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生化讲义

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生化期末考试纲要

▲▲第二章蛋白质化学

三氨基酸的结构特点及分类

1.根据R的化学结构

(1)脂肪族氨基酸: Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys;Arg、Lys、Asp、Glu、Asn、Gln、Ser、Thr (2)芳香族氨基酸:Phe、Tyr

(3)杂环氨基酸:Trp、His

(4)杂环亚氨基酸:Pro

2.根据R的极性

(1)非极性氨基酸:Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Pro、Trp

(2)极性氨基酸:

1)不带电:Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、Cys;

2)带正电:His、Lys、Arg;

3)带负电:Asp、Glu

四两性解离和等电点

氨基酸在水溶液中或在晶体状态时都以离子形式存在,在同一个氨基酸分子上带有能放出质子的—NH3+正离子和能接受质子的—COO-负离子,为两性电解质。

实验证明氨基酸在水溶液中或固体状态时是以两性离子(dipolar ion)形式存在的。所谓两性离子是指在同一个氨基酸分子上带有等量的正负两种电荷,由于正负电荷相互中和而呈电中性,这种形式又称兼性离子(zwitterions)或偶极离子。

调节氨基酸溶液的pH,使氨基酸分子上的—NH3 +基和—COO-基的解离程度完全相等时,即所带净电荷为零,此时氨基酸所处溶液的pH值称为该氨基酸的等电点(pI)。

等电点的含义

定义:当氨基酸在其某一PH值时,氨基酸所带正电荷和负电荷相等,即净电荷为零,此时的PH值成为氨基酸的等电点,用PI表示。氨基酸在等电点时主要以偶极离子形式存在

氨基酸等电点的特点:

净电荷数等于零,在电场中不移动;

此时氨基酸的溶解度最小

氨基酸等电点在生化中的应用:通过电泳法或离子交换法将氨基酸进行分离制备.

氨基酸等电点的确定:

1、酸碱滴定

2、根据pK值(即解离常数的负对数)计算:等电点等于两性离子两侧pK值的算术平均数。

对于含有三个可解离基团的氨基酸来说,只要依次写出它从酸性经过中性至碱性溶液解离过程的各种离子形式,然后取两性离子两侧的pK值的平均值,即可求出其pI。

由此可见,氨基酸的等电点相当于该氨基酸的两性离子状态两侧的基团pK值之和的一半,根据此原则可求出任何一种氨基酸的等电点。

五、蛋白质的高级结构

指蛋白质分子中所有原子在三维空间的排列分布和肽链的走向。

由于羰基碳-氧双键的靠拢,允许存在共振结构(resonance structure),碳与氮之间的肽键有部分双键性质,由-CO-NH构成的肽单元呈现相对的刚性和平面化,肽键中的4个原子和它相邻的两个α-碳原子多处于同一个平面上。

氨基的H与羰基的O几乎总是呈反式(trans)而不是顺式(cis)。

蛋白质构象稳定的原因:1)酰胺平面;2)R的影响。

1. 蛋白质的二级结构

——指蛋白质多肽链本身的折叠和盘绕方式

(1)α-螺旋(α-helix)

结构要点:

1)螺旋的每圈有3.6个氨基酸,螺旋间距离为0.54nm,每个残基沿轴旋转100

2)每个肽键的羰基氧与远在第四个氨基酸氨基上的氢形成氢键(hydrogen bond),氢键的走向平行于螺旋轴,所有肽键都能参与链内氢键的形成。

(2)β-折叠结构(β-pleated sheet)

是一种肽链相当伸展的结构。肽链按层排列,依靠相邻肽链上的羰基和氨基形成的氢键维持结构的稳定性。肽键的平面性使多肽折叠成片,氨基酸侧链伸展在折叠片的上面和下面

β-折叠片中,相邻多肽链平行或反平行(较稳定)。

(3)β-转角(β-turn)

为了紧紧折叠成紧密的球蛋白,多肽链常常反转方向,成发夹形状。一个氨基酸的羰基氧以氢键结合到相距的第四个氨基酸的氨基氢上。

β-转角经常出现在连接反平行β-折叠片的端头。

(4)不规则卷曲

2. 超二级结构和结构域

超二级结构是指若干相邻的二级结构中的构象单元彼此相互作用,形成有规则的,在空间上能辨认的二级结构组合体。是蛋白质二级结构至三级结构层次的一种过渡态构象层次。

结构域是球状蛋白质的折叠单位。多肽链在超二级结构的基础上进一步绕曲折叠成紧密的近似球行的结构,具有部分生物功能。对于较大的蛋白质分子或亚基,多肽链往往由两个以上结构域缔合而成三级结构。

3. 蛋白质的三级结构

蛋白质的三级结构(Tertiary Structure)是指在二级结构基础上,肽链的不同区段的侧链基团相互作用在空间进一步盘绕、折叠形成的包括主链和侧链构象在内的特征三维结构。

维系这种特定结构的力主要有氢键、疏水键、离子键和范德华力等。尤其是疏水相互作用,在蛋白质三级结构中起着重要作用。

3、蛋白质的四级结构

蛋白质的四级结构(Quaternary Structure)是指由多条各自具有一、二、三级结构的肽链通过非共价键连接起来的结构形式,即各个亚基在这些蛋白质中的空间排列方式及亚基之间的相互作用关系。

这种蛋白质分子中,最小的单位通常称为亚基或亚单位Subunit,它一般由一条肽链构成,无生理活性;

维持亚基之间的化学键主要是疏水力。

由多个亚基聚集而成的蛋白质常常称为寡聚蛋白;

六、蛋白质的沉淀反应

1. 加高浓度盐类(盐析):加盐使蛋白质沉淀析出。

分段盐析:调节盐浓度,可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出。血清球蛋白(50%(NH4)2SO4饱和度),清蛋白(饱和(NH4)2SO4)。

蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。

改变溶液的条件,将影响蛋白质的溶解性质

在适当的条件下,蛋白质能够从溶液中沉淀出来。

不可逆沉淀

在强烈沉淀条件下,不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性,而且也破坏了蛋白质的结构和性质,产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。

由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化,所以又称为变性沉淀。

如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀

1. 加有机溶剂2 .加重金属盐3.加生物碱试剂(单宁酸、苦味酸酸、三氯乙酸能沉淀生物碱,称生物碱试剂)

可逆沉淀

在温和条件下,通过改变溶液的pH或电荷状况,使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。

在沉淀过程中,结构和性质都没有发生变化,在适当的条件下,可以重新溶解形成溶液,所以这种沉淀又称为非变性沉淀。

可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法,如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。

七、蛋白质的变性

蛋白质的性质与它们的结构密切相关。某些物理或化学因素,能够破坏蛋白质的结构状态,引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性(denaturation)发生变性的蛋白质一级结构(构型)和分子量不变,高级结构(构象)遭到破坏。

变性蛋白质主要标志是生物学功能的丧失:溶解度降低,易形成沉淀析出,结晶能力丧失,分子形状改变,肽链松散,反应基团增加,易被酶消化。

有些蛋白质的变性作用是可逆的,其变性如不超过一定限度,经适当处理后,可重新变为天然蛋白质(复性作用)。

变性蛋白质通常都是固体状态物质,不溶于水和其它溶剂,也不可能恢复原有蛋白质所具有的性质。所以,蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀。引起变性的主要因素是热、紫外光、激烈的搅拌以及强酸和强碱等。

八蛋白质的分离纯化测定

为了测定蛋白质的氨基酸组成,从蛋白质水解液中制取AA,都需要对AA混合物进行大小不同的分离、纯化方法。

(一)根据分子大小不同进行分离纯化

1、透析和超过滤

透析和超过滤都是利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质,使蛋白质和其它小分子物质分开。

超过滤是利用压力或离心力,强使水和其它小分子溶液透过半透膜,而蛋白质留在膜上。(二)根据溶解度差别的分离方法

1.等电点沉淀和PH值控制

利用各种蛋白质在等电点时,溶解度最小这一性质,可以通过调节蛋白质溶液的PH值,将不同的蛋白质分开。

2.蛋白质盐溶或盐析

中性盐在低浓度时,可以增加蛋白质的溶解度,这种现象叫盐溶。当溶液离子强度增加到一定数值时,蛋白质的溶解度下降开始沉淀,这种现象叫盐析。

(三)根据电荷不同的分离方法

1.电泳

在外界电场的影响下,如果蛋白质不处于等电点状态,它将向电极移动,这种现象称为电泳。纯化中应用最多的是聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳,它们既可以作为蛋白质纯度检验方法,也可以纯化、制备蛋白质。

2.层析

层析法是利用被分离样品混合物中各组分的化学性质的差别,使各组分以不同程度分布在两个“相”中,这两个相中的一个被固定在一定的支持介质上,成为固定相,另一个是移动的,成为移动相。

根据层析法的原理与方式的不同,层析法有分配层析、吸附层析、离子交换层析、亲和层析等不同类别。

凝胶过滤层析

凝胶过滤又称分子筛层析(molecular-sieve chromatography)。这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。凝胶过滤是一种柱层析,柱中的填充物是大分子的惰性聚合物,最常用的有葡聚糖凝胶(商品名为Sephadex)和琼脂糖凝胶(商品名为.Sepharose)等。葡聚糖凝胶是具有不同交联度的网状结构物,它的“网孔”大小可以通过控制交联剂与葡聚糖的比例来达到。

不同型号的葡聚糖凝胶装在层析柱中,不同分子的蛋白质混合物借助重力通过层析柱时,比“网孔”大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒的网格内,而被排阻在凝胶粒之外,随着洗脱剂通过凝胶粒外围而流出;比“网孔”小的分子则扩散进入凝胶粒内部,然后再可逆地扩散出来通过下层凝胶。这样,由于不同大小的分子所经路程不同而得以分离,大分子先洗下来,小分子后洗下来。

离子交换层析

离子交换层析分离蛋白质也是根据其带电荷的情况。常用于蛋白质分离的离子交换剂有弱酸性的羧甲基纤维素(carboxymethyl-cellulose, 简称CM一纤维素)和弱碱性的二已基氨基已基纤维素(diethyl-amino-ethyl-cellulose,简称DEAE一纤维素),前者为阳离子交换剂,后者为阴离子交换剂。

离子交换层析原理及简单流程:

离子交换剂的结合力取决于彼此间相反电荷的静电吸引,这与溶液的pH值有关,因为溶液的PH 值决定离子交换剂与蛋白质的电离程度。盐类的存在可以降低离子交换剂的离子和蛋白质的相反电荷基团之间的静电吸引。因此,蛋白质混合物的分离可用改变溶液中盐类离子强度和PH值来完成。对离子交换剂结合力最小的蛋白质首先由层析柱中洗脱出来。

亲合层析( affinity chromatography):是分离蛋白质的一种极为有效的方法。它经常只需经过一步的处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来,而且纯度很高。这种方法根据的是某些蛋白质所具有的生物学性质,即它们与另一种称为配体的分子能特异而非共价的结合。

第三章核酸化学

第一节概述

四Chargaff定则(1950s,E. Chargaff发现)

I.DNA碱基组成符合:A+G=T+C

II.不对称比率:A+T/G+C;物种不同,DNA碱基组成不同,物种亲缘愈接近,碱基组成也愈接近,该比率越相近似。

III.具有种的特异性,没有器官和组织的特异性,年龄、营养状况、环境的改变不影响DNA的碱基组成。

五DNA双螺旋结构模型要点(1)

螺旋中的两条链反向平行,即其中一条链的方向为5′→3′,而另一条链的方向为3′→5′,两条链共同围绕一个假想的中心轴呈右手双螺旋结构。

DNA双螺旋结构模型要点(2)

疏水的碱基位于双螺旋的内侧,亲水的磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基平面与螺旋轴垂直,

脱氧核糖平面与中心轴平行。由于几何形状的限制,碱基对只能由嘌呤和嘧啶配对,即A与T,G与C。这种配对关系,称为碱基互补。

A和T之间形成两个氢键,G与C之间形成三个氢键。

DNA双螺旋结构模型要点(3)

由于碱基对排列的方向性,使得碱基对占据的空间是不对称的,因此,在双螺旋的表面形成大小两个凹槽,分别称为大沟和小沟,二者交替出现。

DNA双螺旋结构模型要点(4)

双螺旋横截面的直径约为2nm,相邻两个碱基平面之间的距离(轴距)为0.34nm,每10个核苷酸形成一个螺旋,其螺距(即螺旋旋转一圈)的高度)为3.4nm。

DNA双螺旋结构模型要点(5)

两条链借碱基之间的碱基堆积力(即碱基之间的范德华力)牢固的连接起来,维持DNA双螺旋的三维结构。

两条链是互补关系。

六、tRNA的分子结构:1.一级结构2.二级结构

1)tRNA分子的一级结构特点

分子量在25d左右,大多数为70-90个核苷酸组成的单链,沉降系数为4S;

5’端为pG,3’端为-pCCAOH;

有十几个位置的核苷酸是恒定的;碱基组成中有较多的稀有碱基。

2)tRNA的二级结构特点:--三叶草型

3’端有一段以-CCA为主的单链区;

大约有50%的核苷酸配对,形成4个双螺旋区,称为臂或茎;

大约有50%的核苷酸不配对,形成4个环;

不同的tRNA分子在长度上的变化主要发生在三个区域:D环、D茎、额外环。

tRNA的二级结构——4茎

氨基酸接受茎(氨基酸臂)、D茎、反密码子茎、TψC茎;

氨基酸臂包含有tRNA的3’-末端和5’-末端,由7对核苷酸组成,5’-末端为G,3’-末端的最后3个核苷酸残基都是-C-C-AOH,此结构是tRNA结合活化氨基酸的部位。

tRNA的二级结构——4环

①反密码环②左臂——二氢尿嘧啶环(DHU或D环)③附加叉(可变环或额外环)④右臂——Tψ

C环(胸苷T、假尿嘧啶核苷ψ、胞苷C)

反密码区与氨基酸接受区相对,一般含有7个核苷酸残基,其中正中的3个核苷酸残基称为反密码子。

二氢尿嘧啶环(DHU环):该区含有二氢尿嘧啶(D),功能不明。

附加叉位于反密码区与TψC区之间,不同的tRNA该区变化较大。

TψC区与二氢尿嘧啶环相对,环中含有胸苷(T)、假尿苷(ψ)和胞苷(C),故名TψC。

TRNA的功能:将氨基酸转运到核糖体—MRNA复合物的相应位置用于蛋白质的合成。

七、DNA的变性

1、概念:是指核酸双螺旋区的多聚核苷酸链间的氢键断裂,变成单链结构的过程。

2、DNA的变性的条件

能够引起核酸变性的因素有:①温度升高;②酸碱度改变、pH(>11.3或<5.0);③有机溶剂,如甲醛和尿素、甲酰胺等;④低离子强度。

3、DNA变性的特征

变性核酸将失去其部分或全部的生物活性。

变性改变了DNA的二级结构。核酸的变性并不涉及磷酸二酯键的断裂,所以它的一级结构(碱基顺序)保持不变。

DNA的变性过程是突变性的,它在很窄的温度区间内完成。DNA解链温度

紫外吸收值明显增加,即增色效应。

粘度降低,沉降系数增加。

DNA解链温度(熔点,Tm )

当50% 的DNA变性时的温度称为该DNA的解链温度,即增色效应达到一半时的温度;一般DNA 的T m值在70-85 C之间。

均一DNA(如病毒)的Tm值范围较小。

分子中G和C的含量越高,越不易变性,T m值越高。可通过经验公式计算:(G+C)%=(Tm-69.3)X2.44 Tm值随溶液盐浓度增加而增大,

Tm值较低,易变性,不易保存。

增色效应与减色效应:天然DNA分子在热变性条件下,双螺旋结构破坏,碱基暴露,在紫外光260nm波长处的吸收度明显增加,此现象称为增色效应。

变性DNA分子复性形成双螺旋结构时其紫外吸收降低的现象称为减色效应。

八、DNA的复性

1、复性的概念

变性DNA在适当的条件下,两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构,其物理性质和生物活性随之恢复,这一过程称为复性;

对于热变性的DNA,在缓慢冷却的条件下可重新结合恢复双螺旋结构,称为退火。

DNA复性后,一系列性质将得到恢复,但是生物活性一般只能得到部分的恢复。

2、DNA的复性条件

将热变性的DNA骤然冷却至低温时,DNA不可能复性,即淬火。

将变性的DNA缓慢冷却时,可以复性。

退火温度=Tm-25℃

分子量越大复性越难。浓度越大,复性越容易。此外,DNA的复性需要一定的盐浓度,也与它本身的组成和结构有关。

第五章脂类简介

思考题

一、是非题

1.自然界中常见的不饱和脂酸多具有反式结构。

2.植物油的必需脂酸含量丰富,所以植物油比动物油营养价值高。

3.植物油和动物脂都是脂肪。

三:选择题

1. 下列脂类化合物中哪个含有胆碱基?

A.磷脂酸

B.神经节苷脂

C.胆固醇

D.葡萄糖脑苷脂

E.神经鞘磷脂

2.下列有关脂类化合物的叙述中,哪些是正确的?

(1).它们是细胞内的能源

(2).它们在水中的溶解度极低

(3).它们是膜的结构组分

(4).它们仅仅由碳、氢和氧组成

A.1,2,3

B.1,3

C.2,4

D.4

E.1,2,3,4

2.[ ]甘油三酯和卵磷脂分子中共有的基团是

(1).磷酰基(2).脂酰基(3).胆碱基(4).甘油基

A.1,2,3

B.1,3

C.2,4

D.4

E.1,2,3,4

3.[ ]对哺乳动物而言,下列哪些化合物是必需脂酸?

(1).油酸 (2).亚油酸 (3).软脂酸 (4).亚麻酸 A.1,2,3 B.1,3 C.2,4 D.4 E.1,2,3,4

维生素与辅酶

课堂思考题 ? 1. 维生素 B 1 的辅酶形式是 Tpp, 在糖代谢中参与 α- 酮酸的氧化脱羧作用 . 答案:(√ ) ? 2. 维生素 B 1 缺乏必然带来 Tpp 含量减少 , 导致机体脂代谢障碍 , 临床上称为脚气病 . 答案:(√ )

? 3. 维生素 B 2 称为 核黄素 , 其辅酶形式是 NAD + 和 NADP + 。答案:(×) ? 4. 辅酶 A 是含泛酸的复合核苷酸 , 代谢中作为酰基载体起作用 . 答案:(√) ? 5. 叶酸是转移一碳单位酶系的辅酶 . 答案:(×)

? 6. 维生素 E 是一种天然的抗氧化剂 , 其本身极易被氧化 . 答案:(√) ? 8. 泛酸的结构是由喋呤啶、对氨基苯甲酸和谷氨酸构成 . 答案:( × )

? 7. 麦角固醇、 7-脱氢胆固醇在紫外线的作用下都可以转化为维生素 D, 故称为维生素 D 原 . 答案:(√)

? 9. 尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸是脱氢酶的辅酶 , 可缩写为 NADP + , 含维生素 PP. 答案:( × ) ? 10. 视紫红质是一种结合蛋白质 , 其辅基是 11- 顺式视黄醛 , 是维生素 A 的一种氧化物 . 答案:(√)

?

11. 生物素是羧化酶辅酶的组成部分 , 参与体内 CO 2 的固定和羧化反应 . 答案:(√)

▲第五章 新陈代谢总论与生物氧化

二 电子传递链 (呼吸链)

1

概念:线粒体内膜上存在由多种酶和辅基组成的传递H 和电子的反应链,它们按一定顺序排列,称电子传递链(或呼吸链)(electron transfer chain 或respiratory chain )。 2 电子传递链的组成:

1.烟酰胺脱氢酶类

2.黄素脱氢酶类

3.铁硫蛋白类

4.辅酶Q 类

5.细胞色素类 3 还原电位与电子传递链的顺序

标准还原电位:将一个半反应体系与一个标准氢电极(pH7)相连所测的还原电位。 电子传递链中各组分的顺序由还原电位决定 电子传递方向:(还原电位)低 → 高 4 电子传递链的顺序:

1.NADH 呼吸链

2.FADH2呼吸链 电子传递链中生成A TP 的部位

NADH → O2可合成3分子A TP FADH2 → O2可合成2分子A TP 呼吸链抑制剂

1Cytc Cytaa 22-0.32

-0.30

0.04

0.07

0.22

0.25

0.290.82

0.55

(-0.06)

N

Cytc

Cytaa 2

2

ADP ATP

ADP ATP

ADP ATP

1、呼吸链抑制剂

能阻断呼吸链中某些部位电子传递。如植物来源的鱼藤酮可切断NADH 和CoQ 之间的电子流,抗霉素A 可切断细胞色素b 到c 链上的电子流,氰化物和CO 是阻断细胞色素aa3至氧的电子传递抑制剂。

2、解偶联剂 (uncoupler ):

使氧化与磷酸化偶联过程脱离。 二硝基苯酚(dinitrophenol ,DNP 3、氧化磷酸化抑制剂

对电子传递及ADP 的磷酸化均有抑制作用。 如寡霉素(oligomycin ) 测 试 题

A 、含高能磷酸键

B 、含一般磷酸键

C 、两者都有

D 、两者都没有

AMP (B ) GDP (C ) 丙酮酸 (D) 磷酸肌酸 (A)

作为递氢体,能将电子直接传递给细胞 色素的是 : (C) A 、 NADH+H + B 、NADPH+H +

C 、CoQ

D 、FADH2

E 、FMNH2

▲▲第八章糖类代谢

糖氧化分解的主要途径:

(一)无氧酵解(二)有氧氧化(三)磷酸戊糖途径 一、糖的无氧酵解

(一)定义:在无氧条件下,葡萄糖或糖原分解成丙酮酸,进而还原为乳酸并释放少量能量的过程称为糖的无氧分解。这一过程与酵母菌使糖发酵的过程相似,又称为糖酵解,简称EMP 途径。 葡萄糖(G )→丙酮酸(Pyr ) → 乳酸(Lac ) (二)反应部位:细胞液(胞浆)

葡萄糖6-磷酸葡萄糖

AT P ATP

ADP

P

己糖激酶是糖酵解途径的第一个限速酶

葡萄糖磷酸化反应的意义

? 将葡萄糖磷酸化成易参加代谢反应的活化形式; ?

磷酸化的葡萄糖有防止胞内葡萄糖外渗的作用;

1

Cytc

Cytaa 2

鱼藤酮CO 、氰化物

抗霉素A

? 为后续进行的底物水平磷化贮备了磷酸基团。

2、磷酸己糖异构化

磷酸果糖激酶是糖酵解途径的最重要的限速酶

ATP

ADP

P

葡6

6-磷1,6

二磷酸果糖

磷酸二羟丙酮

3-磷酸甘油醛

5、磷酸丙糖的同分异构化

相当于1,6-二磷酸果糖裂解为两分子的3-磷酸甘油醛。

CHOH

CH COO Pi

1,3-

7、高能磷酸基团的转移

糖酵解中第一次底物水平磷酸化,

1

分子葡萄糖产生2分子

ATP

+ ADP

+ ATP ATP

8、3-磷酸甘油酸异构为2-磷酸甘油酸

9、磷酸烯醇式丙酮酸的生成

10、丙酮酸的生成

糖酵解中第二次底物水平磷酸化,丙酮酸激酶是第三个限速酶。1分子葡萄糖产生2分子ATP 。

ADP

ATP

~

自发反应

第四阶段

丙酮酸还原生成乳酸

糖酵解分为四个阶段

第一阶段:葡萄糖的磷酸化

葡萄糖3步1,6-二磷酸果糖

第二阶段:糖的裂解阶段

2步

1,6-二磷酸果糖两分子的磷酸丙糖

第三阶段:产能阶段

5步

两分子的3-磷酸甘油醛两分子丙酮酸

第四阶段:还原阶段

1步

两分子丙酮酸两分子乳酸

糖酵解中的反应类型1. 磷酸转移2. 磷酸移位3. 异构化4. 脱水5. 醇醛断裂

糖酵解的反应特点

?1、整个过程无氧参加;2、三个限速酶;

?3、从葡萄糖开始净生成2分子A TP,从糖原开始净生成3分子A TP;

?4、一次脱氢辅酶为NAD+,生成的NADH+H+中的2H最后又交给丙酮酸生成了乳酸。糖酵解的意义

1、是生物体对不良环境条件的一种适应能力;

2、是红细胞和某些组织细胞的主要供能方式;

3、在工业、农牧业生产中具有重要的实践意义。

课堂思考题

一、填空:

1 克分子葡萄糖酵解时净生成A TP 的克分子数是………

2. 糖酵解途径中最重要的调节酶是………

二、选择:

? 1. 糖酵解的终产物是(B)

? A. 丙酮酸; B. 乳酸; C. 乙酰辅酶 A D. 草酰乙酸

? 2. 糖酵解过程中,有几次底物水平磷酸化过程(以 1 分子葡萄糖为例)?(B)

? A.1 次; B.2 次; C.3 次;D.4 次

? 3. 糖酵解时下列哪二种代谢产物提供~P 使ADP 生成A TP ?(B)

? A.3- 磷酸甘油酸及磷酸果糖

? B.1 ,3- 二磷酸甘油酸及磷酸烯醇式丙酮酸

? C. α- 磷酸甘油及6- 磷酸葡萄糖

? D.1- 磷酸葡萄糖及磷酸烯醇式丙酮酸

? E.1 ,6- 二磷酸果糖及3- 磷酸甘油酸

? 4. 下列哪一组酶是糖酵解的关键酶?(A )

? A. 己糖激酶、6- 磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶

? B. 己糖激酶、磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶

? C.6- 磷酸果糖激酶-1 、醛缩酶、丙酮酸激酶

? D. 己糖激酶、丙酮酸激酶、醛缩酶

? E. 己糖激酶、6- 磷酸果糖激酶-1 、丙酮酸激酶、

二、糖的有氧分解

(一)定义:葡萄糖在有氧的条件下彻底氧化生成CO2、H2O和大量A TP的代谢过程,称为糖的有氧分解或有氧氧化。

(二)反应部位:细胞液和线粒体

糖的无氧氧化与有氧氧化的关系

(三)反应分为三个阶段

第一阶段:丙酮酸的生成(在细胞液中进行)

葡萄糖+2NAD++2ADP+2Pi →2丙酮酸+2A TP+2NADH+2H+

第二阶段:丙酮酸的氧化脱羧(在线粒体中)

二、三羧酸循环的反应部位(线粒体基质—)

三、三羧酸循环的反应过程

(一)缩合反应(二)柠檬酸异构化生成异柠檬(三)异柠檬酸氧化脱羧生成α-酮戊二酸(四)α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰CoA(五)琥珀酰CoA水解生成琥珀酸

(六)琥珀酸脱氢生成延胡索酸(七)延胡索酸加水生成苹果酸(八)草酰乙酸的再生(一)缩合反应

(二)柠檬酸异构化为异柠檬酸

(三)异柠檬酸生成α-酮戊二酸

(四)α-酮戊二酸氧化脱羧反应

COOH

酮戊二酸脱氢酶复合体是第三个限速酶。

α-酮戊二酸脱氢酶复合体

α-酮戊二酸脱氢酶复合体包括:

1、α-酮戊二酸脱氢酶E1;

2、琥珀酰转移酶E2

3、二氢硫辛酸脱氢酶E3;

4、六个辅助因子

(五)琥珀酸的生成

(六)延胡索酸的生成

(七)苹果酸的生成

(八)草酰乙酸的再生

CoA

NADH+H

FAD

FADH 草酰琥珀酸

CO 2三羧酸循环

GDP

GTP

酮戊二酸

2

CO 2

H 2ATP

四、三羧酸循环的反应特点

? 1.需氧;

? 2.不可逆:三个限速酶;己糖激酶;磷酸果糖激酶;丙酮酸激酶

? 3.两次脱羧、四次脱氢(三次受体是NAD , 一次是FAD )、一次底物水平磷酸化; ? 4.共产生12molA TP 。 五、三羧酸循环的生理意义

1 是生物体内能源物质氧化分解的共同途径。

2 是生物体内释放能量最多的氧化 分解阶段。

3 是物质相互转化的基础。

一、填 空: ?

1. 三羧酸循环一共有……次脱氢反应。

? 2. 三羧酸循环中底物水平磷酸化产生……分子A TP 。

?答案:1. 4 2. 1

? 3. 1 分子葡萄糖有氧氧化时,底物水平磷酸化共进行了……次。

? 4. 每摩尔葡萄糖在有氧及无氧条件下彻底氧化净生成A TP 的比值是……。

?答案:3. 3 ;4. 1:19

?二、选择:

? 1. 三羧酸循环中有底物水平磷酸化的反应是( B )

? A. 柠檬酸→α- 酮戊二酸B. 琥珀酰CoA →琥珀酸

? C. 琥珀酸→延胡索酸 D. 延胡索酸→草酰乙酸

? E. 苹果酸→草酰乙酸

? 3. 糖有氧氧化时,伴有底物水平磷酸化的反应有(AC )

? A. 2- 磷酸甘油酸→丙酮酸

? B.1,6- 二磷酸果糖→3- 磷酸甘油醛+ 磷酸二羟丙酮

? C.α- 酮戊二酸→琥珀酸D.苹果酸→草酰乙酸

课堂思考题

?一、填空:

? 1. 磷酸戊糖途径从…………开始的。

?答案:6-P-G

?二、选择题

? 1. 磷酸戊糖途径的生理功能包括:AD

? A. 提供磷酸戊糖 B. 供能

? C. 提供三碳化合物 D. 提供NADPH+H +

糖异生

一、定义:由非糖物质转变为葡萄糖或糖原的过程称为糖异生作用。

二、糖异生的部位:主要在肝脏,其次是肾脏

三、糖异生过程:基本上是糖酵解的逆过程。

1、丙酮酸羧化支路:绕过丙酮酸激酶催化反应“能障”的逆过程。

2.1,6-二磷酸果糖逆转成6-磷酸果糖

3、6-磷酸葡萄糖逆转成葡萄糖

糖异生的意义:

1、有利于机体内糖来源不足时,维持血糖浓度相对恒定;

2、有利于乳酸的利用;

3、协助氨基酸代谢。

糖异生调控(P187)

课堂思考题

一、填空

1. 从葡萄糖合成糖原时,每加上1 个葡萄糖残基实际上消耗…个高能磷酸键。

2. 糖原合成的关键酶是………。

3. 糖原的合成场所是…………。

答案:1. 6 2. 果糖-1,6二磷酸酶 3. 细胞液中

二.选择题:

? 1. 糖异生和糖酵解都起作用的酶是:(C)

? A. 丙酮酸激酶 B. 己糖激酶 C. 3- 磷酸甘油醛脱氢酶D. 果糖二磷酸酶

? E. 丙酮酸羧化酶

? 2. 糖异生途径中的能障是指:(ABC)

? A. 1 ,6- 二磷酸果糖-- →6- 磷酸果糖B. 6- 磷酸葡萄糖-- →葡萄糖

? C. 丙酮酸--- →磷酸烯醇式丙酮酸

? D. 3- 磷酸甘油醛+磷酸二羟丙酮-- →1 ,6- 二磷酸果糖

? 3. 下列哪种反应是耗能反应?(A;B;D)

? A. 丙酮酸——→乙酰CoA B. 葡萄糖——→6- 磷酸葡萄糖

? C.6- 磷酸葡萄糖——→6- 磷酸果糖 D. 磷酸烯醇式丙酮酸——→丙酮酸

E. 1 ,3- 二磷酸甘油酸——→2 ,3- 二磷酸甘油酸

▲▲第七章脂类代谢

脂肪酸的β氧化及能量的生成

在O 2 供应充足时,脂酸可在体内分解为CO 2 和H 2 O 并释放大量的能量,成为人及哺乳动物的重要能源物质。

1. 氧化部位:除脑组织外,大多数组织均可氧化利用脂酸,以肝脏和肌肉组织最为活跃。

2. 氧化过程:在生物体内脂酸氧化的主要方式为β- 氧化,该过程可分为三个阶段。

①脂酸的活化——脂酰CoAd 生成

脂酸在胞浆脂酰CoA 合成酶的催化下,消耗A TP 的二个高能磷酸键,活化生成脂酰CoA ,脂酰CoA 比脂酸具有更强的水溶性和代谢活性。

脂肪酸活化

——脂酰CoA(胞液)

脂酰CoA合成酶

RCOOH+CoA—SH RCO~SCoA

脂肪酸A TP Mg2 AMP+PPi 脂酰CoA

?反应不可逆

?脂酰COA合成酶存在于内质网和线粒体外膜上

②脂酰CoA 进入线粒体

脂酰CoA 在线粒体膜的肉碱脂酰转移酶I (CA Tase I )、肉碱- 脂酰肉碱转位酶及CA Tase II的作用下,以肉碱为载体,由胞浆进入线粒体;

③脂酸的β-氧化

在线粒体基质中,脂酰CoA 在脂酸β氧化多酶复合体的催化下,从脂酰基的β- 碳原子开始,经过脱氢( 辅酶为FAD) 、加水、再脱氢(辅酶为NAD + )、硫解四步连续反应,生成1 分子乙酰CoA 及比原来少二个碳原子的脂酰CoA 。具体的步骤:

脱氢: 在脂酰CoA 脱氢酶的催化下, 脂酰CoA 在α、β位碳原子上脱氢, 形成反式双键的脂酰CoA, 即烯脂酰CoA, 同时FAD 接受氢被还原成FADH 2 。

水化: 在烯脂酰CoA 水化酶的催化下, 反式烯脂酰CoA 在双键上加上一分子水, 形成羟脂酰CoA 。脱氢: 在β- 羟脂酰CoA 脱氢酶的催化下, 羟脂酰CoA 的β位上的羟基脱氢氧化成β- 酮脂酰CoA, 同时NAD + 接受氢被还原成NADH+H + 。

硫解: 在β- 酮脂酰CoA 硫解酶( 简称硫解酶) 的催化下,β- 酮脂酰CoA 在α和β位之间被1 分子CoA 硫解,β- 酮脂酰CoA 在α和β之间被1 分子CoA 硫解后, 产生乙酰CoA 和缩短了两个碳原子的脂酰CoA, 这四步反应组成了 1 次β氧化作用.

脂肪酸β- 氧化的整个过程可用下图表示

a.脱氢

脱氢酶

FAD FADH2 β-烯脂酰CoA

b.水化

水化酶

β-羟脂酰CoA

c.脱氢

~

R C

H

2

C

H

2

C

H

2

C

O

SCoA

R C

H

2

C

H

C

O

~SCoA

R C

H

2

C

H

C

H

2

OH O

~SCoA

C

H

2

C

H

C

H

O

NADH+ NADH + H+ β-酮脂酰CoA

d.硫解 H SCoA

脂酰基团

+

乙酰CoA ?

对于长链脂肪酸 , 需要经过多次 β- 氧化作用 , 每次降解一个二碳单位 , 直至成为二碳 ( 当脂肪酸含偶数碳时 ) 或三碳 ( 当脂肪酸含奇数碳时 ) 的脂酰 CoA 。 后者再进入β - 氧化重复上述过程,最终含偶数碳原子的脂酸全部产生乙酰 CoA ,而少数含奇数碳原子的脂肪酸则余下 1 分子丙酰 CoA ,从而完成脂肪酸的β氧化。乙酰 CoA 可进一步通过三羧酸循环和电子传递链彻底氧化,或在肝脏缩合成酮体而被肝外组织氧化利用。在脂酸β氧化过程中, CA Tase I 为限速酶,控制脂酸进入线粒体氧化的速度。当饥饿、高脂低糖饮食或糖尿病时,机体不能利用糖,需脂酸氧化供能,此时 CA Tase I 活性增加,促进脂酸的氧化;而饱食后,脂肪合成及丙二酰 CoA 增加,后者抑制 CA Tase I 的活性,因而脂酸的氧化被抑制。

3. 能量生成:脂酸氧化是体内能量的重要来源。以 16C 的软脂酸为例, 1 分子软脂酸经 7 次β氧化生成 8 分子乙酰 CoA ,最终产生 131 分子 A TP ,净生成 129 分子 A TP 。以重量计脂酸产生的能量比葡萄糖多。

(五)酮体生成及利用

脂肪酸在肝脏中氧化分解所生成的乙酰乙酸、β-羟丁酸、丙酮三种中间代谢产物,统称为酮体。 生成部位:肝细胞线粒体

利用部位:肝外组织(心、肾、脑、骨骼肌等)线粒体

乙酰乙酸、β - 羟丁酸、丙酮三者通称酮体 ,是脂酸在肝中代谢的正常中间产物,是肝脏输出能源的一种形式。 1. 酮体的生成

脂酸β氧化产生的乙酰 CoA 是合成酮体的原料。在肝细胞线粒体中酶的催化下, 2 分子乙酰 CoA 缩合为乙酰乙酰 CoA ,后者在 HMGCoA 合酶催化下与另 1 分子乙酰 CoA 缩合生成羟甲基戊二酸单酰 CoA ( HMGCoA ), HMGCoA 裂解为乙酰乙酸和乙酰 CoA ,乙酰乙酸在β - 羟丁酸脱氢酶催化下,由 NADH 供氢,还原生成β - 羟丁酸,或脱羧生成丙酮。生成酮体是肝脏特有的功能,但肝脏缺乏氧化利用酮体的酶类,因此酮体生成后须通过血液运输到肝外组织氧化利用。 3 .酮体的生理意义

肝脏将不易氧化的脂酸转变加工为酮体。酮体分子小、极性强、能透过血脑屏障、易于氧化利用。成为肝

~SCoA

R CH 2C

O C H 2

H O

C

~R C H 2C H C H 2

OH

C

O

~SCoA

R CH 2C

O CH

H O

C

~SCoA

C

O

C H 2

R ~SCoA

C

O

C

H 3~SCoA

C

O

C

H 3

脏为肝外组织特别是大脑提供的能源形式。在饥饿、糖供应不足时,酮体可成为大脑、肌肉的主要能源。糖尿病患者由于胰岛素绝对或相对不足,机体氧化利用葡萄糖障碍,必须依赖脂酸氧化供能。此时,脂肪动员加强,酮体生成增加,当超过肝外组织氧化利用能力时,即引起血中酮体浓度升高,其中乙酰乙酸、β- 羟丁酸为较强的有机酸,在血中堆积超过机体的缓冲能力时即可引起酮症酸中毒。

4. 酮体的调节:由于脂肪动员加强,入肝的长链脂酰CoA 增多,别构抑制乙酰CoA 羧化酶,增高的胰高血糖素则使该酶磷酸化而抑制其活性。乙酰CoA 羧化酶可催化乙酰CoA 羧化生成丙二酰CoA ,后者可抑制CA T I 的活性。糖尿病人丙二酰CoA 含量下降,此抑制作用减弱,从而促进脂酰CoA 进入线粒体分解产生酮体。

口诀:FA 氧化为供能;肝内肝外有不同;肝内生酮肝外用;血中转运相沟通

糖供不足缺能量;FA 氧化来补足;若是产销不平衡;小心酮症酸中毒

▲第十章氨基酸代谢

一.氨基酸的脱氨基作用(3种脱氨方式)

1.转氨基作用:氨基转移酶

2.氧化脱氨基作用:氨基酸氧化酶

3.联合脱氨基作用:转氨基+氧化脱氨基

1.转氨基作用(除Lys、Thr)

?一种a-氨基酸的氨基可以转移到a-酮酸上,从而生成相应的一分子a-酮酸和一分子a-氨基酸,这种作用称为转氨基作用。

?酶:转氨酶

?反应可逆

反应特点:

?试验证明,除赖氨酸、苏氨酸外,其余a-氨基酸都可以参加转氨基反应,并且有其特异的转氨酶。

?其中以谷草转氨酶(AST ,GOT)和谷丙转氨酶(ALT,GPT)最为重要。

(1)谷丙转氨酶(GPT)

?谷丙转氨酶以肝脏中活力最大,当肝细胞损伤时,酶就释放到血液内。因此临床上常以此来判断肝功能的正常与否。

(2)谷草转氨酶(GOT)

《生物化学》实验讲义

实验一 蛋白质及氨基酸的颜色反应 一、目的意义 1、学习几种鉴定氨基酸与蛋白质的一般方法及其原理。 2、学习和了解一些鉴定蛋白质的特殊颜色反应及其原理。 二、实验原理 1、双缩脲反应 当尿素加热到180℃左右时,2分子尿素发生缩合放出1分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性溶液中与铜离子结合生成复杂的紫红色化合物,这一呈色反应称为双缩脲反应。 蛋白质分子中含有多个与双缩脲相似的键,因此也具有双缩脲的颜色反应。借此可以鉴定蛋白质的存在或测定其含量。应当指出,双缩脲反应并非蛋白质的特异颜色反应,因为凡含有肽键的物质并不都是蛋白质。 2、茚三酮反应 蛋白质与茚三酮共热,产生蓝紫色化合物,此反应为一切蛋白质及α-氨基酸(除脯氨酸 和羟脯氨酸)所共有。含有氨基酸的其他化合物也呈此反应。 该反应十分灵敏,1:浓度的氨基酸水溶液就能呈现反应。因此,此反应广泛用于氨基酸的定量测定。 3、黄色反应 含有苯环侧链的(特别是含酪氨酸)蛋白质溶液与硝酸共热时,呈黄色(硝基化合物),再加碱则变为橙黄色,此反应也称为黄蛋白反应。 OH + HNO 3 HO NO 2 + H 2O HO NO 2 + O N OH OH

三、仪器与试剂 1、试剂 (1) 蛋白质溶液:取10mL鸡蛋清,用蒸馏水稀释至100mL,搅拌均匀后用纱布过滤得上清液。 (2) 0.3%色氨酸溶液、0.3%酪氨酸溶液、0.3%脯氨酸溶液、0.5%甘氨酸溶液、0.5%苯酚溶液。 (3) 0.1%茚三酮-乙醇溶液:称取0.1g茚三酮,溶于100mL 95%乙醇。 (4) 10%NaOH溶液、1%硫酸铜溶液、尿素、浓硝酸。 2、仪器:试管及试管夹、酒精灯。 四、操作方法 1、双缩脲反应 (1) 取一支干燥试管,加入少量尿素,用微火加热使之熔化,待熔化的尿素开始变硬时停止加 热。此时,尿素已缩合为双缩脲并放出氨气(可由气味辨别)。待试管冷却,加入约1mL10%NaOH溶液,振荡使其溶解,再加入1滴1%硫酸铜溶液。混匀后观察出现的粉红色。(2) 另取1支试管,加入1mL蛋白质溶液,再加入2mL 10%NaOH溶液摇匀,然后再加入2 滴1%的硫酸铜溶液。摇匀观察其颜色变化。 (3) 注意事项 加入的硫酸铜不可过量,否则会产生蓝色的氢氧化铜,从而掩盖了双缩脲反应的粉红色。 (4) 记载上述实验过程和结果,并解释现象。 2、茚三酮反应 (1) 取3支试管,分别加入蛋白质溶液、0.3%脯氨酸溶液、0.5%甘氨酸溶液各1mL,再加0.5mL 0.1%茚三酮-乙醇溶液,混匀后在小火上加热煮沸1-2min,放置冷却,观察颜色变化。 (2) 在滤纸的不同部位分别滴上一滴0.3%脯氨酸溶液、0.5%甘氨酸溶液,风干后再在原处滴 一滴0.1%茚三酮-乙醇溶液,在微火旁烘干显色,观察斑点出现及其颜色。 (3) 记载上述实验过程和结果,并解释现象。 3、黄色反应 向6个试管中按下表加试剂,观察现象并记录。

贝克曼(比较详细)

[化学发光]美国Beckman公司UniCel DxI800免疫分析仪 迎接PG级超微量检测时代的来临 免疫定量分析的发展历程 1960年代以前人工免疫检测阶段 1960-70年代非标记免疫发展阶段放射标记免疫发展阶段 1970-80年代免疫分析新项目不断产生临床应用领域迅速拓展荧光免疫发展阶 段 1980-90年代免疫检测逐渐常规化检测原理发展阶段化学发光,电化学发光1990-2000年标记免疫检测原理日臻成熟优化系统均衡,清洗分离手技术的发展2000-2003年免疫自动化发展阶段;进一步吸收大生化检测的自动化技术成就,采用系统叠加的方式以寻求更快的检测速度 免疫分析技术的自动化智能化发展,是临检领域继生化全自动分析时期的又一个标志性的重要阶段。其推动力源自一些大型实验室在免疫检测应用方面的进一步拓展和规模化,对免疫分析系统的检测速度、自动化和智能化性能提出了更高的要求。 智能化方面 提高了系统流程管理的智能化程度,将系统的自动化性能推进到了一个新的智能化阶段,并进一步强化了全方位的系统监控功能,保证了自动化的可控性。 自动化方面 进一步完善系统的自动化性能,加强系统的简便性、灵活性和前赡性,例如多种的进样方式、尽可能简洁的日常保养程序等,并提高了与轨道自动化的顺应性。 系统化方面 改变了原有检测仪器将系统进行简单并连组合以提高检测速度的做法,在继承原有分系统的独立性优点的基础上,采用同一套分析和探测系统,保证系统的整体性和结果的统一性。 UniCel TM DxI 800 展现自动化非凡成就引领智能免疫时代 DxI 800智能化整系统运行,突破分系统简单组合的传统方式,采用分立一体化整系统的专利设计

生物化学 讲义

《生物化学》课程教学讲义1.课程简介 21世纪是生命科学的世纪,《生物化学》是现代生物学的基础,是生命科学发展的支柱,是生命科学领域的“世界语”因此奠定坚实的生物化学基础是农业科学生命科学学生和科技工作者的共同需要。 生物化学的内容:生物化学是生命的化学。生物是一个高度复杂和组织化的分子系统。这个分子系统主要是由生物大分子—糖类、脂类、蛋白质和核酸组成的。生物的多样性是生物体中生物分子多样性及其结构复杂性(一级结构和空间结构)决定的。但生物体内生物分子及其化学变化不是无序的。生命的化学有着自己的规律。 生命最突出的属性是自我复制和新陈代谢。自我复制依赖的遗传信息都存在于由核酸序列组成的基因中。代谢包含生物体内发生的所有化学反应-四大物质代谢,酶是反应的催化剂,物质代谢伴随着能量的生成和利用。 总之生物化学的内容可划分为两部分:静态生物化学—生物分子的化学组成、结构和性质;生物分子的结构、功能与生命现象的关系。动态生物化学—生物分子在生物机体中的相互作用及其变化规律。 生物化学的发展史:19世纪末,德国化学家李比希 (J.Liebig)初创了生理化学,德国的霍佩赛勒(E.F.Hoppe-seyler)将生理化学建成一门独立的学科,并于1877年提 出“Biochemie”一词,译成英语为“Biochemistry”,即生

物化学。 生物化学的发展大体可分为三个阶段:静态生物化学阶段(static biochemistry stage) 时期:19世纪末到20世纪30年代 特点:发现了生物体主要由糖、脂、蛋白质和核酸四大类有机物质组成,并对生物体各种组成成分进行分离、纯化、结构测定、合成及理化性质的研究。 动态生物化学阶段(dynamic biochemistry stage) 时期:20世纪30~60年代 主要特点:研究生物体内物质的变化,即代谢途径,所以称动态生化阶段。 现代生物化学阶段(modern biochemistry stage) 时期:从20世纪60年代开始 特点:探讨各种生物大分子的结构与其功能之间的关系。 我国:1966年王应睐和邹承鲁合成结晶牛胰岛素;1972年,X-射线衍射法测定了猪胰岛素的空间结构;1979年合成了41个核苷酸的酵母丙氨酸 tRNA3;1981年完成了该tRNA的全合成(76个核苷酸);唯一一个发展中国家,加入人类基因组计划,并出色完成了1%的任务。 生物化学的应用和发展前景:生物化学的原理和技术是研究现代生物科学的重要手段之一;生物化学的原理和技术在生产实践中广泛应用,如食品发酵制药及皮革工业,预防治疗医学等都与生物化学有着密切联系;生物化学是农业科学的重要理论基础之一,如研究植物的新陈代谢过程,可以控制植物的发育,优质高产。了解生物的遗传特性,可进行基因重组。另

八种常用生化实验步骤

实验一基因的PCR扩增技术 一、实验目的与原理简介 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)是体外克隆基因的重要方法,它可在几个小时内使模板分子扩增百万倍以上。因此能用于从微量样品中获得目的基因,同时完成了基因在体外的克隆,是分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段。 常规PCR反用于已知DNA序列的扩增,具体可分为三个主要过程:一、变性。通过升高温度使DNA双链模板分子中氢断裂,形成单链DNA分子,温度为94℃,时间1min。二、复性。降低温度使DNA单链分子同引物结合。温度为55℃,时间1min。三、延深。升高温度,在DNA聚合酶最佳活性的条件下在引物3端加入dNTP,实现模板的扩增,温度为72℃,时间2min。同时第一步变性前要在94℃下预变性5分钟,使DNA双链完全解开。经过 25-35个循环之后,在72℃下继续延伸10分钟。 PCR反应包含的七种基本成分: 1)热稳定性DNA聚合酶:Taq DNA聚合酶是最常适用的酶,商品化Taq DNA酶的特异性活性约为80000单位/mg. 2)寡核苷酸引物:寡核苷酸引物的设计是影响PCR扩增反应的效率与特异性的关键因素。 3)脱氧核苷三磷酸(dNTP):标准的PCR反应体系应包括4种等摩尔浓度的脱氧核苷三磷酸,即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。每种dNTP的浓度一般在200-250μl之间,高浓度的dNTP对扩增反应会起抑制作用,可能是dNTP与Mg2+螯合有关。 4)二价阳离子:一般需要Mg2+来激活热稳定的DNA聚合酶,由于dNTP与寡聚核酸结Mg2+合,因而反应体系中阳离子的浓度一般要超过dNTP和引物来源的磷酸盐基团的摩尔浓度。Mg2+的最佳浓度为1.5mmol/L。 5)维持PH值的缓冲液:用Tris-Cl在室温将PCR缓冲液的PH值调至8.3-8.8之间,标准PCR缓冲液浓度在10mmol/L。在72℃温育时,反应体系的温度将下降1个多单位,致使缓冲液的PH值接近7.2。 6)一价阳离子:标准PCR缓冲液内含有50mmol/L的KCl,它对扩增大于500bp长度的DNA是有益的。 7)模板DNA:含有靶序列的模板DNA可以以单链或双链形式加入到PCR混合液中,闭环DNA的及增效率略低于线性DNA。 学习PCR反应的基本原理和基本技术。 了解引物设计的一般要求。 二、材料和试剂 10Х扩增缓冲液 4种dNTP贮存液(20mmol/L,PH 8.0) Tap DNA 聚合酶 5端引物(20μmol/L)及3端引物(20μmol/L) 模板DNA 琼脂糖凝胶 PCR仪(Bio-Rad公司)移液枪(0.5-10μL 5-50μL)枪头微量移液管 一、实验操作 1)按照以下次序,将各成分加到微量离子管内混合: 10Х扩增缓冲液2.5μl M g2+1.5μl 5端引物1μl

生化实验讲义2010(10个)

生物化学实验讲义 赵 国 芬 2010年9月

实验之前说明 1.各班学习委员将成员分成10个大组,每个大组中2人一小组,大组采用循环实 验的方法,同时开出不同的10个实验. 2.共开出10个不同的实验 实验一温度、pH及酶的激活剂、抑制剂对酶活性的影响 实验二牛奶中蛋白质的提取与鉴定 实验三血液葡萄糖的测定-福林(Folin)-吴宪氏法 实验四双缩脲测定蛋白质的含量 实验五血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳 实验六植物组织中还原糖和总糖的含量测定 实验七应用纸层析法鉴定动物组织中转氨基作用 实验八植物组织中维生素C的定量测定 实验九琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制的观察 实验十植物组织中DNA的提取和鉴定 3.穿着要利索,做好实验记录 4.注意实验室卫生和安全. 一. 实验室规则:按照实验室的规则给学生讲解. 二. 生物化学所用的实验技术 1.样品: :血液、血浆、血清、组织 植物样品:果实、花蕾、茎等 无论用什么做材料,为了提取物质,需匀浆 2.移液管的使用: 移液管吸管 移液管 奥氏吸管 读数时视线与凹面相平,取液时要用吸管嘴吸,放出液体时注意嘴部液体的残留问题。 3.离心机的使用: 平衡(管平衡、机器平衡)缓起和慢停 4.分光光度计 机器原理和测定原理(比尔定律) 5.水浴锅的使用 三、实验报告的书写(用教务处统一印刷的报告纸写) 目的、原理、仪器、药品、步骤、结果及结论、讨论

实验一、温度、pH及酶的激活剂、抑制剂对酶活性的影响 一、实验目的 通过本实验了解酶催化的特异性以及pH、温度、抑制剂和激活剂对酶活力的影响,对于进一步掌握代谢反应及其调控机理具有十分重要的意义。 二、实验原理 酶的化学本质是蛋白质。凡是能够引起蛋白质变性的因素,都可以使酶丧失活性。此外,温度、pH和抑制剂、激活剂对酶的活性都有显著的影响。酶的活性通常是用测定酶作用底物在酶作用前后的变化来进行观察的。 本实验用唾液淀粉酶作用的底物—淀粉,被唾液淀粉酶分解成各种糊精、麦芽糖等水解产物的变化来观察该酶在各种环境条件下的活性。 淀粉被酶水解的变化,可以用遇碘呈不同颜色来观察。淀粉遇碘呈蓝色;糊精按分子从大到小的顺序,遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色和红色;最小的糊精和麦芽糖遇碘不呈现颜色反应。 三、试剂 1.0.5%淀粉溶液 2.碘化钾-碘溶液 3.1%尿素溶液。 4.1%CuSO4溶液 5.磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液pH5.0-8.0: 6.0.5%NaCl溶液。 7.唾液淀粉酶制备每人用自来水漱口3次,然后取20m1蒸馏水含于口中,半分钟后吐入烧杯中,纱布过滤,取滤液lOml,稀释至2Oml为稀释唾液,供实验用。 四、操作步骤 一、温度对酶活性的影响 (一)淀粉酶的观察 1、取3支大试管,编号后按表操作 2、在白色比色板上,置碘液2滴于各孔中,每隔1分钟,从第二管中取出反应

全自动生化分析仪贝克曼奥林帕斯AU介绍

全自动生化分析仪贝克曼AU2700 生化分析仪是根据光电比色原理来测量体液中某种特定化学成分的仪器。它属于光学式分析仪器,基于物质对光的选择性吸收,即分光光度法。分光光度法基于不同分子结构的物质对电磁辐射的选择性吸收而建立起来的方法,属于分子吸收光谱分析。单色器将光源分成单色光,特定波长的单色光通过盛有样品的比色池,光电转化器将透射光转换为电信号后送入信号处理系统进行分析。 从全自动生化分析仪的发展来看,以进样个反应方式分为连续流动式、离心式和分立式三大类。目前分立式技术成熟,全面取代连续流动式和离心式成为主流。分立式全自动生化分析仪能以样本为单位检测,因此使用灵活,客服了离心式的大部分缺陷,并随着技术的进步,分立式的测试速度和稳定性都有较大的提高。我院新引进的贝克曼AU2700测试速度是五年前引进的德林Dimension max的3倍多,而且测试成本低,故障率低,自动化程度高,易保养。其诸多优势得益于其优秀的设计和先进的技术的引入。 全自动生化分析仪由加样和试剂系统、比色系统、清洗系统和程序控制系统组成。 一加样和试剂系统一套加样和试剂系统由一根样品探针,两个试剂探针,三个注射器,三个阀门,三个加样臂,试剂仓与转盘和样本传送装置组成。普通生化仪只有一套,二AU2700有两套,为达到1600个测试/小时提供了硬件保障。同时应用最新的数字加样系统和数字光路系统,加样更精确更精细,最小加样量可达1μL,步进达到0.1μL,最低反应容量仅120μL,减小了试剂用量,而且可以用国产试剂,ISE电解质分析电极寿命长,无需保养,从而极大的减少了测试成本,间接增加了医院收入。自动跟踪微量采样技术根据吸样量大小自动跟踪液面而下降,从而减少探针吸附,降低携带污染。为适应临床需要,AU2700

生物化学讲义教材

蛋白质 元素组成C、H、O、N、S、P、Fe、Zn?-?- 每100份蛋白质中约含16份N(即:每1gN相当于6.25g蛋白质) 2.1 蛋白质的分类 按蛋白质的分子组成,分子形状,溶解度,生物功能等进行分类。 2.1.1 根据分子形状分类 ①球状蛋白②纤尘维状蛋白③膜蛋白 2.1.2 根据分子组成分类 (1)简单蛋白质; (2)结合蛋白质; 2.1.3 根据功能分类 2.2 蛋白质的组成的单位-----氨基酸 ?完全水解的产物是各种AA的混合物。部分水解的产物是各种大小不等的肽段和AA。 氨基酸与蛋白质AA、非蛋白质AA。 2.2.1 AA的结构通式 氨基酸的立体异构体: D-AA ; L-AA 2.2.2 AA的分类 (1)蛋白质中常见的氨基酸见表2-2 依AA的极性状况及其在PH = 6~7间是否带电而分为 ①非极性氨基酸②极性不带电荷③极性带负电荷④极性带正电荷 (2)蛋白质中不常见的氨基酸 (3)非蛋白质氨基酸 2.2.3 AA的重要理化性质 (1)两性解离和等电点 ①何谓氨基酸的等电点PI? ②PI值: (2)AA的化学性质 ①与水合茚三酮反应;②与甲醛反应;③与2,4-二硝基氟苯(DNFB)反应;⑤与亚硝酸反应;⑥与荧光胺反应;⑦与5,5’-双硫基-双(2-硝基苯甲酸)反应。 2.3 肽 寡肽;多肽;蛋白质。 2.3.2 生物活性肽的功能 生物活性肽:谷光甘肽;催产素和升压素。促肾上腺皮质激素。 2.3.3活性肽的来源 (1)体内途径(2)体外途径 2.3.4 活性肽的应用第一个被阐明化学结构构的蛋白质--胰岛素 一级结构确定的原则: 2.4.2蛋白质的空间构象(构象或高级结构) 概念、肽键与酰胺平面 (1)稳定蛋白质空间结构的作用力 1 共价键: 肽键,二硫键。维持一级结构 2 次级键: 氢键,疏水键,盐键,范德华力等。维持空间(高级)结构。 (2)蛋白质的二级结构 概念 ①а-螺旋结构;②B-折叠;③β凸起;④?-转角(β-弯曲、发夹结构);⑤无规卷曲(3)超二级结构与结构域;(4)蛋白质的三级结构;(5)蛋白质的四级结构及亚基。 2.5 蛋白质分子结构与功能的关系 2.5.1 蛋白质一级结构与功能的关系

生物化学实验讲义

生物化学实验报告 姓名: 专业: 院系: 学号:

实验一蛋白质分子量测定------凝胶层析法 一、实验原理 凝胶层析法是利用凝胶把分子大小不同的物质分开的一种方法,又叫做分子筛层析法,排阻层析法。凝胶本身是一种分子筛,它可以把分子按大小不同进行分离,如同过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。但这种“过筛”与普通的过筛不一样。将凝胶颗粒放在适宜溶剂中浸泡,使其充分戏液膨胀,然后装入层析柱中,加入欲分离的混合物后,再以同一溶剂洗脱,在洗脱过程中,大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的缝隙最先流出柱外,而小分子可以进入凝胶内部,流速缓慢,以致最后流出柱外,从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。 凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质,无论是天然凝胶还是人工凝胶,它们的内部都具有很微细的多孔网状结构。凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶,人工合成的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶和葡聚糖凝胶,后者的商品名为Sephadex型的各种交联葡聚糖凝胶,它具有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶,不溶于水。 这种聚合物的立体网状结构,其孔隙大小与被分离物质分子的大小有相应的数量级。在凝胶充分溶胀后,交联度高的,孔隙小,只有相应的小分子可以通过,适于分离小分子物质。相反,交联度低得孔隙大,适于分离大分子物质。利用这种性质可分离不同分子量的物质。 以下进一步来说明凝胶层析的原理。将凝胶装载柱后,柱床总体

积称为“总体积”,以Vt表示。实质上Vt是由Vo,Vi与Vg三部分组成,即Vt=Vi+Vg+Vo。Vo称为“孔隙体积”或“外体积”又称“外水体积”,即存在于柱床内凝胶颗粒外面孔隙之间的水相体积,相应于一般层析柱法中内流动相体积;Vi为内体积,即凝胶颗粒内部所含水相的体积,Vg为凝胶本身的体积,因此Vt-Vo等于Vi+Vg。 洗脱体积与Vo及Vi之间的关系可用下式表示: Ve=Vo+KdVi 式中Ve为洗脱体积,自加入样品时算起,到组分最大浓度(峰)出现时所流出的体积;Kd为样品组分在二相间的分配系数,也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数。它只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关,而与柱的长短粗细无光,也就是说它对每一物质为常数,与柱的物理条件无关。Kd 可通过实验求得,上式可改写成: Kd=(Ve-Vo)/Vi 上式中Ve为实际测得的洗脱体积;Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液通过实际测量求出;Vi可由g.Wr求得。因此,对一层析柱凝胶床来说,只要通过实际实验得知某一物质的洗脱体积Ve就可算出它的Kd值。 Vo表示外体积;Vi内体积;Ve II、Ve III分别代表组分II和III的洗脱体积。Kd可以有下列几种情况: 1、当Kd=0时,则Ve=Vo。即对于根本不能进入凝胶内部的大分子物质,洗脱体积等于空隙体积。

贝克曼dxc600全自动生化分析仪操作规程

1.目的:规范贝克曼DXC600操作 2.适用范围:贝克曼DXC600检测过程 3.支持性文件:《全国临床检验操作规程》(第三版)、《临床检验操作规程编写要求》(WS/T227-2002) 4.操作规程: Ⅰ仪器开机程序 1.开机运行 开机检查MC部分试剂量是否充足,真空压力,水压,空气压力是否处在正常范围。 注意事项:日程维护保养(详见贝克曼保养手册) 例:每日保养工作:开机前用70%酒精擦洗试剂针和搅拌针。 2.安装试剂 a.首先检查试剂状态。在主菜单选定Rgts/Cal。 b.安装试剂 从主菜单选择Rgts/Cal,显示试剂状态屏幕 ↓ 点击试剂名称旁的Pos(1,2,3……),选定试剂放置的位置 ↓ 按F1 Load键,打开试剂舱闸门 ↓ 放入试剂,扫描试剂条码,关闭试剂舱闸门 ↓ 仪器自动检测试剂液面、较准日期等,并显示相应信息。 注意事项: a.AST、ALT、CK试剂需预处理:步骤将C孔试剂全部加打入A孔然后充分混匀。b.TBIL试剂需预处理:将C孔试剂吸取200微升到B孔然后充分混匀。 Ⅱ样品前运行程序 1.清除昨天的测试结果:

选Sample ↓ 选Clear F7 ↓ 输入昨天的日/月/年 ↓ 确定,即清除样品结果 2.冲洗仪器管道: 选Utils ↓ 选Prime F1 ↓ Prime all,清洗5次 Ⅲ仪器校准程序 定标: 选择Rgts/Cal,显示试剂状态屏幕 ↓ 点击试剂名称旁的Pos(1,2,3……),选择需要定标的项目 ↓ 按F7 Assign,选择定标液的类型,并输入试剂架号及位置 ↓ Cancel退出保存,放入定标液架,RUN。 注意事项: a.注有“*”的试剂都需要定标 b.K、Na、Cl、Ca离子项目每隔24小时需要定标一次。 C.贝克曼原装试剂校准周期严格参照贝克曼试剂说明书规定。 *如有项目校准失败必须查找分析原因并要快速解决问题* Ⅳ生化室内质控 取贝克曼高低两个浓度水平质控品,室温放置10-20分钟,摇匀后进行测定,随后将质控值输入质控分析软件进行质控分析。要质控在控后才能开机检测病人标本。 每天做二次质控,开机运行后做一次,中午仪器运行时再做一次。 注意事项: 如有项目失控首先要根该项目的失控类型判断是系统误差还是随机误差引起的,再查找失控原因,解决问题,最后必需重做质控在控后才能做该项目。 Ⅴ样本运行程序

生物化学复习资料

什么是蛋白质的变性作用?引起蛋白质变性的因素有哪些?有何临床意义?在某些理化因素作用下, 使蛋白质严格的空间结构破坏,引起蛋白质理化性质改变和生物学活性丧失的现象称为蛋白质变性。引起蛋白质变性的因素有:物理因素,如紫外线照射、加热煮沸等;化学因素,如强酸、强碱、重金属盐、有机溶剂等。临床上常常利用加热或某些化学士及使病原微生物的蛋白质变性,从而达到消毒的目的,在分离、纯化或保存活性蛋白质制剂时,应采取防止蛋白质变性的措施。 比较蛋白质的沉淀与变性 蛋白质的变性与沉淀的区别是:变性强调构象破坏,活性丧失,但不一定沉淀;沉淀强调胶体溶液稳定因素破坏,构象不一定改变,活性也不一定丧失,所以不一定变性。 试述维生素B1的缺乏可患脚气病的可能机理 在体内Vit B1 转化成TPP,TPP 是α-酮酸氧化脱羧酶系的辅酶之一,该酶系是糖代谢过程的关键酶。维生素B1 缺乏则TPP 减少,必然α-酮酸氧化脱羧酶系活性下降,有关代谢反应受抑制,导致ATP 产生减少,同时α-酮酸如丙酮酸堆积,使神经细胞、心肌细胞供能不足、功能障碍,出现手足麻木、肌肉萎缩、心力衰竭、下肢水肿、神经功能退化等症状,被通称为“脚气病”。 简述体内、外物质氧化的共性和区别 共性①耗氧量相同。②终产物相同。③释放的能量相同。

区别:体外燃烧是有机物的C 和H 在高温下直接与O2 化合生成CO2 和H2O,并以光和热的形式瞬间放能;而生物氧化过程中能量逐步释放并可用于生成高能化合物,供生命活动利用。 简述生物体内二氧化碳和水的生成方式 ⑴CO2 的生成:体内CO2 的生成,都是由有机酸在酶的作用下经脱羧反应而生成的。根据释放CO2 的羧基在有机酸分子中的位置不同,将脱羧反应分为: α-单纯脱羧、α-氧化脱羧、β-单纯脱羧、β-氧化脱羧四种方式。 ⑵水的生成:生物氧化中的H2O 极大部分是由代谢物脱下的成对氢原子(2H),经一系列中间传递体(酶和辅酶)逐步传递,最终与氧结合产生的。 试述体内两条重要呼吸链的排练顺序,并分别各举两种代谢物氧化脱氢 NADH 氧化呼吸链:顺序:NADH→FMN/(Fe-S)→CoQ→Cytb→c1→c→aa3 如异柠檬酸、苹果酸等物质氧化脱氢,生成的NADH+H+均分别进入NADH 氧化呼吸链进一步氧化,生成2.5 分子ATP。 琥珀酸氧化呼吸链:FAD·2H/(Fe-S)→CoQ→Cytb→c1→c→aa3 如琥珀酸、脂酰CoA 等物质氧化脱氢,生成的FAD·2H 均分别进入琥珀酸氧化呼吸链进一步氧化,生成1.5 分子ATP。 试述生物体内ATP的生成方式 生物体内生成ATP 的方式有两种:底物水平磷酸化和氧化磷酸化。

生物化学讲义(7)

第七章糖代谢(10学时) 第一节概述 糖是一类化学本质为多羟醛或多羟酮及其衍生物的有机化合物。在人体内糖的主要形式是葡萄糖(glucose,Glc)及糖原(glycogen,Gn)。葡萄糖是糖在血液中的运输形式,在机体糖代谢中占据主要地位;糖原是葡萄糖的多聚体,包括肝糖原、肌糖原和肾糖原等,是糖在体内的储存形式。葡萄糖与糖原都能在体内氧化提供能量。 食物中的糖是机体中糖的主要来源,被人体摄入经消化成单糖吸收后,经血液运输到各组织细胞进行合成代谢和分解代谢。机体内糖的代谢途径主要有葡萄糖的无氧酵解、有氧氧化、磷酸戊糖途径、糖原合成与糖原分解、糖异生以及其他己糖代谢等。本章重点介绍葡萄糖在机体中血糖浓度动态平衡的维持和前五种主要代谢的途径、生理意义及其调节。 一、糖的主要生理功能 ①氧化供能:糖类占人体全部供能的70%。 (1g糖可提供约16.7kJ的能量) ②构成组织细胞的基本成分:核糖:构成核酸;糖脂:生物膜成分 ③转变为体内的其它成分:转变为脂肪;转变为非必需氨基酸一、糖酵解 二、糖的消化吸收 食物中的糖主要是淀粉,另外包括一些双糖及单糖。多糖及双糖都必须经过酶的催化水解成单糖才能被吸收。 食物中的淀粉经唾液中的α淀粉酶作用,催化淀粉中α-1,4-糖苷键的水解,产物是葡萄糖、麦芽糖、麦芽寡糖及糊精。淀粉的主要消化部位在小肠。糖被消化成单糖后的主要吸收部位是小肠上段,己糖尤其是葡萄糖被小肠上皮细胞摄取是一个依赖Na+的耗能的主动摄取过程,这个过程的能量是由Na+的浓度梯度(化学势能)提供的,它足以将葡萄糖从低浓度转运到高浓度。当小肠上皮细胞内的葡萄糖浓度增高到一定程度,葡萄糖经小肠上皮细胞单向葡萄糖转运体(unidirectional glucose transporter)顺浓度梯度被动扩散到血液中。 三、糖代谢 是指葡萄糖在体内的复杂化学反应,葡萄糖吸收入血后,依赖一类葡萄糖转运体(glucose transporter, GLUT)而进入细胞内代谢。 第一节糖的无氧酵解(糖酵解) 当机体处于相对缺氧情况(如剧烈运动)时,葡萄糖或糖原分解生成乳酸和少量ATP的过程称之为糖 的无氧酵解。这个代谢过程常见于运动时的骨骼肌,因与酵母的生醇发酵非常相似,故又称为糖酵解。 糖的无氧酵解途径,亦称为EMP途径。因Meyerhof (M)、Embden (E)和Parnaas (P)的工作对阐明

生化实验

1.火 (1)酒精及其它可溶于水的液体着火时,可用水灭火 (2)汽油、乙醚、甲苯等有机溶剂着火时,应用石棉布或砂土扑灭,绝对不能用水,否则反而会扩大燃烧面积。 (3)电起火,不能用水和二氧化碳灭火器,应切断电源或用四氯化碳灭火器。 2.烧伤 (1)强碱烧伤:先用大量水冲洗,再用5%的硼酸溶液和2%的乙酸溶液冲洗。 (2)强酸烧伤:先用大量水冲洗,再用5%的碳酸氢钠或5%的氢氧化铵冲洗。 氨基酸的分离鉴定纸层析法 纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。 层析溶剂由有机溶剂和水组成。物质被分离后在纸层 析图谱上的位置是用Rf值(比移)来表示的: 在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大 小与物质的结构、性质、溶剂系统;层析滤纸的质量 和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨 基酸。 在操作过程中,手不要摸滤纸。 点样直径不超过3mm 。 点样的一端朝下, 扩展剂的液面需低于点样线1cm。 即时取出滤纸, 以免出现氨基酸层析跑到滤纸的外面不能检测。 蛋白质及氨基酸的呈色反应 双缩脲反应 紫红色肽键可用于蛋白质的定性或定量测定一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应,但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。 茚三酮反应 除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外,所有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。此反应的适宜pH为5~7,同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH 条件下的颜色深浅不同,酸度过大时甚至不显色。 与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸。在定性、定量测定中,应严防干扰物存在。该反应十分灵敏,1∶1 500 000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应,是一种常用的氨基酸定量测定方法。茚三酮反应分为两步,第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛,水合茚三酮被还原成还原型茚三酮;第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。 黄色反应 含有苯环结构的氨基酸,如酪氨酸和色氨酸,遇硝酸后,可被硝化成黄色物质,该化合物在碱性溶液中进一步形成橙黄色的硝醌酸钠。苯丙氨酸不易硝化,需加入少量浓硫酸才有黄色反应。

生物化学实验

生物化学实验讲义 化学工程与技术学院 基础部

实验一酪蛋白的制备 一、目的 学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。 二、原理. 牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白,含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物,等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理,将牛乳的pH调至4.7时,酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物,除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。 三、器材 1 、离心机2、.抽滤装置 3、精密pH试纸或酸度计 4、电炉 5、烧杯 6、温度计. 四、试剂与材料 1、牛奶2500mL 2、95%乙醇1200mL 3、无水乙醚1200mL

4、0.2mol/L pH 4.7醋酸—醋酸钠缓冲液3000mL 5、.乙醇—乙醚混合液2000mL 五、操作 1、将100mL牛奶加热至40℃。在搅拌下慢慢加入 预热至40℃、pH 4.7的醋酸缓冲液100 mL。用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。将上述悬浮液冷却至室温。离心15分钟(3 000r/min)。弃去清液,得酪蛋白粗制品。 2、用水洗沉淀3次,离心10分钟(3000r/min), 弃去上清液。 3、在沉淀中加入30mL乙醇,搅拌片刻,将全部悬 浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次,抽干。 4、将沉淀摊开在表面皿上,风干;得酪蛋白纯晶。 5、准确称重,计算含量和得率。 含量:酪蛋白g/100mL牛乳(g%)

得率: 测得含量 100 % 理论含量 思考题 1、制备高产率纯酪蛋白的关键是什么? 实验二小麦萌发前 后淀粉酶活力的比较 一、目的 1.学习分光光度计的原理和使用方法。 2.学习测定淀粉酶活力的方法。 3.了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化。 二、原理 种子中贮藏的糖类主要以淀粉的形式存在。淀粉酶能使淀粉分解为麦芽糖。 2(C6H10O5)n +nH2O nC12H22O11 麦芽糖有还原性,能使3,5---二硝基水杨酸还原成棕色的3-氨基-5-硝基水扬酸。后者可用分光光度计测定。

王镜岩生物化学全套讲义第一章糖类

第一章糖 一、糖的概念 糖类物质是多羟基(2个或以上)的醛类(aldehyde)或酮类(Ketone)化合物,以及它们的衍生物或聚合物。 据此可分为醛糖(aldose)和酮糖(ketose)。 还可根据碳层子数分为丙糖(triose),丁糖(terose),戊糖(pentose)、己糖(hexose)。 最简单的糖类就是丙糖(甘油醛和二羟丙酮) 由于绝大多数的糖类化合物都可以用通式Cn (H2O)n表示,所以过去人们一直认为糖类是碳与水的化合物,称为碳水化合物。现在已经这种称呼并恰当,只是沿用已久,仍有许多人称之为碳水化合物。 二、糖的种类 根据糖的结构单元数目多少分为: (1)单糖:不能被水解称更小分子的糖。 (2)寡糖:2-6个单糖分子脱水缩合而成,以双糖最为普遍,意义也较大。 (3)多糖: 均一性多糖:淀粉、糖原、纤维素、半纤维素、几丁质(壳多糖) 不均一性多糖:糖胺多糖类(透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素等) (4)结合糖(复合糖,糖缀合物,glycoconjugate):糖脂、糖蛋白(蛋白聚糖)、糖-核苷酸等 (5)糖的衍生物:糖醇、糖酸、糖胺、糖苷 三、糖类的生物学功能 (1) 提供能量。植物的淀粉和动物的糖原都是能量的储存形式。 (2) 物质代谢的碳骨架,为蛋白质、核酸、脂类的合成提供碳骨架。 (3) 细胞的骨架。纤维素、半纤维素、木质素是植物细胞壁的主要成分,肽聚糖是细胞壁的主要成分。 (4) 细胞间识别和生物分子间的识别。 细胞膜表面糖蛋白的寡糖链参与细胞间的识别。一些细胞的细胞膜表面含有糖分子或寡糖链,构成细胞的天线,参与细胞通信。

2 红细胞表面ABO血型决定簇就含有岩藻糖。 第一节单糖 一、单糖的结构 1、单糖的链状结构 确定链状结构的方法(葡萄糖): a. 与Fehling试剂或其它醛试剂反应,含有醛基。 b. 与乙酸酐反应,产生具有五个乙酰基的衍生物。 c. 用钠、汞剂作用,生成山梨醇。 图2 最简单的单糖之一是甘油醛(glyceraldehydes),它有两种立体异构形式(Stereoismeric form),图7.3。 这两种立体异构体在旋光性上刚好相反,一种异构体使平面偏振光(Plane polarized liyot)的偏振面沿顺时针方向偏转,称为右旋型异构体(dextrorotary),或D型异构体。另一种异构体则使平面偏振不的编振机逆时针编转,称左旋异构体(levorotary,L)或L型异构体。 像甘油醛这样具有旋光性差异的立体异构体又称为光学异构体(Cptical lsmer),常用D,L表示。 以甘油醛的两种光学异构体作对照,其他单糖的光学异构构与之比较而规定为D型或L 型。 差向异构体(epimer):又称表异构体,只有一个不对称碳原子上的基因排列方式不同的非对映异构体,如D-等等糖与D-半乳糖。 链状结构一般用Fisher投影式表示:碳骨架、竖直写;氧化程度最高的碳原子在上方, 2、单糖的环状结构 在溶液中,含有4个以上碳原子的单糖主要以环状结构。 单糖分子中的羟基能与醛基或酮基可逆缩合成环状的半缩醛(emiacetal)。环化后,羰基C 就成为一个手性C原子称为端异构性碳原子(anomeric carbon atom),环化后形成的两种非对映异构体称为端基异构体,或头异构体(anomer),分别称为α-型及β-型头异构体。 环状结构一般用Havorth结构式表示:

高级生化实验讲义

实验一、转录增强因子在DNA转录中的调控作用– 16学时 一.目的和要求 1. 掌握转录增强因子对启动子控制下报告基因调控的工作原理,了解常见的报告基因种类及启动子种类。 2. 学习PCR克隆转录增强因子CRE,构建报告基因表达载体、细胞培养、细胞转染和荧光素酶活性检测技术。 二.基本原理 报告基因 (reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因。把它的编码序列和其它基因相融合形成嵌合基因,当在调控序列控制下进行表达时,利用报告基因的表达产物可以来标定目的基因的表达调控。 作为报告基因,在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件:(1)已被克隆和全序列已测定;(2)表达产物在受体细胞中不存在,即无背景,在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物;(3)其表达产物能进行定量测定。 在动物基因表达调控的研究中,常用的报告基因有氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、β-半乳糖苷酶基因、荧光蛋白、荧光素酶基因等。荧光素酶(Luciferase) 是生物体内催化荧光素或脂肪醛氧化发光的一类酶的总称。自然界有许多发光生物, 1956年, McElroy 等首次从萤火虫中提取到荧光素酶, 此后各国研究人员相继报道了对各种发光生物中荧光素酶的研究。萤火虫荧光素酶是分子量为60~64kD的多肽链,在Mg2+、ATP、O2存在时,催化D-荧光素(D-Luciferin)氧化脱羧,发出光(λ=550~580nm)。荧光素酶作为新型报告基因,与传统报告基因相比,具有检测速度快、灵敏度比cat基因高30~1000倍、费用低、不需使用放射性同位素等优点,因此在基因工程方面得到了广泛的采用,同时荧光素酶在发光免疫分析及环境监测、微生物检测等方面的应用也愈来愈受到关注。 调控元件的选择依赖于特定的信号转导途径。很多情况下,GPCRs的活化信号可通过特定的信号转导途径将信息传递至细胞核,调控特定基因的转录。多种自然和合成的调控元件都广泛用于报告基因系统。自然启动子,如c-fos启动子,含有Serum inducible element(SIE)、Serum response element(SRE)、cAMP response element(CRE)等一系列转录因子结合位点,这些调控元件使得该启动子同时受多重信号转导事件的调控。人工合成的启动子中可加入多个单一调控元件,如cAMP反应元件(CRE)。

贝克曼流水线PP的介绍

自动化流水线 所属系列:贝克曼 PP 实验室自动化产品 美国贝克曼库尔特公司的实验室自动化系统是目前市场上唯一具有完备的前处理和后处理系统的生产厂家,完整的自动化流水线和相应的信息系统拥有全世界唯一符合NCCLS实验室自动化系统全部标准的荣耀。在美国实验室自动化产品市场中占有率第一,达到了55%(第二名仅为27%,CAP TODAY,2008年3月)。自从1994年第一条自动化流水线安装以来,贝克曼库尔特公司为临床实验室提供了最全面、最有质量保证的产品和服务。 贝克曼库尔特流水线采用创新的整体解决方案,使流程简单化、自动化,消除“瓶颈”,提高效率,保证质量,为临床提供及时、可靠、稳定的检测结果。使临床实验室达到国际一流水平。 简而言之,可从以下方面获得最大的收益: λ简化测试步骤,消除耗时、易出错的人工操作 λ降低潜在标本识别错误 λ有效的进行人力资源分配 λ缩短出报告时间(TAT),减少可变因素为临床提供最及时的检测结果 λ对当今信息技术完美应用 λ提供新的测试参数和可扩展的测试项目菜单 λ将各种新的特点如真正的随机任选上样,自动重检和折返测试,以及自动数据解释

进行完美结合 λ提高检测的连续性和可靠性,获得最高的生产效率 λ消除操作中的出错机会,提高病人安全性,减少医疗纠纷 λ提高管理质量,同时增加实验人员的生物安全性 整体特点: 完整性系统性: 具有完整的自动化流水线和相应的信息系统,是目前市场上唯一具有完备的前处理和后处理系统的生产厂家。 灵活性:根据实验室布局、场地进行各种方式的连接,达到最大化的美观和实用。并可随着发展的需要进行扩充。 智能化:在线和离线两种操作模式。急诊样品随时插入、优先分析。实现智能化自动重检、追加、反射项目的检测。 完善的售前、售后服务:从流程的分析、设计,仪器的配置、安装、调试,流水线的使用、培训,到售后维护保养、评估。贝克曼库尔特将提供全程一系列的高品质服务。 实验室自动化给您带来…… 您的管理目标是顺畅的工作流程, 缩短样品周转时间(TAT)医生更快速的得到更准确的检测报告, 提高工作人员的效率。 下图表明使用我司的实验室自动化产品将简化70%的操作步骤,对改善检验科的工作流程产生了超乎想象的影响力。 简化无效步骤加强增值步骤 无效率的步骤:等待 " 1.传送 " 2.常规步骤--样品收集、分类、离心、开盖、上样、存储样品 增值步骤:严格评价结果λ " 1.检查--样品外观 " 2.判断--复检、REFLEX检测

生化实验思考题参考答案[1].

生化实验讲义思考题参考答案 实验一淀粉的提取和水解 1、实验材料的选择依据是什么? 答:生化实验的材料选择原则是含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低。从科研工作的角度选材,还应当注意具体的情况,如植物的季节性、地理位置和生长环境等,动物材料要注意其年龄、性别、营养状况、遗传素质和生理状态等,微生物材料要注意菌种的代数和培养基成分的差异等。 2、材料的破碎方法有哪些? 答:(1) 机械的方法:包括研磨法、组织捣碎法; (2) 物理法:包括冻融法、超声波处理法、压榨法、冷然交替法等; (3) 化学与生物化学方法:包括溶胀法、酶解法、有机溶剂处理法等。 实验二总糖与还原糖的测定 1、碱性铜试剂法测定还原糖是直接滴定还是间接滴定?两种滴定方法各有何优缺点? 答: 我们采用的是碱性铜试剂法中的间接法测定还原糖的含量。间接法的优点是操作简便、反应条件温和,缺点是在生成单质碘和转移反应产物的过程中容易引入误差;直接法的优点是反应原理直观易懂,缺点是操作较复杂,条件剧烈,不易控制。 实验五粗脂肪的定量测定─索氏提取法 (1)本实验制备得到的是粗脂肪,若要制备单一组分的脂类成分,可用什么方法进一步处理? 答:硅胶柱层析,高效液相色谱,气相色谱等。 (2)本实验样品制备时烘干为什么要避免过热? 答:防止脂质被氧化。 实验六蛋白质等电点测定 1、在等电点时蛋白质溶解度为什么最低? 请结合你的实验结果和蛋白质的胶体性质加以说明。

蛋白质是两性电解质,在等电点时分子所带净电荷为零,分子间因碰撞而聚沉倾向增加,溶液的粘度、渗透压减到最低,溶解度最低。结果中pH约为4.9时,溶液最浑浊,达到等电点。 答: 2、在分离蛋白质的时候,等电点有何实际应用价值? 答: 在等电点时,蛋白质分子与分子间因碰撞而引起聚沉的倾向增加,所以处于等电点的蛋白质最容易沉淀。在分离蛋白质的时候,可以根据待分离的蛋白质的等电点,有目的地调节溶液的pH使该蛋白质沉淀下来,从而与其他处于溶液状态的杂质蛋白质分离。 实验七氨基酸的分离鉴定-纸层析法 1、如何用纸层析对氨基酸进行定性和定量的测定? 答: 将标准的已知氨基酸与待测的未知氨基酸在同一张层析纸上进行纸层析,显色后根据斑点的Rf值,就可以对氨基酸进行初步的定性,因为同一个物质在同一条件下有相同的Rf 值;将点样的未知氨基酸溶液和标准氨基酸溶液的体积恒定,根据显色后的氨基酸斑点的面积与点样的氨基酸质量成正比的原理,通过计算斑点的面积可以对氨基酸溶液进行定量测定。 3、纸层析、柱层析、薄层层析、高效液相层析各有什么特点? 答:

生化实验报告资料

生物化学实验报告 姓名:吴瑞 学号: 3120016004 专业年级: 2012级临床医学(妇幼保健) 组别:第四实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心

一、实验室规则 1.实验前应认真预习实验指导,明确实验目的和要求,写出预实验报告。 2.进入实验室必须穿白大衣。严格遵守实验课纪律,不得无故迟到或早退。不得高声说话。严禁拿实验器具开玩笑。实验室内禁止吸烟、用餐。 3.严格按操作规程进行实验。实验过程中自己不能解决或决定的问题,切勿盲目处理,应及时请教指导老师。 4.严格按操作规程使用仪器,凡不熟悉操作方法的仪器不得随意动用,对贵重的精密仪器必须先熟知使用方法,才能开始使用;仪器发生故障,应立即关闭电源并报告老师,不得擅自拆修。 5.取用试剂时必须“随开随盖”,“盖随瓶走”,即用毕立即盖好放回原处,切忌“张冠李戴”,避免污染。 6.爱护公物,节约水、电、试剂,遵守损坏仪器报告、登记、赔偿制度。 7.注意水、电、试剂的使用安全。使用易燃易爆物品时应远离火源。用试管加热时,管口不准对人。严防强酸强碱及有毒物质吸入口内或溅到别人身上。任何时候不得将强酸、强碱、高温、有毒物质抛洒在实验台上。 8.废纸及其它固体废物严禁倒入水槽,应倒到垃圾桶内。废弃液体如为强酸强碱,必须事先用水稀释,方可倒入水槽内,并放水冲走。 9.以实事求是的科学态度如实记录实验结果,仔细分析,做出客观结论。实验失败,须认真查找原因,而不能任意涂改实验结果。实验完毕,认真书写实验报告,按时上交。 10.实验完毕,个人应将试剂、仪器器材摆放整齐,用过的玻璃器皿应刷洗干净归置好,方可离开实验室。值日生则要认真负责整个实验室的清洁和整理,保持实验整洁卫生。离开实验室前检查电源、水源和门窗的安全等,并严格执行值日生登记制度。

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