文章编号:100028551(2009)022257205
水稻愈伤组织中内源植物激素水平与遗传转化的关系
吴 顺
1,2
萧浪涛2 刘 清2 沈革志3 王若仲
2
(11中南林业科技大学生命科学与技术学院,湖南长沙 410004;21湖南农业大学植物激素与生长发育重点实验室,湖南长沙 410128;
31上海市农业科学院作物所上海 201106)
摘 要:以湘早籼33和01早5202为材料,探讨了其愈伤组织在组织培养过程中内源激素的变化及其与
农杆菌遗传转化之间的关系。结果表明,不同继代培养时期的愈伤组织,农杆菌遗传转化频率不同。相
关性分析表明,内源I AA 和Z 含量与愈伤组织转化频率呈正相关,而内源赤霉素(G A 3)和脱落酸(ABA )含量与愈伤组织转化频率相关关系不明显。
关键词:水稻;愈伤组织;内源植物激素;遗传转化
RE LATION SHIP BETWEEN EN DOGEN OU S H ORMONES IN RICE CA LLI AN D GENETIC TRAN SFORMATION
W U Shun
1,2
XI AO Lang 2tao 2 LI U Qing 2 SHE N G e 2zhi 3 W ANG Ruo 2zhong
2
(11College o f Life Science and Technology ,Central South Univer sity o f Forestry and Technology ,Changsha ,Hunan 410004;
21Hunan Provincial K ey Laboratory o f Phytohormones ,Hunan Agricultural Univer sity ,Changsha ,Hunan 410128;
31Crop Institute ,Shanghai Academy o f Agricultural Sciences ,Shanghai 201106)
Abstract :The relationship between endogenous horm ones and genetic trans formation by Agrobcterium tumef aciens was studied during calli culture by X iangzao xian indica 33and 01Z ao 52021The results showed that the trans formation frequency by A .
tumef aciens in different calli culture stage for Indica rice was different.C orrelative analysis showed that there was positive
relationship between trans formation efficiency and endogenous I AA and Z content ,and insignificant relationship between trans formation efficiency and endogenous G A 3and ABA content.K ey w ords :rice ;calli ;endogenous horm ones ;genetic trans formation
收稿日期:2008208201 接受日期:2008209226
基金项目:国家自然科学基金项目(30600049),长沙市科技局攻关项目(K 041113222)
作者简介:吴顺(19762),男,湖南宁乡人,讲师,理学博士,研究方向为植物生理生化与分子生物学。T el :0731********(O );E 2mail :wushuncn @
https://www.doczj.com/doc/1619189067.html,
转基因技术的应用为作物育种开辟了一条崭新的途径,大大加快了育种进程,拓宽了育种范围。水稻是
世界上最重要的粮食作物之一,利用基因工程获得优良的水稻材料已成为研究的热点。自1994年Hiei 等[1]
利用根癌农杆菌成功地转化粳型水稻以来,根癌农杆菌介导法已被广泛应用于许多单子叶植物(如水稻)的遗传转化。然而,成功的植物遗传转化取决于适合农杆菌转化的受体细胞的获得,而植物组织培养作为根癌农杆菌遗传转化的基本技术,其成功与否将直接影响整个遗传转化过程。
众所周知,外源生长物质的添加是植物组织培养
中一种常规的实验手段,不同植物、不同品种的组织培养,其添加外源生长物质的水平及配比不同。但由于
研究初期条件的限制,人们对植物组织培养过程中外源生长物质的添加只是凭经验进行,往往需要花费大量的人力、物力和财力,而且有时还得不到理想的培养效果。随着内源激素检测手段的不断改进,国内外学者对植物组织培养过程中内源激素的变化及其与外源生长物质之间的关系进行了大量研究,从而大大提高了植物组织培养的效率。本文以水稻成熟胚为材料探讨了其愈伤组织在组织培养过程中几种内源激素的变化及其与农杆菌遗传转化之间的关系,以期从改变内
7
52 核农学报 2009,23(2)
:257～261Journal o f Nuclear Agricultural Sciences
源激素水平入手,提高水稻愈伤组织的遗传转化频率,进一步为细胞工程育种提供保证,这也是植物转基因成功的主要环节。
1 材料与方法
111 材料
试验用籼稻品种(Oryza sativa L.subsp.Indica)01早5202(Z5202)和湘早籼33(X33)由湖南农业大学水稻科学研究所提供。pC AM BI A1300质粒由Jeffers on教授(Australia)提供,并通过冻融法将质粒导入根癌农杆菌EH A105。
112 方法
11211 成熟胚愈伤组织的培养 取籽粒饱满、无病虫害的成熟种子去壳,用70%酒精浸泡1min,011%升汞浸泡10-12min后,用无菌水冲洗,再用有效氯含量≥5%的次氯酸钠溶液浸泡约30min,无菌水冲洗3次,吸干水分后,接种于分别添加2mgΠL2,42D和012mgΠL62 BA的N6培养基中,在26℃±1℃暗培养条件下诱导愈伤组织。培养6d后,将愈伤组织剥离,切除幼芽后,转入上述培养基进行继代培养,15d后再继代1次。11212 根癌农杆菌的遗传转化 取农杆菌单菌落接种于含卡那霉素(K m)50mgΠL的YE B液体培养基中,在28℃、150rΠmin震荡培养过夜。将菌液按1∶50分别转入AB培养基(含K m50mgΠL),28℃、150rΠmin震荡培养过夜。在OD
600
=018时以4000g离心10min,收集菌体,并悬浮于1Π2AAM培养基(每25ml菌液用15ml 1Π2AAM培养基)。
分别取不同继代培养12、18、24、30和36d的愈伤组织(由于继代6d后愈伤组织过小,故未采用),用相同浓度EH A105ΠpC AM BI A1300的农杆菌菌液进行浸泡侵染,不时摇晃,20min后取出愈伤组织并用无菌滤纸吸干菌液,置超净工作台上干燥2h至材料表面水分充分干燥,转入垫有一层无菌滤纸的共培养基(CC+ 2mgΠL2,4-D+100μm olΠL乙酰丁香酮)上,26℃暗培养2-3d后转入抗性筛选培养基(CC+2mgΠL2,4-D +25mgΠL潮霉素+500mgΠL羧苄青霉素)培养,15d后将生长的抗性愈伤组织再转入新鲜抗性筛选培养基,进行第2次抗性筛选,15d后统计抗性愈伤组织存活率。取生长良好的抗性愈伤组织转入分化培养基(MS +015mgΠL NAA+015mgΠL K T+300mgΠL羧苄青霉素),分化成苗,分别统计抗性愈伤组织分化率。愈伤组织存活率(%)=抗性筛选后存活的愈伤组织数Π(侵染愈伤组织总数2污染愈伤组织数)×100%;抗性愈伤组织分化率(%)=出现绿点的愈伤组织数Π(侵染愈伤组织总数2污染愈伤组织数)×100%。
11213 4种内源植物激素的检测 将11211中水稻愈伤组织从剥离后开始,每隔6d采集其培养物,液氮冻干后,置于-80℃冰箱中备用。参照王若仲等[2]植物激素检测方法,加以改进。经过色谱条件摸索,将赤霉素G A
3和吲哚乙酸I AA分为一组进行检测,波长为208nm;而玉米素(Z)和脱落酸(ABA)分为另一组,检测波长为270nm。4种植物激素分别在其检测波长和1mΠmin恒流条件下进行梯度洗脱。柱温为35℃,外标峰面积法定量。
2 结果与分析
211 水稻愈伤组织的遗传转化
结果表明(见表1),采用继代培养18和24d的愈
伤组织进行转化,其愈伤组织存活率和分化率都较高,且两个品种的结果基本一致(R=019673,P=01003)。随着培养时间的延长,愈伤组织褐化,非胚性愈伤组织增多,分化能力降低。
212 IAA与愈伤组织转化率的关系
由图1可知在整个组织培养过程中,水稻愈伤组织中的I AA含量都维持在较高水平。随着培养时间的延长,湘早籼33和01早5202愈伤组织中从6-18d I AA含量逐渐上升,达到峰值后,即呈下降趋势。随着继代培养时间的延长,两个品种的愈伤组织都表现出先升后降,再上升的趋势(分别为R=011813,P= 010012和R=013423,P=010025)。
图1 水稻愈伤组织培养过程中内源I AA含量的变化
Fig.1 Changes of endogenous I AA content during
culture of calli in rice
I AA含量与抗性愈伤组织存活率相关性分析表明,湘早籼33和01早5202愈伤组织内源I AA含量对
852核 农 学 报23卷
抗性愈伤组织存活率有正效应(分别为R=017022,P =010202和R=015185,P=01002),而对抗性愈伤组织分化率也表现出明显正相关(分别为R=017795,P =010081和R=016659,P=01001)。
表1 不同培养时间的水稻抗性愈伤组织存活率
T able1 Rate of genetic trans formation in indica rice calli of different subculture time
品种varietie
项目
item
培养时间
subculture time
继代后12d
12d after subculture
继代后18d
18d after subculture
继代后24d
24d after subculture
继代后30d
30d after subculture
继代后36d
36d after subculture 愈伤数
calli number
319299310353297存活愈伤数
number of living calli
3483645428
X33
存活率
rate of living(%)
11153014241419141214分化愈伤数
number of differentiation calli
2667584019分化率
rate of differentiation(%)
818241522111414814愈伤数
calli number
291314269309293存活愈伤数
number of living calli
54110706034
Z5202
存活率
rate of living(%)
20113811311627191711分化愈伤数
number of differentiation calli
3691594328分化率
rate of differentiation(%)
13143115261720101411
注:X33:湘早籼33;Z5202:01早5202。下图表同。
N ote:X33:X iangzaoxian33;Z5202:01Z ao52021The same as following Figures and T ables.
213 Z与愈伤组织转化率的关系
由图2可以看出,水稻愈伤组织在组织培养过程中Z含量发生了明显的变化。当愈伤组织剥离转移到继代培养基后,Z含量不断上升,在18d时达到最大值,湘早籼33和01早5202分别达到170168ngΠg?FW 和169132ngΠg?FW。随后Z含量又呈明显下降趋势, X33的Z含量在30d再次上升,到后期随着愈伤组织的褐化加重,其含量又急剧下降(分别为R=010981, P=011457和R=010435,P=011341)。
Z含量与抗性愈伤组织存活率相关性分析表明,湘早籼33和01早5202愈伤组织内源Z含量对抗性愈伤组织存活率有正效应(分别为R=014390,P= 012230和R=016512,P=010980),而对抗性愈伤组织分化率也表现出正相关(分别为R=013450,P= 012978和R=015102,P=011752)。
214 GA3与愈伤组织转化率的关系
籼稻愈伤组织继代培养过程中G A
3
含量的变化
图2 水稻愈伤组织培养过程中内源Z含量的变化
Fig.2 Changes of endogenous Z content
during culture of calli in rice
如图3。湘早籼33和01早5202愈伤组织培养6-18d,G A3含量呈现下降的趋势,随着继代培养时间的延长,G A
3含量在18-30d逐渐上升,达到峰值后,即呈下降趋势。随着继代培养时间的延长,两个品种的愈伤组织都表现出先降后升,再下降的趋势(分别为R
952
2期水稻愈伤组织中内源植物激素水平与遗传转化的关系
=016344,P =010002和R =011373,P =010232)。
G A 3含量与抗性愈伤组织存活率相关性分析表
明,湘早籼33和01早5202愈伤组织内源G A 3含量与抗性愈伤组织存活率(分别为R =010253,P =010155
和R =010994,P =014261)和抗性愈伤组织分化率(分别为R =010187,P =010423和R =010218,P =012565)之间的相关性较小
。
图3 水稻愈伤组织培养过程中内源G A 3含量的变化
Fig.3 Changes of endogenous G A 3content during
culture of calli in rice
215 ABA 与愈伤组织转化率的关系
在水稻等禾谷类作物组织培养中,ABA 对保持继代培养中愈伤组织胚性的作用早已得到肯定。在组织培养6-24d ,湘早籼33和01早5202愈伤组织中ABA 含量随着培养时间的延长逐渐上升,在24d 达到峰值,这有利于愈伤组织胚性的维持,随后ABA 含量迅速下降,愈伤组织开始非胚性化,分化能力下降(分别为R =015071,P =011107和R =014647,P =011007)。而
后期ABA 含量迅速上升,可能是由于愈伤组织褐化衰老所致。
ABA 含量与抗性愈伤组织存活率相关性分析表
明,湘早籼33和01早5202愈伤组织内源ABA 含量对抗性愈伤组织存活率有正效应(分别为R =010001,P =010552和R =012899,P =010280),而对抗性愈伤组
织分化率也表现出正相关(分别为R =010026,P =010424和R =011198,P =010350),但其相关性均较小。
3 讨论
植物激素对植物的生长发育具有重要的调节作用,
植物组织培养过程中植物生长物质能调节愈伤组
图4 水稻愈伤组织组织培养过程中内源ABA 含量的变化
Fig.4 Changes of endogenous ABA content
during culture of calli in rice
织的诱导及胚性结构的形成[3]
。早在l957年,Skoog 和Miller 就在植物组织培养中发现了生长素和细胞分裂素调控形态发生和植株发育现象,并提出了“激素平
衡”假说[4]
。植物内源激素通过调控细胞或组织的基因活动,从而影响一系列代谢过程,最终影响植物细胞胚性潜力的诱导、维持和表达。
转基因植物的成功与否,在很大程度上取决于合适转化受体的选择。Smith 等认为,用农杆菌转化单子叶植物,应选择处于适宜生理状态的那些组织,其特点是:能够产生Vir 基因活化分子;内源激素浓度适宜;农杆菌比较容易附着于细胞壁上;细胞分裂旺盛,DNA
大量合成,有利于T 2DNA 的摄入和整合[5]
。研究表明[6]
,某些对农杆菌转化敏感性差的植物转化频率很低,甚至不能转化,但它能够通过植物激素处理得到加强,农杆菌介导的遗传转化似乎是取决于植物的激素敏感性。植物细胞的感受态是指植物细胞转化时易于接受外来遗传物质的一种状态。毫无疑问,植物细胞
的感受态与转化频率直接相关。张根义等[7]
的研究表明,在植物转化时,适当浓度的NAA 和62BA 处理将使植物细胞的感受态增强,提高植物的遗传转化率;
S ophie Chateau 等[8]
用2,42D 和K T 处理某些对农杆菌不敏感的拟南芥突变体,发现经处理后其农杆菌转化效率大大提高。他们认为两种处理激活了许多组织细胞的分裂和脱分化,细胞内也相应发生许多生理生化变化。本研究也证明了这一点,愈伤组织从种胚剥离继代培养12d 后,其生长速度较快,内源I AA 和Z 含量明显上升,其转化频率也增加。这表明水稻愈伤组织中较高浓度的I AA 和Z 有利于根癌农杆菌的转化。内源G A 3和ABA 含量的高低与水稻愈伤组织遗传率相关性不大。而Christine 等[9]
在研究烟草花枝器官时发现,施用外源的生长调节物质不仅可以提高内源激素
062核 农 学 报23卷
水平,而且诱发内源激素达到峰值。且在外植体分化与脱分化过程中,内源激素的变化和使用外源生长物质诱导的结果基本一致。这些研究结果的获得,将为今后外源生长物质的应用提供有力的参考依据。
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