分子检测→转基因植物的表型鉴定→转基因植物的遗传分析、田间试验 经遗传改良的生物, 统称： genetically modified organism (GMO)； Genetically engineered organism (GEO)。 转基因植物(transgenic plants), 又称： genetically modified plant (GMP)； genetically modified crop (GMC)。 第一节目的基因的分离 目的基因：已经或准备要分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA 片段，称为~。 可能是: 1）全长基因：外显子+内含子+转录启动区+终止区； 2）全长cDNA：UTR区+编码区（ORF）； 3）开放读框/编码区（ORF，CDS）；信使核糖核酸(mRNA)分子中能翻译成多肽的那部分序列。来自DNA分子中的外显子。 4）一个完整的操纵子或基因簇； 5）只含启动子或终止子等元件的DNA 片段。 1. 分离目的基因的策略/方法： 1) 基于已知/同源序列--分子杂交/筛库与PCR； cDNA文库和基因组文库 （1）构建基因组文库或cDNA文库； 基因组文库：将生物基因组DNA切割成一定大小的片段，与合适的载体连接并导入宿主细
一、简述基因研究所取得主要成就，及其与基因工程创立与发展的关系。 1、基因学说的创立 孟德尔提出遗传因子学说到后来的摩尔根染色体理论，揭示了在染色体上基因的线性排列。 2、DNA是遗传物质 从Avery的细菌转化实验到沃森和克里克揭示了DNA的双螺旋模型及半保留复制机理，表明DNA是遗传物质。 3、DNA是基因的载体 4、基因是细胞中RNA及蛋白质的“蓝图”。 5、随着中心法则的提出和64种密码子的破译，基因碱基顺序与蛋白质氨基酸顺序得到对应。 6、随着基因克隆和DNA序列分析技术的发展，人们对基因的分子结构有了进一步的认识。 7、随着操纵子模型的提出，人们对基因的表达调控有了进一步的认识。 8、随着基因分离与克隆技术的不断改良与发展，基因组文库、cDNA文库、分子探针、PCR等技术不断被人们运用。 9、目前，不仅能够分离天然基因，还能结合化学合成等方法，在实验室内进行基因的合成、构建，并进行相应的表达分析。 基因工程是在分子生物学和分子遗传学等学科综合发展的基础上诞生的一门新兴学科，它的创立和发展，直接依赖于基因及其分子生物学研究的进步，基因及其研究为基因工程的创立奠定了坚实的理论基础。二、基因工程建立的三大理论基础和技术条件是什么？并简述其在基因工程中的应用。 1、三大理论基础： （1）1940年艾弗里（O.Avery）等人通过肺炎球菌的转化试验证明了生物的遗传物质是DNA，而且证明了通过DNA可以把一个细菌的性状转移给另一个细菌； （2）1950年沃森（J.D.Watson）和克里克(F.Crick)发现了DNA分子的双螺旋结构及DNA半保留复制机理； （3）1960年关于遗传信息中心法则的确立。 2、三大技术条件： （1）限制性内切核酸酶和DNA连接酶的发现； （2）基因工程载体； （3）大肠杆菌转化体系的建立。 3、应用：
2017年浙江大学硕士各专业报录比及平均分 下列统计中不含非全日制、推免生、单独考试、强军计划、退役士兵计划以及少民骨干计划考生；录取人数中包括了由本校其他相近专业调剂到该专业录取的考生。 010 经济学院020101 政治经济学19 1 393 393 393 010 经济学院020102 经济思想史 2 1 372 372 372 010 经济学院020104 西方经济学25 5 395 367 383 010 经济学院020105 世界经济 1 1 396 396 396 010 经济学院020106 人口、资源与环境经济学 6 1 389 389 389 010 经济学院020201 国民经济学 4 1 378 378 378 010 经济学院020202 区域经济学 6 1 365 365 365 010 经济学院020203 财政学10 1 394 394 394 010 经济学院020204 金融学85 3 398 389 393 010 经济学院020205 产业经济学63 2 423 396 409 010 经济学院020206 国际贸易学27 2 398 380 389 010 经济学院020207 劳动经济学7 1 371 371 371 010 经济学院020209 数量经济学10 1 406 406 406 010 经济学院0202Z1 互联网金融学13 1 402 402 402 010 经济学院025100 金融(专业学位) 451 52 438 394 408 010 经济学院025300 税务18 5 397 378 389 010 经济学院025400 国际商务(专业学位) 58 11 399 368 379 020 光华法学院030101 法学理论12 4 387 342 366 020 光华法学院030103 宪法学与行政法学23 1 410 410 410 020 光华法学院030104 刑法学14 2 368 344 356 020 光华法学院030105 民商法学42 2 350 344 347 020 光华法学院030106 诉讼法学15 1 384 384 384 020 光华法学院030107 经济法学25 3 387 371 381 020 光华法学院030108 环境与资源保护法学 5 1 385 385 385 020 光华法学院030109 国际法学21 3 402 345 366 020 光华法学院035101 法律（非法学）(专业学位) 259 50 408 341 370 020 光华法学院035102 法律（法学）(专业学位) 31 2 336 321 328 030 教育学院040101 教育学原理17 1 396 396 396
一、绪论 二、食品微生物形态与分类- 原核微生物 三、食品微生物形态与结构- 真核微生物 四、食品微生物形态与结构- 无细胞结构微生物 五、微生物的营养与代谢 六、微生物在食品环境中的生长 七、微生物的遗传与育种 八、微生物的污染及腐败变质 九、微生物在食品制造中的应用 十、食品微生物学检验 十一、食品微生物质量控制 一、绪论 1、微生物定义 微生物（microorganism）是指一类形体微小（一般小于0.1mm）、结构简单、肉眼看不见它们的个体，必须借助光学显微镜或电子显微镜才能看清它们的个体的一类微小生物的统称。 从进化的角度看，微生物是比较原始的生物。 2、生物体分类 3、微生物特点 1）个体小，结构简单 结构简单：原核生物都是单细胞；真菌有些是单细胞，有些是简单的多细胞； 病毒和噬菌体由核酸和蛋白质外壳组成，无细胞结构。 2）分布广，种类多 3）适应性强，易变异 4）生长快，培养容易 5）起源早，发现晚 4、微生物学的发展史三位重要人物： 巴斯德的重要贡献： 否定了自生说
?免疫学---提出了预防接种措施（制备了狂犬疫苗） ?提出了巴氏杀菌法，证实发酵由微生物引起（酒精发酵） ?其他：消毒法、家蚕软化（病原学说） 科赫的重要贡献： 证实了炭疽病是由炭疽菌引起的，结核病是由结核杆菌引起的。创立了柯氏 法则：即某一种微生物是否是相应疾病的病原菌的基本原则 5、微生物的具体分类与名称 1)种(Species) 它是一大群表型、性状、特征高度相似，亲缘关系极其接近的与属内其他种有明显差异的菌株的总和，即是以某个“典型菌株”为代表、十分类似的菌株的总称。1987年，国际细菌分类委员会颁布，DNA同源≧ 70%，而且其T m≦5o C的菌群为一个种 2)亚种（Subspecies) 在种内，有些菌株在遗传学上关系密切，而且在表型上仅存在较小的某些差异，在种内分成2个或2个以上的分类单位，即为亚种 亚种以下:生物变型——表示特殊的生化或生理特征；血清变型——表示抗原结构不同； 致病变型——表示某些寄主的专一致病性；噬菌变型——表示对噬菌体的特异性反应； 形态变型——表示特殊的形态特征； 菌株： 不同来源的相同种，如每一个从自然界分离到的微生物纯培养都可以称为一个菌株 菌株常用数字，地名或符号来表示。 3)属（genus） 通常把具有某些共同特征或密切相关的种归为一个属。由于微生物属间差异比较大，而属的划分也没有客观标准。 6、微生物的命名 每一种微生物都用属与种命名，属名和种名用斜体表达 属名在前，用拉丁名词表示微生物的构造、形态、某科学家名字等，描述微生物的主要特征。第一字母大写 种名在后，第一字母小写。用拉丁形容词表示，描述微生物的色素、形状、来源、病名、地名、某科学家的名字等等 如命名对象是新种，需在种名后加n.sp (即novo species) 如仅泛指某一属的微生物，或某属微生物内的某些种，则在属名后用sp.（单数时）或spp.（复数时） 如需表示变种，则在变种学名前加var., 变种学名命名原则与种名的命名同。 7、微生物的分类方法
第二章 1. 名词解释：核酸内切酶、核酸内切限制酶、同裂酶、同尾酶、核酸外切酶、末端脱氧核苷酸转移酶 答： 核酸内切酶：是一类从多核苷酸链的内部催化磷酸二酯键断裂的酶。 核酸内切限制酶：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4—8bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。 同裂酶：识别位点的序列相同的限制性内切酶。 同尾酶：识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。 核酸外切酶：是一类从多核苷酸链的一头开始催化降解核苷酸的酶。 末端脱氧核苷酸转移酶：可以不需要模板，在单链DNA或突出的双链DNA 3’-OH端随机添加dNTPs的酶 2. 限制性内切核酸酶的命名原则是什么？ 答：限制性内切核酸酶按属名和种名相结合的原则命名的，即：属名+种名+株名+序号； 首字母：取属名的第一个字母，且斜体大写； 第二字母：取种名的第一个字母，斜体小写； 第三字母：(1)取种名的第二个字母，斜体小写； (2)若种名有词头，且已命名过限制酶，则取词头后的第一字母代替。 第四字母：若有株名，株名则作为第四字母，是否大小写，根据原来的情况而定，但用正体。 顺序号：若在同一菌株中分离了几种限制酶，则按先后顺序冠以I、Ⅱ、Ⅲ、…等，用正体。 3．部分酶切可采取的措施有哪些？ 答：1）缩短保温时间 2）降低反应温度
3）减少酶的用量 4. 在序列5'-CGAACATATGGAGT-3'中含有一个6bp 的Ⅱ类限制性内切核酸酶的识别序列，该位点的序列可能是什么?答：回文序列是：5'-CATATG-3， 5．什么是限制性内切核酸酶的星号活性? 受哪些因素影响? 答：Ⅱ类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性，但是这种特异性受特定条件的限 制，即在一定环境条件下表现出来的特异性。条件的改变，限制酶的特异性就会松 动，识别的序列和切割都有一些改变，改变后的活性通常称第二活性，而将这种因 条件的改变会出现第二活性的酶的右上角加一个星号表示，因此第二活性又称为星 活性。 概括起来，诱发星活性的因素有如下几种：(1)高甘油含量(>5％, v／v)；(2)限制性 内切核酸酶用量过高(>100U／ugDNA)；(3)低离子强度(<25 mmol／L)； (4)高pH(8．0 以上)；(5)含有有机溶剂，如DMSO，乙醇等；(6)有非Mg2+的二价阳离子存在(如 Mn2+，Cu2+，C02+，Zn2+等)。 第三章 1．如何将野生型的l噬菌体改造成为一个理想的载体? 答：①删除l噬菌体的非必需区，留出插入空间；并在余下的非必须区内制造限制酶切点 ②引进某些突变表型，作为选择标记 ③突变某些基因，使它成为安全载体 ④删除lDNA必须区段上常用的限制酶切点 2．什么是蓝白斑筛选法? 答：这种方法是根据α互补的原理来筛选重组体。主要是在载体的非必要区插入一个带有大肠杆菌b—半乳糖苷酶的α基因片段（LacZ’），携带有lac基因片段的载体转入LacZ’－的宿主菌后，在IPTG（异丙基硫代-β-D 半乳糖）诱导下，载体表达的b—半乳糖苷酶的α肽段和宿主菌表达的b —半乳糖苷酶的b肽段互补，形成有活性的b—半乳糖苷酶，该酶可以分解无色的5—溴—4—氯—3—引哚—b—D—半乳糖苷(X-gal)得到蓝色的5
第七章微生物遗传试题 一．选择题： 71085.71085.已知DNA 的碱基序列为CATCATCA T，什么类型的突变可使其突变为：CTCATCAT A.A.缺失 B.B.插入 C.C.颠换 D.D.转换 答：( ) 71086.71086.已知DNA 的碱基序列为CATCATCA T，什么类型的突变可产生如下碱基序列的改变：CACCATCAT ？ A. 缺失 B. 插入 C. 颠换 D. 转换 答：( ) 71087.71087.不需要细胞与细胞之间接触的基因重组类型有： A. 接合和转化 B. 转导和转化 C. 接合和转导 D. 接合 答：( ) 71088.71088.转化现象不包括 A. DNA 的吸收 B. 感受态细胞 C. 限制修饰系统 D. 细胞与细胞的接触 答：( ) 71089.71089.将细菌作为实验材料用于遗传学方面研究的优点是： A. 生长速度快 B. 易得菌体 C. 细菌中有多种代谢类型 D. 所有以上特点 答：( ) 71090.71090.转导噬菌体 A. 仅含有噬菌体DNA B. 可含有噬菌体和细菌DNA C. 对DNA 酶是敏感的 D. 含1 至多个转座子 答：( ) 71091.71091.在Hfr 菌株中： A. F 因子插入在染色体中 B. 在接合过程中，F 因子首先转移 C. 在接合过程中，质粒自我复制 D. 由于转座子是在DNA 分子间跳跃的，因此发生高频重组 答：( ) 71092.71092.以下碱基序列中哪个最易受紫外线破坏？ A. AGGCAA B. CTTTGA C. GUAAAU D. CGGAGA 答：( ) 71093.71093.对微生物进行诱变处理时，可采用的化学诱变剂是：
第十章软体动物门 要求：掌握软体动物门的主要特征及无齿蚌的形态结构与机能特点，并掌握双神经纲、腹足纲、瓣鳃纲及头足纲的主要特征，了解软体动物的重要经济种类。第一节门的主要特征 代表动物：无齿蚌。 主要特征：体柔软、不分节、两侧对称(腹足纲除外)。体分头、足、内脏团，其皮肤褶形成的外套膜，此膜分泌贝壳，保护身体。用鳃呼吸（外套腔与呼吸的关系）。体腔退化，开管式循环。神经系由四对神经节组成。大多雌雄异体，海产种类个体发育经担轮幼虫和面盘幼虫。 一、身体柔软，多为两侧对称（除腹足纲外），体分头、足、内脏团三部分； 二、具皮肤褶形成的外套膜 来源：为身体背侧皮肤褶向下伸展而成，常包裹整个内脏团并形成 外套腔（出、入水孔） 外层上皮：分泌物形成贝壳 结构结缔组织 内层上皮：具纤毛 内层上皮细胞：纤毛的摆动并通过出入水孔形成水流，借以完成 呼吸、摄食、排泄和生殖等 功能外层上皮：分泌物贝壳 保护内脏 有助运动(如头足类) 呼吸(如蜗牛) 出、入水管：瓣鳃类等软体动物左右两片外套膜紧贴二壳内，其背面与内脏团的皮肤相连，腹缘游离，生活时左右腹缘互相紧贴，构成了其中的外套腔，外套腔之后端形成两个外管，上为出水管，下为入水管。入水管稍大，且有感觉乳突，食物及氧随水流从入水管进入外套腔中，而代谢废物、食物残渣及性产物皆由出水管排出。 三、贝壳（贝类）：1-2或8片贝壳，形态各异
来源：贝壳由外套膜上皮细胞分泌而成 成分：碳酸钙（占95％）及少量的壳基质(或称贝壳素)， 角质层 结构、棱柱层 珍珠层。 功能：保护柔软的身体。 四、足为运动器官，头足类的足变为腕和漏斗。 五、消化系统呈U字形，有消化腺（唾液腺、肝脏等）。除瓣鳃纲外，口内一 般有颚片和齿舌（特有）。 齿舌：是软体动物(除瓣鳃类外)特有的器官，位于口腔底部的舌状突起上，由横列的角质齿组成，似锉刀状。摄食时，由于肌肉伸缩，齿舌可前后活动，以锉刮食物。齿舌的数目，大小和形状为鉴定种类的重要特征之一。 默囊：乌贼等头足类动物在直肠的末端近肛门处有一导管，连一梨形小囊，即墨囊。囊内腺体可分泌墨汁，经导管由肛门排出，使周围海水成黑色，借以隐藏避敌，乌贼之名来源于此。 六、水生种类以鳃呼吸，陆生种类有“肺”。 七、初生体腔和次生体腔并存（但次生体腔极度退化，仅存于围心腔、肾腔 和生殖腔，初生体腔存在于各组织间）；开管式循环系统(头足类十腕目例外，为闭管式循环)，心脏在围心腔内，通常有一心室二心耳(腹足纲仅一心室一心耳)。 围心腔：即软体动物次生体腔的剩余部分，内有心脏，外有围心腔膜包围，一般位于内脏团背侧。 鳃心：乌贼等头足类动物除心室能搏动外，还有两个鳃心亦可搏动。 鳃心位于二鳃基部，为此处入鳃静脉血管膨大所形成，其壁为海绵质，能收缩，可加快静脉入鳃的速度，加速气体交换，增强循环、代谢效率。 八、后肾型排泄系统，通常具肾一对(腹足类因扭转仅具肾一个)。
一、名词解释(20’) 引物、克隆、探针、转化率、重组率、基因工程、分子克隆技术、限制性核酸内切酶 1、基因工程 基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。 2、基因表达 是指细胞在生命过程中，把储存在DNA顺序中遗传信息经转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子 3、限制性核酸内切酶 能特异性识别双链DNA某段特殊序列，并切割DNA双链的酶，主要存在于原核细菌中，主要作用是保护自身DNA不受限制，及破坏外源DNA使之迅速降解 4、重组率：重组率= 含有外源DNA的重组分子数/ 载体分子总数 在常规实验条件下，重组率一般为25-75%；重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大简化DNA重组的后续操作 5、探针 一小段单链DNA或RNA片段，用于检测与其互补的核酸序列，双链DNA加热变性成为单链，随后用放射性同位素(P-32常用)、荧光燃料或酶标记成为探针 1 U DNA连接酶的酶活性 在最佳反应条件下15 ℃反应1h，完全连接 1 mg l-DNA（Hind III片段）所需的酶量 二、选择题 1、重组乙肝疫苗是 由重组酵母或重组CHO工程细胞表达的乙型肝炎表面抗原，经纯化、灭活及加入佐剂吸附制成。前者为重组酵母乙型肝炎疫苗，后者为重组CHO乙型肝炎疫苗 2、基因工程用于药物筛选模型的战略 3、控制质粒拷贝数的意义是使外源蛋白在细胞内更稳定 4、酵母作为受体，比大肠杆菌的优势在于 大肠：原核 酵母：真核，具有多种细胞器，在用于生产需加工分泌的蛋白质时比大肠杆菌有优势 5、分子杂交的化学本质是形成氢键 6、PCR定点突变DNA的方法是 碱基的添加、删除、点突变 7、双链DNA切开后，两链末端基团是5'-磷酸基和3'-羟基的末端『五菱三枪』 8、限制性核酸内切酶缓冲液中，DTT的功能是 还原，抗氧化。保护酶分子上的还原性基团，维持还原性环境，稳定酶活 9、DNA连接反应的最佳温度是16℃ 10、聚乙二醇促进平头DNA分子连接的机理： 促进DNA分子凝聚成聚集体的物质以提高转化效率 11、大肠杆菌DNA聚合酶的用途： 细胞复制DNA的重要作用酶，催化DNA合成 Klenow酶：又称Klenow片段，用枯草杆菌蛋白酶将DNA聚合酶I裂解为36kD和76kD
第十章遗传物质的改变（1）-染色体畸变 1 什么叫染色体畸变？ 解答：染色体畸变是指染色体发生数目或结构上的改变。（1）染色体结构畸变指染色体发生断裂，并以异常的组合方式重新连接。其畸变类型有缺失、重复、倒位、易位。（2）染色体数目畸变指以二倍体为标准所出现的成倍性增减或某一对染色体数目的改变统称为染色体畸变。前一类变化产生多倍体，后一类称为非整倍体畸变。 2 解释下列名词： （1）缺失；（2）重复；（3）倒位；（4）易位。 解答： 缺失：缺失指的是染色体丢失了某一个区段。 重复：重复是指染色体多了自己的某一区段 倒位：倒位是指染色体某区段的正常直线顺序颠倒了。 易位：易位是指某染色体的一个区段移接在非同源的另一个染色体上。 3 什么叫平衡致死品系？在遗传学研究中，它有什么用处？ 解答：紧密连锁或中间具有倒位片段的相邻基因由于生殖细胞的同源染色体不能交换，所以可以产生非等位基因的双杂合子，这种利用倒位对交换抑制的效应，保存非等位基因的纯合隐性致死基因，该品系被称为平衡致死系。平衡致死的个体真实遗传，并且它们的遗传行为和表型表现模拟了具有纯合基因型的个体，因此平衡致死系又称永久杂种。 平衡致死品系在遗传学研究中的用处： （1）利用所谓的交换抑制子保存致死突变品系-平衡致死系可以检测隐形突变（2）用于实验室中致死、半致死或不育突变体培养的保存（3）检测性别 4 解释下列名词： （1）单倍体，二倍体，多倍体。 （2）单体，缺体，三体。 （3）同源多倍体，异源多倍体。 解答： （1）单倍体(haploid)：是指具有配子体染色体数目的个体。
二倍体(diploid)：细胞核内具有两个染色体组的生物为二倍体。 多倍体(polyploid)：细胞中有3个或3个以上染色体组的个体称为多倍体。（2）单体(monosomic)：是指体细胞中某对染色体缺少一条的个体（2n－1）。 缺体(nullosomic)：是指生物体细胞中缺少一对同源染色体的个体（2n －2），它仅存在于多倍体生物中，二倍体生物中的缺体不能存活。 三体(trisomic)：是指体细胞中的染色体较正常2n个体增加一条的变异类型，即某一对染色体有三条染色体（2n＋1）。 （3）同源多倍体：由同一染色体组加倍而成的含有三个以上的染色体组的个体 称为同源多倍体。 异源多倍体：是指体细胞中具有2个或2个以上不同类型的染色体组。 5 用图解说明无籽西瓜制种原理。 解答：优良二倍体西瓜品种 人工加倍 ♀三倍体×二倍体♂ 联会紊乱 三倍体无籽西瓜 6 异源八倍体小黑麦是如何育成的？ 解答：普通小麦×黑麦 (42) AABBDD RR(14) ABDR 染色体加倍 AABBDDRR(56) 异源八倍体小黑麦 7 何以单倍体的个体多不育？有否例外？举例。 解答：单倍体个体多是不育的，因为单倍体在减数分裂时,由于染色体成单价体存在,没有相互联会的同源染色体,所以最后将无规律地分离到配子中去,结果极大多数不能发育成有效配子,因而表现高度不育。有时也存在特殊的情况，例如四