英文解释: solid phase peptide synthesis 简写为SPPS
在肽合成的技术方面取得了突破性进展的是R.Bruce Merrifield，他设计了一种肽的合成途径并定名为固相合成途径。由于R.BruceMerrifield 在肽合成方面的贡献，1984年获得了诺贝尔奖。下面给出了肽固相合成途径的简单过程（合成一个二肽的过程）。
氯甲基聚苯乙烯树脂作为不溶性的固相载体，首先将一个氨基被封闭基团（图中的X）保护的氨基酸共价连接在固相载体上。在三氟乙酸的作用下，脱掉氨基的保护基，这样第一个氨基酸就接到了固相载体上了。然后氨基被封闭的第二个氨基酸的羧基通过N,Nˊ-二环己基碳二亚胺（DCC，Dicyclohexylcarbodiimide）活化，羧基被DCC活化的第二个氨基酸再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，这样在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽。
重复上述肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度。最后脱去保护基X，用HF水解肽链和固相载体之间的酯键，就得到了合成好的肽。
固相合成的优点主要表现在最初的反应物和产物都是连接在固相载体上，因此可以在一个反应容器中进行所有的反应，便于自动化操作，加入过量的反应物可以获得高产率的产物，同时产物很容易分离。
化学合成多肽现在可以在程序控制的自动化多肽合成仪上进行。Merrifield成功地合成出了舒缓激肽（9肽）和具有124个氨基酸残基的核糖核酸酶。1965年9月，中国科学家在世界上首次人工合成了牛胰岛素。
多肽固相合成法
固相合成法的诞生
多肽合成研究已经走过了一百多年的光辉历程。1902年，Emil Fischer 首先开始关注多肽合成，由于当时在多肽合成方面的知识太少，进展也相当缓慢，直到1932年，Max Bergmann等人开始使用苄氧羰基(Z)来保护α-氨基，多肽合成才开始有了一定的发展。
到了20世纪50年代，有机化学家们合成了大量的生物活性多肽，包括催产素，胰岛素等，同时在多肽合成方法以及氨基酸保护基上面也取得了不少成绩，这为后来的固相合成方法的出现提供了实验和理论基础。
1963年，Merrifield首次提出了固相多肽合成方法(SPPS)，这个在多肽化学上具有里程碑意义的合成方法，一出现就由于其合成方便，迅速，成为多肽合成的首选方法，而且带来了多肽有机合成上的一次革命，并成为了一支独立的学科——固相有机合成(SPOS)。因此，Merrifield荣获了1984年的诺贝尔化学奖。Merrifield经过了反复的筛选，最终屏弃了苄氧羰基(Z)在固相上的使用，首先将叔丁氧羰基(BOC)用于保护α-氨基并在固相多肽合成上使用，同时，Merrifield在60年代末发明了第一台多肽合成仪，并首次合成生物蛋白酶，核糖核酸酶(124个氨基酸)。
1972年，Lou Carpino首先将9-芴甲氧羰基(FMOC)用于保护α-氨基，其在碱性条件下可以迅速脱除，10min就可以反应完全，而且由于其反应条件温和，迅速得到广泛使用，以BOC和FMOC这两种方法为基础的各种肽自动合成仪也相继出现和发展，并仍在不断得到改造和完善。同时，固相合成树脂，多肽缩合试剂以及氨基酸保护基，包括合成环肽的氨基酸正交保护上也取得了丰硕的成果。
多肽合成仪介绍
多肽合成仪的诞生
虽然Merrifield在发明固相多肽合成科学并取得巨大成功的同时，使用了自主研发的合成设备，但却没因此将多肽合成仪引入市场。1970年，Beckman公司开发的全自动多肽合成仪Beckman 990 Peptide Synthesizer 作为第一台投入市场的科研用多肽合成仪，被美国多所大学的实验室采用。
几乎同一时间，Vega Biotechnologies, Inc.公司开发出两款经济型多肽合成仪：Vega’s Coupler 1000与Vega’s Coupler 250 (不久又推出Vega’s Coupler 296),其将多肽合成后续的在线切割理念结合到设备中，所有反应器采用防爆玻璃材质，防止TFA的腐蚀。被当时的肽化学界称为最经济适用的多肽合成仪。
而今，Beckman与Vega’s两家公司均停止的多肽合成仪的研发与制造，而转向到更多面的化学合成、分离、检测技术设备的研制产业中。
多肽合成仪的发展
第一代多肽合成仪是以Beckman公司推出的Beckman 990 Peptide Synthesizer以及Vega’s Biotechnologies公司推出的Vega’s 296 Peptide Synthesizer为代表的，诞生在上世纪七十年代。
虽然随着生产工艺的改进和发展，如今第一代多肽合成仪已全部退出了市场。但1990年以前的众多肽化学文献都是在此实验设备上运行研发而来，第一代的多肽合成仪为之后的合成仪研发与制造产生了重大意义。
第二代多肽合成仪是以Protein Technologies公司推出的PS3 Peptide Synthesizer以及Advanced ChemTech公司推出的ACT peptide synthesizer Model 90为代表的，诞生在上世纪八十年代。此两款设备也是目前市场上仍在销售的最早的多肽合成仪。
PS3 的设计原理是采用氮气鼓泡的反应方式来对反应物进行搅拌，即合成仪上反应器是固定的，氮气从反应器的下方通过反应器到上部排出，在这一过程中产生的汽泡把固相和液相混合起来。这样设计的好处是结构简单，成本低，但反应相对温和：1）有时候多肽-固相载体在静电作用下会“抱团”，使其不能与液相充分混合，在这种情况下需要调高氮气的压力以消除静电作用；而在静电作用消除后要把压力立刻调低，不然的话较高的压力会把多肽-固相载体“吹”到反应器液面上方。由于多肽-固相载体具有较强的粘壁性，一旦被粘到反应器液面上方就再也无法下来，也就是无法再参加反应。显然第一代机器是无法自动作这样的压力调整的，这就是造成反应“死角”的重要原因。反应死角会降低多肽合成的效率和多肽的纯度，有的甚至造成合成的失败。2）长时间氮气鼓泡会使溶液挥发，液面降低后一部分多肽-固相载体就粘在液面上方，也无法再参加反应。3）氮气消耗量大，运行成本增大。
ACT90的设计原理是反应器在直立下围绕原点作左右摆动，或者圆周运动。ACT的多肽合成仪同样具有反应温和的特点，即转动角度与速度都不能够完全达到氨基酸耦合的极限，反应往往需要更长的时间。
第三代多肽合成仪是以Applied Biosystems公司的ABI 433 peptide synthesizer 与C S Bio公司的CS336为代表的无死角多肽合成仪为代表的，诞生在上世纪九十年代。
ABI433的设计原理是反应器上方相对固定，而下方作圆周360度快速旋转，带动反应器里的固液两相从底部向上作螺旋运动，一直达到反应器的最上方。换句话说，溶液可以达到反应器内部的任意点，真正做到了无死角。由于搅拌速率可达每分钟1800转的高速，反应得以充分完全。由于无死角的搅拌方式保证的肽的合成纯度，ABI433型多肽合成仪（其退出多肽合成仪市场后最后一款仪器）至今在世界上还占有着很大的比例。当然，ABI产品的售价也是最高的。由于部件使用频率高，电磁阀会经常损坏，而ABI将7个电磁阀做成模块化的设计，坏掉一个电磁阀必须要更换整个模块，无形中增加了维修成本。
CS336的设计原理是反应器中点为圆心，上下做180度旋转搅拌，搅拌速度可达180rpm，同时其采用了氮气鼓泡反应方式的优越性，将氮气吹动
作为可选反应方式融入反应方法中，多肽合成仪在科研领域的高耦合率效果得到充分体现。
多肽合成仪的现状
进入二十世纪以来，各大合成仪制造公司相继推出了升级产品和新产品，如Protein Technologies公司推出Tribute双通道多肽合成仪，将“短信通知”功能融入产品，增添了用户与设备之间的紧密感，更加人性化；C S Bio公司对其从研发型到生产型设备的UV Online Monitor系统配置统一升级，用户可直观看到每一部氨基酸偶联反应的状态并可根据数据调整出最佳合成效果与工艺；Advanced ChemTech公司自2005年破产重组后分裂为两家新公司，其中Aapptec延续了其前身的生产步骤，推出Focus XC三通道合成仪。美国另一家公司CEM以蛋白质有机反应设备的制造著称，推出了微波多肽合成仪同样可以合成简单的小分子多肽。其采用微波加热方式，大大提高了反应速度，将反应的速率增加到之前多肽合成仪的几倍甚至十几倍。可惜的是在加热的情况下副反应也相应增多，多肽纯度不能与之前的第三代甚至第二代产品媲美。另外，微波加热方法无法放大，故不适合用作多肽药物的研发。
活化基团Fmoc与tBoc
多肽固相合成法
多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序一般从C端（羧基端）向N端（氨基端）合成。固相合成法，大大的减轻了每步产品提纯的难度。为了防止副反应的发生，参加反应的氨基酸的侧链都是保护的。羧基端是游离的，并且在反应之前必须活化。固相合成方法有两种，即Fmoc 和tBoc。由于Fmoc比tBoc存在很多优势，现在大多采用Fmoc法合成具体合成由下列几个循环组成：
1. 去保护：Fmoc保护的柱子和单体必须用一种碱性溶剂（piperidine）去除氨基的保护基团。
2. 激活和交联：下一个氨基酸的羧基被一种活化剂所活化。活化的单体与游离的氨基反应交联，形成肽键。在此步骤使用大量的超浓度试剂驱使反应完成。循环：这两步反应反复循环直到合成完成。
3. 洗脱和脱保护：多肽从柱上洗脱下来，其保护基团被一种脱保护剂（TFA）洗脱和脱保护。
树脂的选择及氨基酸的固定
多肽固相合成法
将固相合成与其他技术分开来的最主要的特征是固相载体，能用于多肽合成的固相载体必须满足如下要求：必须包含反应位点（或反应基团），以使肽链连在这些位点上，并在以后除去；必须对合成过程中的物理和化学条件稳定；载体必须允许在不断增长的肽链和试剂之间快速的、不受阻碍的接触；另外，载体必须允许提供足够的连接点，以使每单位体积的载体给出有用产量的肽，并且必须尽量减少被载体束缚的肽链之间的相互作用。
用于固相法合成多肽的高分子载体主要有三类：聚苯乙烯-苯二乙烯交联树脂、聚丙烯酰胺、聚乙烯-乙二醇类树脂及衍生物，这些树脂只有导入反应基团，才能直接连上（第一个）氨基酸。根据所导入反应基团的不同，又把这些树脂及树脂衍生物分为氯甲基树脂、羧基树脂、氨基树脂或酰肼型树脂。BOC合成法通常选择氯甲基树脂，如Merrifield树脂；FMOC合成法通常选择羧基树脂如王氏树脂。氨基酸的固定主要是通过保护氨基酸的羧基同树脂的反应基团之间形成的共价键来实现的，形成共价键的方法有多种：氯甲基树脂，通常先制得保护氨基酸的四甲铵盐或钠盐、钾盐、铯盐，然后在适当温度下，直接同树脂反应或在合适的有机溶剂如二氧六环、DMF或DMSO中反应；羧基树脂，则通常加入适当的缩合剂如DCC或羧基二咪唑，使被保护氨基酸与树脂形成共酯以完成氨基酸的固定；氨基树脂或酰肼型树脂，却是加入适当的缩合剂如DCC后，通过保护氨基酸与树脂之间形成的酰胺键来完成氨基酸的固定。
氨基、羧基、侧链的保护及脱除
多肽固相合成法
要成功合成具有特定的氨基酸顺序的多肽，需要对暂不参与形成酰胺键的氨基和羧基加以保护，同时对氨基酸侧链上的活性基因也要保护，反应完成后再将保护基因除去。同液相合成一样，固相合成中多采用烷氧羰基类型作为α氨基的保护基，因为这样不易发生消旋。最早是用苄氧羰基，由于它需要较强的酸解条件才能脱除，所以后来改为叔丁氧羰基（BOC）保护，用TFA（三氟乙酸）脱保护，但不适用含有色氨酸等对酸不稳定的肽类的合成。changMeienlofer和Atherton等人采用Carpino报道的Fmoc(9-芴甲氧羰基)作为α氨基保护基，Fmoc基对酸很稳定，但能用哌啶-CH2CL2或哌啶-DMF脱去，近年来，Fmoc合成法得到了广泛的应用。羧基通常用形成酯基的方法进行保护。甲酯和乙酯是逐步合成中保护羧基的常用方法，可通过皂化除去或转变为肼以便用于片断组合；叔丁酯在酸性条件下除去；苄酯常用催化氢化除去。对于合成含有半胱氨酸、组氨酸、精氨酸等带侧链功能基的氨基酸的肽来说，为了避免由于侧链功能团所带来的副反应，一般也需要用适当的保护基将侧链基团暂时保护起来。保护基的选择既要保证侧链基团不参与形成酰胺的反应，又要保证在肽合成过程中不受破坏，同时又要保证在最后肽链裂解时能被除去。如用三苯甲基保护半胱氨酸的
S-，用酸或银盐、汞盐除去；组氨酸的咪唑环用2,2,2-三氟-1-苄氧羰基和2,2,2-三氟-1-叔丁氧羰基乙基保护，可通过催化氢化或冷的三氟乙酸脱去。精氨酸用金刚烷氧羰基（Adoc）保护，用冷的三氟乙酸脱去。
固相中的接肽反应原理与液相中的基本一致，将两个相应的氨基被保护的及羧基被保护的氨基酸放在溶液内并不形成肽键，要形成酰胺键，经常用的手段是将羧基活化，变成混合酸酐、活泼酯、酰氯或用强的失去剂（如碳二亚氨）形成对称酸酐等方法来形成酰胺键。其中选用DCC、HOBT
或HOBT/DCC的对称酸酐法、活化酯法接肽应用最广。
裂解及合成肽链的纯化 BOC法用TFA+HF裂解和脱侧链保护基，FMOC
法直接用TFA，有时根据条件不同，其它碱、光解、氟离子和氢解等脱保护方法也被采用。合成肽链进一步的精制、分离与纯化通常采用高效液相色谱、亲和层析、毛细管电泳等。
HPLC分析和纯化
分析HPLC使用柱子和泵系统，可以经受传递高压，这样可以用极细的微粒（3-10μ m）做填料。由此多肽要在几分钟内高度被分析。
HPLC分两类：离子交换和反相。离子交换HPLC依靠多肽和固相间的直接电荷相互作用。柱子在一定PH范围带有特定电荷衍变成一种离子体，而多肽或多肽混合物，由其氨基酸组成表现出相反电荷。分离是一种电荷相互作用，通过可变PH，离子强度，或两者洗脱出多肽，通常，先用低离子强度的溶液，以后逐渐加强或一步一步加强，直到多肽从柱中洗脱出。离子交换分离的一个例子使用强阳离子交换柱。如sulfoethylaspartimide 通过酸性PH中带正电来分离。
反相HPLC条件与正常层析正相反。多肽通过疏水作用连到柱上，用降低离子强度洗脱，如增加洗脱剂的疏水性。通常柱子由共价吸附到硅上的碳氢烷链构成，这种链长度为G4-G8碳原子。由于洗脱是一种疏水作用。大的疏水肽用短链柱洗脱好。然而，总体实践中，这两类柱互变无多少显著差别，别类载体由碳水化合物构成，比如苯基。
典型的操作常由两绶冲剂组成，0.1%TFA-H2o和80%
acetonitrile0.1%TFA--H2o稀acetonitrile。用线型梯变以每分钟0.5%到1.0%改变的速度混合。常见分析和纯化用柱为4.6×250mm(3-10μ m)和22×250mm(10μ m). 如果用径向填柱，那么大小是8×100（3-10μm）和25×250mm(10μ m)。
大量各种缓冲剂含许多不同试剂，比如heptafluorobutyric酸，0.1%磷酸，稀He formic酸(5-6%, pH2-4), 10-100mM NH4HCO3,醋酸钠/氨，TFA/TEA，磷酸钠或钾，异戊酚。这样许多不同组合可形成缓冲剂，但要注意一点：硅反相柱料不能长时间暴露于高pH，甚至微碱pH，因为这样会破坏柱子。
Fmoc―氨基酸的制备和侧链保护
Fmoc基团是在有NaHCO3或Na2CO3存在的二氧六环溶液中，理想的Fmoc-氨基酸的侧链保护基应在碱性条件下稳定，在酸性条件下脱除..
侧链保护
多肽固相合成法
1. Asp和Glu
Asp和Glu侧链羧基常用t-Bu保护.可用TFA、TMSBr等脱除.但是用
t-Bu保护仍有侧链环化形成酰亚胺的副反应发生.近年来，发展了一些新的保护基如环烷醇酯、金刚烷醇酯等可减轻这一副反应，这些保护基可用TMSOTf(三氟甲磺酸三甲硅烷酯)除去.
2. Ser、Thr和Tyr
ser、Thr的羟基及Tyr的酚羟基通常用t-Bu保护.叔丁基的引入比较麻烦，首先ser制成苄氧羰基酯，再在酸催化下与异丁烯反应.Ser和Thr 还可用苄基保护，Ser用苄醇引入苄基、Thr用溴苄引入苄基.
3. Asn和Gln
Asn和Gln侧链的酰胺键在肽合成中一般不加以保护.但合成大肽时，Asn和Gln的α-羧基活化时可能会发生分子内脱氢反应生成氰基化合物.碱性时Gln的侧链可以环化生成酰胺.而且不保护的Fmoc-Gln和Fmoc-Asn 在DCM中溶解度很差.为了避免这些问题，可以用9-咕吨基，2，4，6-三甲氧苄基，4，4′―二甲氧二苯甲基或三苯甲基等保护，这四种基因均可用TFA脱除.
4. His
His是最容易发生消旋化的氨基酸，必须加以保护.
对咪唑环的非π-N开始用苄基(Bzl)和甲基磺酰基(TOS)保护.但这两种保护基均不太理想.TOS对亲核试剂不稳定，Bzl需要用氢解或Na/NHs除去，并且产生很大程度消旋.Boc基团是一个较理想的保护基，降低了咪唑环的碱性，抑制了消旋，成功地进行了一些合成.但是当反复地用碱处理时，也表现出一定的不稳定性.哌啶羰基在碱中稳定，但是没能很好地抑制消旋，而且脱保护时要用很强的亲核试刘如.
对咪唑环π-N保护，可以完全抑制消旋，π-N可以用苄氧甲基(Bom)和叔丁氧甲基(Bum)保护，(Bum)可以用TFA脱除，Bom更稳定些，需用催化氢解或强酸脱保护，Bum是目前很有发展前途的His侧链保护基，其不足之处在于Fmoc(His)Bum在DCM和DMF中的溶解度较差.
5. Cys
Cys的－SH具有强亲核性，易被酰化成硫醚，也易被氧化为二硫键，必须加以保护.常用保护基有三类：一类用TFA可脱除，如对甲苄基、对甲氧苄基和三苯甲基等；第二类可用(CF3CO)3T1／TFA脱除，对TFA稳定.如t-Bu、Bom和乙酰胺甲基等.第三类对弱酸稳定，如苄基和叔丁硫基(stBu)
等，Cys(StBu)可用巯基试剂和磷试剂还原，Cys(Bzl)可用Na/NH3(1)脱保护.
6. Arg
Arg的胍基具有强亲核性和碱性，必须加以保护.理想的情况是三个氮
都加以保护，实际上保护1或2个胍基氮原子.保护基分四类：(1)硝基(2)烷氧羰基(3)磺酰基(4)三苯甲基.
硝基在制备、酰化裂解中产生很多副反应，应用不广.烷氧羰基应主要
有Boc和二金刚烷氧羰基(Adoc)2、Fmoc(Arg)Boc的耦联反效率不高，哌啶
理时不处稳定，会发生副反应；Adoc保护了两个非π－N，但有同样的副
反应发生.对磺酰基保护，其中TOS应用最广，但它较难脱除.近年来2，3，6-三甲基-4-甲氧苯横酰基(Mtr)较受欢迎，在TFA作用下，30分钟即可脱除，但是它们都不能完全抑制侧链的酰化发生.三苯甲基保护基可用TFA脱除.缺点是反应较慢，侧链仍有酰化反应，且其在DCM、DMF中溶解度不好.
7. Lys
Lys的ε-NH2必须加以保护.但与α－NH2的保护方式应不同，该保护
基要到肽链合成后除去.ε－NH2的保护无消旋问题，可以采用酰基保护基，其它常用的保护基有苄氧碳基
8. Fmoc基团的脱除
Fmoc基团的芴环系的吸电子作用使9-H具有酸性，易被较弱碱除去，
反应条件很温和.反应过程可表示如下：哌啶进攻9-H,β消除形成二苯芴烯，很容易被二级环胺进攻形成稳定的加成物.Fmoc基团对不同的碱稳定性
不同，可根据实际条件选用.
9. 耦联反应
固相中的接肽反应原理与液相中基本一致.将两个相应的氨基被保护
的及羧基被保护的氨基酸放在溶液内，并不形成肽键.要形成酰胺键，经常
用的手段是将羧基活化，其方法是将它变成混合酸酐，或者将它变为活泼酯、酰氯，或者用强的失去剂(碳二亚胺)也可形成酰胺键。
碳二亚胺是常用的活化试剂，其中Dcc使用范围最广，其缺点是形成
了不溶于DCM的DCH，过滤时又难于除尽.其他一些如二异丙基碳二亚胺(DCI)、甲基叔丁基碳二亚胺也用于固相合成中，它们形成的脲溶于DCM中，经洗涤可以除去.其他活化试剂，还有Bop(Bop－C1)、氯甲酸异丙酯、氯甲
酸异丁酯、SOC12等.其中Dcc、Bop活化形成对称酸酐、SOC12形成酰氯，其余三种形成不对称酸酐。 '[)V#e'{8E2c
10. 对称酸酐法
用Dcc形成对称酸酐的方法使用较广.其缺点是有些氨基酸在DCM中不易溶解，生成的Fmoc氨基酸酐溶解度更差.同时还有些副反应，如形成二肽、消旋等.â??? %]"B'z9g n6}9b
11. 混合酸酐法
最常用试剂是氯甲酸的异丙基酯和异丁基酯.前者得到的酸酐稳定性好.只产生很少消旋，在适当的化学计量及溶剂条件下，耦联反应很快.而且，在此反应中使用的N-甲基吗啉和N-甲基哌啶对Fmoc基团无影响.
12. 酰氯法
在Boc法中不常用的酰氯，因为比较激烈，一些保护基如Boc不稳定.但是，Fmoc基团可以耐受酰氯处理，生成的Fmoc氨基酰氯也很稳定.在三甲基乙酸／三胺或苯并三氮唑／二异丙基乙二胺中，反应速度很快，消旋很少.酰氯法在固相合成中应用还不多，但已表明，Fmoc－氨基酰氯适用于合成有立体障碍的肽序列.
13. 活化酯法
活化酯法在固相合成中应用最为广泛.采用过的试剂也很多，近来最常用的有HOBt酯、ODhbt酯、OTDO酯等.
HOBt酯反应快，消旋少，用碳二亚胺很容易制得；ODhbt酯很稳定，容易进行分离纯化，与HOBt酯具有类似的反应性和消旋性能，它还有一个优越之处，在酰化时有亮黄色、耦联结束时颜色消失，有利于监测反应；OTDO酯与ODhbt酯类似，消旋化极低，易分离，酰化时伴有颜色从桔红色到黄色的变化等. b1Z7n+k:E5w3n2E2l7\
14. 原位法
将碳二亚胺和α－N保护氨基酸直接加到树脂中进行反应叫做原位法.。
用DIC代替Dcc效果更好.其他的活化试剂还有Bop和Bop-C1等.原位法反应快、副反应少、易操作.其中DIC最有效，其次是Bop、Bop-C1等.遗憾的是Bop酰化时生成致癌的六甲基磷酰胺，限制了其应用.
15. 裂解及侧链保护基脱除
Fmoc法裂解和脱侧链保护基时可采用弱酸.TFA为应用最广泛的弱酸试剂，它可以脱除t-Bu、Boc、Adoc、Mtr等；条件温和、副反应较少.不足之处：Arg侧链的Mtr很难脱除，TFA用量较大；无法除掉Cys的t-Bu等基因.也有采用强酸脱保护的方法：如用HF来脱除一些对弱酸稳定的保护基，如Asp、Glu、Ser、Thr的Bzl(苄基)保护基等，但是当脱除Asp的吸电子保护基时，会引起环化副反应.而TMSBr和TMSOTf在有苯甲硫醚存在时，脱保护速度很快.此外，根据条件不同，碱、光解、氟离子和氢解等脱保护方法也有应用.
固相合成法对于肽合成的显著的优点：简化并加速了多步骤的合成；因反应在一简单反应器皿中便可进行，可避免因手工操作和物料重复转移而产生的损失；固相载体共价相联的肽链处于适宜的物理状态，可通过快速的抽滤、洗涤未完成中间的纯化，避免了液相肽合成中冗长的重结晶或分柱步骤，可避免中间体分离纯化时大量的损失；使用过量反应物，迫使个别反应完全，以便最终产物得到高产率；增加溶剂化，减少中间的产物聚焦；固相载体上肽链和轻度交联的聚合链紧密相混，彼此产生一种相互的溶剂效应，这对肽自聚集热力学不利而对反应适宜。固相合成的主要存在问题是固相载体上中间体杂肽无法分离，这样造成最终产物的纯度不如液相合成物，必需通过可靠的分离手段纯化。
多肽的不稳定
多肽的不稳定性是其制剂研究中存在的主要问题之一，其原因较多。但对某一个多肽来说引起不稳定的主要原因并不多。详细研究外界条件（如PH、温度、光照、氧浓度等）对多肽稳定性的影响有助于设计合理的制剂配方。尽管添加剂稳定多肽的机制还不十分清楚，使用添加剂仍是目前提高多肽制剂稳定性的主要手段之一。应用CD、DSC等分析手段可帮助快速筛选道合适的添加剂。
引起多肽不稳定的原因
1. 脱酰胺反应在脱酰反应中，Asn/Gln 残基水解形成Asp/Glu。非酶催化的脱酰胺反应的进行。在Asn-Gly-结构中的酰胺基团更易水解，位于分子表面的酰胺基团也比分子内部的酰胺基团易水解。
2. 氧化多肽溶液易氧化的主要原因有两种，一是溶液中有过氧化物的污染，二是多肽的自发氧化。在所有的氨基酸残基中，Met、Cys和His、Trp、Tyr等最易氧化。氧分压、温度和缓冲溶液对氧化也都有影响。
3. 水解多肽中的肽键易水解断裂。由Asp参与形成的肽键比其它肽键更易断裂，尤其是Asp-Pro和Asp-Gly 肽键。
4. 形成错误的二硫键二
硫键之间或二硫键与巯基之间发生交换可形成错误的二硫键，导致三级结构改变和活性丧失。
5. 消旋除Gly外，所有氨基酸残基的α碳原子都是手性的，易在碱催化下发生消旋反应。其中Asp残基最易发生消旋应。
6. β-消除β-消除是指氨基酸残基中β碳原子上基团的消除。Cys、Ser、Thr、Phe、Tyr 等残基都可通过β-消除降解。在碱性PH下易发生β-消除，温度和金属离子对其也有影响。
7. 变性、吸附、聚集或沉淀变性一般都与三级结构以及二级结构的破坏有关。在变性状态，多肽往往更易发生化学反应，活性难以恢复。在多肽变性过程中，首先形成中间体。通常中间体的溶解度低，易于聚集，形成聚集体，进而形成肉眼可见的沉淀。
蛋白质的表面吸附是其贮存、使用过程中遇到的另一个令人头痛的问题，如riL-2在进行曲灌注时会吸附在管道表面，造成活性损失。
提高稳定性的途径
1. 定点突变
通过基因工程手段替换引起多肽不稳定的残基或引入能增加多肽稳定性的残基，可提高多肽的稳定性。
2. 化学修饰
多肽的化学修饰方法很多，研究最多的是PEG修饰。PEG是一种水溶性高分子化合物，在体内可降解，无毒。PEG与多肽结合后能提高热稳定性，抵抗蛋白酶的降解，降低抗原性，延长体内半衰期。选择合适的修饰方法和控制修饰程度可体质或提高原生物活性。
3. 添加剂
通过加入添加剂，如糖类、多元醇、明胶、氨基酸和某些盐类，可以提高多肽的稳定性。糖和多元醇在低浓度下迫使更多的水分子围绕在蛋白质周围，因而提高了多肽的稳定性。在冻干过程中，上述物质还可以取代水而与多肽形成氢键来稳定多肽的天然构象，而且还可以提高冻干制品的玻璃化温度。此外表面活性剂如SDS、Tween、Pluronic,能防止多肽表面吸附、聚集和沉淀。
4. 冻干
多肽发生的一系列化学反应如脱酰胺、β-消除、水解等都需要水参与，水还可以作为其它反应剂的流动相。另外，水含量降低可使多肽的变性温
度升高。因此，冻干可提高多肽的稳定性。
关于多肽合成 1．多肽化学合成概述： 1963年，R.B.Merrifield［1］创立了将氨基酸的C末端固定在不溶性树脂上，然后在此树脂上依次缩合氨基酸，延长肽链、合成蛋白质的固相合成法，在固相法中，每步反应后只需简单地洗涤树脂，便可达到纯化目的.克服了经典液相合成法中的每一步产物都需纯化的困难，为自动化合成肽奠定了基础.为此，Merrifield获得1984年诺贝尔化学奖. 今天，固相法得到了很大发展.除了Merrifield所建立的Boc法(Boc:叔丁氧羰基)之外，又发展了Fmoc 固相法(Fmoc:9-芴甲氧羰基).以这两种方法为基础的各种肽自动合成仪也相继出现和发展，并仍在不断得到改造和完善. Merrifield所建立的Boc合成法［2］是采用TFA(三氟乙酸)可脱除的Boc为α-氨基保护基，侧链保护采用苄醇类.合成时将一个Boc－氨基酸衍生物共价交联到树脂上，用TFA脱除Boc，用三乙胺中和游离的氨基末端，然后通过Dcc活化、耦联下一个氨基酸，最终脱保护多采用HF法或TFMSA(三氟甲磺酸)法.用Boc 法已成功地合成了许多生物大分子，如活性酶、生长因子、人工蛋白等. 多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质。它是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物,由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。到现在，人们已发现和分离出一百多种存在于人体的肽，对于多肽的研究和利用，出现了一个空前的繁荣景象。多肽的全合成不仅具有很重要的理论意义，而且具有重要的应用价值。通过多肽全合成可以验证一个新的多肽的结构；设计新的多肽，用于研究结构与功能的关系；为多肽生物合成反应机制提供重要信息；建立模型酶以及合成新的多肽药物等。 多肽的化学合成技术无论是液相法还是固相法都已成熟。近几十年来，固相法合成多肽更以其省时、省力、省料、便于计算机控制、便于普及推广的突出优势而成为肽合成的常规方法并扩展到核苷酸合成等其它有机物领域。本文概述了固相合成的基本原理、实验过程，对其现状进行分析并展望了今后的发展趋势。 从1963年Merrifield发展成功了固相多肽合成方法以来，经过不断的改进和完善，到今天固相法已成为多肽和蛋白质合成中的一个常用技术，表现出了经典液相合成法无法比拟的优点。其基本原理是：先将所要合成肽链的羟末端氨基酸的羟基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂相连，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组分反应，接长肽链。重复（缩合→洗涤→去保护→中和及洗涤→下一轮缩合）操作，达到所要合成的肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，经过纯化等处理，即得所要的多肽。其中α-氨基用BOC（叔丁氧羰基）保护的称为BOC固相合成法，α-氨基用FMOC（9-芴甲氧羰基）保护的称为FMOC固相合成法， 2．固相合成的基本原理 多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序一般从C端（羧基端）向 N端（氨基端）合成。过去的多肽合成是在溶液中进行的称为液相合成法。现在多采用固相合成法，从而大大的减轻了每步产品提纯的难度。为了防止副反应的发生，参加反应的氨基酸的侧链都是保护的。羧基端是游离的，并且在反应之前必须活化。化学合成方法有两种，即Fmoc和tBoc。由于Fmoc比tBoc存在很多优势，现在大多采用Fmoc 法合成，如图： 具体合成由下列几个循环组成：
精心整理 多肽合成技术多肽化学已经走过了一百多年的光辉历程，1902年，EmilFischer首先开始关注多肽合成，由于当时在多肽合成方面的知识太少，进展也相当缓慢当时合成采用了苯甲酰，乙酰保护，脱去相当困难，而且容易导致肽链断裂。直到1932年，MaxBergmann等人开始使用苄氧羰基（Z）来保护α-氨基，该保护基可以在催化氢化或氢溴酸的条件下定量脱除，多肽合成才开始有了一定的发展。到了20世纪50年代，随着越来越多的生物活性多肽的发现，大大推动了有机化学家们对多肽合成方法以及保护基的研究，因此这一阶段的研究成果也非常丰富，人们合成了大量的生物活性多肽，包括催产素（oxytocin），胰岛素等，同时在多肽合成方法以及氨基酸保护基上面也取得了不少成绩，这为后来的固相合成方法的出现也提供了实验和理论基础。也就是这个阶段，FredSanger 发明了氨基酸序列测定方法，并为此获得了1958年的Nobel化学奖。还是他后来发明了DNA序列检测方法，并于1980年再次获得了Nobel化学奖，成为到目前为止唯一获得两次Nobel化学奖的科学家。1963年，Merrifield 提出了固相多肽合成方法（SPPS），这个在多肽化学上具有里程碑意义的合成方法，一出来，就由于其合成方便，迅速，现在已经成为多肽合成的首选方法，随后的发展也证明了该方法不仅仅是一种合成方法，而且也带来了有机合成上的一次革命，并成为了一支独立的学科，固相有机合成（SPOS）。当然，Merrifield也因此荣获了1984年的Nobel化学奖。也正是Merrifield，他经过了反复的筛选，最终屏弃了苄氧羰基（Z）在固相上的使用，首先将叔丁氧羰基（BOC）用于保护α-氨基并在固相多肽合成上使用，其可以在酸性条件下定量的脱除，反应也非常迅速，在30min就可以反应完全。由于叔丁氧羰基（BOC）方法中，氨基酸侧链的保护基团大多基于苄基（Bzl），因此也称为BOC-Bzl策略。同时，Merrifield在20世纪60年代末发明了第一台全自动多肽合成仪，并首次合成生物蛋白酶，核糖核酸酶（124个氨基酸）。随后的多肽化学研究主要集中在固相合成树脂，多肽缩合试剂，氨基酸保护基的研究。1972，LouCarpino首先将9-芴甲氧羰基（FMOC）用于保护α-氨基，其在碱性条件下可以迅速脱除，10min就可以反应完全，而且由于其反应条件温和，迅速得到广泛使用，到了20世纪80年代取代了叔丁氧羰基（BOC），成为了固相多肽合成中的首选合成方法。该方法中氨基酸的侧链大多基于叔丁基（But），因此，也称为FMOC-But策略。同时，在多肽合成树脂，缩合试剂以及氨基酸保护，包括合成环肽的氨基酸正交保护上也取得了丰硕的成果。 进入21世纪，随着蛋白质组学的研究深入，对于多肽化学的要求不仅仅是合成方法，而更多的集中在多肽标记与修饰方法，以及蛋白结构与功能模拟多肽的合成以及长肽或蛋白合成。 多肽化学合成的基本介绍 多肽化学合成方法，包括液相和固相两种方法。液相合成方法现在主要采用BOC和Z两种保护方法，现在主要应用在短肽合成，如阿斯巴甜，力肽，催产素等，其相对与固相合成，具有保护基选择多，成本低廉，合成规模容易放大的许多优点。与固相合成比较，液相合成主要缺点是，合成范围小，一般都集中在10个氨基酸以内的多肽合成，还有合成中需要对中间体进行提纯，时间长，工作量大。固相合成方法现在主要采用FMOC和BOC两种方法，它具有合成方便，迅速，容易实现自动化，而且可以比较容易的合成到30个氨基酸左右多肽。 1.1．氨基酸保护基 20种常见氨基酸，根据侧链可以分为几类：脂肪族氨基酸（Ala，Gly，Val，Leu，Ile，），芳香族氨基酸（Phe，Tyr，Trp，His），酰胺或羧基侧链氨基酸（Asp，Glu，Asn，Gln），碱性侧链氨基酸（Lys，Arg），含硫氨基酸（Cys，Met），含醇氨基酸（Ser，Thr），亚氨型基酸（Pro）。多肽化学合成中氨基酸的保护非常关键，直接决定了合成能够成功的关键。因为常见的20中氨基酸中有很多都是带有活性侧链的，需要进行保护，一般要求，这些保护基在合成过程中稳定，无副反应，合成结束后可以完全定量的脱除。合成中需要进行保护的氨基酸包括：Cys，Asp，Glu，His，Lys，Asn，Gln，Arg，Ser，Thr，Trp，Tyr。需要进行保护的基团：羟基，羧基，巯基，氨基，酰胺基，胍基，吲哚，咪唑等。其中Trp也可以不保护，因为吲哚性质比较稳定。当然在特殊的情况下，有些氨基酸也可以不保护，象，Asn，Gln，Thr，Tyr。
多肽合成中肽键形成的基本原理 一个肽键的形成（生成一个二肽），从表面上看是一个简单的化学过程，它指两个氨基酸组分通过肽键（酰胺键）连接，同时脱去水。 在温和反应条件下，肽键的形成是通过活化一个氨基酸（A）的羧基部分，第二个氨基酸（B）则亲核进攻活化的羧基部分而形成二肽（A－B）。如果羧基组分（A）的氨基未保护，肽键的形成则不可控制，可能开有成线性肽和环肽等副产物，与目标化合物A－B混在一起。所以，在多肽合成过程中，对不参与肽键形成的所有官能团必须以暂时可逆的方式加以保护。 因此，多肽合成－即每一个肽键的形成，包括三个步聚： 第一步，需要制备部分保护的氨基酸，氨基酸的两性离子结构不再存在； 第二步，为形成肽键的两步反应，N－保护氨基酸的羧基必须先活化为活性中间体，随后形成肽键。这一耦合反应既可作为一步反应进行，也可作为两个连续的反应进行。 第三步，对保护基进行选择性脱除或全脱除。尽管全部脱除要等到肽链全部组装完成后才能进行，但为了继??? 续肽合成，选择性脱除保护基也是必需的。 由于10个氨基酸（Ser、Thr、Tyr、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Sec和Cys）含有需要选择性保护的侧链官能团，使肽合成变得更加复杂。因为对选择性的要求不同，所以必须区分临时性和半永久性保护基。临时性保护基用于下一步要反应氨基酸的氨基或羧基官能团的暂时保护，在不干扰已经形成的肽键或氨基酸侧链的半永久性保护基才脱除，有时也在合成过程中脱除。 在理想状态下，羧基组分的活化和随后的肽键形成（耦合反应）应为快速反应，没有消旋或副产物形成，并应用等摩尔反应物以获得高产率。但遗憾的是，还没有一种能满足这些要求的化学耦合方法相比，适用于实际合成的方法很少。 在肽合成过程中，参与多种反应的官能团常常与一个手性中心相连（甘氨酸是唯一的例外），存在发生的消旋的潜在危险。 多肽合成循环的最后一步，保护基要全部脱除。除了在二肽的合成中需要全脱保护以外，选择性脱除保护基对于肽链延长具有非常重要的意义。合成策略要深思熟虑地规划，依战略选择，可以选择性脱除Nα－氨基保护基或羧基保护基。“战略”一词这里是指单个氨基酸的缩合反应顺序。一般来说，在逐步合成和片段缩合之间是有区别的。在溶液中进行肽合成（也指“常规合成”），对困难序列，多数情况下，用肽链逐步延长法只能合成较短的片段。要合成更长的肽时，目标分子必须分割成合适的片段，并确定在片段缩合过程中，它们能使能C端差向异构化程度最小。在单个片段逐步组装完成后，再连接产生目标化合物。肽合成战术包括选择最恰当的保护基组合和最佳的片段偶联方法。 最初的固相多肽合成（SPPS）只是肽和蛋白质逐步合成法的一种变化，其概念是将增长的肽链连接到一个不溶性的聚合物载体上，由Robert Bruce Merrifield在1963年首次报道。今天，为纪念他1984年获得诺贝尔奖而称之为Merrifield。在聚合物载体上，也可以进行片段缩合反应。
发明 英文解释: solid phase peptide synthesis 简写为SPPS 在肽合成的技术方面取得了突破性进展的是R.Bruce Merrifield，他设计了一种肽的合成途径并定名为固相合成途径。由于R.BruceMerrifield在肽合成方面的贡献，1984年获得了诺贝尔奖。下面给出了肽固相合成途径的简单过程（合成一个二肽的过程）。 氯甲基聚苯乙烯树脂作为不溶性的固相载体，首先将一个氨基被封闭基团（图中的X）保护的氨基酸共价连接在固相载体上。在三氟乙酸的作用下，脱掉氨基的保护基，这样第一个氨基酸就接到了固相载体上了。然后氨基被封闭的第二个氨基酸的羧基通过N,Nˊ-二环己基碳二亚胺（DCC，Dicyclohexylcarbodiimide）活化，羧基被DCC活化的第二个氨基酸再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，这样在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽。 重复上述肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度。最后脱去保护基X，用HF水解肽链和固相载体之间的酯键，就得到了合成好的肽。 固相合成的优点主要表现在最初的反应物和产物都是连接在固相载体上，因此可以在一个反应容器中进行所有的反应，便于自动化操作，加入过量的反应物可以获得高产率的产物，同时产物很容易分离。 化学合成多肽现在可以在程序控制的自动化多肽合成仪上进行。Merrifield成功地合成出了舒缓激肽（9肽）和具有124个氨基酸残基的核糖核酸酶。1965年9月，中国科学家在世界上首次人工合成了牛胰岛素。固相合成法的诞生 多肽合成研究已经走过了一百多年的光辉历程。1902年，Emil Fischer 首先开始关注多肽合成，由于当时在多肽合成方面的知识太少，进展也相当缓慢，直到1932年，Max Bergmann等人开始使用苄氧羰基(Z)来保护α-氨基，多肽合成才开始有了一定的发展。
附件三 合成多肽药物药学研究技术指导原则
合成多肽药物药学研究技术指导原则 一、前言 多肽类化合物是一类重要的生物活性分子。20世纪70年代生物技术在生命科学领域的应用，使多肽等生物技术药物的研究进展迅速；与此同时，随着多肽固相合成技术及高效液相色谱（HPLC）纯化、分析技术等的发展，合成多肽药物的开发也成为药物研究中的一个活跃领域。 采用化学合成方法制备多肽，可以对天然多肽的结构进行修饰，从而增加多肽与受体的亲和力、选择性，增强对酶降解的抵抗力或改善药代动力学特性，甚至由受体的激动剂变为拮抗剂；此外，新技术的发展，例如以多肽固相合成和组合化学为基础的组合肽库合成技术，使得在短时间内获得大量的多肽化合物成为可能，药物筛选的效率不断提高。因此，将会有越来越多的采用化学合成方法制备的多肽类化合物成为治疗用药物。 合成多肽药物是指采用化学合成方法制备的多肽类药物。这类药物的药学研究同样遵循国家食品药品监督管理局已经发布的相关技术指导原则的一般性要求。但是，由于多肽主要由氨基酸（包括天然氨基酸和非天然氨基酸）构成，这使得多肽类药物在制备方法、结构确证、质量研究等方面又有与一般药物不同的独特问题。本指导原则就是在已有的相关指导原则基础上，对合成多肽药物药学研究方面所涉及的特殊问题进行分析，结合国内对多肽药物研究和评价的实践经验，提出多肽药物药学各项研究的一般性要求。当然，具体品种研究的内容与深度还要取决于品种本身的特性。 本指导原则适用于采用液相或固相合成方法制备的多肽药物。
二、合成多肽药物药学研究的基本考虑 合成多肽药物药学研究的主要内容、研究思路、研究方法及一般性的技术要求与其他类型的化学药物基本一致。但是，由于多肽药物的特点，在进行药学研究时还应注意考虑以下问题。 1、关于多肽（原料药）合成工艺选择的考虑 多肽的化学合成是有机合成的一个非常特殊的分支，目前主要有液相合成和固相合成两种方法。 液相合成是经典的多肽合成方法，一般采用逐步合成或片段缩合方法。逐步合成法通常从链的C'末端氨基酸开始，向不断增加的氨基酸组分中反复添加单个α-氨基保护的氨基酸。片段缩合一般先将目标序列合理分割为片段，再逐步合成各个片段，最后按序列要求将各个片段进行缩合。液相合成的优点是每步中间产物都可以纯化、可以获得中间产物的理化常数、可以随意进行非氨基酸修饰、可以避免氨基酸缺失，缺点是较为费时、费力等。 固相合成是将目标肽的第一个氨基酸的羧基以共价键的形式与固相载体(树脂)相连,再以这一氨基酸的氨基为合成起点,使其与相邻氨基酸（氨基保护）的羧基发生酰化反应,形成肽键。然后让包含有这两个氨基酸的树脂肽的氨基脱保护后与下一个氨基酸的羧基反应,不断重复这一过程,直至目标肽形成为止。其优点是简化了每步反应的后处理操作，避免因手工操作和物料转移而产生的损失，产率较高且能够实现自动化等；其缺点是每步中间产物不可以纯化，必须采用较大的氨基酸过量投料，粗品纯度不如液相合成物，必需通过可靠的分离手段进行纯化等。 液相合成和固相合成各有优缺点，应根据合成的实际需要选择适合的工艺。一般而言，液相合成法较适于合成短肽；固相合成法
实施例1 本发明多肽的合成 1)实验仪器与材料: 二甲基甲酰胺（DMF），哌啶，树脂，二氯甲烷（DCM），茚三酮反应试剂（茚三酮，维C，苯酚），四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU），六氢吡啶（哌啶），三异丙基硅烷TIS,乙二硫醇（EDT），无水乙醚，三氟乙酸（TFA），N-甲基吗啉（NMM），甲醇，各种氨基酸,Fmoc-e-Acp-OH,FITC，多肽固相合成管。 2）溶液配制 脱保护溶剂——六氢吡啶：DMF=1：4 反应液——NMM:DMF=1：24 裂解液——TFA(92.5%)TIS(2.5%)EDT(2.5%) 茚三酮测试液——茚三酮、vc、苯酚各一滴 荧光偶联溶剂——吡啶：DMF：DCM=12:7:5 2)实验步骤: 称量树脂并投入到多肽固相合成管（以下简称反应器）中，加入适量的DMF 溶胀半小时以上。抽掉DMF，用脱保护液进行Fmoc去保护反应，10min于摇床。抽掉去保护液，用DMF、DCM洗涤3次，从反应器中取少量树脂（约5~10mg）于试管中，用乙醇洗涤2次，茚三酮法检测并记录颜色，准备投料，进入氨基酸缩合反应。分别按照SEQ.1- SEQ.N肽的氨基酸序列顺序取相应氨基酸、HBTU （氨基酸：HBTU=1:1），用反应液溶解，投入到反应器中，搅拌反应。1-2小时后，从反应器中取少量树脂于试管中，用乙醇洗涤2次，茚三酮法检测。抽掉反应器中的液体，用DMF、DCM各洗涤2次，得到第一个氨基酸缩合后的肽树脂。对所得肽树脂重复进行以上“Fmoc去保护——氨基酸缩合”反应步骤，至最后一个氨基酸反应完毕，得到序列号为SEQ ID NO.1 –N+1的肽。反应完毕后，DMF、DCM各洗涤树脂2-3次，甲醇洗两次，继续抽干15-20min。反应器中取出合成完的肽树脂，在室温下于裂解液（裂解液先冰浴20min）中裂解两小时。将树脂过滤后，于旋蒸仪蒸干，用无水乙醚（冰浴）洗3次。粗肽使用制备型反相HPLC纯化，使用HPLC检测纯度>90%。所得到的纯肽使用质谱(MS, electrospray)鉴定。 至最后一个肽合成后，取出部分加荧光标记。先将Fmoc-e-Acp-OH按氨基
1．多肽化学合成概述： 1963年，R.B.Merrifield［1］创立了将氨基酸的C末端固定在不溶性树脂上，然后在此树脂上依次缩合氨基酸，延长肽链、合成蛋白质的固相合成法，在固相法中，每步反应后只需简单地洗涤树脂，便可达到纯化目的.克服了经典液相合成法中的每一步产物都需纯化的困难，为自动化合成肽奠定了基础.为此，Merrifield获得1984年诺贝尔化学奖. 今天，固相法得到了很大发展.除了Merrifield所建立的Boc法(Boc:叔丁氧羰基)之外，又发展了Fmoc 固相法(Fmoc:9-芴甲氧羰基).以这两种方法为基础的各种肽自动合成仪也相继出现和发展，并仍在不断得到改造和完善. Merrifield所建立的Boc合成法［2］是采用TFA(三氟乙酸)可脱除的Boc为α-氨基保护基，侧链保护采用苄醇类.合成时将一个Boc－氨基酸衍生物共价交联到树脂上，用TFA脱除Boc，用三乙胺中和游离的氨基末端，然后通过Dcc活化、耦联下一个氨基酸，最终脱保护多采用HF法或TFMSA(三氟甲磺酸)法.用Boc法已成功地合成了许多生物大分子，如活性酶、生长因子、人工蛋白等. 多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质。它是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物,由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。到现在，人们已发现和分离出一百多种存在于人体的肽，对于多肽的研究和利用，出现了一个空前的繁荣景象。多肽的全合成不仅具有很重要的理论意义，而且具有重要的应用价值。通过多肽全合成可以验证一个新的多肽的结构；设计新的多肽，用于研究结构与功能的关系；为多肽生物合成反应机制提供重要信息；建立模型酶以及合成新的多肽药物等。 多肽的化学合成技术无论是液相法还是固相法都已成熟。近几十年来，固相法合成多肽更以其省时、省力、省料、便于计算机控制、便于普及推广的突出优势而成为肽合成的常规方法并扩展到核苷酸合成等其它有机物领域。本文概述了固相合成的基本原理、实验过程，对其现状进行分析并展望了今后的发展趋势。 从1963年Merrifield发展成功了固相多肽合成方法以来，经过不断的改进和完善，到今天固相法已成为多肽和蛋白质合成中的一个常用技术，表现出了经典液相合成法无法比拟的优点。其基本原理是：先将所要合成肽链的羟末端氨基酸的羟基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂相连，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组分反应，接长肽链。重复（缩合→洗涤→去保护→中和及洗涤→下一轮缩合）操作，达到所要合成的肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，经过纯化等处理，即得所要的多肽。其中α-氨基用BOC（叔丁氧羰基）保护的称为BOC固相合成法，α-氨基用FMOC（9-芴甲氧羰基）保护的称为FMOC固相合成法， 2．固相合成的基本原理 多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序一般从C端（羧基端）向 N端（氨基端）合成。过去的多肽合成是在溶液中进行的称为液相合成法。现在多采用固相合成法，从而大大的减轻了每步
多肽合成技术 多肽化学已经走过了一百多年的光辉历程，1902年，Emil Fischer首先开始关注多肽合成，由于当时在多肽合成方面的知识太少，进展也相当缓慢，当时合成采用了苯甲酰，乙酰保护，脱去相当困难，而且容易导致肽链断裂。直到1932年，Max Bergmann等人开始使用苄氧羰基（Z）来保护α-氨基，该保护基可以在催化氢化或氢溴酸的条件下定量脱除，多肽合成才开始有了一定的发展。到了20世纪50年代，随着越来越多的生物活性多肽的发现，大大推动了有机化学家们对多肽合成方法以及保护基的研究，因此这一阶段的研究成果也非常丰富，人们合成了大量的生物活性多肽，包括催产素（oxytocin），胰岛素等，同时在多肽合成方法以及氨基酸保护基上面也取得了不少成绩，这为后来的固相合成方法的出现也提供了实验和理论基础。也就是这个阶段，Fred Sanger发明了氨基酸序列测定方法，并为此获得了1958年的Nobel 化学奖。还是他后来发明了DNA序列检测方法，并于1980年再次获得了Nobel化学奖，成为到目前为止唯一获得两次Nobel化学奖的科学家。1963年，Merrifield提出了固相多肽合成方法（SPPS），这个在多肽化学上具有里程碑意义的合成方法，一出来，就由于其合成方便，迅速，现在已经成为多肽合成的首选方法，随后的发展也证明了该方法不仅仅是一种合成方法，而且也带来了有机合成上的一次革命，并成为了一支独立的学科，固相有机合成（SPOS）。当然，Merrifield也因此荣获了1984年的Nobel化学奖。也正是Merrifield，他经过了反复的筛选，最终屏弃了苄氧羰基（Z）在固相上的使用，首先将叔丁氧羰基（BOC）用于保护α-氨基并在固相多肽合成上使用，其可以在酸性条件下定量的脱除，反应也非常迅速，在30min就可以反应完全。由于叔丁氧羰基（BOC）方法中，氨基酸侧链的保护基团大多基于苄基（Bzl），因此也称为BOC-Bzl策略。同时，Merrifield在20世纪60年代末发明了第一台全自动多肽合成仪，并首次合成生物蛋白酶，核糖核酸酶（124个氨基酸）。随后的多肽化学研究主要集中在固相合成树脂，多肽缩合试剂，氨基酸保护基的研究。1972，Lou Carpino 首先将9-芴甲氧羰基（FMOC）用于保护α-氨基，其在碱性条件下可以迅速脱除，10min就可以反应完全，而且由于其反应条件温和，迅速得到广泛使用，到了20世纪80年代取代了叔丁氧羰基（BOC），成为了固相多肽合成中的首选合成方法。该方法中氨基酸的侧链大多基于叔丁基（But），因此，也称为FMOC-But策略。同时，在多肽合成树脂，缩合试剂以及氨基酸保护，包括合成环肽的氨基酸正交保护上也取得了丰硕的成果。 进入21世纪，随着蛋白质组学的研究深入，对于多肽化学的要求不仅仅是合成方法，而更多的集中在多肽标记与修饰方法，以及蛋白结构与功能模拟多肽的合成以及长肽或蛋白合成。 多肽化学合成的基本介绍 多肽化学合成方法，包括液相和固相两种方法。液相合成方法现在主要采用BOC和Z两种保护方法，现在主要应用在短肽合成，如阿斯巴甜，力肽，催产素等，其相对与固相合成，具有保护基选择多，成本低廉，合成规模容易放大的许多优点。与固相合成比较，液相合成主要缺点是，合成范围小，一般都集中在10个氨基酸以内的多肽合成，还有合成中需要对中间体进行提纯，时间长，工作量大。固相合成方法现在主要采用FMOC和BOC两种方法，它具有合成方便，迅速，容易实现自动化，而且可以比较容易的合成到30个氨基酸左右多肽。 1.1．氨基酸保护基 20种常见氨基酸，根据侧链可以分为几类：脂肪族氨基酸（Ala，Gly，Val，Leu，Ile，），芳香族氨基酸（Phe，Tyr，Trp，His），酰胺或羧基侧链氨基酸（Asp，Glu，Asn，Gln），碱性侧链氨基酸（Lys，Arg），含硫氨基酸（Cys，Met），含醇氨基酸（Ser，Thr），亚氨型基酸（Pro）。多肽化学合成中氨基酸的保护非常关键，直接决定了合成能够成功的关键。因为常见的20中氨基酸中有很多都是带有活性侧链的，需要进行保护，一般要求，这些保护基在合成过程中稳定，无副反应，合成结束后可以完全定量的脱除。合成中需要进行保护的氨基酸包括：Cys，Asp，Glu，His，Lys，Asn，Gln，Arg，Ser，Thr，Trp，Tyr。需要进行保护的基团：羟基，羧基，巯基，氨基，酰胺基，胍基，吲哚，咪唑等。其中Trp也可以不保护，因
多肽合成的研究及应用现状 多肽合成的研究及应用现状 多肽是一种与生物体内各种细胞功能都相关的生物活性物质，它的分子结构介于氨基酸和蛋白质之间，是由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成的化合物。到现在，人们已在人体中发现和分离出一百多种肽类，关于多肽的研究与应用，也取得了巨大的进步，引发了空前的研究热潮。多肽的全合成不仅具有很重要的理论意义，而且具有重要的应用价值，多肽研究成为了医学和分子生物学研究的重点对象，世界各先进国家无不拨出巨款来建立各种规模的多肽研究中心，以期在这一重要领域中取得突破性进展。现在具有生物活性的多肽已经广泛地应用在临床检测、医学研究、疾病防治和治疗等三大方面。 1，多肽合成的研究历史 多肽合成研究已经走过了一百多年的光辉历程，1902年，Emil Fischer首先开始关注多肽合成，由于当时在多肽合成方面的知识太少，进展也相当缓慢，直到1932年，Max Bergmann等人开始使用苄氧羰基（Z）来保护α-氨基，多肽合成才开始有了一定的发展。到了20世纪50年代，有机化学家们合成了大量的生物活性多肽，包括催产素，胰岛素等，同时在多肽合成方法以及氨基酸保护基上面也取得了不少成绩，这为后来的固相合成方法的出现提供了实验和理论基础。1963年，Merrifield首次提出了固相多肽合成方法（SPPS），这个在多肽化学上具有里程碑意义的合成方法，一出现就由于其合成方便，迅速，成为多肽合成的首选方法，而且带来了多肽有机合成上的一次革命，并成为了一支独立的学科——固相有机合成（SPOS），为此，Merrifield荣获了1984年的诺贝尔化学奖。Merrifield经过了反复的筛选，最终屏弃了苄氧羰基（Z）在固相上的使用，首先将叔丁氧羰基（BOC）用于保护α-氨基并在固相多肽合成上使用，同时，Merrifield在60年代末发明了第一台全自动多肽合成仪，并首次合成生物蛋白酶，核糖核酸酶（124个氨基酸）。1972，Lou Carpino 首先将9-芴甲氧羰基（FMOC）用于保护α-氨基，其在碱性条件下可以迅速脱除，10min就可以反应完全，而且由于其反应条件温和，迅速得到广泛使用，以BOC和FMOC这两种方法为基础的各种肽自动合成仪也相继出现和发展，并仍在不断得到改造和完善。同时，固相合成树脂，多肽缩合试剂以及氨基酸保护基，包括合成环肽的氨基酸正交保护上也取得了丰硕的成果。 2，多肽合成的原理与步骤 多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序一般从C端（羧基端）向 N端（氨基端）合成。过去的多肽合成是在溶液中进行的称为液相合成法。从1963年Merrifield发展成功了固相多肽合成方法以来，经过不断的改进和完善，到今天固相法已成为多肽和蛋白质合成中的一个常用技术，表现出了经典液相合成法无法比拟的优点，从而大大的减轻了每步产品提纯的难度。 2.1多肽合成基本原理： 先将所要合成肽链的羟末端氨基酸的羟基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂相连，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组分反应，接长肽链。重复（缩合→洗涤→去保护→中和及洗涤→下一轮缩合）操作，达到所要合成的肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，经过纯化等处理，即得所要的多肽。其中α-氨基用BOC（叔丁氧羰基）保护的称为BOC固相合成法，α-氨基用FMOC（9-芴甲氧羰基）保护的称为FMOC固相合成法。 2.2固相多肽合成的步骤： A，树脂的选择及氨基酸的固定
指导原则编号： 【H 】G P H 11 - 1 合成多肽药物药学研究技术指导原则 二00七年九月
目录 一、前言 二、合成多肽药物药学研究的基本考虑 三、合成多肽药物药学研究的主要内容（一）制备工艺研究 （二）结构确证研究 （三）制剂处方工艺研究 （四）质量研究与质量标准 （五）稳定性研究 四、名词解释 五、参考文献 六、著者
合成多肽药物药学研究技术指导原则 一、前言 多肽类化合物是一类重要的生物活性分子。20世纪70年代生物技术在生命科学领域的应用，使多肽等生物技术药物的研究进展迅速；与此同时，随着多肽固相合成技术及高效液相色谱（HPLC）纯化、分析技术等的发展，合成多肽药物的开发也成为药物研究中的一个活跃领域。 采用化学合成方法制备多肽，可以对天然多肽的结构进行修饰，从而增加多肽与受体的亲和力、选择性，增强对酶降解的抵抗力或改善药代动力学特性，甚至由受体的激动剂变为拮抗剂；此外，新技术的发展，例如以多肽固相合成和组合化学为基础的组合肽库合成技术，使得在短时间内获得大量的多肽化合物成为可能，药物筛选的效率不断提高。因此，将会有越来越多的采用化学合成方法制备的多肽类化合物成为治疗用药物。 合成多肽药物是指采用化学合成方法制备的多肽类药物。这类药物的药学研究同样遵循国家食品药品监督管理局已经发布的相关技术指导原则的一般性要求。但是，由于多肽主要由氨基酸（包括天然氨基酸和非天然氨基酸）构成，这使得多肽类药物在制备方法、结构确证、质量研究等方面又有与一般药物不同的独特问题。本指导原则就是在已有的相关指导原则基础上，对合成多肽药物药学研究方面所涉及的特殊问题进行分析，结合国内对多肽药物研究和评价的实践经验，提出多肽药物药学各项研究的一般性要求。当然，具体品种研究
多肽合成详细解说 1．多肽化学合成概述： 1963年，R.B.Merrifield［1］创立了将氨基酸的C末端固定在不溶性树脂上，然后在此树脂上依次缩合氨基酸，延长肽链、合成蛋白质的固相合成法，在固相法中，每步反应后只需简单地洗涤树脂，便可达到纯化目的.克服了经典液相合成法中的每一步产物都需纯化的困难，为自动化合成肽奠定了基础.为此，Merrifield获得1984年诺贝尔化学奖. 今天，固相法得到了很大发展.除了Merrifield所建立的Boc法(Boc:叔丁氧羰基)之外，又发展了Fmoc固相法(Fmoc:9-芴甲氧羰基).以这两种方法为基础的各种肽自动合成仪也相继出现和发展，并仍在不断得到改造和完善. Merrifield所建立的Boc合成法［2］是采用TFA(三氟乙酸)可脱除的Boc为α-氨基保护基，侧链保护采用苄醇类.合成时将一个Boc－氨基酸衍生物共价交联到树脂上，用TFA 脱除Boc，用三乙胺中和游离的氨基末端，然后通过Dcc活化、耦联下一个氨基酸，最终脱保护多采用HF法或TFMSA(三氟甲磺酸)法.用Boc法已成功地合成了许多生物大分子，如活性酶、生长因子、人工蛋白等. 多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质。它是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物,由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。到现在，人们已发现和分离出一百多种存在于人体的肽，对于多肽的研究和利用，出现了一个空前的繁荣景象。多肽的全合成不仅具有很重要的理论意义，而且具有重要的应用价值。通过多肽全合成可以验证一个新的多肽的结构；设计新的多肽，用于研究结构与功能的关系；为多肽生物合成反应机制提供重要信息；建立模型酶以及合成新的多肽药物等。 多肽的化学合成技术无论是液相法还是固相法都已成熟。近几十年来，固相法合成多肽更以其省时、省力、省料、便于计算机控制、便于普及推广的突出优势而成为肽合成的常规方法并扩展到核苷酸合成等其它有机物领域。本文概述了固相合成的基本原理、实验过程，对其现状进行分析并展望了今后的发展趋势。 从1963年Merrifield发展成功了固相多肽合成方法以来，经过不断的改进和完善，到今天固相法已成为多肽和蛋白质合成中的一个常用技术，表现出了经典液相合成法无法比拟的优点。其基本原理是：先将所要合成肽链的羟末端氨基酸的羟基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂相连，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组分反应，接长肽链。重复（缩合→洗涤→去保护→中和及洗涤→下一轮缩合）操作，达到所要合成的肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，经过纯化等处理，即得所要的多肽。其中α-氨基用BOC（叔丁氧羰基）保护的称为BOC固相合成法，α-氨基用FMOC（9-芴甲氧羰基）保护的称为FMOC固相合成法， 2．固相合成的基本原理 多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序一般从C端（羧基端）向N端（氨基端）合成。过去的多肽合成是在溶液中进行的称为液相合成法。现在多采用固相合成法，从而大大的减轻了每步产品提纯的难度。为了防止副反应的发生，参加反应的氨基酸的侧链都是保护的。羧基端是游离的，并且在反应之前必须活化。化学合成方法有两种，即Fmoc 和tBoc。由于Fmoc比tBoc存在很多优势，现在大多采用Fmoc法合成，如图：
科学与财富 多肽固相合成的研究进展 刘立伟 （华北理工大学迁安学院河北唐山064400） 摘要：多肽是一类非常重要的生物活性物质，在治疗某些疾病方面具有独特的疗效，因此其化学合成有着非常重要的意义。文章介绍了多肽固相合成的原理、方法、固相载体的选择、连接分子的种类及肽键的形成等，揭示了固相合成多肽存在的问题并展望了其研究前景。 关键词：多肽固相合成 1多肽的概述 多肽是普遍存在于生物体内由氨基酸组成的生物活性物质，它是由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。在生物体内发现的多肽已达数万种，由于其具有广泛的生物活性及良好的安全性，因此已日益受到药物研发工作者的重视。尤其在20世纪90年代以后，随着多肽合成技术的日臻成熟，越来越多的活性多肽已被开发并广泛应用于医药、食品、化妆品、农业及畜牧业等领域。 合成多肽的方法主要是指化学合成法，其中液相合成和固相合成是最主要的合成方法，无论是液相法还是固相法都已经很成熟。液相合成多肽主要有逐步合成和分段合成两种途径，它在多肽的工业化生产方面有非常重要的应用。与经典的液相合成多肽方法相比，固相法合成多肽更以其省时、省力、省料、便于计算机控制、便于普及推广的突出优势而成为肽合成的常规方法并扩展到核苷酸合成等其它有机物领域。 2多肽的固相合成 1963年Merrifield提出固相多肽合成方法(SPPS，Solid Phase Peptide Synthesis)，为多肽研究开辟了广阔的天地，并极大地推动了分子生物学等领域的发展，为此1984年Merrifield被授予了诺贝尔化学奖。 2.1固相合成的基本原理 多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，合成一般从C端(羧基端)向N端(氨基端)合成。首先将目的肽第一个氨基酸的羧基以共价键的形式与固相载体相连，再以这一氨基酸的氨基为合成起点，经过脱去氨基保护基并同过量的活化的第二个氨基酸反应，接长肽链。重复(缩合?洗涤?去保护?中和及洗涤?下一轮缩合)操作，达到所要合成的肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，经过纯化等处理，即得所要的多肽。其中α-氨基用Boc（叔丁氧羰基）保护的称为Boc固相合成法，α-氨基用Fmoc（9-甲氧羟基合成）保护的称为Fmoc固相合成法。 2.2合成方法 2.2.1Boc合成法 采用三氟乙酸(TFA)可脱除的Boc为α-氨基保护基，侧链保护采用苄醇类。合成时将一个Boc保护的α-氨基酸共价交联到树脂上，用TFA 脱除Boc，三乙胺中和游离的氨基末端，然后通过DCC活化、偶联下一个氨基酸，最终采用强酸HF法或三氟甲磺酸(TFMSA)将合成的目标多肽从树脂上解离。在Boc合成法中，由于要反复地用酸来脱保护以便进行下一步的偶联，这就引入了一些副反应，如多肽容易从树脂上切除下来，氨基酸侧链在酸性条件不稳定并发生副反应。 2.2.2Fmoc合成法 1978年，Meienlofer和Atherton等人发展了以Fmoc(9-芴甲氧羰基)基团作为α-氨基保护基的多肽合成方法—Fmoc法。在Fmoc法中，采用了可被碱脱除的Fmoc作为α-氨基酸的保护基，侧链采用酸脱除的Boc 保护方法。Fmoc作为氨基保护基的优点在于它对酸稳定，用TFA等试剂处理不受影响，仅需用温和的碱处理，侧链用对碱稳的Boc进行保护等。肽段最后用TFA/二氧甲烷(DCM)定量地从树脂上切除，避免了采用强酸。Fmoc法与Boc法相比，由于Fmoc法反应条件温和，副反应少，产率高，而被广泛应用于多肽合成中。 2.3固相合成的聚合物载体的选择 将固相合成与其他多肽合成技术分开来的最主要的特征是固相载体，而能被用作多肽固相载体的聚合物必须满足以下条件:①必须包含合适的连接分子(或反应基团)，使肽链能连接在载体上面，并在以后除去。②必须在合成过程中保持稳定并且不与氨基酸分子反应。③必须提供足够的连接点，以满足肽链不断增长的需要。目前用于固相合成的聚合物载体主要有三类:聚苯乙烯-苯二乙烯交联树脂、聚丙烯酰胺、聚乙烯—乙二醇类树脂及衍生物。这些聚合物载体只有引入相应的连接分子，才能与氨基酸进行连接。根据连接分子的不同，树脂又被分为几种类型:氯甲基树脂、羧基树脂、氨基树脂或酰肼型树脂。 2.4连接分子 一个理想的连接分子必须在整个合成过程中十分稳定，并在合成后可以定量的切割下来而又不破坏合成的目标分子，同时连接分子还需要根据与树脂相连的肽的C端的结构类型，裂解后生成的羧酸、酰胺或氨基醇等衍生物来选择。固相多肽合成使用过的连接分子为含有氯甲基、巯甲基、酰氯基、对苯甲酰基、芳磺酰氯基、烯丙醇基、丁二酰基、邻硝基苄醇基及二苯氯硅烷等的双官能团化合物。 2.5肽键的形成 固相中肽键的形成原理与液相中的基本一致，应用的方法主要有缩合剂法、混合酸酐法、酰氯法、活化酯法和原位法等，其中选用DCC、HOBT 或HOBT/DCC的对称酸酐法、活化酯法由于在肽键的形成过程中可以减少副反应并抑制消旋的发生，最终得到的多肽收率高等优点而应用最广。 2.6多肽的切割，沉淀与纯化 按既定的顺序合成完多肽后，就要把目标多肽从树脂上切割下来，并进行进一步的纯化。由于多肽的合成有Boc法和Fmoc法两种，因此，它们的切割方法也不完全一样。在Boc法中，主要用TFA＋HF裂解和脱侧链保护。在Fmoc法中直接用TFA进行切割。合成肽链进一步的精制、分离与纯化通常采用高效液相色谱、亲和层析、毛细管电泳等。目前应用最多的是高效液相色谱法， 3展望 固相多肽合成已经有50年的历史了，但是，目前人们还只能合成一些相对较短的肽链，而对于相对分子质量较大、肽链较长的蛋白质类物质，固相合成技术还有很大的局限性。同时在合成中要用到大量的有毒试剂，合成费用昂贵，并伴随副反应、消旋化等问题，这些都是不可忽视的问题。而在生物体内，核糖体上合成肽链的速度和产率都是惊人的，那么，是否能从生物体合成蛋白质的原理上得到一些启发，应用在固相多肽合成（树脂）上，这是一个令人感兴趣的问题。同时，寻找更加绿色、环保的多肽合成技术，对科学家来说也是一个重大的挑战。 参考文献： [1]韩香，顾军.多肽的固相合成。天津药学，2002,14（7）：9. [2]李正超，韩香.多肽合成方法研究进展。武警后勤学院学报.2012，22（2）：153-158. 界,2015,11:191-192. [3]曹华英.浅谈电力市场营销在市场经济条件下的发展创新[J].广东科技,2012,03:97-98. [4]刘淑萍.浅析市场经济下电力市场营销的创新发展[J].科技创新与应用,2012,29:265. [5]孙皓.浅议电力企业市场营销的创新发展[J].科技风,2012,20:269. （上接109页）科学发展 110
----------------------------------------------------------------------------------------- 多肽合成 基础知识汇编 编制: 合成部 ----------------------------------------------------------------------------------------- 一、多肽合成概论 1．多肽化学合成概述： 1963年，［1］创立了将氨基酸的C末端固定在不溶性树脂上，然后在此树脂上依次缩合氨基酸，延长肽链、合成蛋白质的固相合成法，在固相法中，每步反应后只需简单地洗涤树脂，便可达到纯化目的.克服了经典液相合成法中的每一步产物都需纯化的困难，为自动化合成肽奠定了基础.为此，Merrifield获得1984年诺贝尔化学奖. 今天，固相法得到了很大发展.除了Merrifield所建立的Boc法(Boc:叔丁氧羰基)之外，又发展了Fmoc 固相法(Fmoc:9-芴甲氧羰基).以这两种方法为基础的各种肽自动合成仪也相继出现和发展，并仍在不断得到改造和完善. Merrifield所建立的Boc合成法［2］是采用TFA(三氟乙酸)可脱除的Boc为α-氨基保护基，侧链保护采用苄醇类.合成时将一个Boc－氨基酸衍生物共价交联到树脂上，用TFA脱除Boc，用三乙胺中和游离的氨基末端，然后通过Dcc活化、耦联下一个氨基酸，最终脱保护多采用HF法或TFMSA(三氟甲磺酸)法.用Boc法已成功地合成了许多生物大分子，如活性酶、生长因子、人工蛋白等. 多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质。它是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物,由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。到现在，人们已发现和分离出一百多种存在于人体的肽，对于多肽的研究和利用，出现了一个空前的繁荣景象。多肽的全合成不仅具有很重要的理论意义，而且具有
·研究报告· 生物技术通报 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第1期 收稿日期: 2011-06-16基金项目: 贵州省教育厅自然科学研究项目重点项目[黔科教（2009）0132号],贵州省优秀科技教育人才省长专项资金项目[黔省专合字 （2009）104号] ,农业科技成果转化资金项目（2009GB2F200330）,科技人员服务企业行动项目（2009GJF20047),贵州省科技厅农业攻关项目（黔科合NY 字［2011］3052号） 作者简介:陈卓,男,博士,副教授,研究方向:植物分子生物学; E -mail: gychenzhuo@https://www.doczj.com/doc/281914196.html, NPR1多肽抗体的制备和应用 陈卓 刘家驹 毕亮 李向阳 胡德禹 于丹丹 王贞超 杨松 宋宝安 （贵州大学绿色农药与农业生物工程国家重点实验室培育基地, 贵阳 550025; 贵州大学绿色农药与农业生物 工程教育部重点实验室, 贵阳 550025） 摘 要： 根据NCBI GenBank 中报道的NPR1一级结构信息，采用Blastn 、Blastx 、ExPASy 和Protean 等软件进行序列同源性和抗原性指数分析，获得三段序列特异性较高的多肽，并从中优选一段序列特异性多肽，采用9-氟甲氧羰基固相合成法获得序列特异性最好的多肽，采用HPLC 和LC -MS 测定合成多肽的浓度和分子量，试验表明目的多肽纯度达88%、目的多肽分子量为1.92234 kD 。采用碳化二亚胺法将多肽与KLH 进行偶联获得免疫原Pep -KLH ，并将其免疫新西兰大白兔以获得抗血清和多克隆抗体，采用ELISA 和Western blotting 测定其效价和特异性，经ELISA 检测表明抗血清和多克隆抗体可与Pep 发生特异性免疫反应，经Western blotting 试验表明抗血清和多克隆抗体可识别烟草叶片特异性条带，其相对分子量为65 kD ，与预测分子量相符，表明利 用该方法制备的NPR1多肽抗体具有较高特异性和灵敏度。 关键词： 非表达型病程相关蛋白 序列分析 多肽 合成 多克隆抗体 Preparation and Application of Polyclonal Antibody with a Peptide of NPR1 Chen Zhuo Liu Jiaju Bi Liang Li Xiangyang Hu Deyu Yu Dandan Wang Zhenchao Yang Song Song Baoan （State Key Laboratory Breeding Base of Green Pesticide and Agricultural Bioengineering , Guiyang 550025; Key Laboratory of Green Pesticide and Agricultural Bioengineering, Ministry of Education, Guizhou University, Guiyang 550025） Abstract: According to the primary structure of information about NPR1 in NCBI GenBank, 3 polypeptides with sequence -specific were obtained using Blastn and Blastx software. One polypeptide was synthetized by fmoc solid phase synthesis methods, and determined theirs purity and molecular weight using HPLC and LC -MS with purity value reaching at 88% and molecular weight being at 1.92234 kD. The polypeptide was coupled to keyhole limpet hemocyanin （KLH） to form a complex of Pep -KLH by EDC. Anti -sera were acquired by immunizing rabbit with Pep -KLH emulsified by complete freund’s adjuvant （CFA） and incomplete freund’s adjuvant （IFA）, and polyclonal antibody was purified by affinity chromatography. The titer and specificity of anti -sera and polyclonal antibody were determined by ELISA and Western blotting. The results showed that anti -sera and polyclonal antibody reacted with Pep -KLH and detected a specific band of 65 kD, and the size was agreed with the predicted molecular mass. The NPR1 polyclonal antibody revealed high sensitivity and specificity. Key words: Nonexpressor of pathogenesis -related genes 1 （NPR1） Sequence analysis Polypeptide synthesizing Polyclonal antibody 系统性获得性抗性（systemic acquired resistance, SAR）在植物体内具有持效长、作用谱广的抗病特性，在植物体内，它常被外来入侵的病原生物所激发［1,2］。植物SAR 常被植物体内的内源性激素—— 水杨酸（salicylic acid, SA）所调控［3-6］，同时引起病程相关蛋白的表达上调并发挥广泛的抗真菌、抗细菌和抗病毒的活性［7-9］。NPR1（nonexpressor of pathogenesis -related genes 1），又称为NIM1或SAI1，