湖北大学
学年论文（课程设计）
学院：生命科学学院
专业：生物技术
年级： 2012级生物技术本科班
姓名：徐振良
论文（设计）题目：内含子对真核基因表达调控的影响
指导教师：职称：
成绩：
2016 年 1 月 8 日
目录
摘要: (1)
关键词: (1)
1 真核mRNA内含子的特征和剪接机制 (1)
1.1 U2-型内含子的特征及剪接机制 (1)
1.2 U12-型内含子的特性及剪接机制 (2)
2 真核mRNA内含子对基因表达调控的影响 (2)
2.1 真核mRNA内含子对转录的促进作用 (2)
2.2 内含子剪接与其它pre-mRNA加工事件的相互作用 (3)
2.2.1 内含子剪接与5′端加帽 (3)
2.2.2 内含子剪切与加帽的区别 (3)
2.3 真核mRNA内含子对下游mRNA新陈代谢的促进作用 (3)
2.3.1 内含子的作用部位 (3)
2.3.2 内含子对翻译的促进作用 (4)
2.3.3 mRNA监视 (4)
3 展望 (5)
参考文献 (5)
内含子对真核基因表达调控的影响
摘要:大多数真核基因都含有非编码的间隔序列——内含子，根据剪接机制的不同，可将内含子分为3类:真核mRNA内含子、自我剪接内含子和真核tRNA 内含子。在多数情况下，真核mRNA内含子的存在可以提高基因的表达水平，因为其剪接过程会影响mRNA新陈代谢的多个阶段，包括转录、RNA编辑、pre-mRNA 的加工、mRNA的出核运输、翻译和无义衰变等。真核mRNA内含子在真核生物基因表达调控中起着重要的作用，是转基因研究中提高外源基因表达的重要元件之一。就真核mRNA内含子的特性、剪接机制及其对真核基因表达调控的影响作一概述。
关键词:内含子剪接基因表达调控
真核生物基因的一个基本特征是它们被一个或多个内含子所间隔，这些间隔DNA 在转录后被除去以形成具有完整读码框的mRNA，这一过程叫做内含子的剪接。根据剪接机制的不同，可将内含子分为3类:真核mRNA内含子、自我剪接内含子和真核tRNA内含子。真核mRNA内含子最初被认可的功能主要有2种，一是通过外显子的复制和移动简化新基因的进化历程；二是通过可变剪接由单基因表达多种蛋白，丰富了蛋白的多样性。
1 真核mRNA内含子的特征和剪接机制
1.1 U2-型内含子的特征及剪接机制
随着基因组测序计划的进行，人们发现大多数的真核基因都含有内含子，并且主要是真核mRNA内含子。真核mRNA内含子有两种类型:U2-型内含子和U12-型内含子，U2-型内含子存在较为普遍，占总数的99%，而U12-型内含子含量较少(<0.4%)。U2-型内含子的5′剪接位点(5′splicingsite，5′ss)具有AG/GTAAGT 的保守序列，3′剪接位点具有TGCAG/G(3′splicingsite，3′ss)的保守序列(图1)。分支点位于3′ss上游大约20~30nt处，序列并不保守，一般含有一个腺苷酸，突变或缺失腺苷酸会降低剪接的效率或导致pre-mRNA无法剪接。脊椎动物内含子分支点下游还有一段多聚嘧啶序列，是其他生物内含子不具有的。植物内含子的一个显著特点就是富含UA序列，UA序列均匀的分散在整个内含子当中，对于保证剪接的保真度和精确性起着关键的作用。U2-型内含子的剪接包括两步连续的转酯反应:第一步，分支点腺苷酸的2′-OH亲核攻击5′剪接位点的磷酸集团，产生套索状中间物和自由的5′端外显子。第二步5′外显子的羟基亲核攻击3′剪接位点的磷酸二酯键，去除套索状的内含子序列，同时将相邻的两个外显子连接起来。整个剪接反应由一个巨大的核糖核蛋白体(RNP)-剪接体(spliceosome)介导。剪接体的装配是高度有序和动态的反应，包括RNA-RNA，
RNA-蛋白，蛋白-蛋白之间的相互作用。在剪接过程中RNA结合蛋白，RNA解旋酶，蛋白激酶等多种蛋白因子参与其中，保证了外显子、内含子的序列被有效的区分，5′ss和3′ss被正确的选择。
1.2 U12-型内含子的特性及剪接机制
虽然U12-型内含子含量较少，但是在植物、哺乳动物、昆虫的核基因组中均有发现。第一个发现的U12-型内含子是以AT双核苷酸开始，A双核苷酸结束，所以U12-型内含子又被称为AT-AC型内含子。后来发现U12-型内含子也有GT-AG 型的，此外还有一小部分边界并不规则。U12-型内含子5′-ss(G/ATATCCTY)和分支点(TCCTTRAY)序列高度保守，而3′ss序列的保守性稍差(YAC/G)，与分支点之间距离大约为10~20nt。植物U12-型内含子也富含UA序列，与U2-型内含子相似。U12-型内含子的剪接体包括5个小的核糖核蛋白组分。除了与U2型相同的U5snRNP外，其它4种组分分别为U11，U12，U4atac，U6atac，与之对应的U2型内含子剪接体组分为U1，U2，U4和U6，虽然这些组分的序列不尽相同，功能位点却十分保守。值得注意的是，GT-AG型内含子经常被U12型剪接体剪接，AT-AC型内含子也可以被U2型剪接体剪接，可见是内含子的整个序列，而不只是边界序列决定到底是哪一种剪接体起作用。至今为止，只对极少数的U12型内含子进行了研究。Lewandowsk等分离了拟南芥CBP20，GSH2和LD基因的内含子，并对3个内含子的剪接位点、分支点、UA含量进行了突变分析，结果显示U12型内含子的剪接依赖于一系列要素，包括UA含量、邻近的外显子序列、ESEs(Exon Splicing Enhancer sequences)等，各要素都会影响其剪接效率。
2 真核mRNA内含子对基因表达调控的影响
许多基因如β-球蛋白、胸腺激素合成酶、嘌呤核苷磷酸化酶基因当以cDNA形式存在时，表达效率极低，而当有内含子存在时，表达水平会大大提高。在线虫、昆虫、哺乳动物、植物中都发现内含子的存在对基因表达有着积极的作用，内含子已经成为提高外源基因表达的重要元件。下面就真核mRNA内含子对基因表达调控的影响作一综述。
2.1 真核mRNA内含子对转录的促进作用
许多基因中的内含子都可以刺激转录的效率，如转基因鼠的转录效率会因内含子的去除而降低100倍，邻氨基苯甲酸磷酸核糖基化转移酶(PAT1)基因的两个内含子都可以提高报告基因的转录效率，进而提高报告基因的表达。在DNA水平上，内含子以2种方式影响转录。一种方式是通过内含子序列本身含有的转录增强元件或抑制元件。目前在许多基因的内含子中都发现了转录调控元件，其中大多为增强元件。Chang等发现猪的MyHC(Myosin Heavy Chain)基因内含子中存在转录调控元件，可以通过调控转录的起始来增强基因的表达。内含子影响转录的另一种方式是通过调节核小体的位置来控制DNA的可接近性。在对转基因鼠的研究中发现鼠生长激素基因的内含子可以通过促进核小体靠近启动子的有序排列来刺
激转录。最近研究表明RNA聚合酶Ⅱ的CTD(C-terminal domain)在pre-mRNA加工中起着重要的作用，CTD既是转录和pre-mRNA加工的平台，又是它们的调节子。U1snRNA是剪接体的重要组分，可以与转录起始因子TFⅡH相互作用，进而增强RNA聚合酶Ⅱ的转录起始能力。另外，内含子内部的剪接信号可以通过与3种转录延伸因子相互作用增强RNA聚合酶Ⅱ的持续合成能力。转录延伸因子pTEFb能够磷酸化CTD的丝氨酸(Ser)位点，在装配一个新转录的内含子时，pTEFb 集合TAT-SF1、TAT-SF1与剪接因子相互作用，调节剪接复合体的装配，被TAT-SF1结合的剪接复合体可以强烈的刺激转录。最近发现，pTEFb还可以磷酸化另一个转录延伸因子hSPT5，转录延伸因子TFIIS也可与RNA聚合酶Ⅱ的复合体、剪接因子等相互作用。
2.2 内含子剪接与其它pre-mRNA加工事件的相互作用
除了内含子的剪接，pre-mRNA的加工事件还包括5′端的加帽，3′端的裂解和多聚腺苷酸化作用，RNA编辑等。这些加工事件对基因表达调控至关重要，虽然是被独立发现的，但在时间和空间上却是相互偶联的。
2.2.1 内含子剪接与5′端加帽
在RNA聚合酶刚刚合成20~30nt后，聚合反应暂停，通过一个3步反应将帽(cap)结构加入到pre-mRNA的5′端。许多实验都证明了加帽对剪接的促进作用。把含有多个内含子的pre-mRNA加入到在核抽提物中，发现帽子结构可以增强帽子近端第一个内含子的切除，但对第二个内含子的剪接效率影响不大。帽结合复合体(cap-bindingcomplex)可以促进U1snRNP与5′剪接位点之间的作用，通过加强U6对U1snRNP的替换，促进剪接的进行。通过酵母双杂交系统筛选得到可能介导CBC与剪接体相互作用的蛋白因子HnRNPF，HnRNPF可以特异性地与CBC亚基相互作用，去除HnRNPF的抽提物剪接效率明显下降。
2.2.2 内含子剪切与加帽的区别
内含子剪接与3′端形成与5′加帽不同的是，mRNA3′末端的形成与内含子剪接之间的作用是相互的。体外研究发现，上游的3′剪接位点可以有效增强下游多聚腺苷酸化的效率，而3′polyA尾巴也会促进3′ss的识别，两者之间的促进作用会使mRNA的累积量大大增加。这些反应的分子基础是剪接因子与多聚腺苷酸化作用因子之间的直接作用。另外，剪接还会影响PolyA位点的选择，导致不同基因产物的产生。如在IgM基因中，内含子内部相对较弱的PolyA位点会由于U1-70K的作用而受到上游5′剪接位点的抑制，产生含有内含子的的转录本。
2.3 真核mRNA内含子对下游mRNA新陈代谢的促进作用
2.3.1 内含子的作用部位
内含子对mRNA运输的促进作用内含子的剪接与mRNA的输出虽然发生在细胞的不同部位，但这两个过程却是直接相关的。以前曾有报告指出cDNA转录的mRNA 不能出核，因此不能够表达蛋白，而包含有内含子的mRNA转录本可以有效的输
出而被翻译，说明内含子对mRNA的出核运输有促进作用。最近研究发现含有内含子的转录本是由不同于cDNA转录本的促进出核的mRNP复合体所装配。mRNP 中剪接因子UAP56可以将输出因子Aly结合到mRNA上，ALY与mRNA出核受体TAP 之间相互作用，将mRNA运送到核孔处出核翻译。但是应该指出的是虽然剪接可以促进mRNA的输出，但是剪接并不是mRNA出核所必须的，因为许多运输因子都可以独立于剪接而单独作用。本身不含内含子的转录本(组蛋白等)是靠本身含有的特异序列与输出因子结合，不需要剪接体的协助。剪接体的另一作用是将未剪接的转录本保留在细胞核中，促进成熟正确剪接的mRNA输出。剪接因子hnRNP 将初级和部分剪接的转录本包裹起来保留在核中，mRNP/输出因子复合体将成熟的mRNA带出细胞核。然而，在一些反转录病毒中，一些蛋白的表达往往需要非转录或部分转录本的存在，这些病毒基因在内含子中通常包括与特异病毒或细胞运输因子相互作用的顺式作用元件，所以能够打破核滞留。
2.3.2 内含子对翻译的促进作用
Braddock等人发现当将成熟的mRNA直接注射入非洲爪蟾(Xenopus)卵母细胞核中时，mRNA在细胞质中的翻译会受到抑制，这种抑制可以通过在3′-UTR处加入可剪接的内含子而消除，说明了内含子对翻译的促进作用。另外，剪接体剪接结束后在外显子接头上游20~24nt处沉积的EJC(exon junction complex)可以增强核糖体与mRNA之间的结合。研究发现，将EJC组成蛋白Y14、Magoh、RNPS1加入到无内含子的转录本中，翻译的效率会大大提高。当将参与NMD(nonsense-mediated mRNA decay)的EJC蛋白因子Upf1、Upf2、Upf3b加入到报告基因ORF(Open Read Frame)的5′端，翻译的产量、核糖体与mRNA之间的结合大大增加，说明参与NMD作用的EJC因子不仅用于消除异常的转录本，在翻译中也担当了新的任务。Matsumot等发现剪接对翻译的影响与内含子的位置有关。当内含子置于5′-UTR时，翻译会被大大的刺激，而当内含子置于3′-UTR 时，翻译的水平会低于无内含子的水平。内含子识别、内含子对位置的依赖、内含子对翻译的影响机理还不甚清楚。但是对于想要优化转基因生物表达的研究者来说，必须关注内含子的位置，这是一个十分重要的元素。当内含子位于表达核的3′-UTR时，除了翻译的效率会降低外，甚至还会引起mRNA的无义衰变，导致更低水平蛋白的表达。
2.3.3 mRNA监视
内含子剪接与无义介导的mRNA(nonsense-mediated mRNA decay，NMD)无义介导的mRNA衰变又名mRNA监视，是指选择性的降解含有早熟终止密码子(premature termination codons，PTCs)的mRNA，对转录后的mRNA进行质量控制。NMD广泛存在于各种真核生物中，可以消除由畸变mRNA产生的截短的有害的蛋白。NMD 的一个关键步骤是区分早熟的和正常的终止密码子。在哺乳动物中，如终止密码子与下游外显子接头处间距大于50~55nt，则被认为是早熟的，相应的mRNA会被降解。最近研究发现EJC包含与NMD作用的重要因子。在剪接因子RNPf1和蛋
白因子Y14的作用下，输出因子hUPF3结合到EJC上，这些因子伴随mRNA进入细胞质，在细胞质中被翻译终止复合体所检测。在第一轮翻译后，这些蛋白因子虽然从mRNA上剥去，利用特异的蛋白将mRNA降解，但是NMD复合体对入膜的正确mRNA已经有了记忆功能，这就使核内剪接与膜中NMD之间建立起了直接联系。
3 展望
随着分子生物学的发展，越来越多的证据显示，真核mRNA内含子在真核基因表达调控中起着重要的作用。在单子叶植物中，玉米adh1和sh1内含子使转基因玉米报告基因的表达水平提高10~100倍。在双子叶植物中也观察到了内含子增强表达的现象，但是这种增强幅度较小，一般为2~5倍。实验室将玉米泛素蛋白基因ubiquitin的内含子ubi插入到具有自主知识产权的Bt杀虫基因cry1Ah 上游，基因枪法转化玉米愈伤组织，对获得的T1代植株进行了ELISA检测，结果显示ubi使Btcry1Ah的表达量提高了11.9%(王悦冰，未发表)。内含子的剪接通过刺激转录、提高mRNA稳定性、促进mRNA的输出、增强mRNA的翻译等提高基因的表达。但是这些过程是怎么相互联系的，到底哪一个步骤占主导地位、起着最为关键的作用还不清楚。外显子接头复合体——EJC中的蛋白因子在mRNA 新陈代谢的各个阶段均行驶其功能，无疑是内含子发挥其积极作用的一个关键因子，对EJC的研究有利与解开内含子增强效应的谜团。随着基因组测序计划的进行，人们将会更加深入的了解参与剪接的顺式作用元件和反式作用因子，对内含子的认识将会不断突破，这对于想要优化转基因生物表达的研究者来说，无疑是一个巨大的财富。
参考文献
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真核基因表达调控的特点 尽管我们现在对真核基因表达调控知道还不多，但与原核生物比较它具有一些明显的特点。 真核基因表达调控的环节更多 如前所述：基因表达是基因经过转录、翻译、产生有生物活性的蛋白质的整个过程。同原核生物一样，转录依然是真核生物基因表达调控的主要环节。但真核基因转录发生在细胞核（线粒体基因的转录在线粒体内），翻译则多在胞浆，两个过程是分开的，因此其调控增加了更多的环节和复杂性，转录后的调控占有了更多的分量。 图中标出了真核细胞在分化过程中会发生基因重排（gene rearrangement），即胚原性基因组中某些基因会再组合变化形成第二级基因。例如编码完整抗体蛋白的基因是在淋巴细胞分化发育过程中，由原来分开的几百个不同的可变区基因经选择、组合、变化、与恒定区基因一起构成稳定的、为特定的完整抗体蛋白编码的可表达的基因。这种基因重排使细胞可能利用几百个抗体基因的片段，组合变化而产生能编码达108种不同抗体的基因，其中就有复杂的基因表达调控机理。 此外，真核细胞中还会发生基因扩增（gene amplification），即基因组中的特定段落在某些情况下会复制产生许多拷贝。最早发现的是蛙的成熟卵细胞在受精后的发育程中其rRNA 基因（可称为rDNA）可扩增2000倍，以后发现其他动物的卵细胞也有同样的情况，这很显然适合了受精卵其后迅速发育分裂要合成大量蛋白质要求有大量核糖体的需要。又如MTX （methotrexate）是叶酸的结构类似物，能竞争性抑制细胞对叶酸的还原利用，因而对细胞有毒性，但当缓慢提高MTX浓度时，一些哺乳类细胞会对含有利用叶酸所必需的二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase,DHFR)基因的DNA区段扩增40-400倍，使DHFR的表达量显著增加，从而提高对MTX的抗性。基因的扩增无疑能够大幅度提高基因表达产物的量，但这种调控机理至今还不清楚。 真核基因的转录与染色质的结构变化相关 真核基因组DNA绝大部分都在细胞核内与组蛋白等结合成染色质，染色质的结构、染色质中DNA和组蛋白的结构状态都影响转录，至少有以下现象： 染色质结构影响基因转录细胞分裂时染色体的大部分到间期时松开分散在核内，称为常染色质（euchromatin），松散的染色质中的基因可以转录。染色体中的某些区段到分裂期后不像其他部分解旋松开，仍保持紧凑折叠的结构，在间期核中可以看到其浓集的斑块，称为异染色质（hetrochromatin），其中从未见有基因转录表达；原本在常染色质中表达的基因如移到异染色质内也会停止表达；哺乳类雌体细胞2条X染色体，到间期一条变成异染色质者，这条X染色体上的基因就全部失活。可见紧密的染色质结构阻止基因表达。 组蛋白的作用早期体外实验观察到组蛋白与DNA结合阻止DNA上基因的转录，去除组蛋白基因又能够转录。组蛋白是碱性蛋白质，带正电荷，可与DNA链上带负电荷的磷酸基相结合，从而遮蔽了DNA分子，妨碍了转录，可能扮演了非特异性阻遏蛋白的作用；染色质中的非组蛋白成分具有组织细胞特异性，可能消除组蛋白的阻遏，起到特异性的去阻遏促转录作用。 发现核小体后，进一步观察核小体结构与基因转录的关系，发现活跃进行基因转录的染色质区段常有富含赖氨酸的组蛋白（H1组蛋白）水平降低、H2A、H2B组蛋白二聚体不稳定性增加、组蛋白乙酰化（acetylation）和泛素化（obiquitination）、以及H3组蛋白巯基等现
真核生物基因表达的调控 一、生物基因表达的调控的共性 首先，我们来看看在生物基因表达调控这一过程中体现的共性和一些基本模式。 1、作用范围。生物体内的基因分为管家基因和奢侈基因。管家基因始终表达，奢侈基因只在需要的时候表达，但二者的表达都受到调控。可见，调控是普遍存在的现象。 2、调控方式。基因表达有两种调控方式，即正调控与负调控，原核生物和真核生物都离不开这两种模式。 3、调控水平。一种基因表达的调控可以在多种层面上展开，包括DNA水平、转录水平、转录后加工水平、翻译后加工水平等。然为节省能量起见，转录的起始阶段往往作为最佳调控位点。 二、真核生物基因表达调控的特点 真核生物与原核细胞在结构上就有着诸多不同，这决定了二者在运行方面的迥异途径。真核生物比原核生物复杂，转录与翻译不同时也不同地，基因组与染色体结构复杂，因而有着更为复杂的调控机制。 1、 2、 3、 4、多层次。真核生物的基因表达可发生在染色质水平、转录起始水平、无操纵子和衰减子。 大多数原核生物以负调控为主，而真核生物启动子以正调控为主。 个体发育复杂，而受环境影响较小。真核生物多为多细胞生物，在转录后水平、翻译水平以及翻译后水平。
生长发育过程中，不仅要随细胞内外环境的变化调节基因表达，还要随发育的不同阶段表达不同基因。前者为短期调控，后者属长期调控。 从整体上看，不可逆的长期调控影响更深远。 三、真核生物基因表达调控的机制 介于真核生物表达以多层次性为最主要特点，我们可以分别从它的几个水平着眼，剖析它的调控机制。 1、染色质水平。真核生物基因组DNA以致密的染色质形式存在，发生在染色质水平的调控也称作转录前水平的调控，产生永久性DNA序列和染色质结构的变化，往往伴随细胞分化。染色质水平的调控包括染色质丢失、基因扩增、基因重排、染色体DNA的修饰，等等。a.基因丢失：丢失一段DNA或整条染色体的现象。在细胞分化过程中，可以通过丢失掉某些基因而去除这些基因的活性。某些原生动物、线虫、昆虫和甲壳类动物在个体发育中，许多体细胞常常丢失掉整条或部分的染色体，只有将来分化产生生殖细胞的那些细胞一直保留着整套的染色体。如马蛔虫2n＝2，但染色体上有多个着丝粒。第一次卵裂是横裂，产生上下2个子细胞。第二次卵裂时，一个子细胞仍进行横裂，保持完整的基因组，而另一个子细胞却进行纵向分裂，丢失部分染色体。目前，在高等真核生物（包括动物、植物）中尚未发现类似的基因丢失现象。 b.基因扩增：基因扩增是指某些基因的拷贝数专一性增大的现象，它使得细胞在短期内产生大量的基因产物以满足生长发育的需要，是基因活性调控的一种方式。如非洲爪蟾卵母细胞中rDNA的基因扩增是因发育需要而出现的基因扩增现象；基因组拷贝数增加，即多倍性，在植物中是非常普遍的现象。基因组拷贝数增加使可供遗传重组的物质增多，这可能构成了加速基因进化、基因组重组和最终物种形成的一种方式。 c.基因重排：将一个基因从远离启动子的地方移到距它很近的位点从而启动转录，这种方式被称为基因重排。通过基因重排调节基因活性的典型例子是免疫球蛋白结构基因的表达。在人类基因组中，所有抗体的重链和轻链都不是由固定的完整基因编码的，而是由不同基因片段经重排后形成的完整基因编码的。
一、真核基因组的复杂性 与原核生物比较，真核生物的基因组更为复杂，可列举如下。 1. 真核基因组比原核基因组大得多，大肠杆菌基因组约4×106bp，哺乳类基因组在 109bp数量级，比细菌大千倍；大肠杆菌约有4000个基因，人则约有10万个基因。 2. 真核生物主要的遗传物质与组蛋白等构成染色质，被包裹在核膜内，核外还有遗传 成分(如线粒体DNA等)，这就增加了基因表达调控的层次和复杂性。 3. 原核生物的基因组基本上是单倍体，而真核基因组是二倍体。 4. 如前所述，细菌多数基因按功能相关成串排列，组成操纵元的基因表达调控的单元， 共同开启或关闭，转录出多顺反子(polycistron)的mRNA；真核生物则是一个结构基因转录生成一条mRNA，即mRNA是单顺反子(monocistron)，基本上没有操纵元的结构，而真核细胞的许多活性蛋白是由相同和不同的多肽形成的亚基构成的，这就涉及到多个基因协调表达的问题，真核生物基因协调表达要比原核生物复杂得多。 5. 原核基因组的大部分序列都为基因编码，而核酸杂交等实验表明：哺乳类基因组中 仅约10%的序列为蛋白质、rRNA、tRNA等编码，其余约90%的序列功能至今还不清楚。 6. 原核生物的基因为蛋白质编码的序列绝大多数是连续的，而真核生物为蛋白质编码 的基因绝大多数是不连续的，即有外显子(exon)和内含子(intron)，转录后需经剪接(splicing)去除内含子，才能翻译获得完整的蛋白质，这就增加了基因表达调控的环节。 7. 原核基因组中除rRNA、tRNA基因有多个拷贝外，重复序列不多。哺乳动物基因组 中则存在大量重复序列(repetitive sequences)。用复性动力学等实验表明有三类重复序列：1）高度重复序列(highly repetitive sequences)，这类序列一般较短，长10－300bp，在哺乳类基因组中重复106次左右，占基因组DNA序列总量的10－60%，人的基因组中这类序列约占20%，功能还不明了。2）中度重复序列(moderately repetitive sequences)，这类序列多数长100－500bp，重复101－105次，占基因组10-40%。例如哺乳类中含量最多的一种称为Alu的序列，长约300bp，在哺乳类不同种属间相似，在基因组中重复3×105次，在人的基因组中约占7%，功能也还不很清楚。在人的基因组中18S/28SrRNA基因重复280次，5SrRNA基因重复2000次，tRNA基因重复1300次，5种组蛋白的基因串连成簇重复30-40次，这些基因都可归入中度重复序列范围。3）单拷贝序列(single copy sequences)。这类序列基本上不重复，占哺乳类基因组的50-80%，在人基因组中约占65%。绝大多数真核生物为蛋白质编码的基因在单倍体基因组中都不重复，是单拷贝的基因。 从上述可见真核基因组比原核基因组复杂得多，至今人类对真核基因组的认识还很有限，使现在国际上制订的人基因组研究计划(human gene project)完成，绘出人全部基因的染色体定位图，测出人基因组109bp全部DNA序列后，要搞清楚人全部基因的功能及其相互关系，特别是要明了基因表达调控的全部规律，还需要经历很长期艰巨的研究过程。 二、真核基因表达调控的特点 尽管我们现在对真核基因表达调控知道还不多，但与原核生物比较它具有一些明显的特点。
第十章作业 1. 简述真核生物基因表达调控的7个层次。 ①染色体和染色质水平上的结构变化与基因活化 ②转录水平上的调控，包括基因的开与关，转录效率的高与低 ③RNA加工水平的调控，包括对出事转录产物的特异性剪接、修饰、编辑等。 ④转录后加工产物在从细胞核向细胞质转运过程中所受到的调控 ⑤在翻译水平上的控制，即对哪一种mRNA结合核糖体进行翻译的选择以及蛋白质成量的控制 ⑥对蛋白质合成后选择性地被激活的控制，蛋白质和酶分子水平上的剪接等的控制 ⑦对mRNA选择性降解的调控 2. 真核基因表达调控与原核生物相比有何异同？ 相同点：①与原核基因的调控一样，真核基因表达调控也有转录水平调控和转录后水平的调控，并且也以转录水平调控为最重要； ②在真核结构基因的上游和下游(甚至内部)也存在着许多特异的调控成分，并依靠特异蛋白因子与这些调控成分的结合与否调控基因的转录。 不同点：①原核细胞的染色质是裸露的DNA，而真核细胞染色质则是由DNA与组蛋白紧密结合形成的核小体。 ②在原核基因转录的调控中，既有激活物参与的正调控，也有阻遏物参与的负调控，二者同等重要。 ③原核基因的转录和翻译通常是相互偶联的，即在转录尚未完成之前翻译便已开始。 ④真核生物大都为多细胞生物，在个体发育过程中发生细胞分化后，不同细胞的功能不同，基因表达的情况也就不一样，某些基因仅特异地在某种细胞中表达，称为细胞特异性或组织特异性表达，因而具有调控这种特异性表达的机制。 3. DNA 甲基化对基因表达的调控机制。 甲基化抑制基因转录的机制：DNA甲基化会导致某些区域DNA构象改变，包括甲基化后染色质对于核酸酶或限制性内切酶的敏感度下降，更容易与组蛋白H1相结合，DNaseⅠ超敏感位点丢失，使染色质高度螺旋化, 凝缩成团, 直接影响了转录因子与启动区DNA的结合效率的结合活性，不能启始基因转录。DNA的甲基化不利于模板与RNA聚合酶的结合，降低了转录活性。 4. 转录因子结合DNA的结构基序（结构域）有哪几类？ ①螺旋-转折-螺旋 ②锌指结构 ③碱性-亮氨酸拉链 ④碱性-螺旋-环-螺旋 5. 真核基因转调控中有几种方式能够置换核小体？ ①占先模式：可以解释转录时染色质结构的变化。该模型认为基因能否转录取决于特定位置上组蛋白和转录因子之间的不可逆竞争性结合。 ②动态模式该模型认为转录因子与组蛋白处于动态竞争之中，基因转录前染色质必须经历结构上的改变，即转换核小体中的全部或部分成分并重新组装，这个耗能的基因活化过程称为染色质重构 6. 简述真核生物转录水平调控过程。 真核生物在转录水平的调控主要是通过反式作用因子、顺式作用元件和RNA聚合酶的相互作用来完成的，主要是反式作用因子结合顺式作用元件后影响转录起始复合物的形成过程：①转录起始复合物的形成：真核生物RNA聚合酶识别的是由通用转录因子与DNA形成的
真核生物基因表达的调控远比原核生物复杂，可以发生在DNA水平、转录水平、转录后的修饰、翻译水平和翻译后的修饰等多种不同层次。但是，最经济、最主要的调控环节仍然是在转录水平上。 DNA水平的调控 DNA水平上的调控主要指通过染色体DNA的断裂，删除，扩增，重排，修饰（如甲基化与去甲基化，乙酰化与去乙酰化等）和染色质结构变化等改变基因的数量、结构顺序和活性而控制基因的表达。 转录水平的调控 转录水平的调控包括染色质的活化和基因的活化。通过染色质改型，组蛋白乙酰化，染色质变得疏松化及DNA去甲基化以便被酶和调节蛋白作用，基因的表达受顺式作用元件包括启动子及应答元件，转座元件，增强子，抑制子的调控，同时受反式作用因子包括基本转录因子，上游转录因子和转录调节因子等的调控。 转录后调控 转录后调控包括hnRNA的选择性加工运输和RNA编辑 在真核生物中，蛋白质基因的转录产物统称为hn RNA，必须经过加工才能成为成熟的mRNA分子。加工过程包括三个方面：加帽、加尾和去掉内含子。同一初级转录产物在不同细胞中可以用不同方式剪接加工，形成不同的成熟mRNA分子，使翻译成的蛋白质都可能不同。转录后的RNA在编码区发生碱基插入，缺失或转换的现象。
翻译水平的调控 阻遏蛋白与mRNA结合，可以阻止蛋白质的翻译并使成熟的mRNA变为失活状态贮存起来。一些调控作用的micRNAh和siRNA 还可以与mRNA作用降解mRNA，阻止其翻译 此外，还可以控制mRNA的稳定性和有选择的进行翻译。 翻译后调控 直接来自核糖体的线状多肽链是没有功能的，必须经过加工才具有活性。在蛋白质翻译后的加工过程中，还有一系列的调控机制。 1．蛋白质折叠 线性多肽链必须折叠成一定的空间结构，才具有生物学功能。在细胞中，蛋白质的折叠必须有分子伴侣的作用下才能完成折叠。 2．蛋白酶切割 末端切割 有些膜蛋白、分泌蛋白，在氨基端具有一段疏水性强的氨基酸序列，称为信号肽，用于前体蛋白质在细胞中的定位。信号肽必须切除多肽链才具有功能。 多聚蛋白质的切割 有些新合成的多肽链含有几个蛋白质分子的序列，切割以后产生具有不同功能的蛋白质分子。
真核生物基因表达的调控 河南大学民生学院王磊生物技术 一、生物基因表达的调控的共性 首先，我们来看看在生物基因表达调控这一过程中体现的共性和一些基本模式。 1、作用范围。生物体内的基因分为管家基因和奢侈基因。管家基因始终表达，奢侈基因只在需要的时候表达，但二者的表达都受到调控。可见，调控是普遍存在的现象。 2、调控方式。基因表达有两种调控方式，即正调控与负调控，原核生物和真核生物都离不开这两种模式。 3、调控水平。一种基因表达的调控可以在多种层面上展开，包括DNA水平、转录水平、转录后加工水平、翻译后加工水平等。然为节省能量起见，转录的起始阶段往往作为最佳调控位点。 二、真核生物基因表达调控的特点 真核生物与原核细胞在结构上就有着诸多不同，这决定了二者在运行方面的迥异途径。真核生物比原核生物复杂，转录与翻译不同时也不同地，基因组与染色体结构复杂，因而有着更为复杂的调控机制。 1、多层次。真核生物的基因表达可发生在染色质水平、转录起始水平、转录后水平、翻译水平以及翻译后水平。 2、无操纵子和衰减子。 3、大多数原核生物以负调控为主，而真核生物启动子以正调控为主。 4、个体发育复杂，而受环境影响较小。真核生物多为多细胞生物，在生长发育过程中，不仅要随细胞内外环境的变化调节基因表达，还要随发育的不同阶段表达不同基因。前者为短期调控，后者属长期调控。从整体上看，不可逆的长期调控影响更深远。 三、真核生物基因表达调控的机制 介于真核生物表达以多层次性为最主要特点，我们可以分别从它的几个水平着眼，剖析它的调控机制。 1、染色质水平。真核生物基因组DNA以致密的染色质形式存在，发生在染色质水平的调控也称作转录前水平的调控，产生永久性DNA序列和染色质结构的变化，往往伴随细胞分化。染色质水平的调控包括染色质丢失、基因扩增、基因重排、染色体DNA的修饰，等等。 a.基因丢失：丢失一段DNA或整条染色体的现象。在细胞分化过程中，可以通过丢失掉某些基因而去除这些基因的活性。某些原生动物、线虫、昆虫和甲壳类动物在个体发育中，许多体细胞常常丢失掉整条或部分的染色体，只有将来分化产生生殖细胞的那些细胞一直保留着整套的染色体。如马蛔虫2n＝2，但染色体上有多个着丝粒。第一次卵裂是横裂，产生上下2个子细胞。第二次卵裂时，一个子细胞仍进行横裂，保持完整的基因组，而另一个子细胞却进行纵向分裂，丢失部分染色体。目前，在高等真核生物（包括动物、植物）中尚未发现类似的基因丢失现象。 b.基因扩增：基因扩增是指某些基因的拷贝数专一性增大的现象，它使得细胞在短期内产生大量的基因产物以满足生长发育的需要，是基因活性调控的一种方式。如非洲爪蟾卵母细胞中rDNA的基因扩增是因发育需要而出现的基因扩增现象；基因组拷贝数增加，即多
原核生物和真核生物基因表达调控特点的比较1.相同点:转录起始是基因表达调控的关键环节2.不同点:A.原核基因的表达调控主要包括转录和翻译水平 真核基因的表达调 控主要包括染色质活化、转录、转录后加工、翻译、翻译后加工多个层次B.原核基因表达调控主要为负调控,真核主要为正调控C.原核转录不需要转录因子,RNA聚合酶直接结合启 动子,由sita因子决定基因表的的特异性 真核基因转录起始需要基础特异两类转录因子 依赖DNA-蛋白质、蛋白质-蛋白质相互作用 调控转录激活D.原核基因表达调控主要采用操纵子模型 转录出多顺反子RNA 实现协调调节 真核基因转录产物为单顺反子RNA 功能相关蛋白的协调表达机制更为复杂。真核生物基因表达调控的环节主要在转录水平 其次是翻译水平。原核生物基因以操纵子的形式存在。转录水平调控涉及到启动子、sita因子 与RNA聚合酶结合 、阻遏蛋白 负调控 、正调控蛋白、倒位蛋白、RNA聚合酶抑制物、衰减子等。翻译水平的调控涉及SD序列、mRNA的稳定性 不稳定(5’端和3’端的发夹结构可保护不被酶水解mRNA的5’端与核糖体结合 可明显提高稳定性)、翻译产物及小分子RNA的调控作用。真核生物基因表达的调控环节较多 在DNA水平上可以通过染色体 丢失、基因扩增、基因重排、DNA甲基化、染色体结构改变影响基因表达。在转录水平主要通过反式作用因子调控转录因子与TATA盒的结合、RNA聚合酶与转录因子-DNA复合物的结合及转录起始复合物的形成。在转录后水平主要通过RNA修饰、剪接及mRNA运输的控制来影响基因表达。在翻译水平有影响起始翻译的阻遏蛋白、5’AUG、5’端非编码区长度、mRNA 的稳定性调节及小分子RNA。真核基因调控中最重要的环节是基因转录 真核生物基因表达需要转录因子、启动子、沉默子和增强子。葡萄糖存在 乳糖不存在 此时无诱导剂
真核生物与原核生物基因表达调控的区别
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真核基因和原核基因表达调控的异同？ 真核基因表达调控的基本原理与原核基因相同，主要表现在： 1、与原核基因的调控一样，真核基因表达调控也以转录水平调控为最重要； 2、在结构基因均有调控序列，并依靠特异蛋白因子与这些调控序列的结合与否调控基因的表达。 3、都要经历转录、翻译的过程。 4、表达过程都有复杂性，多环节 不同 1、真核基因表达调控过程更复杂。 2、在染色质结构上。原核细胞的DNA是裸露的，而真核细胞DNA包装在染色体中。DNA与组蛋白组成核小体形成为染色体基本单位。在原核细胞中染色质结构对基因的表达没有明显的调控作用，而在真核细胞中染色质的变化调控基因表达，并且基因分布在不同的染色体上，存在染色体间基因的调控问题； 3、真核生物中编码蛋白质的基因通常是断裂基因，含有有非编码序列即内含子，因而转录产生的mRNA前体必须剪切加工才能成为有功能的成熟的mRNA，而不同拼接方式的可产生不同的mRNA。而原核生物的基因由于不含有外显子和内含子，因此，转录产生的信使RNA不需要剪切、拼接等加工过程。 4、在原核基因转录的调控中，既有正调控，也有负调控，二者同等重要，而真核细胞中虽然也有正调控成分和负调控成分，但目前已知的主要是正调控，且一个真核基因通常都有多个调控序列，必须有多个激活物同时特异地结合上去才能调节基因的转录； 5、原核基因的转录和翻译通常是相互偶联的，而真核基因的转录与翻译在时空上是分开的，从而使真核基因的表达有多种调控机制。 6、真核生物细胞中存在mRNA的稳定性调控
7、真核生物大都为多细胞生物，基因的表达随细胞内外环境条件的改变和时间程序在不同的表达水平上进行着精确调控，而原核生物主要受环境因素和营养状况影响基因调控。 8、真核生物由三种RNA聚合酶分别负责三种RNA的转录，而原核生物只有一种。
第10章真核生物基因表达的调控 本章教学要求 1.熟悉真核基因组的结构特点、真核生物在DNA水平、转录水平和翻译水平上基因表达调控的特点。 2.掌握以下概念：顺式作用元件、反式作用因子、启动子、增强子，熟悉沉默子、基本转录因子、特异转录因子。 3.了解转录因子的结构特点。 本章教学重点和难点 1、真核生物在DNA水平和转录水平基因表达调控的特点。 2、转录因子的结构特点。 教学方法与手段 讲授与交流互动相结合，采用多媒体教学。 授课内容 10.1 真核生物基因表达调控的特点和种类 一、真核生物基因表达调控的特点 原核生物的调控系统就是要在一个特定的环境中为细胞创造高速生长的条件，或使细胞在受到损伤时，尽快得到修复，所以，原核生物基因表达的开关经常是通过控制转录的起始来调节的。 真核基因表达调控的最显著特征是能在特定时间和特定的细胞中激活特定的基因，从而实现"预定"的、有序的、不可逆转的分化、发育过程，并使生物的组织和器官在一定的环境条件范围内保持正常功能。 真核生物基因表达调控与原核的共同点： ?基因表达都有转录水平和转录后的调控，且以转录水平调控为最重要； ?在结构基因上游和下游、甚至内部存在多种调控成分，并依靠特异蛋白因子与这些调控成分的结合与否调控基因的转录。 真核生物基因表达调控与原核的不同点： 1、真核基因表达调控的环节更多：转录与翻译间隔进行，具有多种原核生物没有的调控机制；个体发育复杂，具有调控基因特异性表达的机制。 2、真核生物活性染色体结构的变化对基因表达具有调控作用：DNA拓扑结构变化、DNA 碱基修饰变化、组蛋白变化； 3、正性调节占主导，且一个真核基因通常有多个调控序列，需要有多个激活物。
真核生物的基因表达调控概述 真核生物基因在染色质活性、DNA水平、转录水平和翻译水平的表达调控特点。答：真核基因组结构具有基因组结构庞大、单顺反子、含有大量重复序列、基因不连续性、非编码区较多等特点。 （1）染色质结构水平对基因表达调控：①常染色质或异染色质；②染色质的状态（活性或阻遏），紧密结构会抑制基因表达，解凝集结构利于基因表达；③可以通过对组蛋白结构的修饰来实现，有组蛋白翻译后的乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等；④DNA水平的调控包括基因丢失、扩增、重排和移位等方式。 （2）转录水平的调控：①RNA聚合酶、转录因子等反式作用因子和顺式作用元件（启动子强弱、增强子、沉默子）相互作用对基因转录的调控；②同一基因转录起始位点的不同，导致在不同组织细胞中的基因表达差异。 （3）转录后的加工：转录后加工的多样性，包括①加尾和剪接；②多个5′端转录起始位点或剪接位点；③多个加多聚（A）位点和不同的剪接方式；④虽无剪接，但有多个转录起始位点或加多聚（A）位点等多种方式调控基因的表达。（4）翻译水平的调控：①翻译起始因子eIF-4F 的磷酸化激活蛋白质的合成，eIF-2α 的磷酸化引起翻译起始受阻，降低蛋白质的生物合成水平；② mRNA 结构与翻译控制：mRNA5′端m7G 帽有增强翻译水平的作用，上游AUG 密码子的存在往往抑制下游开放读框的翻译效率；③起始AUG 上游序列对翻译效率的影响，如Kozak序列；④poly(A)尾增加翻译效率；⑤poly(A)尾中富含UA 序列抑制翻译。 （5）翻译后加工水平的调控：翻译的蛋白质还需要加工、修饰、折叠和分选后才具有功能。综上所述，真核生物基因表达调控是一个十分复杂的过程。
第十章真核生物基因表达调控 第一节染色质结构与基因表达 染色质是细胞核中基因组DNA与蛋白质构成的复合体。染色质的基本结构单位是核小体。10 nm粗的纤维可以进一步盘绕成30 nm粗的纤维。在分裂期，30 nm粗纤维再折叠成具有一定形态结构的染色体。分裂期结束后，染色体又转化为染色质。按照功能不同，可将染色质划分为活性染色质和非活性染色质。前者是指那些具有转录活性的染色质，而后者则用于表示缺乏转录活性的染色质。在结构上，活性染色质和非活性染色质也有很大的差异。具有转录活性的染色质区域为一种开放、松散的结构。而非活性染色质呈现一种高度浓缩的形态，转录机器不能与其中的启动子结合，因而没有转录活性。异染色质就是一种典型的非活性染色质。 一、位置效应 位置效应（position effect）是指一个基因由于在基因组的位置发生改变，而发生的表达上的变化。 二、活性染色质的特征 与非表达区域中核小体结构紧密、间隔规则相比，其核小体组装较为伸展或不规则。这样的一种结构有利于转录因子的结合，以及RNA聚合酶沿模板的滑动。在转录起始区以及某些特殊的区域，核小体的构象变化更为明显，DNase I和微球菌核酸酶等非特异性内切酶可用于检测这种变化。 三、染色质结构的调节 在原核细胞中，RNA聚合酶和调节蛋白可以自由地接近DNA。由组蛋白和基因组DNA两部分组成的染色质结构限制了转录因子对DNA的接近与结合，实际上起着阻遏转录的作用。基因转录需要染色质发生一系列重要的变化，如染色质去凝集，核小体变成开放式的疏松结构，使转录因子等更容易接近并结合核小体DNA。有两种方式可以显著改变DNA的易接近性：组蛋白的乙酰化和核小体重塑。组蛋白的去乙酰化，则可以使染色质凝集，引起基因沉默。 1．组蛋白N端尾的修饰对染色质结构及基因转录的影响 每种核心组蛋白包括一个～80个氨基酸残基构成的保守的区域称为组蛋白