实验一植物基因组DNA的提取及其定性分析
【实验目的】
通过本实验学习利用CTAB法从植物组织中提取DNA并通过琼脂糖凝胶电泳定性分析。
【实验原理】
CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子型去污剂，可溶解细胞膜，在高离子强度下(大于0.7 M NaCl)，与蛋白和中性多糖形成复合物沉淀出来。利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。然后加入CTAB缓冲液将DNA溶解出来，再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，最后经乙醇沉淀得到DNA。
琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA片段的常用技术。把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质(琼脂糖凝胶)的样品孔中，并置于静电场上。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此，在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，分子量小的DNA分子比分子量大的DNA分子迁移速率快，迁移距离远，由此得到分离。凝胶电泳也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子，超螺旋质粒
DNA(cccDNA)泳动最快，其次为线状DNA(L DNA)，最慢的为开环质粒DNA(ocDNA)。【实验步骤】
1. 取约100 mg新鲜的拟南芥嫩叶放入1.5 ml EP管，在液氮冷冻条件下研磨成粉末状。
2. 加入0.6 ml 2×CTAB提取液(用前加入0.2﹪的巯基乙醇)，混匀，65℃水浴30 min，每10 min颠倒混匀一次。
3. 取出离心管，冷却后加入0.6 ml酚氯仿混合液，混匀。
4. 11,500 rpm室温离心8 min(若没离好可重复一次)。
5. 将上清液(约450 μl)转移到另一新的1.5 ml离心管中。
6. 加入与上清等体积的氯仿，混匀，11,500 rpm 离心8 min，取上清(约350 ul)。
7. 加入600 μl无水乙醇，上下颠倒混匀，-80℃放置30 min。
8. 4℃，15,800 rpm离心20 min，弃上清。
9. 1 ml 70％乙醇(预冷)洗涤沉淀2次，上下颠倒几次，不能Vertex，7,000 g离心3 min，弃上清，风干。
10. 加入30 μl无菌水(含20 μg/m l RNase A)，37℃溶解DNA 30 min。
11. 取5 μl DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测。
【实验结果】
M 1 2 3 4 5 6 7 8
植物基因组DNA提取的琼脂糖凝胶电泳检测图
【实验结果分析】
从琼脂糖凝胶电泳图来看，全组提取植物基因组DNA实验成功，且1、2、3、7、8号泳道的条带较亮，说明对应泳道样品提取所得的DNA的量较多。本人实验结果为6号泳道的检测结果，从电泳图看，条带较暗，说明提取所得的DNA的量较少，这是由于以下原因：1）样品在研磨过程中没有融化，没有导致细胞裂解释放DNA酶，DNA没有降解；2）样品研磨较粗，植物细胞破碎不完全，得到的DNA的量较少；3）在抽提DNA的过程中，抽提较彻底，减少了DNA量的损失；4）沉淀DNA时，倒入冰乙醇的速度较慢，DNA沉淀充分，损失了较少。同时，电泳条带呈括号状，对比Marker可知，可能是由于电压不稳导致的，所以在以后的实验中，要注意电泳时电压保持恒定。下一步将进行PCR 实验。
实验二PCR扩增目的片段
【实验目的】
通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。
【实验原理】
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种体外核酸扩增系统，其原理类似DNA分子的天然复制过程，是将待扩增的DNA片段与其两侧互补的两个寡聚核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。
典型的PCR 反应体系由如下组分组成：DNA 模板、反应缓冲液、dNTP、两个合成的DNA引物、耐热DNA聚合酶。PCR的工作程序实际上是一个在模板DNA、一对已知序列的寡核苷酸引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应。整个扩增过程分三步：①变性，加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段；②退火，快速降低温度至50-60℃后，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶段；③延伸，溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA 为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4 种脱氧核苷三磷酸（dNTP)，按5′→3′方向复制出互补DNA ，即引物的延伸阶段。完成以上三步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量就增加一倍，新形成的DNA链又成为下一轮循环的模板。经过25-30个循环后，DNA可扩增106-109倍。PCR扩增的特异性取决于引物与模板DNA的结合。
【实验步骤】
1．在200 μl PCR 管内配制20 μl 反应体系：
反应物体积/μl
ddH2O 11.3
10×PCR 缓冲液 2.0
dNTP 1.6（终浓度20—200 μM）
引物1 2.0（引物终浓度0.2 μM）
引物2 2.0（引物终浓度0.2 μM）
模板DNA 1.0
rTag 酶0.1
Total 20
2. 将上述试剂依次加入PCR薄壁管。加样后用手轻弹混匀，6,000 rpm离心15 sec使
反应成分集于管底。
3. PCR反应热循环程序设置：
① 94 ℃预变性3 min;
② 94 ℃变性30 sec;
③ 64 ℃退火30 sec; 30 cycles
④ 72 ℃延伸 1 min;
⑤ 72 ℃延伸10min;
⑥ 16℃pause
反应结束后短暂离心，置4℃保存备用。
4. 配制0.8％的琼脂糖凝胶。
5. 取5 μl PCR产物，加1 μl的6×loading buffer，轻弹混匀后进行电泳检测。
6. 如果PCR产物非常特异，可以直接用于与载体的重组连接。
【实验结果】
本实验扩增片段长652 bp。
3 6 1 2 M
4 7 8 5
植物DNA的PCR扩增电泳检测图
【实验结果分析】
从电泳检测图来看，1、3、6号泳道的样品经PCR扩增没有得到扩增产物，2、4、5、7、8号泳道的样品经扩增得到了扩增产物且大小为652 bp，符合实验要求。本人实验结果为6号泳道的检测结果，条带无，原因如下：1)自己前期准备不充足，虽然引物设计合理，酶、Mg2+、dNTP的浓度适合，循环参数适合；但是结果不完美2）由上一步实验所得的DNA不纯，虽然模板的浓度合适。但是电泳显示的条带整体亮度不高，与同一块胶的其他组结果相比，排除了胶和核酸染料的原因，推测原因如下：1）移液枪使用不准确，造成模
板浓度不够，影响了PCR的结果；2）由于PCR仪的原因，因为本组的PCR反应物放置在PCR仪内部样品孔的边缘，温度控制不如中部精确，影响了PCR的结果。所以经电泳检测后，本小组选择2、4、5、6、7、8号PCR产物进行蓝白斑筛选及酶切实验鉴定重组子。
实验三目的片段和载体的连接
【实验目的】
通过本实验掌握DNA重组连接方法。
【实验原理】
外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这种重新组合的DNA叫做重组子。DNA 重组本质是一个酶促反应过程。即在一定的条件下，DNA连接酶催化两个双链DNA片段的5′端磷酸和3′端羟基之间相互作用，形成磷酸二酯键的过程。
pMD?19-T Vector是一种高效克隆PCR产物(TA Cloning)的专用载体。它含有Amp抗性基因、β半乳糖苷酶的启动子和编码其N端氨基酸(α肽链)的片断基因，在这段基因中插入一个多克隆位点（DNA载体序列上人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点，能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案），其中有EcoR V识别位点，用EcoR V 进行酶切反应后，再在两侧的3′端添加“T”而成。这款载体含有的高效连接液Solution I 可以在短时间内（约30 min）完成连接反应，连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度12-16℃，最多可以连接12-16hr（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。
【实验步骤】
1. 在灭菌的Eppendorf 管中，加入：
pMD-19 T载体0.5 μl
目的PCR片段 4.5 μl
Solution 5 μl
共10μl反应体系。
2. 盖好盖子，用手指轻弹EP管数次，并于台式离心机离心2 sec以集中溶液。
3. 将反应管放入16℃连接过夜（12～16hr）。
实验四大肠杆菌感受态细胞的制备
【实验目的】
通过本实验掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法。
【实验原理】
体外连接的重组DNA分子导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、增殖和表达。研究发现，用含Ca2+的溶液处理大肠杆菌细胞会使细胞易于吸收外源DNA。大肠杆菌吸收外源DNA的过程被称为转化。细菌处于容易吸收外源DNA的状态称为感受态。用理化方法可以诱导细胞进入感受态，如电转化法、CaCl2法。
CaCl2法是目前实验室常用的制备感受态细胞的方法，其原理是使细菌处于0°C、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性发生改变，外源DNA附着于细胞膜表面，经42°C 短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物。
本实验以E.coli DH5α菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态，之后通过转化实验检测感受态细胞的转化效率。
【实验步骤】
1. 从大肠杆菌DH5α 平板上挑取一个单菌落接于2 ml LB液体培养基的试管中，37 ℃210 rpm 振荡培养过夜。
2. 次日，按1:100(V/V)，即取1 ml菌液转接到一个含有100 ml LB液体培养基锥形瓶中，37 ℃振荡培养2-3 hr。（此时，OD 600 ≤ 0.3-0.5，此为实验成功的关键）。
3. 将菌液转移到50 ml冰浴好的离心管中，冰上放置10 min。
4. 4 ℃，3,500 rpm/min，离心10 min，回收细胞。
5. 倒出培养液，将管倒置，以便培养液流尽。
6. 将菌体重悬于1/10体积的终浓度为20 mM CaCl2和80 mM MgCl2的混合溶液中。（务必放冰上）。
7. 4 ℃，3,500 rpm/min，离心10 min，回收细胞。
8. 将菌体重悬于1/50体积冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液中（务必放冰上）。此细胞为感受态细胞。于4℃冰箱中保存，一周内使用或将菌体悬浮于1/50体积冰冷的含有15%甘油的0.1 mol/L CaCl2溶液中，分装，每100 μl一份，液氮速冻，置于-80℃。
实验五重组质粒的转化
【实验目的】
通过本实验，掌握重组质粒的转化方法和原理。
【实验原理】
转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。转化缓冲液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的羟基—钙磷酸复合物，此复合物粘附于感受态细胞表面。42℃短时间热处理（热休克），可以促进细胞吸收DNA复合物。将处理后的细菌放置在非选择性培养液中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型(如Amp抗性) 得到表达。然后再涂布于含有氨苄青霉素的选择性平板上，37℃培养过夜形成单克隆。在这个过程中包含两种筛选方法，一种是抗性筛选，一种是蓝白斑筛选。载体中含有耐药基因，可以使转化成功的受体细胞具有抗药性，能够在含有相应药物的琼脂平板上形成单克隆菌落。通过这种方法就可以筛选转化成功的受体细胞。而能进行蓝白筛选是因为载体中有一段大肠杆菌β-半乳糖苷酶的启动子和编码其N端氨基酸（α肽链）的片断基因。宿主具有编码β半乳糖苷酶的C端基因。当二者产物组合在一起，就具有活性酶的产生，此现象称为α互补。在诱导物IPTG（乳糖类似物，不会被β-半乳糖苷酶摧化降解）的作用下，由α互补形成的具有功能活性的β-半乳糖苷酶，可分解培养物中的X-gal（它能将无色的化合物X-gal切割成半乳糖和蓝色底物），使其呈蓝色反应。如果外源基因插入位于LacZ基因内部的多克隆酶切位点中，就会破坏α肽链的阅读框，从而不能合成与受体菌内的β-半乳糖苷酶相互补的活性α肽链，导致不能编码β-半乳糖苷酶，菌落呈正常的白色。而没有插入外源片断的则是蓝色的。因此，按照菌落的颜色就可以确定载体上是否插入了外源基因。【实验步骤】
1. 取实验三重组质粒10 μl加入100 μl感受态细胞，混匀（轻弹，感受态很脆弱），冰浴30 min（静置，勿动，确保DNA吸附在感受态细胞表面）。
2. 将管放到42 ℃水浴锅中，热激90 sec（准确，防止LB液体进入细胞中）。
3. 冰浴2 min（使得感受态细胞膜收缩，磷脂双分子层的运动）。
4. 加500 μl LB 液体培养基（在超净台中进行），轻轻混匀。
5. 37 ℃温育45 min ，130 rpm慢摇（必须保证前20 min的转速，因为大肠杆菌20 min 繁殖一代，第一代的细胞较脆弱，防止细胞破碎）。
6. 在预制的LB 琼脂平板上，加40 μl 20 mg/ml X-gal 和16 μl 50 mg/ml IPTG 溶液。
7. 用灭菌玻璃棒（酒精灯上烧后冷却）均匀涂布。
8. 37 ℃温箱中放置30 min（使有毒物质挥发）。
9. 3,500 rpm，离心2 min。
10. 弃约500 μl上清，将剩余菌液轻轻吹打混匀涂于含有氨苄青霉素的LB平板上，
晾
至液体被吸收。
11. 倒置平皿37 ℃培养12-16hr，出现单菌落（培养皿上的会长出蓝色和白色菌落，其中白色菌落为含有重组DNA 质粒的菌落）。
【实验结果】
经蓝白斑筛选实验，培养皿中出现了大量的白斑，蓝斑数量很少，不符合“白斑周围有蓝斑，蓝斑周围有白斑”的检验要求，原因如下：1）X-gal没有涂匀；2）用涂布器涂匀细胞时用力过大，导致细胞破裂；3）培养时间不够，显色不完全，放入4℃冰箱显色1h 蓝斑数量有所增加。
实验六菌落的PCR鉴定
【实验目的】
通过本实验学习菌落PCR的基本原理与实验技术。
【实验原理】
重组子经过蓝白斑筛选后（具有假阳性），接下来可通过菌落PCR方法对重组子进一步进行快速鉴定。用灭菌后的牙签轻轻粘取白色菌落的部分菌体，在准备好的双蒸水中洗涮一下，充分混匀，取一定量加入PCR反应体系，在PCR反应循环中，95℃加热可以使细菌破裂，释放出重组质粒作为PCR扩增模板。采用外源基因特异性引物进行扩增，如果重组质粒转化入宿主细胞，则可以扩增得到预期大小的目的片段。
【实验步骤】
用200 μl的枪头挑取转化平板上白色的单菌落于15 μl无菌水中，从中取2 μl菌液作为菌落PCR模板。
1．在200 μl PCR 管内配制20 μl 反应体系：
反应物体积/μl
ddH2O 10.3
10×PCR 缓冲液 2.0
dNTP 1.6
引物１ 2.0
引物2 2.0
菌液 2.0
rTag 酶0.1
Total 20
2. 将上述试剂依次加入PCR薄壁管。加样后用手轻弹混匀，6,000 rpm离心15 sec使
反应成分集于管底。
3. PCR反应热循环程序设置：
① 94 ℃预变性3 min;
② 94 ℃变性30 sec;
③ 64 ℃退火30 sec; 30 cycles
④ 72 ℃延伸 1 min;
⑤ 72 ℃延伸 3 min;
⑥ 16 ℃pause
反应结束后短暂离心，置4℃保存备用。
4. 配制0.8％的琼脂糖凝胶。
5. 取5 μl PCR产物，加1 μl的6×loading buffer，轻弹混匀后进行电泳检测。
【实验结果】
4 4’ 8
5 M 2 7 7’ 6
菌落PCR电泳检测图
【实验结果分析】
本小组选用实验二中2、4、5、6、7、8号PCR产物进行重组质粒的构建、转化和筛选。所得结果如电泳检测图，由图可知，对应2、4、4’、5、7、7’、8号泳道的样品与载体连接成功，对应6号泳道的样品没有连接到载体上。本人实验结果为6号。原因如下：1.很可能该感受态有空载质粒的污染； 2. 外源片段的浓度不够理想，可回收更多的PCR 产物，增加片段的比例，连接的概率会变大。
实验七重组质粒DNA的提取及酶切鉴定
【实验原理】
细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1 kb至200 kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
一般分离质粒DNA的方法都包括3个步骤：①培养细菌，使质粒DNA大量扩增；②收集和裂解细菌；③分离和纯化质粒DNA。分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。
碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，在这样的条件下，尽管共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH 至中性时，因为共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们相互缠绕形成不溶性网状结构，而复性的质粒DNA恢复原来构型，保持可溶性状态。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，最后用酚氯仿抽提纯化上清液中的质粒DNA。
限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶，主要存在于原核生物中。根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。其中Ⅱ类酶在分子克隆和基因操作中最为有用，是常用的分子生物学工具酶。
限制性内切酶识别序列长度一般为4-8个呈回文序列的特异核苷酸对。一般情况下，
识别序列越长，在同一DNA分子中识别位点出现的频率就越小。限制性内切酶主要用于基因组DNA的片段化、重组DNA分子的构建与鉴定、载体中目的基因片段的分离与回收以及DNA分子物理图谱的构建等。根据酶切目的和要求不同，可有单酶切、双酶切或部分酶切等不同方式。根据酶切反应的体积不同，可分为小量酶切反应和大量的酶切反应。本实验以EcoRⅠ和Hind III对本实验中提取的重组质粒进行小量酶切鉴定。在用特定的限制性内切核酸酶对质粒进行酶切反应后，通常可采用琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切效果。
【实验步骤】
1. 将实验六第一步剩余的13 μl菌液接于2 ml 含Amp ( 50 μg/m l )的LB液体培养基中37 ℃振荡（225 rpm）培养过夜。
2. 取1.5 ml的过夜培养菌液，12,000 rpm离心2 min，弃上清，尽可能除去细菌沉淀里残留的液体培养基。
3. 用250 μl的Solution Ⅰ（含RNase A1）充分悬浮细菌沉淀。（注：注意不要残留细小菌块，可以使用振荡器（vortex）等剧烈振荡使菌体充分悬浮。）
4. 加入250 μl的Solution Ⅱ轻轻地上下翻转混匀5-6次，使菌体充分裂解，形成透明溶液。（注：此步骤不宜超过5 min。）
5. 加入400 μl的4℃预冷的Solution Ⅲ，轻轻上下翻转混合5-6次，直至形成紧实凝集块，然后室温静置2 min。
6. 室温12,000 rpm离心10 min，取上清。（注：此时4℃离心不利于沉淀沉降。）
7. 将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。
8. 将上述操作6的上清液转移至Spin Column中，12,000 rpm离心1 min，弃滤液。
9. 将500 μl的Rinse A加入Spin Column中，12,000 rpm离心30 sec，弃滤液。
10. 将700 μl的Rinse B加入Spin Column中，12,000 rpm离心30 sec，弃滤液。（注：请确认Rinse B中加入了指定体积的100%乙醇。）
11. 重复步骤10。
12. 将Spin Column安置于Collection Tube上，12,000 rpm离心1 min。
13. 将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入60 μl的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1 min。（注：把灭菌蒸馏水或Elution Buffer 加热至60℃使用时有利于提高洗脱率。）
14. 12,000 rpm离心1 min洗脱DNA。
15. 构建重组质粒酶切体系，限制性内切酶反应一般在灭菌的0.2或0.5 ml PCR薄壁离
心管中进行。
在冰浴上建立酶切反应体系（20 μl）
ddH2O 12 μl
重组质粒 5 μl（本实验提取的重组质粒DNA）
10×NEB Buffer 2 2 μl
EcoRⅠ0.5 μl
Hind III 0.5 μl
Total 20 μl
限制性内切酶最后加入，手弹混匀或用吸头轻轻上下吹吸混匀，3,000 rpm离心
15sec。37℃水浴温育90 min。
16. 取20 μl酶切产物，加入4 μl 6×上样缓冲液，混匀后0.8%凝胶电泳观察实验结果。
【实验结果】
7 7’ 4 4’ M 2 5 6 8
重组质粒双酶切电泳检测图
【实验结果分析】
将实验六中2、4、4’、5、6、7’、、8号剩余的菌液进行重组质粒DNA的提取及酶切鉴定。所得结果如电泳检测图，由图可知，对应7、8号泳道的样品双酶切成功，为阳性重组子；对应2、4、5号泳道的样品双酶切不成功，重组子为假阳性；对应6号泳道的样品经酶切鉴定，确认为非重组子。本人实验结果为6号。
分子生物学实验报告
姓名：曲若端
专业：植物遗传
学号：2011211011