棉花学报Cotton Science 2013,25(5):453~458
风尧蜜蜂因素对转1Ac 基因棉花花粉介导的基因漂移的影响
贺娟,朱威龙,朱家林,潘李隆,张青文,刘小侠*
(中国农业大学农学与生物技术学院,北京100193)
摘要:在温室内人工创造风力和释放传粉昆虫蜜蜂的条件下,应用PCR 和蛋白试纸条结合的方法检测外源1Ac 基因通过花粉漂移至非转基因棉的频率和距离。结果表明:风力处理和蜜蜂处理的基因漂移频率均显著高于空白对照。漂移至非转基因亲本棉石远321的频率显著高于陆地棉中棉所35和海岛棉吉扎1号。漂移至石远321的频率随距离远近差异显著,而漂移至中棉所35和吉扎1号的频率在不同距离上差异不显著。风力处理共检测到阳性样本72个,在检测范围内,漂移至石远321的最远距离为25.6m ,漂移至中棉所35和吉扎1号的最远距离均为19.2m 。蜜蜂处理中共检测到阳性样本75个,在检测范围内,漂移到常规棉的最远漂移距离均达到设置最远处36m ,并在此处达到峰值。本研究可为转基因棉花基因漂移生态风险性评估提供参考。关键词:转
基因棉花;基因漂移;花粉介导;安全性评估
中图分类号:S562:Q347
文献标志码:A
文章编号:1002-7807(2013)05-0453-06
HE Juan,ZHU Wei-long,ZHU Jia-lin,PAN Li-long,ZHANG Qing-wen,LIU Xiao-xia *
(
100193,
)
The frequency and distance of pollen-mediated gene flow from transgenic cotton to non-transgenic cotton were investi-gated in greenhouses using artificial wind,or bee pollinators,separately.The seedlings of F 1generations were screened using PCR assays,then the positive samples were identified for Bt insecticidal protein by dipstick assay.The results showed that the frequency of gene flow in the greenhouse with wind or bee pollinators was higher than that of the control (without wind or bee pollinators).The pollen-mediated gene flow (PGF)to the non-transgenic counterpart (Shiyuan 321)was obviously higher than those to the island cotton (GIZA 1)and another upland cotton (CCRI 35)in both wind and bee pollination treatments.Further-more,in both treatments,there was a remarkable difference in the PGF to Shiyuan 321related to distances from the donor plots;whereas this trend was not obvious to the other two conventional cultivars.There were a total of 72positive samples in the wind treatment.The maximal distance of gene flow to Shiyuan 321was 25.6m,while the maximal distance to both CCRI 35and GIZA 1was 19.2m.In the bee treatments,there were a total of 75positive samples.The maximal distances of gene flow to all three conventional cultivars was 36m,and gene flow peaked at this distance.Our research builds a foundation for the model of gene flow,and provides value reference for the ecological risk assessment of transgenic cotton.
transgenic
cotton;transgene escape;pollen-mediated;safety assessment
收稿日期:2013-03-21
作者简介:贺
娟(1986-),女,硕士,hejuan@https://www.doczj.com/doc/231333117.html, ;*通讯作者,liuxiaoxia611@https://www.doczj.com/doc/231333117.html,
基金项目:转基因生物新品种培育科技重大专项(2011ZX0811-002)
转基因植物基因漂移是指外源基因通过花粉授精杂交、种子传播等途径在种群之间扩散的过程。基因漂移的途径大致分为2种:自然杂交(花粉介导、种子介导、无性繁殖器官介导)和基因水平上的漂移[1]。随着转基因作物的商品化种
植,基因漂移导致的生态风险愈加受到关注。花
粉介导的基因漂移影响因素包括:植物种类[2-3]、
花粉产量[4]、气候因子[5]、传粉昆虫[6]、转基因作物
种植面积[7]等。转基因植物花粉传播距离和基因漂移频率是目前基因漂移研究的主要内容。大部
棉花学报25卷分转基因作物的花粉传播距离介于10～1000m[5,8-9],
防止外源基因向周围环境扩散的最有效方法是
设置隔离带。基因漂移频率在不同转基因植物之
间存在差异,取决于花粉供体的花粉产量、花粉
受体的异交率、不同物种之间的杂交亲和性以及
花粉竞争能力等[1,10-11,]。
棉花在国民经济中占有重要地位,由于其花
朵较大,花粉外露,易造成外媒传粉的发生。虽然
棉花花粉自身的传播距离有限,但是如果借助昆
虫[12]和风力[13]的传播就可使传播距离大幅增加,可能提高基因漂移的发生风险。本研究在温室中设置风和蜜蜂2种不同传粉媒介处理,结合分子生物学检测和蛋白检测,对温室内转基因棉花外源基因的转入和表达进行有效鉴定,从而对转基因棉花的基因漂移风险进行科学且有效的安全评价。
材料和方法
植物材料
转基因棉花品种为sGK321(1Ac)。常规棉品种为sGK321的非转基因亲本石远321、陆地棉栽培种中棉所35(CCRI35)、海岛棉栽培种吉扎1号(GIZA1)。对所选材料随机进行1Ac基因的检测,均符合试验要求。材料由中国农业科学院棉花研究所提供。
试验设计
试验于北京市中国农业大学上庄试验基地(40°08'22.92"N,116°12'16.98"E)的温室(60m×4 m)中进行。A为对照处理(20m×4m)、B为风力处理(36m×4m)、C为蜜蜂处理(36m×4m),3个处理区均种植常规棉。由于选取1Ac基因作为检测指标,因此可以排除常规品种间杂交对结果的影响。各处理区与转基因棉花种植区(4m×4 m)相邻(图1)。栽培方法和田间管理均按常规棉花生产方式进行,株距30cm,行距80cm。
在对照处理中,仅按处理区规划进行常规种植,不设人工风力、蜜蜂条件。
在风力处理中,在每个品种分布区的上方设置8台电风扇(FB40-1205型,上海华生电器有限公司),高度约为2m,每隔4.5m设置1台,风向自西向东,恒定不变。在sGK321种植区设置了3台落地电风扇(FS40-8A2型,广东美的环境电器制造公司),高度约为2m,使之面向B处理区工作,以保证转基因花粉充分扩散。结合自然气候条件和温室控制条件下所能承担的风速范围,风速设定为低档,并保持处理区内部风速相近。在初花期开启电风扇,并使之保持持续工作(每天5:00－21:00)。
在蜜蜂处理中,参考蜜蜂传粉效率和温室面积,在初花期引入中等意大利蜜蜂(
)蜂群(中国农业科学院蜜蜂研究所提供),置于转基因种植区中部用于传粉。
处理区的风速测定使用热球微风仪(ZRQF F303型,北京检测仪器有限公司)完成。
进入棉花收获期后,各处理以与转基因棉田交界线处记为0m,A处理在0.8m、1.6m、3.2m、6.4m、12.8m、19.2m处取样;B、C处理在0.8m、1.6m、3.2m、6.4m、12.8m、19.2m、25.6 m、36m处取样。每个取样点在棉花上、中、下部摘取棉铃,作为3次重复。采用土培法室内种植,每个样点每个品种随机选择F1代棉苗30株。每个品种在A处理取样180株,在B、C处理分别取样240株,共取660株,用于棉叶总DNA提取。
PCR分析及蛋白检测
采用改良的CTAB法提取样品总DNA[14]。通过PCR检测1Ac基因。用于扩增1Ac的引物序列为:5'-GAAGGATTGAGCAATCTCTA-C-3'和5'-CAATCAGCCTAGTAAGGTCGT-3'[15]。PCR体系:2×Taq PCR MasterMix(PC0902,北京艾德莱生物科技有限公司)10μL,上下游引物(10μmol·L-1)各0.5μL,DNA模板2μL,双蒸水7μL。反应程序:预变性95℃4min,94℃1min、56℃1min、72℃1.5min,30个循环,72℃延伸5图1各处理的田间种植布局
Fig.1Sketch for field design
转基因棉花
Transgenic
cotton
中棉所35CCRI35
石远321Shiyuan321
吉扎1号GIZA1
N
454
基因漂移结果
。与空白处理相比,风力处理的基因漂移频率
显著提高(＜0.05)。空白处理的全部样本均未发
现阳性结果;风力处理存在阳性结果共计72个,不同品种不同取样位点的漂移频率,多数较空白处理的漂移频率大。漂移至非转基因亲本石远321的频率在19.2m 、25.6m 处(19.2m:2,6
=
54.000,＜0.05;25.6m:
2,6
=21.053,＜0.05)显
著高于中棉所35和吉扎1号(表1)。陆地棉中棉所35和海岛棉吉扎1号间,不同距离的漂移频率并未出现显著差异。基因漂移频率在不同距离之间呈现波动。漂移至石远321的频率在不同距离上呈现显著差异(
7,16
=5.256,＜0.05),基因漂
移最远距离为25.6m ;漂移至中棉所35和吉扎1号的频率在不同距离之间差异不显著,基因漂移最远距离均为19.2m 。
min 。使用琼脂糖凝胶电泳检测目的片段。
使用Cry1Ac 蛋白免检测试纸条(金标BT-Cry1Ab/Ac 免疫检测试剂盒,北京银土地生物技术有限公司)对PCR 阳性样本进行蛋白检测。
数据处理
PCR 和蛋白试纸条均呈阳性的样本计为阳性结果,即
1Ac 基因在F 1代植株体内转入并
表达;其余样本计为阴性结果。
基因漂移频率=(含外源1Ac 基因并表
达的F 1代个体数/总检测个数)×100%。
所得数据采用SPSS17.0软件进行统计分析。采用独立样本-test 和Duncan 法多重比较,＜0.05视为有显著差异。
结果与分析
风速测定结果
结果表明(图2),B 处理区风速显著高于A 、C 处理区风速(＜0.05),因而,风力处理达到了试验设计的风力效果,而蜜蜂处理和空白对照可以剔除风力对基因漂移的影响。
不同的大写字母表示特定取样位点A 、B 、C 区之间风速差异显著。
Capital letters represent significant difference of wind velocities among A,B,C treatments at a certain distance.
图2A 、B 、C 三个处理区的风速测定结果
Fig.2
The measurement of wind velocities in A,B,C treatments
贺娟等:风、蜜蜂因素对转1Ac 基因棉花花粉介导的基因漂移的影响5期455
棉花学报25卷
。与空白处理相比,蜜蜂处理的基因漂移频率显著提高(＜0.05)。空白处理的全部样本均未发现阳性结果;蜜蜂处理存在阳性结果共计75个。不同品种不同距离位点的漂移频率,多数较空白处理的漂移频率大。漂移至非转基因亲本石远321的频率相对于中棉所35和吉扎1号在较远距离存在显著差异(6.4m:2,6=6.368,＜0.05;
19.2m:2,6=25.000,<0.05;36m:2,6=8.233,＜0.05)(表2)。漂移至陆地棉中棉所35和海岛棉吉扎1号的频率之间未出现显著差异;但在相同的取样位点,漂移至海岛棉吉扎1号的频率和存在阳性结果的位点数均高于陆地棉中棉所35。基因漂移频率在不同距离之间呈波动性变化。漂移至石远321的频率在不同距离上呈显著差异
(7,16=5.498,＜0.05),漂移至中棉所35和吉扎1号的频率在不同距离间差异不显著。3个品种检测范围内最远漂移距离皆达到最远处36m,且漂移频率在此处达到峰值。
表1风力处理转基因棉发生的基因漂移频率
Table1The frequency of transgenic cotton in the wind treatment
样点距离Distance of sampling plot/m
基因漂移频率The frequency of gene flow/%
石远321Shiyuan321中棉所35CCRI35吉扎1号GIZA1
0.80.00±0.00B0.00±0.00 3.33±3.33
1.626.67±17.64AB0.00±0.000.00±0.00
3.20.00±0.00B0.00±0.00 3.33±3.33
6.460.00±30.55A 3.33±3.33 3.33±3.33
12.80.00±0.00B0.00±0.00 3.33±3.33
19.263.33±6.67a A 3.33±3.33b 3.33±3.33b
25.666.67±14.53a A0.00±0.00b0.00±0.00b
36.00.00±0.00B0.00±0.000.00±0.00
注:平均值(±标准误)为3次重复的均值;纵向为同品种不同距离的比较结果,以大写字母表示;横向为同距离不同品种的比较结果,以小写字母表示(Duncan法多重比较)。
Note:Each trial was replicated three times;Data with capital letters in the column represent significant difference among varying distances,and data with small letters in the row are significantly different among various non-transgenic cottons accord-ing to Duncan's multiple comparison test.
表2蜜蜂处理转基因棉发生的基因漂移频率
Table2The frequency of transgenic cotton in the bee treatment
样点距离Distance of sampling plot/m
基因漂移频率The frequency of gene flow/%
石远321Shiyuan321中棉所35CCRI35吉扎1号GIZA1
0.80.00±0.00C 6.67±6.67 3.33±3.33
1.630.00±17.32BC0.00±0.00 3.33±3.33
3.20.00±0.00C 3.33±3.33 3.33±3.33
6.436.67±14.53a B0.00±0.00b0.00±0.00b
12.810.00±10.00BC0.00±0.00 6.67±3.33
19.250.00±10.00a A0.00±0.00b0.00±0.00b
25.610.00±10.00BC0.00±0.000.00±0.00
3663.33±3.33a A 6.67±6.67b16.67±16.67b
注:平均值(±标准误)为3次重复的均值;纵向为同品种不同距离的比较结果,以大写字母表示;横向为同距离不同品种的比较结果,以小写字母表示(Duncan法多重比较)。
Note:Each trial was replicated three times;Data with capital letters in the column represent significant difference among varying distances,and data with small letters in the row are significantly different among various non-transgenic cottons accord-ing to Duncan's multiple comparison test.
456
讨论
在本试验设定的风媒和虫媒条件下,风和蜜蜂这两种传粉媒介均能使基因漂移频率提高、漂移距离增加。且蜜蜂介导的基因漂移发生范围更广,发生频率更高。棉花果实为蒴果,蜜蜂随机选择传粉时,对传粉花结铃吐絮后产出的各部位的种子均可能造成影响,随机取样检测到的基因漂移可能性就会提高。
在蜜蜂处理中,基因漂移在36m处存在峰值,且在检测范围内有波动。鉴于36m为检测边界,且田间蜜蜂传粉距离可达6km[16],推测蜜蜂传粉随机性较强,但传播距离远,偏嗜远距离传粉。另外,蜜蜂将外源花粉携带至能够接受异源花粉的柱头上,并与自花花粉竞争,因此携带的外源花粉活力至关重要[17]。昆虫携带花粉并使之保持活力可以持续4～8h[18],这就为昆虫介导基因漂移提供了充分的时间,造成漂移频率具有一定的波动性。虽然漂移至陆地棉中棉所35和海岛棉吉扎1号的频率不存在显著差异,但吉扎1号的阳性样本数量多于中棉所35,原因可能是海岛棉花朵艳丽,蜜腺发达更易吸引蜜蜂。
在风力处理中,基因漂移在检测范围内波动性较大,和随着与转基因作物距离的增加漂移频率下降[19-20]的预期不符。可能的原因有2个方面,一为风速,二为样本量。为了营造持续的风力条件并使转基因花粉充分扩散,本试验在转基因棉种植区设置了落地扇,造成处理区初始取样位点风速的大幅提高,导致漂移至此处(0.8m、1.6m)常规棉的频率较低。同时,受温室面积限制,每个取样位点棉花植株数和收获样本数量有限,导致试验结果存在一定的波动性。在风力处理检测结果中存在假阳性的样本,即DNA检测为阳性、蛋白检测为阴性的样本(36m处)。根据对外源基因转入不表达样本的1Ac基因上下游序列分析,最大可能性是长时间、长距离的漂移造成花粉活性降低,致使外源基因不能完全转入。
风力作用下,漂移至海岛棉吉扎1号频率的波动性较中棉所35低。海岛棉植株茂密,株型大,风阻大,植株内部风速小,故风力可以将外源花粉带入植株内部微环境,但带出时风速不足,致使转基因花粉在海岛棉植株内部滞留,提高了杂交的可能性。而陆地棉株型相对较小,对风力携带的转基因花粉拦截作用小,外源花粉的漂移和滞留受风速的影响相对较大。由此推测,持续的风力主要影响转基因花粉漂移的范围,而转基因花粉与常规棉杂交微环境的风速主要影响花粉杂交成功率,进而改变基因漂移的发生风险。
常规棉品种间差异主要表现在19.2m的检测距离以外,这可能与取样位点转基因花粉的活性、识别、接受及杂交过程有关。与田间棉花基因漂移最远距离为20m以上的试验结果[6,15]相结合,可以认为在一定的介导媒介下,转基因花粉在20m的漂移距离内基本能保持较高活性,表现为与常规棉进行正常杂交,并且外源基因转入和表达的效果较好;而在20m以外,转基因花粉活性较低,表现为与常规棉的杂交出现明显的品种间差异性,即转基因棉花的非转基因亲本对含有外源基因的转基因花粉接受程度显著高于其他品种的棉花。
参考文献院
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对转基因棉花的浅析 摘要：1990年，美国利用生物技术，合成B.t杀虫基因，导入棉花获得抗虫转基因棉花，成为世界上第一个拥有转基因抗虫棉的国家。我国“抗虫棉研究”在“七五”期间开始进行。“八五”期间，在“863”计划资助下，也人工合成了CryIA(b)和CryIA(c)杀虫基因导入我国棉花主栽品种获得成功，成为继美国之后，第二个拥有自主研制抗虫棉的国家。 关键词：转基因；棉花；抗虫；种植 正文： 转基因棉花是指把其他物种中的有用基因导入棉花的基因组后，获得了该基因功能的棉花。1990年，美国利用生物技术，合成B.t杀虫基因，导入棉花获得抗虫转基因棉花，成为世界上第一个拥有转基因抗虫棉的国家。我国“抗虫棉研究”在“七五”期间开始进行。“八五”期间，在“863”计划资助下，也人工合成了CryIA(b)和CryIA(c)杀虫基因导入我国棉花主栽品种获得成功，成为继美国之后，第二个拥有自主研制抗虫棉的国家。“九五”开始，“抗虫棉”的研究又被国家“863”计划立为重大项目，进一步开展单价基因、双价基因及多价基因抗虫棉的研究，分离新的抗虫基因及抗刺吸式口器害虫（蚜虫）新基因的分离，改造及合成融合蛋白基因，对获得的新基因进行重组，构建高效植物表达载体。同时“九五”期间，“863”计划还将根据目前单价抗虫棉可能存在的棉铃虫产生抗性的问题，在生产中使用的持久性问题，环境释放安全性问题，遗传分离及稳定性问题，以及田间加代选择农艺性状以及蚜虫危害等问题作深入的研究。（中国转基因棉花产业化背景） 1、转基因棉花的现状 1.1我国的转基因棉花情况 来自中国农业科学院棉花研究所的最新统计显示，今年全国转基因抗虫棉种植面积达4000多万亩，占棉花总面积一半以上。今年全国转基因抗虫棉种植面积达4656万亩，而国产转基因抗虫棉种植面积达到70％左右。目前全国种植转基因抗虫棉的省份有11个。其中河北、山东、河南、安徽4省实现了100％的种植,据中国农业科学院棉花研究所有关负责人介绍，我国目前已经建成高效、工厂化的棉花转基因技术体系，培育成功的转基因棉花新品种已达8个，年产转
转基因棉花的应用研究 1.引言 自1990年美国合成苏云金芽胞杆菌基因（BT基因）并导入棉花获得世界上第一株抗虫转基因棉花以来，世界各国纷纷展开对转基因农作物的研究，发达国家把发展转基因技术作为抢占未来科技制高点和增强农业国际竞争力的战略重点，发展中国家也积极跟进。研究的主要方向分别是抗虫、耐除草剂、抗病、纤维改良、抗旱和耐盐碱[1]。 上个世纪90年代，在中国大部分种植棉花的地区持续性发生棉铃虫害，给棉花生产带来了巨大的威胁，大大增加了棉花种植成本，给种植棉花的农户造成了一定的经济损失。“八五”期间，中国人工合成的Cry1Ab和Cry1Ac杀虫基因导入棉花中获得成功，成为了世界上继美国之后第二个拥有自主研制抗虫棉的国家[2]。培育更加具备优良性状的转基因棉花品种，应用于棉花生产，解决棉花 病虫害给棉花生产带来的巨大损失，减少化学农药的使用量，保护环境和生态平衡，成为了当代转基因技术研究工作者的目标。 2.转基因棉花的技术来源与应用实践 2.1 转基因技术介绍 随着生物基因技术的出现，在技术工具理性的驱动下，人类获得了打破物种间固有边界并根据人类自身的意愿重新改造生物的能力。转基因技术的原理是将人工分离或修饰过的优质基因，导入到生物体基因组中，从而达到改造生物的目的。其理论基础来源于进化论衍生来的分子生物学[3]。基因片段的来源可以是 提取特定生物体基因组中所需要的目的基因，也可以是人工合成指定序列的DNA 片段。 转基因技术的应用可以使重组生物增加人们所期望的新性状，培育出新品种。转基因作物的大规模商业化种植始于1996年，主要的转基因作物有棉花、大豆、玉米和油菜[4]。转基因技术的遗传转化方法按是否需要通过组织培养分成两大类，一类需要通过组织培养再生植株，常用的方法有农杆菌介导转化法、基因枪法；另一类方法不需要通过组织培养，比较成熟的主要有花粉管通道法[5]。 2.2转基因棉花介绍 棉花，属于锦葵科棉属，是世界上最主要的经济作物之一。全世界植棉国家和地区有96个，其中产量较高的国家有中国、美国、印度等[6]。中国是世界产棉大国，年植棉面积470万公顷，棉花产量占世界总产量的1/4[7]。病虫害对棉花的种植有很大的影响，制约了棉花的发展。与此同时，化学农药的大量使用导致了一些棉花害虫抗药性的产生，严重威胁了棉花的生产，并且使环境污染日益恶化。 随着转基因技术的发展，利用植物基因工程和遗传育种技术手段培育的转基因抗虫、耐除草剂棉花，为棉花害虫和草害的控制提供了新的手段。转基因棉花受到了棉农的喜爱，得到了进一步的推广。转基因棉花，就是将人们预想的可以得到表达的基因（比如抗病虫害的苏云金芽胞杆菌基因）通过遗传转化方法进行
根据《中华人民共和国种子法》《农业转基因生物安全管理条例》和《农作物种子生产经营许可管理办法》规定，我部修订了《转基因棉花种子生产经营许可规定》，现予公布，自2016年10月18日起施行。农业部2011年9月6日发布的《转基因棉花种子生产经营许可规定》（农业部第1643号公告）同时废止。 特此公告。 农业部 2016年9月18日 转基因棉花种子生产经营许可规定 第一条为加强转基因棉花种子生产经营许可管理，根据《中华人民共和国种子法》《农业转基因生物安全管理条例》《农作物种子生产经营许可管理办法》，制定本规定。 第二条转基因棉花种子生产经营许可证，由企业所在地省级农业主管部门审核，农业部核发。 第三条申请领取转基因棉花种子生产经营许可证的企业，应当具备以下条件： （一）具有办公场所200平方米以上，检验室150平方米以上，加工厂房500平方米以上，仓库500平方米以上； （二）具有转基因棉花自育品种或作为第一选育人的品种1个以上，或者合作选育的品种2个以上，或者受让品种权的品种3个以上；生产经营的品种应当通过审定并取得农业转基因生物安全证书。生产经营授权品种种子的，应当征得品种权人的书面
同意； （三）具有净度分析台、电子秤、样品粉碎机、烘箱、生物显微镜、电子天平、扦样器、分样器、发芽箱、PCR扩增仪及产物检测配套设备、酸度计、高压灭菌锅、磁力搅拌器、恒温水浴锅、高速冷冻离心机、成套移液器等仪器设备，能够开展种子水分、净度、纯度、发芽率四项指标检测及品种分子鉴定； （四）具有种子加工成套设备，成套设备总加工能力1吨/小时以上，配备棉籽化学脱绒设备； （五）具有种子生产、加工贮藏和检验专业技术人员各3名以上，农业转基因生物安全管理人员2名以上； （六）种子生产地点、经营区域在农业转基因生物安全证书批准的区域内； （七）符合棉花种子生产规程以及转基因棉花种子安全生产要求的隔离和生产条件，生产地点无检疫性有害生物； （八）有相应的农业转基因生物安全管理、防范措施； （九）农业部规定的其他条件。 第四条申请转基因棉花种子生产经营许可证的企业，应当向审核机关提交以下材料： （一）转基因棉花种子生产经营许可证申请表（式样见附件1）； （二）单位性质、股权结构等基本情况，公司章程、营业执照复印件，设立分支机构、委托生产种子、委托代销种子以及以
收稿日期:2008201215 基金项目:国家“863”计划现代农业技术领域重大项目资助(编号2006AA10A211)。 作者简介:魏艳丽,(1978-)女,助理研究员,从事农业微生物研究。 3为通讯作者,E 2mail :yanght @https://www.doczj.com/doc/231333117.html, 文章编号:100224026(2008)0320038204棉花转基因技术研究 魏艳丽1,黄玉杰1,李红梅1,孙红星1,2,杨合同1,23 (1.山东省科学院中日友好生物技术研究中心,山东省应用微生物重点实验室,山东济南250014; 2.山东理工大学,山东淄博255049) 摘要:棉花是一种重要的经济作物,在我国广泛种植。 培育转基因棉花被看作是解决产量和生态环境问题最 根本和最有效的方式。本文介绍了转基因棉花主要的研究方法,包括转化方法以及转入的基因等,并对转基 因棉花的发展趋势作了相关探索。 关键词:转基因;棉花;遗传转化;Bt 中图分类号:S562.032 文献标识码:A A Survey of Cotton Transgene Technology WEI Y an 2li 1,H UANG Y u 2jie 1,LI H ong 2mei 1,S UN H ong 2xing 1,2,Y ANG He 2tong 1,23 (1.Biotechnology Research Center ,Shandong Academy o f Sciences ;K ey Laboratory o f Applied Microbiology o f Shandong Province ,Jinan 250014,China ; 2.School o f Life Sciences ,Shandong Univer sity o f Technology ,Zibo 255049,China ) Abstract :C otton is one of im portant industrial crops ,and is widely planted in China.The cultivation of transgenic cotton is considered the m ost efficient way of increasing yield and res olving environmental problems.We introduced three dominant approaches in the development of genetic cotton and s ome useful target genes ,and forecast its probable future w ork. K ey w ords :transgene ;cotton ;genetic trans formation ;Bt 1 引言 棉花是一种以利用纤维为主的农作物。据估计,棉花每年创造的产值有1800～2000亿美元,全世界有18亿人口以种植棉花为生[1]。棉花同时又是一种非常容易感染病虫害的农作物,我国棉花每年因虫害造成 的产量损失约为10%～15%,而每年用于棉花防治的杀虫剂的剂量约占杀虫剂使用总量的2Π3[2]。随着生物 技术特别是基因工程技术的成熟,人们认识到利用转基因技术改造棉花,是提高棉花产量以及解决环境问题的根本途径。 1979年Price 和Smith 报道通过克劳茨基棉细胞悬浮培养得到胚状体[3],1986年,美国Agracetus 公司的第21卷 第3期 2008年6月 山东科学SH ANDONG SCIE NCE V ol.21 N o.3Jun.2008
转基因棉花环境安全性研究进展 随着转基因技术的大力推广与发展．转基因产品在给人类带来巨大经济利益的同时．食品与环境安全的问题备受社会关注。其中转基因棉花大面积种植尤为重要．利益与安全应该同步发展与推广才能得到人们认可。2008年，全球共有10个国家（前5位包括：美国、阿根廷、巴西、印度、加拿大）增加种植了混合型转基因棉花，其中美国种植转基因棉花达78%：印度多数种植转Bt基因棉花，种植面积占印度种植棉花总面积的82%m。种植的转基因棉花既是主要的纤维经济作物．同时也是仅次于大豆的重要油料和蛋白质作物．全球种植转基因棉花的面积为2100万hm2．位居种植转基因农作物物种的第3位，而国内种植转基因棉花的面积达到530万hm2。北美地区和澳大利亚是种植转基因抗除草剂棉花面积最大的地区与国家，在2007年孟山都第二代抗草甘膦棉花在美国与澳大利亚种植面积达80×104 hm2。抗除草剂有效解决棉花杂草的危害，并扩大除草剂施用范围，降低了除草费用．达到低投入和高产出的目的。因此，在广泛种植转基因棉花过程及生产应用中存在风险随之产生，主要包括：抗除草剂棉花有成为杂草的可能：基因漂移威胁棉花近缘物种：转基因棉花的应用会加速害虫抗性进化：转基因棉花对
非靶标有益生物的影响：转基因棉花对土壤生态环境的影响。笔者旨在对转基因棉花的研究情况进行综述、讨论及展望。 1 种植转基因棉花的优势 1.1 种植转Bt基因棉花对环境的影响 首先．经过长时间种植转Bt基因棉花对环境影响较明显：棉田中的益虫增多，周围其他农田受益，整个农田生态系统呈良性发展态势。Bt基因具有天然杀虫特性，能够杀死害虫中的蛋白质。在国内主要防治棉铃虫．对其他害虫也有间接防治效果，在转基因棉花田中瓢虫、蜘蛛和草蛉等益虫的数量都出现上升．它们会捕食蚜虫等害虫，从而间接起到防治虫害的效果。同时不仅是转基因棉花田受益，这些益虫还会进入邻近的大豆、花生、玉米等非转基因作物田．使整个地域的农田生态系统向有益方向发展。转Bt基因抗虫棉对鳞翅目靶标害虫具有良好的控制作用，减少了化学杀虫剂的使用，降低了对环境的污染，保证了人畜的安全，提高了农民的收益。Mat in等研究发现，印度转基因棉花单产相对增加34.3%．而中国只增加6.11%．美国更少．仅为2.36%。朱行等通过对印度种植转基因棉花研究发现，种植转基因棉花单产增加31%．杀虫剂使用量减少39%．利润增长88%，同时还保护环境，增进健康。Huang对农户种植Bt抗虫棉与非转基因棉的成本收益进行比较指出．农药施用量大幅度减
农业生物技术课程论文 题目：棉花转基因技术研究进展 院（系）：农学院 专业：农学 班级：农学081 姓名：秦绍龙 学号：01108012 成绩： 完成日期：2011年5月25日
棉花转基因技术研究进展 摘要：近些年来，转基因技术被广泛应用于遗传育种中，尤其是在棉花遗传育种和基因改良方面取得了重大的突破，本文主要通过查阅参考文献，综合阐述了三大转基因技术手段及其在棉花抗虫、抗病、抗除草剂以及品质改良等方面的应用与最新进展，并对棉花转基因研究进展中存在的主要问题进行分析。 关键词：棉花；转基因；育种；外源基因；进展 转基因技术又称外源基因导入技术, 它是通过采用农杆菌介导技术、花粉管通道技术与基因枪导入技术, 将外源基因导入受体作物的细胞，并得到整合与表达的一种现代高新育种技术。在国家“863”项目的支持下，我国自20世纪80年代末开始棉花转基因育种技术研究与开发应用,该项技术在我国发展很快，也取得了一些重大的成就与技术突破。在转基因技术的正确指引下，目前棉花转基因育种中已获得了大量转基因抗病、抗虫、抗除草剂等方面的优良抗性株系,并选育出了多个转基因抗病虫品种,这些品种在增强抗病虫性的同时，基本上延续了受体亲本原有的高产、优质的良好性状，但所选育的转基因棉花品种仍不同程度地存在种子活力低、前期生长发育偏慢、中期易发生茎枯病、后期易脱肥早衰、抗性范围窄且随生育进程强度下降等缺陷。 一、转基因棉花研究的概况 自从1983年，人类首次获得转基因烟草、马铃薯以来，植物转基因技术在基础研究和应用开发中获得了显著进展，成功培育一批具有抗虫、抗病、耐除草剂和高产优质等外源优异性状的农作物新品种，对农业的生产方式和经济效益产生了深刻影响。棉花是利用转基因技术进行遗传改良最为成功的作物之一，仅我国自主研制的CryA+CpTI双价抗虫等基因就已被转育到41个棉花品种中。棉花作为主要的经济作物之一，对一个国家国民经济发展起到了举足轻重的作用，也曾一度被列入我国战略储备物资行列。近年来，随着基因工程技术的不断发展，利用生物技术来创新棉花种质资源和培育新品种是一条非常有效的途径，极大地推动了棉花遗传育种的发展随着国际转基因技术的不断发展和转基因生物安全性方面的相关法律法规的不断完善，转基因作物的大面积推广和种植势不可挡。美国转基因抗虫棉大田种植已超过其棉田总面积的70%，澳大利亚和中国超过30%，全球转基因棉花种植面积达到680万公顷，占世界棉花种植面积的20%。 棉花为我国主要农作物之一，其基因工程方面的研究进展迅速，在抗虫、抗病、抗除草剂、棉纤维品质改良和生态效应方面均取得了一系列重要研究成果。1992 年中国农科院
转基因抗虫棉的发展以及存在的问题 张文亮26 摘要：棉花是重要的农作物以及经济产物，自上个世纪90年代以来， 由于棉铃虫在我国大部分棉区持续性大发生或爆发，给棉花生产带来 了巨大的威胁，因此开始进行抗虫棉的研究。本文叙述了抗虫棉的发 展过程以及抗虫棉的特点，从而对转基因抗虫棉有了更深刻的了解， 不仅仅停留在其优点，也发现了它的潜在危害，毕竟所有事物都是有 两面性的。 关键词：转基因棉花、抗虫棉、抗虫性、Bt蛋白、 Abstract：Cotton is one of the important crops and economic product, since the 90s of last century, because of the cotton bollworm in major cotton growing areas of China continuing occurrence or outbreak, cotton production has brought great threat, so start study on insect resistant cotton. This paper describes the Bt cotton in the development process and characteristics of the insect resistant cotton, thus of insect resistant transgenic cotton have more profound understanding, not only stay in the utility model has the advantages of, also found the potential harm, after all, all things are two sides.
基金项目：863子项目“特殊生境植物资源的开发利用技术”（No ：2007AA021401）转基因专项“转新型基因的棉花种质资源材料创造”（No ：2008ZX08005-004）。 第一作者简介：张煜星，男，1967年出生，副教授，博士生，从事植物基因工程研究。通信地址：571101海口市城西学院路，中国热带农业科学院热带生物技术研究所国家重点实验室周鹏转张煜星，Tel ：015109875070，E-mail ：zyx2027193@https://www.doczj.com/doc/231333117.html, 。 通讯作者：男，1963年出生，研究员，博士生导师，从事植物基因工程研究。E-mail ：Zhp6301@https://www.doczj.com/doc/231333117.html, 。 收稿日期：2009-04-16，修回日期：2009-05-07。 棉花accD 基因植物表达载体的 构建与遗传转化的研究 张煜星1,2,3，崔燕3，祝建波3，周鹏2 （1海南大学农学院，海南儋州571737； 2中国热带农业科学院热带生物技术研究所国家重点实验室，海口571101； 3石河子大学生命科学学院农业生物技术重点实验室，新疆石河子832003） 摘要：乙酰辅酶A 羧化酶(ACCase)催化脂肪酸合成的第一步，是脂肪酸合成的限速酶。采用PCR 方法分别从陆地棉和拟南芥基因组中扩增出ACCase 羧基转移酶β-CT 亚基编码基因accD ，ACCase 羧基转移酶α-CT 亚基编码基因CAC3的定位于叶绿体的转运肽序列。将CAC3基因转运肽序列与accD 基因进行体外重组，构建融合植物表达载体pBI-CAC3tp-accD 。重组质粒通过冻融法转化根癌农杆菌GV3101。渗透法转化拟南芥，收种子，在含卡那霉素的MS 培养基中发芽筛选。用叶盘法转化烟草，经不定芽诱导、生根培养，获转基因烟草植株。T1代转基因拟南芥和转基因烟草植株经卡那霉素检测、PCR 、RT-PCR 检测后，初步表明目的基因已在植株中转化成功，并可以正常转录。 关键词：陆地棉；拟南芥；accD 基因 中图分类号：S336文献标识码：A 论文编号：2009-0791 Construction of Plant Expression Vector on accD Gene fom Gossypuum hirsutum and Its Genetic Transformation Zhang Yuxing 1,2,3,Cui Yan 3,Zhu Jianbo 3,Zhou Peng 2(1College of Agronomy,Hainan University ,Danzhou Hainan 571737; 2National Key Biotechnology Laboratory for Tropical Crops, Institute of Bioscience and Biotechnology,CATAS,Haikou,571101; 3Laboratory of Agricultural Biotechnology ,College of Life Science,Shihezi Universit ,Shihezi Xinjiang 832003) Abstract:The acetyl-CoA carboxylase (ACCase)is the rate-limiting enzyme of fatty acids synthesis.The accD Gene and transit peptide of CAC3Gene was amplified from Gossypuum hirsutum Genome and Arabidopsis thaliana Geneome.Plant Expression Vector of Fusion Transit Peptide of CAC3Gene and accD Gene was constructed.The Vector of pBI-CAC3tp -accD were transferred into Agrobacterium tumefaciens https://www.doczj.com/doc/231333117.html,ing infiltration and leaf discs method,the gene were transferred into Arabidopsis thaliana and tobacco cell.The seeds of Arabidopsis thaliana were selected on solid medium containing Kanamycin.Transferred leafs of tobacco were selected on solid medium containing Kanamycin.Transgenic Arabidopsis thaliana (T1)and tobacco plants were found containing purpose gene by PCR.After RT-PCR,it shows that the CAC3tp -accD gene could transcript normally.Key words:Gossypuum hirsutum,rabidopsis thaliana,accD Gene 中国农学通报2009,25(18):36-40 Chinese Agricultural Science Bulletin
转基因棉花在生产应用上的风险与安全控制 植物转基因技术的诞生，对生物工程技术和世界农业都产生了巨大影响。棉花是纤维植物，由于遗传转化的限制，棉花的转基因研究起步较晚，但近几年进展迅速。一方面，随着转基因技术的发展，抗虫、抗病、抗除草剂基因等先后成功导入棉花载体中并应用于大田生产，使得转基因抗虫棉成为我国唯一大面积种植并实现产业化的转基因农作物。对缓解棉铃虫给棉花生产造成的为害、减少化学农药的使用量和保护生态环境起到了重要的作用；另一方面，随着转基因棉花的大面积应用，其安全性问题逐渐引起了人们的重视，转基因棉花的田间种植是否会引起外源基因向其他物种渗透，是否会对生态环境造成危害，这都是转基因植物进入商业化生产前都必须明确的问题¨1。但目前人们还很难准确预测外源基因导入一个新的遗传背景会产生什么样的后果心1。因此，必须采取措施预防转基因棉花在生产应用中可能存在的安全风险，作者以目前应用面积最大的转Bt基因抗虫棉为基础，进行转外源基因棉花在生产上应用对生态环境安全的影响分析，并提出转Bt基因抗虫棉在生产应用上的风险预防和安全控制措施。 1 转基因棉花在生产应用上的风险
1.1抗除草剂棉花有成为杂草的可能 杂草生长迅速并且具有强大生存竞争力，能够广泛传播，阻碍农作物的生长。所以，杂草常常给农业生产造成巨大损失。虽然转基因棉花在抗病虫性、抗逆性和生活力等方面比非转基因棉花强，但由于棉花不具有杂草特性，不会入侵其他植物栖息地，破坏自然种群平衡，一般情况下，转基因棉花不会出现杂草化问题。但近年来棉田除草普遍使用除草剂对棉花造成伤害，为了减少除草剂对棉花的伤害而开展的抗除草剂棉花选育。有使其成为杂草的可能，如果抗除草基因从棉花漂移到杂草上，也就有可能出现抗（耐）除草剂的“超级杂草”。1.2基因漂移威胁棉花近缘物种基因漂移是指基因通过花粉授精杂交等途径在种群之间扩散的过程。棉花是常异花授粉作物，转基因棉花的外源基因花粉可以通过风力、昆虫等向近缘非转基因植物转移，不仅影响近缘物种的遗传纯度，使近缘物种有获得选择优势的潜在可能性，如果近缘物种获得抗病、抗虫或抗除草剂基因。也可能使其成为另一种“超级杂草”。这样会促使大量化学农药的应用，造成严重的环境危害。另外，随着转基因棉花的大面积推广应用，还可能向其他物种渗透，若大量外源基因漂移进入野生植物基因库并扩散开来，可能会影响基因库的遗传结 构，给生物多样性造成危害心1。