荧光原位杂交技术在环境微生物
生态学解析中的应用研究
孙寓姣
1,2
王 勇1 黄 霞
1
(1.清华大学环境科学与工程系,环境模拟与污染控制国家重点联合实验室,北京100084;
2.哈尔滨工业大学环境生物技术研究中心,哈尔滨150090)
摘 要 近年来,诸多国家在环境微生物领域先后开展了分子生物学研究方法的建立和生物学评价工作。一些不依
靠纯培养的微生物群落的分析方法已得到广泛应用和发展。荧光原位杂交(FISH )技术,具有细胞在测定过程中不被破坏、形状不改变、特异性强、能够真实反映在自然环境下微生物的情况及分布等特点,在环境微生物群落探测分析中已逐渐被广泛应用。该技术利用带有荧光标记的特异性寡核苷酸探针,与细胞内相应的靶核糖体结合,能将微生物探测、鉴定到属和种的水平。运用于硝化细菌、除磷细菌和丝状微生物等废水处理中常见的特征性微生物种群和群落生态学研究中,颇为高效。该技术的应用避免了传统培养方法进行鉴定和计数的局限性,在环境微生物生态学解析中具有较高应用价值。
关键词 分子生物学 荧光原位杂交 寡核苷酸探针 环境微生物 微生物生态学
Application of fluorescence in situ hybridization in
analysis of environmental microbial ecology
Sun Yujiao 1,2 Wang Yong 1 Huang Xia 1
(1.Environmental S imul ation and Poll u tion Control S tate Key Joint Laboratory ,Department of
Environmen tal Science and Engineering ,Tsinghua Univers ity ,Beijing 100084;
2.Environmental Biotechnol ogy Research Office ,Harbin Industry University ,Harbin 150090)
A bstract Recently ,molecular biology methods are established and biology evaluation are carried out in
environmental microbiology field in many countries .Some methods to analy se microbiological community w ithout traditional culture -based methods are used ex tensively .Fluorescence in situ hybridization (FISH )technology can exactly reflect the natural colo nial morphology of culturable and unculturable org anisms .In FISH method ,especial probes are used to hybridize w ith targeted rRNA in cells ,and the exact identification of bacteria can be attained to genus and species level .Nitrifying bacterium probes ,phosphate -removing bac -terium probes ,and filamentous bacterium probes are often used in microbiology morphology ,count ,spatial distribution studies .FISH technology avoids the localization of bacterial traditional culture -based methods ,and has a g reat potential in environmental microbial ecology analy sis .
Key words molecular biology ;fluorescent in situ hybridization (FISH );oligonucleotide probes ;envi -ronmental microorganism ;microbial ecology 资助项目:国家“863”高技术研究发展计划项目(2002AA601220)收稿日期:2003-08-22;修订日期:2003-10-09
作者简介:孙寓姣(1975～),女,博士研究生,主要从事环境微生态
学研究。E -mail :w -yong02@mail .tsinghua .edu .cn
在传统微生物学研究中,对于自然环境内微生物的认识和了解主要基于常规的培养基培养方法,如显微计数法、活菌计数法(CFU 法)和最大可能数法(M PN 法)等等。但是通过研究,人们逐步认识到,自然环境中绝大多数(99%以上)的微生物种类是不能通过人工培养获得的
[1,2]
,这就给微生物的
分析和研究工作带来了极大的障碍。目前,微生物学和环境科学研究工作者们,都一直在寻找和探索一些新的分析方法来解决这些问题。随着近代分子生物学技术的发展,不依靠纯培养的微生物群落结
构的分析方法已得到广泛发展和应用。
近年来,针对目前传统微生物分析方法存在的问题,在环境微生物领域,国际上诸多国家先后开展了分子生物学研究方法的建立和生物学评价工作
[3,4]
,更精确地揭示了微生物种类和遗传的多样
性。目前在微生物生态学研究中常用的方法有:核
第5卷第11期环境污染治理技术与设备
Vol .5,N o .112004年11月Techniques and Equipment for Environmental Pollution Control Nov .2004
酸探针杂交技术、DNA直接测序、rRNA序列同源性分析方法和梯度凝胶电泳方法等,使微生物生态学研究有了重大突破。1988年,Giovannoni[5]将原位杂交技术引入了细菌学的研究中,他首先用放射性标记rRNA寡核苷酸探针显微探测细菌。随着安全性较强的荧光技术的发展,1989年,DeLong首先用荧光标记的寡核苷酸探针来探测独立的微生物细胞。此项技术即荧光原位杂交(fluo rescent in situ hybridization,FISH)技术,由于它安全、方便、实用,从而在环境微生物监测中得到广泛应用。通过在环境样品上直接原位杂交,不仅可测定不可培养微生物的形态特征及丰度,而且可原位分析它们的空间及数量分布。德国慕尼黑大学的Amann教授[6]在环境微生物FISH技术研究中,进行了大量深入详尽的工作。Wagner[7～10]、Manz[11]及Luxmy[3],在此方面特别是在污水处理中对微生物的种群原位监测投入了大量的精力,对不同城市污水处理厂混合液样品的微生物种群进行荧光探针原位检测,发现beta-亚纲的变形细菌所占比例最高,其次是Cy-tophaga-flavobacterium菌群和高G+C含量的革兰氏阳性细菌,而gamma亚门的变形细菌所占比例较低,在10%以下。最近,随着这些研究工作的开展,一些分子生物学研究分析技术,其中特别是简便、实用的FISH技术,正在环境科学研究工作中逐渐被广泛应用。
本文将在简述FISH技术基本原理的基础上,对FISH技术在废水生物处理微生物生态学检测中的应用研究状况进行介绍。
1 FISH技术简介
1.1 FISH技术的主要原理
细菌细胞内核糖体数量达104～105,核糖体RNA(rRNA)有特异区和高度保守区,对物种的进化有指示性作用,被称为微生物体内的“活化石”。核糖体内的16S-rRNA的序列是最理想的用于基因分类的靶序列。因为16S-rRNA分子结构上高度保守,只有某些位置有少量核苷酸序列的改变,而这些位置的改变具有种属特异性。另外,它信息较多,且长度适中,约1500bp。所以根据16s rRNA序列的保守性和特异性可设计所需要的不同分类级别的寡核苷酸探针。所谓核酸探针是指,能识别特异核苷酸序列的带标记的一段单链DNA或RNA分子,只与被检测的特定核苷酸序列结合,不与其他系列结合。对微生物探测的FISH技术中使用的16(～23)S-rRNA寡核苷酸探针,一般是进行了荧光标记20bp左右的特异性核苷酸片段上。利用该探针与固定的组织或细胞中特定的核苷酸序列进行杂交。分子杂交是DNA的变性和与带有互补的同源单链退火配对形成双链结构的过程。而上述过程并不需要DNA或RNA的提纯、扩增等繁琐步骤,实用性较强。
1.2 FISH技术主要步骤
该技术主要操作步骤[6]包括:(1)活性污泥的预处理:革兰氏阳性细菌用50%乙醇溶液,革兰氏阴性细菌用4%多聚甲醛处理;(2)样品在载玻片上固定并用乙醇脱水;(3)寡核苷酸探针杂交:一般在46℃下杂交1～3h;(4)样品清洗:用48℃水浴的清洗液及冰浴的超纯水清洗;(5)封片观察。通常要结合使用一些通用的寡核苷酸探针对微生物样品进行区域界定及不同分类级别的区分。如EUB338探针是细菌的通用探针,DAPI染色可作背景来界定生物体细胞的区域。并结合其他特异性探针,选择不同颜色的荧光标记,同时,进行荧光原位杂交。
2 FISH技术在废水生物处理微生物生态学检测中的应用
微生物是废水生物处理过程中的作用主体,通过新陈代谢过程,具有分解和矿化有机物的能力。处理系统中微生物的一般存在方式为活性污泥和生物膜。研究并阐述活性污泥及生物膜微生物生态系统的组成、结构与功能,对于进一步了解微生物种群之间的相互关系,以及微生物群落结构与处理效率的相关性及其工程调控,进一步提高微生物对有机污染物的降解能力,提高废水的生物处理效率具有重要的理论和实用意义。传统的培养法由于具有客观的局限性,不适合对污泥生态结构及物种组成进行全分析。FISH能够克服传统方法上微生物分离培养的困难,同时,也避免了其他分子生物学方法的烦杂的过程,可准确快捷地反映出各种处理系统中微生物群落的原位分布,是研究环境微生物群落结构的较佳工具。原位杂交技术相关研究结果充分证明了上述观点:原位杂交发现氨氧化菌Nitrospir-spira广泛分布在各种环境中,而Nitrosomonas却很少在环境中监测到,而实验室传统培养得出的结果却相反。FISH技术可利用网式探针杂交法层层筛选复杂的共生体,对所关注的优势菌株进行动态的半定量监测。德国学者Wag ner对8个污水处理工
15
第11期孙寓姣等:荧光原位杂交技术在环境微生物生态学解析中的应用研究
艺(以生物除磷为主)的生物多样性进行了FISH探测。平均看来,其中α-亚纲变型细菌占细菌总数的11%,β-亚纲变型细菌占细菌总数的29%,其中γ-亚纲变型细菌占细菌总数的10%,δ-亚纲变型细菌占细菌总数的2%,ε-亚纲变型细菌占细菌总数的4%,Bacteroides细菌占细菌总数的14%,放线菌占细菌总数的7%,硝化细菌Nitrospira占细菌总数的2%。表1为废水生物处理中常用的高分类级别探针。表2为标记探针的常用荧光标记素及相关内容[12]。
2.1 利用FISH技术对硝化细菌的研究
硝化菌和氨氧化菌的数量及空间分布与微生物硝化循环中所处的阶段相关。对处理系统中硝化菌及氨氧化菌的研究,是调控工艺运行的重要参数。由于硝化细菌是一类生理上非常特殊的化能自氧菌,传统的研究方法存在着缺陷。传统的研究方法要经过富集、分离、分类和鉴定步骤,耗时长(4～8周),而且,因为所用的培养基有选择性,使得某些易于培养的菌株如Nitrosomonas europae a和Nitrobacter winograd-skyi等超过了其他硝化细菌,在培养基中处于竞争优势,因此得到的优势类群与样品中的真实情况有差异;而且,传统的方法对培养困难的硝化菌无法进行研究[13],FISH技术的引入解决了上述困难。Wagner 和Bruce等[7,9,10,14,15]较早将FISH技术应用于硝化细菌检测,他们研究了一套较完善的对硝化细菌检测的FISH技术,后来随着人工设计合成的硝化细菌及氨氧化菌探针的不断推出,FISH技术被广泛地应用于活性污泥系统、硝化流化床反应器和膜-生物反应器等污水处理系统中。Juretschko和Schramm 等[16～19]曾对硝化流化床、普通活性污泥等工艺的活性污泥中硝化细菌的多样性采用FISH法进行了跟踪分析,发现Nitros ospira、Nitrospira为优势菌种,而并未探测到Nitrosomonas和Nitrobacter。在Ju-retschko[16]对多个工业废水处理厂利用活性污泥工艺处理工业废水的探测中发现,属于变形细菌β-亚纲的Nitrosomonas氨氧化菌占DAPI染色的总菌数的16%～20%;用探针S-＊-Ntspa-1026-a-A-18探测到的Ni-trospira硝化细菌占细胞总数的9%。一般硝化细菌FISH检测的常用探针如表3所示。图1是常用硝化细菌进化亲源关系进化系统。
表1 一般常用的寡核苷酸探针
Ta ble1 Pro bes in common use
探针序列(5′—3′)目标位置16S-rRNA特异种属
UNIV1392ACGGGCGGTGTGTRC1392-1406通用探针
EUB338GCTGCC TCCCGTAGGAGT338-355细菌类
ARCH915GTGC TCCCCCGCCAATTCC T915-934主要古菌(EUB338以外)
ALF1b CGT TCGYTC TGAGCCAG19-35α-亚纲变型菌及其他
BET42a GCCT TCCCACT TCGT TT23S1027-1043β-亚纲变型菌
GAM42a GCCT TCCCACATCGT TT23S1027-1043γ-亚纲变型菌
CF319a TGGTCCGTGTC TCAGTAC319-336CFB门Cytophaga-Flavobacterium类菌HGC TGTAGTTACCACCGCCGT1901-1918高G+C DNA含量革兰氏阳性细菌
表2 FISH探测微生物常用荧光素
Ta ble2 Fluorochrome in common use
荧光染料激发波长(nm)发射波长(nm)颜色
AM CA351450蓝FITC异硫氰酸盐荧光素492528绿Fl uoX TM(5-(-6-)羰基-N-羟基丁二酰亚胺荧光素488520绿
(T RITC)四甲基罗丹明异硫氰酸盐荧光素557576红Texas Red德克萨斯红578600红
Cy3T M550570橙/红
Cy5T M651674红外
16环境污染治理技术与设备第5卷
表3 FISH 检测硝化细菌常用探针
Table 3 Probes for nitrobacteria detectio n in FISH
探针序列(5′—3′)
目标位置16S rRNA
特异种属
NEU23a CCCCTC TGCTGCAC TCTA 653-670Halophilic and hal otoler ant members of lithoautotr ophic 氨氧化菌Nb1000TGCGACCGGTCATGG 1000-1012Nitrobacter hamburgensis +Nitrobacter winogradsdyi +Ni -trobacter sp .
NIT3CCTGTGC TCCATGCTCCG 1035-1048Nitrobacter s pp .同Nb1000CNIT3CCTGTGC TCCAGGCTCCG 1035-1048NIT3竞争性探针NSO190CGATCCCCTGC TTT TCTCC 190-208氨氧化菌NSO1225CGCCATTGTATTACGTGTGA 1225-1244氨氧化菌
Nsm156TAT TAGCACATCT TTCGAT 156-174NEU +Nitr os omonas C 56
Nsv443CCGTGACCGT TTCGTTCCG 444-462Nitros ospira br iensis +Nitros ovibrio ten uis +Nitrosol obus mu ltiformis
C TE TTCCATCCCCC TCTGCCG 659-676Coma monas testosteroni ,Leptothrix disc ophor a and relat -icves
S -＊-Ntspa -1026
-a -A -18
AGCACGCTGGTATTGCTA
1026-1043
Nitros ospira spp
.
图1 常用硝化细菌进化树示意图Fig .1 T he ev olutio n tree of nitrobacteria
2.2 利用FISH 技术对除磷细菌的研究
脱氮除磷工艺在废水处理工程中被广泛应用,特别是强化除磷(EBPR )工艺,对污水除磷效果十分显著。近年来,国内外许多学者利用分子杂交技术对不同除磷工艺中聚磷菌的生态变化进行了大量研究,其中台湾大学的刘文涛、Alex 等[20,21]、Christina 和M ino 等[22,23]。FISH 技术的应用克服了以往除磷菌难于用常规方法培养造成的研究上的困难,并
对不同条件下生物除磷工艺的改进起到了指导性的作用。Mamoru 对除磷工艺的FISH 研究中,使用ALF1b 、HGC 和Bet42a 探针检测出的细菌量所占比
例较大,分别在10%～64%,MP2和CF 探针探测到的细菌含量并不高,在4%以下。在强化除磷(EBPR )工艺中,无论好氧或厌氧区的活性污泥中都
存在着大量丰富的除磷微生物,其中常见类群为Bet Proteobacteria 亚类的Actinobacteria 菌、GPB -
17
第11期孙寓姣等:荧光原位杂交技术在环境微生物生态学解析中的应用研究
HGC、Epbr15和Epbr16等。近期报道[24]的Rholo-cyclus也是生物除磷的优势种群,并且利用常规培养方法不能培养的γ-亚纲变型细菌也在EBPR工艺中探测到。现今在污水生物处理的生物学相关研究中,结合分子生物学领域变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术,对活性污泥中混合微生物提取基因进行电泳分离,经测定其基因序列后,现已设计出一些探测常见除磷细菌的生物学探针(表4)。图2是对活性污泥中除磷菌进行FISH探测后的照片(a)与相应光学照片对照(b)。其中白色圆环内是与被黄色荧光素标记(文中浅色位置)的Rhodoc yclus-like除磷菌探针结合的除磷菌。充分显示了该技术在除磷菌研究中的直接和高效性能。
2.3 利用FISH技术对丝状微生物的研究
在污水生物处理工艺系统内,丝状微生物的大量滋生是引起污泥膨胀的主要成因。一些种类的丝状菌大量增殖,
严重影响活性污泥的沉降性能造成
图2 聚磷菌(PAO)对照实验观察
F ig.2 PAO photos of FISH and common microscope
表4 几种常见的聚磷菌探针
Table4 Pro bes of PA O used in FISH
探针序列(5′—3′)目标位置rRNA特异种属
GAM A42a GCCT TCCCACT TCGT TT23S1027-1043γ-亚纲变型菌
HGC69a TATAGTTACCACCGCCGT23S1901-1918高G+C DNA含量革蓝氏阳性细菌
C F319TGGCTCCGTGTCTCAGTAC16S319-336Cytophaga-Flavobacterium菌群
Gam1019GGTTCCT TGCGGCACCTC23S1019-1027Novel group of the gamma subclass Gam1278ACGAGCGGCT TTT TGGGATT23S1278-1478Novel group of the gamma subclass PAO846CGCTCCCAGAACGCAAGG16S846-864Accumulibacter phosphotis(Epbr15,Epbr16) Actino1011TTGCGGGGCACCCATCTC T16S1011-1030Epbr19,Ebp r20
M NP1TTAGACCCAGTTTCCCAGGCT152-172Nocardioforme Actinomycetes
ACA23a ATCC TCTCCAATACTCTA16S652-669Acinetobacter spp.
RHC438--Rhodocyclus-like cluster
污泥膨胀,将导致系统整体的处理能力和处理效率下降。资料整理发现[25～28],这些丝状菌类群主要包括丝状真菌、放线菌和丝状细菌3大类,其中具体包括有:亮发菌属(Leucothrix cohaerens)、诺卡氏菌属(Nocardia)、球衣菌属(Sphacrotilus)和发硫菌属(Thiothrix)等微生物类群。Eikelboom[29]利用传统的分离和培养方法对丝状菌做了大量的研究:他从膨胀的污泥中采集到1100个样品,分离出26个典型的丝状菌,其中大多为丝状细菌,通过研究总结出一套可行的传统鉴定分类方法。所以一直以来沿袭下来的传统分析方法通常是在显微镜下直接观察,粗略地进行分析。但是,用传统的方法对丝状菌进行鉴定过程中,在菌体的培养问题上遇到了较大的困难,尽管丝状菌在发生膨胀的活性污泥中客观存在,但由于其对培养基的选择性很强,所以不易进行实验室分离培养,也就更加难以进行其生态学分析。基于分子生物学实验技术发展和应用,人们利用FISH技术使该问题得到了较好的解决,Francis 等[30]、Peter[31]、Linda等[32]、Wagner[8]和Kanag aw a 等[33～35]对活性污泥中丝状微生物作了大量的FISH鉴定工作,从探针的设计及应用等方面作了详尽的阐述。FISH技术的应用对深入认识丝状微生物膨胀机理提供了大量有用的信息。从前人们认为,丝状微生物膨胀受放线菌细胞的霉菌素升高影
18环境污染治理技术与设备第5卷
响。但是近期FISH检测结果表明,在好氧及厌氧消化膨胀的活性污泥中,放线菌目Mycobacterrium 菌群含量占15%～18.3%,其中主要是Gordona 菌[32]。Liu和Seviour[24,36]则利用FISH技术对Nostoc oida lim icola进行了大量的分类研究工作。近年来,人们经过对活性污泥中常见丝状菌的研究,开发出的一些主要的丝状微生物探针,经整理列为表5。
表5 几种常见的丝状微生物探针
Ta ble5 Probes of filam entous bacterium used in FISH
探针序列(5′—3′)目标位置16S-rRNA特异种属
HHY GCCTACCTCAACCTGAT T655-672Ha lisc omenobacter hydross is S NA CATCCCCCTCTACCGTAC656-673S phaerotilus natans
LM U CCCC TCTCCCAAACTC TA652-669Leuc oth rix m uc or T NI C TCC TCTCCCACATTC TA652-669Thiothr ix nivea LDI CTC TGCCGCACTCCAGCT649-666Leptoth rix dis cophora
21TH CCTTCCGATC TCTATGCA-Type021N+Thiothrix spp. M NP1TTAGACCCAGTTTCCCAGGCT152-172Nocardiofor me actinomyc etes AHW183CCGACAC TACCCAC TCGT183-200Nostocoida limicola
M PA223GCCGCGAGACCC TCCTAG223-240Microthrix par vicella
CH L1851AATTCCACGAACCTCTGCCA592-6121815型
TM7305GTCCCAGTC TGGCTGATC305-3220041-0675型
3 结 论
FISH技术在国内外微生物群落解析工作中已得到较为广泛的应用,技术水平日趋成熟。10余年来,一些科研工作者将该技术初步应用于环境科学研究中,这些研究工作取得了较好的结果,揭示了FISH技术在环境科学领域内应用的可行性和实用性。FISH技术的主要原理是利用rRNA并结合其他分子生物学研究方法,突出特点是可以克服纯培养的技术限制,可以在原位水平进行探测和分析生物处理工艺系统中微生物群落的组成及演替,以及不同种群的空间联系等生态学变化规律。
尽管FISH技术应用于环境微生物监测中还存在一些问题,如荧光信号弱、清晰度差;还有一些种类的微生物细胞壁穿透性差,使探针不能充分进入细胞内与rRNA分子杂交;另外,一些生长缓慢的细胞由于rRNA含量低而很难被探测到。相信随着分子生物学技术和精密仪器设备研制技术的不断发展,FISH技术将会具有更强的可操作性和实用性,并且随着新探针(如厌氧菌探针)的开发,将应用到更多的生态系统的解析中,从而更深入地对各类生物处理系统进行分析,具有更为广阔的应用前景。
总之,FISH技术在环境科学领域内的广泛应用,对于深入、完整地进行环境微生物生态学理论研究,具有重要的理论意义和现实意义。
参考文献
[1]刘志培,等编.现代微生物学.北京:科学出版社,2002
[2]王建龙,文湘华.现代环境生物技术.北京:清华大学出
版社,2000
[3]Luxmy B.S.,et al.A naly sis of bacterial community in
membrane-separation bioreacto rs by fluorescent in situ hy bridizato n and dena turing gradient gel electrophoresis.
Wat.Sci.T echnol.,2000,41:259～268
[4]向近敏,林雨霖,周峰.分子生态学.湖北:湖北科技出
版社,2002
[5]Giov anno ni S.J.,Delong E.F.,Olsen G.J.,et al.Phylo ge-
netic group-specific oligodeoxy nucleotide probes fo r identifi-cation of single microbial cells.J.Bact.,1988,170:720～
726
[6]Amann R.I.M olecular M icrobial Ecology M anual:I n situ
identification of microorganisms by w hole cell hybrizatio n with rRN A targ eted mucleic acid probes.Dordrecht:Kluw-er A cademic,1995.1～15
[7]Wagner M.,et al.In situ analysis of nitrify ing bacteria in
sewage treatment plants.Wa t.Sci.T echnol.,1996,34: 237～244
[8]Wagner M.,Amann R.,et al.Identifica tio n and in situ
detectio n of gram-neg ative filamentous bacteria in activa ted sludge.Syst.Appl.Microb.,1994,17:405～417
[9]Wagner M.,G.Rath,R.A mann,et al.In situ identifi-
19
第11期孙寓姣等:荧光原位杂交技术在环境微生物生态学解析中的应用研究
cation of ammonia-oxidizing bacteria.Sy st.Appl.M icrobi-ol.,1995,1:251～264
[10]Wag ner M.,N oguera D.,et https://www.doczj.com/doc/1319104211.html,bining fluorescent
in situ hybridization with cultivation and mathematical
modeling to study population structure and function of
ammonia-oxidizing bacteria in activated sludge.Wat.
Sci.T ech.,1998,37:441～449
[11]M anz W.,R.Amann,W.Ludwig,et al.Phy logene tic
oligonucleo tide probes for the majo r subclasses of pro-
teobacteria:Problems and solutions.Syst.Appl.M icrobi-
ol.,1992,15:593～600
[12]A nne tte mo ter,et al.Fluorescence in situ hybridization for
direct visualization of microorganisms.J.M icrob.
M etho.,2000,41:85～112
[13]翁酥颖,戚蓓静,等.环境微生物学.北京:科学出版
社,1985
[14]Bruce E.R,Per ry L.M.Environmental bio technology:
P rinciples and applications.Boston Burr Ridge,I L
Dubuque,IA M adison:W I New York,1999.340～346 [15]Bruce K.M.,M.Wanger,V.U rbain,et al.Phy logene tic
probes for analy zing abundance and spatial o rganization of
nitrifying bacteria.A ppl.Environ.M icrob.,1996,62: 2156～2162
[16]Juretschko S.,et https://www.doczj.com/doc/1319104211.html,bined mo lecular and co nven-
tional analyses of nitrifying bacterium diversity in activ at-
ed sludge:Nitro sococcus mobilis and nitrospira-like bacte-
ria as dominant populations.Appl.Environ.M icrobiol.,
1998,64:3042～3051
[17]Schramm A.,https://www.doczj.com/doc/1319104211.html,rsen,et al.Structrue and functio n
of a nitrifying biofilm as determined by in situ hybridiza-
tion and the use of microelectrides.Appl.Environ.M i-
crobiol.,1996,62:4641～4647
[18]Schramm A.,De Beer D.,Wag ner M.,et al.Identifica-
tion and activities in situ of N itro sospira and Nitrospira
spp.as dominant populations in a nitrifying fluidized bed
reacto r.A ppl.Environ.Microbiol.,1998,64:3480～
3485
[19]Szilia S.,Istvan K.,Miklos K.,et al.M icrobial popula-
tion in a hydrogen-dependent denitrification reacto r.
Wa t.Res.,2002,36:4088～4094
[20]Alex T-N.,Wen T-L.,et al.Identification of a novel
g roup of bacteria in sludge from a deteriora ted biological
phospho rus removal reacto r.Appl.Environ.M icrobiol.,
1999,65:1251～1258
[21]Wen T.L.,Alex T.N.,e t al.In situ identification of
polyphosphate and poly hydroxy alkenoate accumulating
traits for microbial populations in a biolog ical phosphorus
removal process.Environmental M icrobiology,2001,3: 110～122
[22]Christina M-F,Elisabeth M.,et al.Population change in
a biofilm reacto r for phosphorus removal as evidenced by
the use of FISH.Wat.Res.,2002,36:491～500[23]M ino T.,e t al.M icrobiology and biochemistry of the en-
hanced biolo gical phosphate remo val process.Wat.Res.,
1998,32:3193～3207
[24]J.R.Liu and R.J.Seviour.Design and application of oligonu-
cleotide probes for fluorescent in situ identification of the fila-
mentous bacterial morphotype nostocoida l imicola in activated
sludge.Environ.Microbiol.,2001,3:551～60
[25]Hornby L.A.,Horan N.J.Isola tio n of filamentous bac-
teria from activ ated sludg e using micromanipulation.
W at.Res.,1994,28:2033～2034
[26]Eikelboom D.H.,V an Buijsen H.J.J.M icroscopic
sludg e investig ation manual.Delft:T NO Research I nsti-
tute,1983
[27]Zieg ler M.,Lange M.,Dott W.Isolation and morpho-
logical and cy tological characterization of filamentous bac-
teria from bulking sludg e.Wat.Res.,1990,24:1437～
1451
[28]周群英,等.上海市几个污水处理厂活性污泥-丝状污
泥膨胀成因的机制研究.上海:同济大学科学技术情
报站,1979
[29]Eikelboom D.H.Filamentous organisms observed in acti-
vated sludge.Wat.Res.,1975,9:365～388
[30]Francis L.,D.E.Los Reyes,et al.G roup-specific small-
subunit rRNA hybridization probes to characterize fila-
mentous foaming in activated sludge sy stems.Appl.Env-
iron.M icrobiol.,1997,63:1107～1117
[31]P eter K.Detectio n and cultivation of filamentous bacteria
from activated sludge.FEM S.Micr.Ecol.,1997,23: 169～181
[32]Linda L.B.,Elizabeth M.S.,et al.T owards under-
standing the taxono my of some of the filamentous bacteria
causing bulking and foaming in activated sludge plants.
W at.Sci.T ech.,1996,34:137～144
[33]A ruga S.,Y.K amaga ta,T.Kohno,et al.Characteriza-
tion of filamentous Eikelboom type021N bacteria and de-
scription of Thiothri x disciformis sp.nov.and Thio-
thri x f lexilis sp.J.Sy st.Evol.M icrobiol.,2002,52: 1309～1316
[34]Kanag aw a T akahiro,Yoichi Kamagata,Shinobu Aruga,
et al.Phy logenetic analy sis of and olig onucleotide probe
development for Eikelb oom type021N filamentous bacte-
ria isolated from bulking activated sludge.A ppl.Envir.
M icrobiol.,2000,66:5043～5052
[35]Toshihiko Suzuki,T akahiro Kanag aw a and Yoichi Kama-
gata.I dentification of a gene essential for sheathed struc-
ture formation in sphaerotilus natans,a filamentous
sheathed bacterium.A ppl.Envir.M icrobiol.,2002,
68:365～371
[36]Seviour R.J.,J.R.Liu,E.M.Seviour,et al.T he“Nos-
tocoida limicola”sto ry:Resolving the phylogeny of this
morpho ty pe responsible fo r bulking in activated sludge.
W at.Sci.T echnol.,2002,46:105～110
20环境污染治理技术与设备第5卷
土壤生物与生态学复习指导 第一章绪论 基本概念：土壤生态学/土壤生态系统。 土壤生态学的概念土壤生态学是研究土壤生态系统内生物与生物、生物与非生物环境之间 的相互作用及功能过程的学科。土壤生态学是研究土壤生态系统的结构、功能及调控规律的 学科。土壤生态学是研究土壤与环境之间相互关系的科学 (徐琪，1990)。 土壤生态学土壤生物之间及与周围环境相互作用的研究. 土壤生物学相对于土壤物理和 土壤化学，以生物个体本身为研究重点的学科. 土壤生物化学主要研究包括土壤内的微生 物过程、土壤酶及土壤内有机质形成和周转的研究. 土壤微生物学研究土壤微生物及其生 态过程的传统学科. 微生物生态学微生物生态学研究的生境包括土壤、植物、动物、淡水 和海洋及沉积物，它包含了部分土壤生物学和土壤生态学的内容. 土壤生态学的研究内容。 ①土壤生物与非生物组成份的数量、构成及时空分布；②土壤生物的相互作用及其与土壤 环境的关系；③土壤生物群落及生态系统的发展和演替；④土壤生物多样性、生物相互作 用与生态功能的关系；⑤土壤生态系统的物质循环、能量流动和信息交换；⑥土壤生态系 统结构和功能的恢复和维持；⑦土壤生态系统与其他生态系统之间的相互作用。⑧土壤生 态工程及各种应用研究⑨结合和发展生态学理论的研究 土壤生态学的研究主要发表在哪些中英文专业杂志上（各举例3个） 土壤生态学方面的研究报告主要发表在生态学报、应用生态学报、土壤学报、生物多样性、 生态学杂志、其它土壤及微生物、植物和环境类的杂志上；Soil Biology and Biochemistry、Microbial Ecology、Biology and Fertility of Soil、Plant and soil、Pedobiologia、European Journal of Soil Biology、Agriculture, Ecosystems and Environment、Biogeochemistry、 FEMS Microbiology Ecology、 The ISME Journal和Ecology Letters、 Ecology、Journal of Applied Ecology、Ecological Application、European Journal of Soil Biology、Functional Ecology、Global Change Biology 等刊物上。 我国进行土壤生态学研究的主要科研机构。 中国科学院南京土壤研究所，中国科学院生态环境研究中心，中国科学院植物研究所，浙江大学 环境与资源学院 第二章土壤生物的生境 土壤结构 土壤质地是指土壤中不同大小颗粒砂粒 sand – mm)，粉粒silt – mm)，黏粒clay(< mm) 的相对比例。土壤质地，一般分为砂土、壤土和黏土三 大类。土壤质地主要继承了成土母质的类型和特点，是较为稳定的自然属性。土壤质地与土 壤持水性能、阳离子交换量，植物和生物养分的短期库有关；因此土壤质地的重要性在于 它（黏土矿物的类型和数量）决定了土壤保持水分和养分的能力。质地的测定实际上就是颗 粒组成的测定。土壤结构是不同大小的颗粒结合或团聚形成具有一定稳定性的土块或土团。 稳定（力稳、水稳）团聚体的形成需要物理、化学和生物学因子的相互作用。土壤结构的 稳定性常用土壤大团聚体的比例来反映。一般将直径大于的团聚体视为大团聚体。土壤结 构主要不仅受到成土母质的影响，而且也是人类可以调控的属性。土壤结构很早就被认为是 高肥力和高生物活性土壤的标志。良好的土壤结构能够促进水气流通、利于土壤生物的迁移， 从而增加营养交互的机会；当然，也利于根系的生长。土壤结构受到土壤生态学家的强烈 关注，其重要性不仅决定了土壤水分和养分的分布和保持能力，而且其创造的孔隙分布也 决定了土壤生物能否获得栖息空间。土壤团聚体的传统测定方法
免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。 紫外光激发荧光物质放射荧光示意图 免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备（通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片（Slides or Coverslips）的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法（如ELISA或Western Blot）中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。 由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。 基本实验步骤：
2018环境微生物学考研试题及答案一、名词解释 包含体： 细胞膜： 衣原体： 同宗配合： 酵母菌： 生态系统： 碳源： 拮抗： 菌种复壮： DNA的变性： DNA复制： 根际微生物： 物质流： 类菌体： 硝化细菌： 细菌活性污泥法： 生物反应器： 微生物细胞固定化： 堆肥化：
自生固氮作用： 二、是非题 原噬菌体是整合在宿主DNA上的DNA片段,它不能独立进行繁殖。( > 细菌的异常形态是细菌的固有特征。( > 真核微生物比原核微生物更能在高温下生长。( > 芽孢是芽孢细菌的繁殖器官。( > 光合细菌和蓝细菌都是产氧的光能营养型微生物。( > 用来固化细菌培养基的多糖是琼脂。( > 微生物生长的衰亡期，细胞死亡速率超过细胞分裂速率。( > 碱基腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶存在于RNA或DNA，但只RNA中有胸腺嘧啶。( > 真菌最适的生长条件是有点碱性的。( > 凡是影响微生物生长速率的营养成分均称为生长限制因子。( > 三、选择题 1.大部分微生物___。 (a>是原生动物(b>帮助改善生活质量 (c>生活在海洋的底层(d>发现于外层空间 2.噬菌体是一种感染____的病毒。 (a>酵母菌(b>霉菌 (c>放线菌和细菌(d>原生动物 3.G+菌由溶菌酶处理后所得到的缺壁细胞是___
(a>支原体(b>L型细菌(c>原生质体(d>原生质球 4.下列微生物中，______属于革兰氏阴性菌 (a>大肠杆菌(b>金黄葡萄球菌(c>巨大芽孢杆菌(d>.肺炎双球菌 5.下列能产游动孢子的霉菌是____。 (a>腐霉(b>毛霉 (c>赤霉(d>青霉 6.硝酸细菌依靠____方式产能。 (a>发酵作用(b>有氧呼吸(c>无氧呼吸(d>光合磷酸化 7.酵母菌适宜的生长pH值为____ (a>5.0-6.0(b>3.0-4.0(c>8.0-9.0(d>7.0-7.5 8.进人三羧酸循环进一步代谢的化学底物是____。 (a>乙醇(b>丙酮酸(c>乙酰CoA(d>三磷酸腺苷 9.称为微好氧菌的那些细菌能___生长。 (a>在高浓度盐中(b>在低浓度氧中 (c>没有ATP或葡萄糖(d>只在有病毒时 10.深层穿刺接种细菌到试管固体培养基中____。 (a>提供厌氧菌生长条件(b>除去代谢废物的一个机会 (c>增加氧气(d>增加钾和钠离子的数目 11.微生物分批培养时，在延迟期_____ (a>微生物的代谢机能非常不活跃(b>菌体体积增大 (c>菌体体积不变(d>菌体体积减小 12.下面所有特征皆适用于胞嘧啶和胸腺嘧啶，除了___之外。
微生物生态学 一.生态学概念（ecology）：研究生物有机体与其周围环境(生物环境与非生物环境)之间相互关系的一门科学。生物环境(biotic environment)包括微生物、动物和植物；非生物环境(abiotic environment)包括非生命物质，如土壤、岩石、水、空气、温度、光和PH等。生态学又称环境生物学environment biology。 微生物生态学（microbial ecology）：研究微生物有机体（细菌、真菌、病毒、放线菌、单细胞藻类及原生动物）与其周围生物环境（生物环境和非生物环境）之间相互作用及其作用规律的一门科学。又称环境微生物学。 二.土著微生物（Autochthonous microorganism）：指在一个给定的生境中那些能生存、生长和进行活跃代谢的微生物，并且这些微生物能与来自其他群落的微生物进行有效的竞争。土著微生物一般包括：G+球菌类、色杆菌、芽孢杆菌、节杆菌、分支杆菌、放线菌、青霉、曲霉等。 外来微生物（Allochthonous microorganism）：指来自于其他生态系统的微生物，所以这些微生物不能在这一生境中长期生活下去。 群落（Community）：指一定区域里，各种群体(Population)相互松散结合的一种结构单位。生态系统：生态系统就是在一定的时间和空间内，生物和非生物的成分之间，通过不断的物质循环和能量流动而相互作用、相互依存的统一体，构成一个生态学的功能复合体。 生态系统=生物群落+无机环境。 影响土壤中微生物分布的因素 ●土壤颗粒性质腐殖质》砂土 ●土壤水分游动微生物 ●氧气上层好氧微生物多（穴居动物活动可以给微生物好氧生长提供条件） ●pH pH对营养物质的利用，微生物吸附，胞外酶的产生和分泌产生影响 ●温度蓝细菌能抗变化范围很大的温度；耐寒的藻类（雪藻） ●营养状况有机物对自养细菌有抑制作用（刍溪藻喜欢在营养丰富的鸟粪中）（土 壤颗粒中细菌的不均匀分布） ●人类生产活动 三.淡水微生物的共同特征： 1 能在低营养物浓度下生长 2 微生物是可以游动的 3 表面积和体积比大（柄细菌），有效吸收营养。 研究极端环境中微生物的意义 ●研究其强而稳定的特殊结构、机能和遗传基因以及应答因子，对阐明物种起源、生 物进化具有重要意义。 ●研究其生理生化特性，可用于量度地球上生命生存的理化极限，对探索宇宙星球上 的生物有参考价值； ●可探索出新的生理途径，生产新酶和新的生物制剂，使用于特殊环境条件，如煤脱 硫、冶炼金属、处理有毒废水、高压深油井探矿、纤维素高温发酵酒精等。 ●研究成果可以大大促进微生物在环境保护、人类健康和生物技术等领域的应用。 嗜冷微生物（psychrophiles） ?0℃以下或3～20℃能生长的微生物， ?最适生长温度不超过15℃， ?最高生长温度不超过20℃。
免疫荧光操作步骤及注意事项 免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术(比如流式细胞仪)测定含量。 紫外光激发荧光物质放射荧光示意图 免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透(或称为透化)、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备(通俗的说法是细胞爬片)是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片(Slides or Coverslips)的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法(如ELISA或Western Blot)中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4?或-20?避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。
由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。 基本实验步骤: (1) 细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次;对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤(1000rpm,5min)2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。 (2) 固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4?保存3个月。PBS洗涤3×5 min. (3) 通透。使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min. (4) 封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min. (5) 一抗结合。室温孵育1h或者4?过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min. (6) 二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。 (7) 封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。 (一)细胞准备 用于免疫荧光实验的细胞可以是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞，也可以是经过离心后涂片的悬浮细胞或者是将取自体内的组织细胞悬液离心后涂片。贴壁良好
第1章绪论 1.什么是微生物生态学？ 微生物生态学（Microbial Ecology）是研究微生物与其周围生物和非生物环境之间相互关系的一门科学。 2.微生物生态学研究意义？ ①发现新的、在工农业、食品、医药和环境保护方面有重要用途的微生物菌株； ②开发和利用自然界中的微生物资源，保护好微生物基因资源； ③为提高生产效率、保护人类健康和保护生态平衡发挥微生物的最佳作用。 开发利用保护微生物资源，保护环境维持环境生态平衡 第2章微生物生态学的基本原理 1.生境：是指发现有生物的物理区域。这一区域的物理化学特征可以影响在这一区域中生活的微生物生长、代谢活力、生物与生物之间的相互作用和微生物的生存。 2.生态位：生态位不仅指生物生长的空间范围，而且包括生物在这一生境内的活动、它们的功能作用及其与其他生物的相互作用。 3.土著微生物：指在一个给定的生境中那些能生存、生长和进行活跃代谢的微生物，并且这些微生物能与来自其他群落的微生物进行有效的竞争。 4.外来微生物：指来自于其他生态系统的微生物，所以这些微生物不能在这一生境中长期生活下去。 5.微生物区系：在一块土壤碎片内或植物根的表面有可能有很多环境因素不同的微环境。而每一微环境只适宜于某种或某些微生物的生长、繁殖，而不适合其他种微生物的生长，从而形成复杂的微生物区系（microflora）。 6.群落演替：是指在某一特定环境内，生物群落随着时间的推移顺序出现或被相继取代，最终形成比较稳定的群落结构的发展过程。 第3章自然环境中的微生物 1.生理群：指按生理特性将微生物划分为不同的类群。 2.优势种：在一定条件下或在一个生理群中常只有少数种类占优势，即在最高稀释度平皿中出现较多菌落数的菌种，该菌种称优势种。 3.水体富营养化：当水体中N、P营养元素的含量大量增加，远远超出正常指标，结果导致原有生态系统破坏，藻类或某些细菌数量猛增，其他生物种类减少，水质变坏的现象。 4.为什么说土壤是适合微生物生长的环境？
细胞免疫荧光实验步骤 细胞免疫荧光实验步骤 简单实验步骤如下: 1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时. 2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟 3.PBS洗净:3min＊3 4.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS 5.PBS洗净:2＊5min 6.羊血清封闭：３７度，２０分钟 ７.一抗，４度过夜，一般要大于１８小时或者３７度１－２小时 ８.４度PBS洗净，３min＊５次 ９.二抗３７度小于一小时 １０.３７度PBS洗净，３＊５min 凉干封片（封闭液ＰＨ８.５） 活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备 （一）制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、 胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法) ↓ 用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为 5×10６～１×10７／ml ↓ 取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl) 的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS 稀释)灭活正常兔血清 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右 1000rpm×5min
↓ 弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠 (或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右 1000rpm×5min ↓ 加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入 1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察， 视细胞浓度加入100～500μl固定液) ↓ FCM检测或制片后荧光显微镜下观察 (标本在试管中可保存5～7天) （二）试剂和器材 1. 各种特异性单克隆抗体。 2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。 3. 10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。 4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。 （三）注意事项 1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN ３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。 2. 洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。 3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。 4. 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。 附: 1. DPBS (×10, 贮存液)
Microbial Ecology 绪论 1、名词解释: 微生物生态学:就是研究微生物与其周围生物与非生物环境之间相互关系的一门科学。 微生态学:就是生态学的一个层次,就是研究正常微生物在细胞或分子水平上相关关系的科 学 环境、自然环境+生物环境 生境、指生物的个体、种群或群落生活地域的具体环境。生物＋非生物 栖息地、生物生活或居住的范围的物理环境。如林地生境中的不同树冠层、树干 生态位、一个种群在生态系统中,在时间空间上所占据的位置及其与相关种群之间的功能关 系与作用。 基础生态位、一个物种能够占据的生态位空间,由物种的变异与适应能力决定,而非其地理因素。基本生态位就是实验室条件下的生态位,里面不存在捕食者与竞争。 实际生态位、自然界中真实存在的生态位。 物种流就是指物种的种群在生态系统内或系统之间时空变化的状态。 2、微生物生态学的研究意义有哪些？ ①发现新的在工农业(如固氮)、食品(如发酵)、医药(如抗生素)与环境保护(如生物修复)方面有重要用途的微生物菌株(包括极端环境中微生物资源的发掘); ②微生物在地球物质化学循环中具有重要作用; ③开发与利用自然界中的微生物资源,保护好微生物基因资源; ④控制有害微生物,利用微生物净化环境,保护环境,维持环境生态平衡; ⑤保护人类健康与保护生态平衡发挥微生物的最佳作用。 3、微生物生态学主要研究内容有哪些？ ①正常自然环境中的微生物种类、分布及变化规律; ②极端自然环境中的微生物; ③微生物之间、微生物与动植物相互关系; ④微生物在净化污染环境中的作用; ⑤现代分子微生物生态学的研究方法。 4、生态系统的功能有哪些？ 物种流能量流食物链营养级信息流 5、什么就是微生物生态系统？其特点就是什么？ 就是指各种环境因子如物理、化学及生物因子对微生物区系(即自然群体)的作用与微生物区系对外界环境的反作用。 特点:微环境稳定性适应性 7、简述物种流的含义及其特点。 就是指物种的种群在生态系统内或系统之间时空变化的状态。不同生态系统间的交流与联 系。主要有三层含义: 生物有机体与环境之间相互作用所产生的时间、空间变化的过程; 物种种群在生态系统内或系统之间格局与数量的动态,反映了物种关系的状态,如寄生、捕食、共生等; 生物群落中物种组成、配置、营养结构变化,外来种与本地种的相互作用,生态系统对物种增 加与空缺的反应等。
方法一： 1.首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片） 2.然后在4％PFA里面室温下固定30分钟，PBS洗两次，0.1% TX-100室温下作用1－2分 钟使细胞膜通透。 3.接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器（面积大，扁平状的，比如大的培养皿）里面， 放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。 4.剪一片合适大小的parafilm，在上面滴上稀释在1％BSA/TBS中的一抗（稀释倍数依具体 抗体而定），每个玻璃片30ul足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育30分钟，然后在PBS里洗三次。 5.接下来二抗孵育步骤同上。 6.最后，在载玻片加上mounting medium（大约每个玻璃片加10ul），把玻璃片放上去（细 胞面朝下），37度30分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。 7.抗体很重要，不能有非特异性结合。你可以先做WB检测一下你的抗体，看看有没有杂带。 8.双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看看那种方法合适）。 如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。 方法二： 1.选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，二抗则是不 同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。 2.我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔细摸索， 我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。 3.我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对 照是PBS+荧光标记物。 4.封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的正常donkey血清。 5.其余步骤同一般免疫荧光单标操作。 方法三： 1.片子的制作：可以做细胞爬片，细胞甩片，还有直接在24well/12well/96well中直接染色 2.细胞爬片的制作：直接购买公司的已经处理过的细胞爬片，要是自己制作的话，就用无菌 的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片 3.细胞甩片：需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。
北京师范大学自然资源专业张全国微生物生态学考博真题-参考书-状元经验 一、专业的设置 北京师范大学减灾与应急管理研究院/地表过程与资源生态国家重点实验室每年招收博士生30人，下设自然地理学、地图学与地理信息系统、自然资源、全球环境变化、自然灾害学，共5个专业。 自然资源专业下设顾卫的海岸带自然资源开发与利用；何春阳、邬建国、于德永的城市生态与规划；何春阳、邬建国、于德永的景观生态与土地系统设计；张全国的微生物生态学；高琼的生态系统生态学及模型。本专业拟招生5名 二、考试的科目 微生物生态学的考试科目为：①1101英语②2023高等数学与数理统计③3065生态学 三、导师介绍 张全国：教授，博士生导师，研究领域：微生物生态学 四、参考书目 专业课信息应当包括一下几方面的内容： 第一，关于参考书和资料的使用。这一点考生可以咨询往届的博士学长，也可以和育明考博联系。参考书是理论知识建立所需的载体，如何从参考书抓取核心书目，从核心书目中遴选出重点章节常考的考点，如何高效的研读参考书、建立参考书框架，如何灵活运用参考书中的知识内容来答题，是考生复习的第一阶段最需完成的任务。另外，考博资料获取、复习经验可咨询叩叩：肆九叁叁，柒壹六，贰六，专业知识的来源也不能局限于对参考书的研读，整个的备考当中考生还需要阅读大量的paper，读哪一些、怎么去读、读完之后应该怎么做，这些也会直接影响到考生的分数。 第二，专题信息汇总整理。每一位考生在复习专业课的最后阶段都应当进行专题总结，专题的来源一方面是度历年真题考点的针对性遴选，另一方面是导师
研究课题。最后一方面是专业前沿问题。每一个专题都应当建立详尽的知识体系，做到专题知识点全覆盖。 第三，专业真题及解析。专业课的试题都是论述题，答案的开放性比较强。一般每门专业课都有有三道大题，考试时间各3小时，一般会有十几页答题纸。考生在专业课复习中仅仅有真题是不够的，还需要配合对真题最权威最正统的解析，两相印证才能够把握导师出题的重点、范围以及更加偏重哪一类的答案。 第四，导师的信息。导师的著作、研究方向、研究课题、近期发表的论文及研究成果，另外就是为研究生们上课所用的课件笔记和讨论的话题。这些都有可能成为初复试出题的考察重点。同时这些信息也是我们选择导师的时候的参照依据，当然选择导师是一个综合性的问题，还应当考虑到导师的研究水平、课题能力、对待学生的态度和福利等等。 第五，时事热点话题分析。博士生导师在选择博士的时候会一般都会偏重考查考生运用基础理论知识来解决现实热点问题的能力，这一点在初试和复试中都有体现。近几年的真题中都会有联系实际的热点分析。所以考生在复习备考时就应单多阅读一些本专业本学科的最新研究方向研究成果，权威的期刊上面“大牛们”都在关心、探讨什么话题，以及一些时事热点问题能不能运用本专业的知识来加以解释解决。 六、北师考博专业课 考博就是考专业课，专业课定生死。对于专业课的复习，可不仅仅是看看参考书就可以的。我们育明教育考博分校针对专业课的辅导一共有五轮，第一轮是对核心参考书的分析讲解，考博资料获取、复习经验可咨询叩叩：肆九叁叁，柒壹六，贰六，主要是理清学科的发展史，掌握每一个阶段的主要理论，代表人物，提出背景和评价，最终构建起完整的学科框架，第二轮在第一轮的基础上进行常考专题的讲解，是对一一轮和深化和凝练，第三轮是针对真题的难度深度广度灵活度和缜密度以及出题老师的特点，就出题老师的学科背景，研究重点，上课的笔记讲稿，论文，研究课题成果等进行深度讲解，第四轮是就最新的理论前沿和
在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。 (1)直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光素的抗体(如抗A 和抗B)以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，即可对两种抗原进行定位和定量。直接法简便可靠，但灵敏度较低。 (2)间接法双重免疫荧光标记：用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，从而对两种抗原进行定位和定量。使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属，且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。 免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项 一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下： 1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。 2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。 3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。 4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS (1：1)。条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。
5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。 6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。 二、注意事项 1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。 2、每次试验均需设置以下三种对照： (1) 阳性对照：阳性血清+荧光标记物; (2) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物; (3) 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。 三、免疫荧光双标的经验之谈 1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。 2、我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要自我摸索，我感觉一抗4℃孵育过夜比较好，背景比较清晰。 3、我的阳性对照采用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。 4、封闭血清是二抗来源动物的正常血清，我用的是10%正常donkey 血清。 5、其余事项同免疫荧光单标操作。 免疫组化双重染色方法和步骤 在生物医学和临床研究实践中，经常需要检测两种不同物质是否在同一
(5)高通量测序：环境微生物群落多样性分析 微生物群落多样性的基本概念 环境中微生物的群落结构及多样性和微生物的功能及代谢机理是微生物生态学的研究 热点。长期以来，由于受到技术限制，对微生物群落结构和多样性的认识还不全面， 对微生物功能及代谢机理方面了解的也很少。但随着高通量测序、基因芯片等新技术 的不断更新，微生物分子生态学的研究方法和研究途径也在不断变化。第二代高通量 测序技术（尤其 是Roche 454高通量测序技术）的成熟和普及，使我们能够对环境微生物进行深度测序，灵 敏地探测出环境微生物群落结构随外界环境的改变而发生的极其微弱的变化，对于我 们研究微生物与环境的关系、环境治理和微生物资源的利用以及人类医疗健康有着重 要的理论和现实意义。 在国内，微生物多样性的研究涉及农业、土壤、林业、海洋、矿井、人体医学等诸多领域。以在医疗领域的应用为例，通 过比较正常和疾病状态下或疾病不同进程中人体微生物群落的结构和功能变化，可以 对正常人群与某些疾病患者体内的微生物群体多样性进行比较分析，研究获得人体微 生物群
落变化同疾病之间的关系；通过深度测序还可以快速地发现和检测常见病原及新发传 染病病原微生物。研究方法进展 环境微生物多样性的研究方法很多，从国内外目前采用的方法来看大致上包括以下四 类：传统的微生物平板纯培养方法、微平板分析方法、磷脂脂肪酸法以及分子生物学 方法等等。 近几年，随着分子生物学的发展，尤其是高通量测序技术的研发及应用，为微生物分 子生态学的研究策略注入了新的力量。 目前用于研究微生物多样性的分子生物学技术主要包 括:DGGE/TGGE/TTGE 、 T-RFLP 、SSCP、FISH 、印记杂交、定量 PCR、基因芯片等。 DGGE 等分子指纹图谱技术，在其实验结果中往往只含有数十条条带，只能反映出样品中少数 优势菌的信息；另一方面，由于分辨率的误差，部分电泳条带中可能包含不只一种 16S rDNA 序列，因此要获悉电泳图谱中具体的菌种信息，还需 对每一条带构建克隆文库，并筛选克隆进行测序，此实验操 作相对繁琐；此外，采用这种方法无法对样品中的微生物做 到绝对定量。生物芯片是通过固定在芯片上的探针来获得微
免疫荧光染色大全（精华版） 组织免疫荧光法 （1）将待染组织切片置于65摄氏度恒温箱烤片1h，脱蜡 （2）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （3）0.5%Triton X-100（PBS 配制）室温通透 10min （4）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 注意：步骤（3）和（4）用于检测细胞核抗原，细胞膜抗原直接跳过此步骤（5）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火3min，后转成低火 15min。 （6）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （7）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。 （8）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （9）使用1% BSA进行室温封闭 30min，用于封闭非特异性抗原表位。 （10）按抗体推荐使用说明书孵育特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜。（11）次日取出切片，室温下复温 30min。 （12）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （13）选取相应的免疫荧光二抗滴加于血管组织上，37°C避光孵育30min。（14）1×PBS洗涤 3 次，每次 5min。 （15）避光条件下，DAPI 染液染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用（16）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （17）在血管组织上滴加抗荧光淬灭剂进行封片。 （18）使用荧光显微镜进行观察拍照。 贴壁细胞免疫荧光法 （1）在培养板中接种的带染色的细胞爬片用PBS泡洗3次×3min （2）4%多聚甲醛固定细胞爬片15min （3）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （4）0.5%Triton X-100（PBS配制）室温通透10min （5）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （6）1%BSA室温封闭30min （7）弃掉封闭液，细胞爬片滴加适量稀释至适当比例的一抗，4℃孵育过夜（8）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （9）细胞爬片滴加稀释至适当比例的荧光二抗 （10）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （11）DAPI染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用 （12）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （13）用抗荧光淬灭剂封片 （14）荧光显微镜下观察采集图像 细胞免疫荧光（悬浮细胞方法一） （1）收集悬浮细胞，细胞在冰浴中冷却，然后用台式离心机于4℃以800 g 离心5 min，吸去培养液并以4℃ 1×PBS重悬细胞。
1.细菌特殊构造包括、、、等。（本题2分） 2.溶源性细胞在正常情况下有大约10 -5 细胞会发生现象，这是由于少数溶源细胞中的变成了的缘故。（本题分） 3.营养物质可以通过、、和四种方式进入细胞。（本题2分） 4.控制有害微生物措施中杀灭的方法有和，常用和方法，抑制的方法有和。（本题3分） 5.证明遗传物质的基础是核酸的三个著名的实验为、、。（本题分） 6.微生物基因重组的方式包括、_____、_____和。（本题2分） 1.纯培养是其中（）的培养物。 A.只有一种微生物 B.只有细菌生长所需的一种营养物 C.除主要微生物外只有一种微生物 D.没有代谢废物 2.实验室常用的培养细菌的培养基是（）。 $ A. 马铃薯培养基 B. 牛肉膏蛋白胨培养基 C.高氏一号培养基 D.麦芽汁培养基 3.己糖单磷酸支路和ED途径是进行（）替换的一个机制。 A.微生物中DNA合成 B.光合生物中的光合作用 C.某些种类微生物中的能量代谢 D.化学渗透作用 4.微生物代谢中，硝酸盐和硫酸盐可作为电子受体是在（）。 A.无酶时 B.无ATP时 C. 有细胞色素时 D. 无氧时 5.由于控制微生物的目的，灭菌一词指的是（）。 A.除去病原微生物 B.降低微生物的数量 ? C.消灭所有的生物 D.只消灭体表的微生物 6.紫外线辐射主要作用于微生物的（）。 A. 核酸 B.酶类 C. 糖类 D.细胞壁 7.青霉素族的抗生素主要用于抗（）。 A.病毒 B.真菌 C.革兰氏阴性菌 D.革兰氏阳性菌 8.所有下述特征皆适合质粒，除了（）之外。 A.它们是自我复制的DNA环 B.它们有10～50个基因 C.它们是细菌存活所必需的成分 D.它们是接合所必需的成分 9.接合时F因子进入受体细胞，受体细胞（）。 A.经历裂解 B.快速繁殖 C.变成供体细胞 D.发育出线粒体 — 10.研究不同微生物群落及其环境之间的关系的是（）。 A.微生物进化 B.微生物生态学 C.微生物生理学 D.微生物生物化学 四、判断题（每小题1分，共10小题10分）
胞免疫荧光步骤： 1.细胞爬片；首先是玻片的处理，普通的盖玻片用砂轮划成自己要的大小的小方块，先用洗衣粉洗干净，用水冲静烤干，然后泡酸过夜，捞酸后流水洗净，烤干，置于器皿中高压灭菌，然后再烤箱中大约8小时烤干备用。 爬片可以在培养皿六孔板或24孔板中都可，我选择在培养皿中爬。一为节约经费（培养皿可以重复利用）二来觉得培养皿口大，操作比较方便。培养皿消毒同上，消毒时记得消两把镊子 具体操作是：用胰酶消化好细胞，充分吹打，使之成单细胞悬液（注意：这一点很重要，关系到将来爬出来片子的质量） 取出消毒的培养皿，可以先加少量培养基（以使玻片与培养皿紧密接触），将玻片小心放入摆放其中，然后将单细胞悬液一滴一滴的滴到玻片上。最后盖上培养皿置于37度5％CO2的暖箱中培养，根据细胞生长状况，24小时或更长时间适时取出爬片。 爬片置于37度PBS中洗三次，每次3到5秒钟，然后在4％多聚甲醛中固定15分钟，然后再用37度去离子水将甲醛冲干净，注意手法轻柔，要不然掉片很厉害。同时操作过程中注意玻片的正反面，要不然真的是前功尽弃。 将做好的爬片置于滤纸上晾干，然后用中性树胶粘在载玻片上。注意一定要等中性树胶彻底干了之后才能做后续实验，要不然玻片会掉下来的，就又是前功尽弃了做好的细胞爬片可以放在－20保存备用，具体能保存多长时间不太清楚，当然尽量早用。 2.4%多聚甲醛固定10min(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮)； 3.PBS漂洗5min； 4.0.5% Triton 穿孔15min(丙酮固定法不用透化处理)； 5.PBS漂洗2次，每次5min； 6.1%BSA封闭30min； 7.加入1%BSA稀释的一抗，于37℃杂交2h； 8.PBS漂洗2次，每次5min； 9.加入1%BSA稀释的二抗，于37℃杂交1h； 10.PBS漂洗2次，每次5min； 11.5ug/ml DAPI染色2min； 12.抗淬灭封片剂封片。
微生物生态学复习资料
指来自于其他生态系统的微生物，所以这些微生物不能在这一生境中长期生活下去。 群落（Community）：指一定区域里，各种群体(Population)相互松散结合的一种结构单位。生态系统：生态系统就是在一定的时间和空间内，生物和非生物的成分之间，通过不断的物质循环和能量流动而相互作用、相互依存的统一体，构成一个生态学的功能复合体。 生态系统=生物群落+无机环境。 影响土壤中微生物分布的因素 ●土壤颗粒性质腐殖质》砂土 ●土壤水分游动微生物 ●氧气上层好氧微生物多（穴居动物活动可 以给微生物好氧生长提供条件） ●pH pH对营养物质的利用，微生物吸附，胞 外酶的产生和分泌产生影响 ●温度蓝细菌能抗变化范围很大的温度；耐 寒的藻类（雪藻） ●营养状况有机物对自养细菌有抑制作用 （刍溪藻喜欢在营养丰富的鸟粪中）（土壤颗粒中细菌的不均匀分布） ●人类生产活动
三.淡水微生物的共同特征： 1 能在低营养物浓度下生长 2 微生物是可以游动的 3 表面积和体积比大（柄细菌），有效吸收营养。 研究极端环境中微生物的意义 ●研究其强而稳定的特殊结构、机能和遗传基 因以及应答因子，对阐明物种起源、生物进 化具有重要意义。 ●研究其生理生化特性，可用于量度地球上生 命生存的理化极限，对探索宇宙星球上的生 物有参考价值； ●可探索出新的生理途径，生产新酶和新的生 物制剂，使用于特殊环境条件，如煤脱硫、 冶炼金属、处理有毒废水、高压深油井探矿、纤维素高温发酵酒精等。 ●研究成果可以大大促进微生物在环境保护、 人类健康和生物技术等领域的应用。 嗜冷微生物（psychrophiles） ?0℃以下或3～20℃能生长的微生物， ?最适生长温度不超过15℃， ?最高生长温度不超过20℃。
免疫荧光技术（Immunofluorescence technique）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位。 一、基本原理： 免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光（黄绿色或橘红色），可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。 二、应用范围： 其应用范围极其广泛，可以测定内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、肿瘤标志物、血药浓度等各种生物活性物质。根据诊断类别，又可分为传染性疾病、内分泌、肿瘤、药物检测、免疫学、血型鉴定等。 三、基本实验步骤：
1、细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm,5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。 2、固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。PBS洗涤3×5min. 3、通透。使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5min. 4、封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min. 5、一抗结合。室温孵育1h或者4℃过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min. 6、二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。 7、封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。 四、注意事项： 1、染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会崔灭的。 2、荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。