pET-41b(+) 编号 名称 北京华越洋VECT--‐540 pET--‐41b(+) pET41b载体基本信息 别名: pET41b, p ET 41b 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 5932 b p 5' 测序引物: T7或pGEX--‐5‘ 5' 测序引物序列: T7: 5'--‐TAATACGACTCACTATAGGG--‐3'; pGEX--‐5': 5'--‐GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG--‐3' 载体标签: N--‐GST, N--‐His, N--‐Thrombin 载体抗性: Kanamycin 备注: Encodes GST fusion tag; Nterm thrombin cleavage site; Nterm enterokinase c leavage s ite; P shAI b lunt c loning s ite; a,b,c v ary b y M CS 稳定性: 瞬时表达 Transient 组成型: 组成型 Constitutive 病毒/非病毒: 非病毒 pET41b载体质粒图谱和多克隆位点信息
Feature N ame Start End T7_terminator 120 1 T7_Terminal_primer 69 87 EK 278 264 S15 353 309 6xHIS 413 396 GST (variant) 1094 444 T7_transl_en_RBS 1119 1103 lacO 1164 1137 T7_promoter 1182 1164 tet (300 --‐ 563) 1218 1481 pBRrevBam_primer 1289 1270 lacI 1564 2655 ROP 3227 3418 pGEX_3_primer 3434 3412 pBR322_origin 4452 3833
pET-SUMO 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT4790 pET--‐SUMO pETsumo载体基本信息 载体名称: pET--‐SUMO 质粒类型: 大肠杆菌表达载体 高拷贝/低拷贝: 低拷贝 启动子: T7 和 lacO 克隆方法: TA C loning 载体大小: 5643bp 5' 测序引物及序列: T7 F orward 3' 测序引物及序列: --‐--‐ 载体标签: His T ag(6x)；SUMO T ag 载体抗性: 卡那霉素 筛选标记: --‐--‐ 备注: 宿主菌株BL21(DE3)；IPTG诱导 稳定性: --‐--‐ 组成型: 诱导型 病毒/非病毒: 非病毒 pETsumo载体质粒图谱和多克隆位点信息
pETsumo载体简介 The Champion pET--‐SUMO Expression System produces the highest levels of soluble protein i n E. c oli. I t u tilizes a s mall u biquitin--‐related m odifier (SUMO) f usion, b elonging t o the growing family of ubiquitin--‐related proteins, to enhance the solubility of expressed fusion proteins. In contrast to ubiquitin, SUMO is involved in the stabilization and localization of proteins in vivo. After expression, the 11 kd SUMO moiety can be cleaved by the highly specific and active SUMO (ULP--‐1) protease at the carboxyl terminal, producing a native protein*. The Champion pET SUMO Protein and Peptide Expression System o ffers: Greatly enhanced solubility with an N--‐terminal SUMO fusionHighly efficient cleavage--‐ produces n ative p rotein o f i nterest w ith S UMO (ULP--‐1) p rotease*Highly s pecific c leavage--‐ eliminates the chance of your protein of interest being internally digested, regardless of its a mino a cid s equenceSignificantly i ncreased s tability w ith S UMO f usion--‐can b e u sed f or small peptide productionT7lac promoter for high--‐level protein expressionN--‐terminal 6xHis t ag f or p rotein d etection a nd p urification. pETsumo载体序列
pET-48b(+) 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT4670 pET--‐48b(+) pET48b载体基本信息 别名: pET48b, p ET 48b 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 5605 b p 5' 测序引物序列: T7: 5'--‐TAATACGACTCACTATAGGG--‐3'; Trx--‐F: 5'--‐TTCCTCGACGCTAACCTG--‐3' 3' 测序引物序列: T7t: 5'--‐TGCTAGTTATTGCTCAGCGG--‐3' 载体标签: N--‐Trx, N--‐His,N--‐HRV 3C, C--‐S, C--‐Thrombin 载体抗性: Kanamycin (卡那霉素) 备注: Same as pET47 but also has Nterm Trx Tag; contains HRV 3C Protease cleavage site for fusion tag removal at low temperatures; Cterm thrombin c leavage s ite. 稳定性: 瞬时表达 组成型: 组成型 病毒/非病毒: 非病毒 pET48b载体质粒图谱和多克隆位点信息
pET48b载体简介 pET--‐48b载体含有N端Trx和His标签，在标签后面紧跟着的是HRV 3C蛋白酶切位点。HRV 3C蛋白酶能够高特异性的识别LEVLFQ↓GP蛋白序列，能够在低温下高效切割掉融合标签序列。pET--‐48b载体还含有一个可选择的C端Thrombin蛋白酶切位点，紧接着位点后是S标签。 pET48b载体的单一的多克隆位点见上面的环状质粒图谱。注意：载体序列是以pBR322质粒的编码规矩进行编码的，所以T7蛋白表达区在质粒图谱上面是反向的。 T7 RNA聚合酶启动的克隆和表达区域在质粒图谱中也被标注了出来。质粒的F1复制子是被定向的，所以在T7噬菌体聚合酶的作用下，包含有蛋白编码序列的病毒 粒子能够
pET-22b(+) 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT5200 pET--‐22b(+) pet22b载体基本信息 别名: pET22b, p et 22b, p ET--‐22b(+) 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 5500bp 5' 测序引物及序列: T7: 5'--‐TAATACGACTCACTATAGGG--‐3' 3' 测序引物序列: T7t: 5'--‐GCTAGTTATTGCTCAGCGG--‐3' 载体标签: N--‐pelB; C--‐His 载体抗性: 氨苄 备注: pET22b载体含有PelB信号肽序列， 能够将表达的目的蛋白定位在细胞外周质腔。 稳定性: 瞬时表达 Transient 组成型: 组成型 Constitutive 病毒/非病毒: 非病毒 pet22b载体质粒图谱和多克隆位点信息
pet22b载体简介 pET--‐22b(+)载体携带有一个N端的pelB信号肽序列，能够将表达的目的蛋白定位于外周质腔，同时载体含有C端His标签。载体的单一的多克隆位点见上面的环状质粒图谱。注意：载体序列是以pBR322质粒的编码规矩进行编码的，所以T7蛋白表达区在质粒图谱上面是反向的。 T7 RNA聚合酶启动的克隆和表达区域在质粒图谱中也被标注了出来。质粒的F1复制子是被定向的，所以在T7噬菌体聚合酶的作用下，包含有蛋白编码序列的病毒 粒子能够产生，并启动蛋白表达，同时蛋白表达将被T7终止子序列的作用下终止蛋白翻译。 pet22b载体序列 ORIGIN 1 ATCCGGATAT AGTTCCTCCT TTCAGCAAAA AACCCCTCAA GACCCGTTTA GAGGCCCCAA 61 GGGGTTATGC TAGTTATTGC TCAGCGGTGG CAGCAGCCAA CTCAGCTTCC TTTCGGGCTT 121 TGTTAGCAGC CGGATCTCAG TGGTGGTGGT GGTGGTGCTC GAGTGCGGCC GCAAGCTTGT 181 CGACGGAGCT CGAATTCGGA TCCGAATTAA TTCCGATATC CATGGCCATC GCCGGCTGGG 241 CAGCGAGGAG CAGCAGACCA GCAGCAGCGG TCGGCAGCAG GTATTTCATA TGTATATCTC 301 CTTCTTAAAG TTAAACAAAA TTATTTCTAG AGGGGAATTG TTATCCGCTC ACAATTCCCC 361 TATAGTGAGT CGTATTAATT TCGCGGGATC GAGATCTCGA TCCTCTACGC CGGACGCATC 421 GTGGCCGGCA TCACCGGCGC CACAGGTGCG GTTGCTGGCG CCTATATCGC CGACATCACC 481 GATGGGGAAG ATCGGGCTCG CCACTTCGGG CTCATGAGCG CTTGTTTCGG CGTGGGTATG 541 GTGGCAGGCC CCGTGGCCGG GGGACTGTTG GGCGCCATCT CCTTGCATGC ACCATTCCTT 601 GCGGCGGCGG TGCTCAACGG CCTCAACCTA CTACTGGGCT GCTTCCTAAT GCAGGAGTCG
pET 原核表达 pET 载体中，目标基因克隆到T7 噬菌体强转录和翻译信号控制之下，并通过在宿主细胞提供T7 RNA 聚合酶来诱导表达。Novagen 的pET 系统不断扩大，提供了用于表达的新技术和选择，目前共包括36 种载体类型、15 种不同宿主菌和设计用于有效检测和纯化目标蛋白的许多其它相关产品。 优点 ·是原核蛋白表达引用最多的系统 ·在任何大肠杆菌表达系统中，基础表达水平最低 ·真正的调节表达水平的“变阻器”控制 ·提供各种不同融合标签和表达系统配置 ·可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌 ·许多载体以LIC 载体试剂盒提供，用于迅速定向克隆PCR 产物 ·许多宿主菌株以感受态细胞形式提供，可立即用于转化 阳性pFORCE TM 克隆系统具有高效克隆PCR 产物、阳性选择重组体和高水平表达目标蛋白等特点。 pET 系统概述 pET 系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统。根据最初由Studier 等开发的T7 启动子驱动系统，Novagen 的pET 系统已用于表达成千上万种不同蛋白。 控制基础表达水平 pET 系统提供6 种载体- 宿主菌组合，能够调节基础表达水平以优化目标基因的表达。没有单一策略或条件适用于所有目标蛋白，所以进行优化选择是必要的。 宿主菌株 质粒在非表达宿主菌中构建完成后，通常转化到一个带有T7 RNA 聚合酶基因的宿主菌（λDE3 溶原菌）中表达目标蛋白。在λDE3 溶原菌中，T7 RNA 聚合酶基因由lacUV5 启动子控制。未诱导时便有一定程度转录，因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。而宿主菌带有pLysS 和pLyE 时调控会更严紧。pLys 质粒编码T7 溶菌酶，它是T7 RNA 聚合酶的天然抑制物，因此可降低其在未诱导细胞中转录目标基因的能力。pLysS 宿主菌产生低量T7 溶菌酶，而pLysE 宿主菌产生更多酶，因此是最严紧控制的λDE3 溶原菌。 有11 种不同DE3 溶原化宿主菌。使用最广泛的为BL21 及其衍生菌株，它的优点在于缺失lon 和ompT 蛋白酶。B834 菌株为甲硫氨酸营养缺陷型，因此可用35 S- 甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记。BLR 为recA - 衍生菌株，改善了质粒单体产量，有助于稳定含有重复序列的目标质粒。两个硫氧还蛋白还原酶( trxB ) 突变菌株(AD494,BL21 trxB ) ，有利于大肠杆菌胞浆中二硫键形成。Origami TM 和OrigamiB 菌株为trxB/gor 双突变，这两个酶是主要还原途径的关键酶。Origami 和OrigamiB 宿主菌的主要优点是能形成正确折迭的含有二硫键的蛋白。新的Rosetta TM 菌株补充了四种大肠杆菌稀有密码子的tRNA ，改善了由于密码子使用频率不同而引起的一些真核蛋白低表达。其它菌株背景包括K-12 菌株HMS174 和NovaBlue ，象BLR 一样为recA - 。这些菌株可稳定表达其产物可能导致DE3 噬菌体丢失的某些目标基因。由于存在F 附加体编码
pET-3a(+) 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT5510 pET--‐3a(+) pet3a载体基本信息 别名: pET3a, p et 3a 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 4640bp 5' 测序引物: T7 5' 测序引物序列: 5'--‐TAATACGACTCACTATAGGG--‐3' 载体标签: N--‐T7 载体抗性: Ampicillin 备注: Same a s p ET9 b ut a mpR; a,b,c,d v ary b y M CS. 稳定性: 瞬时表达 Transient 组成型: 组成型 Constitutive 病毒/非病毒: 非病毒 pet3a载体质粒图谱和多克隆位点信息
pet3a载体简介 The maps for pET--‐3b, pET--‐3c and pET--‐3d are the same as pET--‐3a (shown) with the following exceptions: pET--‐3b is a 4639bp plasmid; subtract 1bp from each site beyond BamH I a t 510. p ET--‐3c i s a 4638bp p lasmid;subtract 2bp f rom e ach s ite b eyond B amH I a t 510. pET--‐3d is a 4637bp plasmid; the BamH I site is in the same reading frame as in pET--‐3c. An Nco I site is substituted for the Nde I site with a net 1bp deletion at position 550 o f p ET--‐3c. A s a r esult, N co I c uts p ET--‐3d a t 546. F or t he r est o f t he s ites,subtract 3bp from each site beyond position 551 in pET--‐3a. Nde I does not cut pET--‐3d. The pET--‐3a--‐d vectors carry an N--‐terminal T7?Tag? sequence and BamH I cloning site. These vectors are the precursors to many pET family vectors; the pET--‐23a--‐d(+) series corresponds to pET--‐3a--‐d but incorporates several additional features. Unique sites are shown on the circle map.Note that the sequence is numbered by the pBR322 convention, so the T7 expression region is reversed on the circular map. The cloning/expression region of the coding s trand t ranscribed b y T7 R NA p olymerase i s s hown a bove.
pET-41a(+) 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT4930 pET--‐41a(+) pET41a载体基本信息 别名: pET41a, p ET 41a 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 5933 b p 5' 测序引物: pGEX--‐5': 5'--‐GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG--‐3' 3' 测序引物: T7t: 5'--‐GCTAGTTATTGCTCAGCGG--‐3' 载体标签: N--‐GST, N--‐His, N--‐Thrombin, N--‐EK, N--‐S 载体抗性: 卡那 备注: 载体带有GST蛋白纯化标签，pET41 a,b,c 的差异是在于多克隆位点。 稳定性: 瞬时表达 组成型: 组成型 病毒/非病毒: 非病毒 pET41a载体质粒图谱和多克隆位点信息
pET41a载体简介 pET41系列载体是设计用来克隆和高水平表达蛋白质的载体，载体融合表达一个含有220 个氨基酸的GST标签蛋白纯化片段。pET41a载体的单一的多克隆位点见上面的环状质粒 图谱。注意：载体序列是以pBR322质粒的编码规矩进行编码的，所以T7蛋白表达区在 质粒图谱上面是反向的。 T7 RNA聚合酶启动的克隆和表达区域在质粒图谱中也被标注了出来。质粒的F1复制子 是被定向的，所以在T7噬菌体聚合酶的作用下，包含有蛋白编码序列的病毒 粒子能够 产生，并启动蛋白表达，同时蛋白表达将被T7终止子序列(Cat. N o. 69337--‐3)的作用下终 止蛋白翻译。 pET--‐41a载体上面含有一个EK蛋白酶切位点，当将目的基因使用载体上面的PshAI限制 性内切酶位点插入进去时，可以通过EK蛋白酶将载体上的融合的所有氨基酸序列包括GST标签序列，全部切除掉。
pET-14b 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT4150 pET--‐14b pET14b载体基本信息 别名: pET14b, p et 14b 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 4671bp 5' 测序引物: T7 5' 测序引物序列: 5'--‐TAATACGACTCACTATAGGG--‐3' 载体标签: N--‐His, N--‐thrombin 载体抗性: Ampicillin 备注: Hosts: E.coli. R elated v ectors: p BR322. 稳定性: 瞬时表达 Transient 组成型: 组成型 Constitutive 病毒/非病毒: 非病毒 pET14b载体质粒图谱和多克隆位点信息
pET14b载体简介 The p ET--‐14b v ector (Cat. N o. 69660--‐3) c arries a n N--‐terminal H is?Tag? s equence f ollowed b y a thrombin site and three cloning sites. Unique sites are shown on the circle map. Note that thesequence i s n umbered b y t he p BR322 c onvention, s o t he T7 e xpression r egion i s r eversed on the circular map. The cloning/expression region of the coding strand transcribed by T7 RNA p olymerase i s s hown b elow. pET14b载体序列 ORIGIN 1 TTCTCATGTT TGACAGCTTA TCATCGATAA GCTTTAATGC GGTAGTTTAT CACAGTTAAA 61 TTGCTAACGC AGTCAGGCAC CGTGTATGAA ATCTAACAAT GCGCTCATCG TCATCCTCGG 121 CACCGTCACC CTGGATGCTG TAGGCATAGG CTTGGTTATG CCGGTACTGC CGGGCCTCTT 181 GCGGGATATC GTCCATTCCG ACAGCATCGC CAGTCACTAT GGCGTGCTGC TAGCGCTATA 241 TGCGTTGATG CAATTTCTAT GCGCACCCGT TCTCGGAGCA CTGTCCGACC GCTTTGGCCG 301 CCGCCCAGTC CTGCTCGCTT CGCTACTTGG AGCCACTATC GACTACGCGA TCATGGCGAC 361 CACACCCGTC CTGTGGATAT CCGGATATAG TTCCTCCTTT CAGCAAAAAA CCCCTCAAGA 421 CCCGTTTAGA GGCCCCAAGG GGTTATGCTA GTTATTGCTC AGCGGTGGCA GCAGCCAACT 481 CAGCTTCCTT TCGGGCTTTG TTAGCAGCCG GATCCTCGAG CATATGGCTG CCGCGCGGCA 541 CCAGGCCGCT GCTGTGATGA TGATGATGAT GGCTGCTGCC CATGGTATAT CTCCTTCTTA 601 AAGTTAAACA AAATTATTTC TAGAGGGAAA CCGTTGTGGT CTCCCTATAG TGAGTCGTAT 661 TAATTTCGCG GGATCGAGAT CTCGATCCTC TACGCCGGAC GCATCGTGGC CGGCATCACC 721 GGCGCCACAG GTGCGGTTGC TGGCGCCTAT ATCGCCGACA TCACCGATGG GGAAGATCGG 781 GCTCGCCACT TCGGGCTCAT GAGCGCTTGT TTCGGCGTGG GTATGGTGGC AGGCCCCGTG 841 GCCGGGGGAC TGTTGGGCGC CATCTCCTTG CATGCACCAT TCCTTGCGGC GGCGGTGCTC 901 AACGGCCTCA ACCTACTACT GGGCTGCTTC CTAATGCAGG AGTCGCATAA GGGAGAGCGT 961 CGACCGATGC CCTTGAGAGC CTTCAACCCA GTCAGCTCCT TCCGGTGGGC GCGGGGCATG 1021 ACTATCGTCG CCGCACTTAT GACTGTCTTC TTTATCATGC AACTCGTAGG ACAGGTGCCG 1081 GCAGCGCTCT GGGTCATTTT CGGCGAGGAC CGCTTTCGCT GGAGCGCGAC GATGATCGGC 1141 CTGTCGCTTG CGGTATTCGG AATCTTGCAC GCCCTCGCTC AAGCCTTCGT CACTGGTCCC 1201 GCCACCAAAC GTTTCGGCGA GAAGCAGGCC ATTATCGCCG GCATGGCGGC CGACGCGCTG 1261 GGCTACGTCT TGCTGGCGTT CGCGACGCGA GGCTGGATGG CCTTCCCCAT TATGATTCTT 1321 CTCGCTTCCG GCGGCATCGG GATGCCCGCG TTGCAGGCCA TGCTGTCCAG GCAGGTAGAT 1381 GACGACCATC AGGGACAGCT TCAAGGATCG CTCGCGGCTC TTACCAGCCT AACTTCGATC 1441 ACTGGACCGC TGATCGTCAC GGCGATTTAT GCCGCCTCGG CGAGCACATG GAACGGGTTG 1501 GCATGGATTG TAGGCGCCGC CCTATACCTT GTCTGCCTCC CCGCGTTGCG TCGCGGTGCA 1561 TGGAGCCGGG CCACCTCGAC CTGAATGGAA GCCGGCGGCA CCTCGCTAAC GGATTCACCA 1621 CTCCAAGAAT TGGAGCCAAT CAATTCTTGC GGAGAACTGT GAATGCGCAA ACCAACCCTT 1681 GGCAGAACAT ATCCATCGCG TCCGCCATCT CCAGCAGCCG CACGCGGCGC ATCTCGGGCA 1741 GCGTTGGGTC CTGGCCACGG GTGCGCATGA TCGTGCTCCT GTCGTTGAGG ACCCGGCTAG 1801 GCTGGCGGGG TTGCCTTACT GGTTAGCAGA ATGAATCACC GATACGCGAG CGAACGTGAA 1861 GCGACTGCTG CTGCAAAACG TCTGCGACCT GAGCAACAAC ATGAATGGTC TTCGGTTTCC 1921 GTGTTTCGTA AAGTCTGGAA ACGCGGAAGT CAGCGCCCTG CACCATTATG TTCCGGATCT 1981 GCATCGCAGG ATGCTGCTGG CTACCCTGTG GAACACCTAC ATCTGTATTA ACGAAGCGCT
pET-37b(+) 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT4740 pET--‐37b(+) pET37b载体基本信息 别名: pET37b, p et 37b, p ET--‐37b(+) 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 5932 b p 5' 测序引物及序列: T7: 5'--‐TAATACGACTCACTATAGGG--‐3' 3' 测序引物序列: T7t: 5'--‐GCTAGTTATTGCTCAGCGG--‐3' 载体标签: N--‐Signal, N--‐CBD, N--‐S, N--‐Thrombin, N--‐EK, C--‐His 载体抗性: 卡那 备注: --‐--‐ 稳定性: 瞬时表达 组成型: 组成型 病毒/非病毒: 非病毒 pET37b载体质粒图谱和多克隆位点信息
pET37b载体简介 载体含有N端纤维素结合结构域(N--‐CBD), 是分泌性蛋白表达载体。 pET37b载体序列 ORIGIN 1 ATCCGGATAT AGTTCCTCCT TTCAGCAAAA AACCCCTCAA GACCCGTTTA GAGGCCCCAA 61 GGGGTTATGC TAGTTATTGC TCAGCGGTGG CAGCAGCCAA CTCAGCTTCC TTTCGGGCTT 121 TGTTTAGCAG CCTAGGTATT AATCAATTAG TGGTGGTGGT GGTGGTGGTG GTGCTCGAGT 181 GCGGCCGCAA GCTTGTCGAC GGAGCTCGAA TTCGGATCCG ATATCGCCAT GGCCAGAGGA 241 GAGTTAGAGC GACCCTCAAT ACCGGAGCCA CCACCGGTAC CCAGATCTGG GCTGTCCATG 301 TGCTGGCGTT CGAATTTAGC AGCAGCGGTT TCTTTCATAC CAATTGCAGT ACTACCGCGT 361 GGCACCAGAC CCGCGGAACC TGGTGCCGTG GGGCTGGTCG TCGGCACGGT GCCCGTGCAG 421 GTGGTGCCGT TGAGCGAGAA CGACGCCGGC GTCGGGTTGG ACCCGGCCCA CGAGCCGTTG 481 AACCCGAACG ACGCCGTGCC GCCGGTCGGG ATGCTGCCGT TCCAGGGCAG GCTGGTGACG 541 GAGACCTGGC CGCCGTTGGT CGAGGCGGTG CCGTTCCACA GCTGCTGGAT ACGCTGGCCT 601 GCGGTGTAGG TCCAGTCGAG CTTCCACGAC GAGACGGGGT CGCCGAGGTT GGTGATCGTG 661 ACGTTGGCGC CGAAGCCGCC GGGCCACTGG TTGGTGACGG CGTAGTCGAC GCGGCAGCCG 721 GGACTAGCGG CCTGGGCGGG CAGCACGACC GTGGCGCCGA CGACGAGCGT CGCCGCCGCG 781 GCGGCGAGCG TCGTGCGCAG AGCGGTGCGG GCGCCGCGGG CCGGGTGGCC GGGTGCGGGC 841 GTGGTACGAG GGTCCATATG TATATCTCCT TCTTAAAGTT AAACAAAATT ATTTCTAGAG 901 GGGAATTGTT ATCCGCTCAC AATTCCCCTA TAGTGAGTCG TATTAATTTC GCGGGATCGA 961 GATCGATCTC GATCCTCTAC GCCGGACGCA TCGTGGCCGG CATCACCGGC GCCACAGGTG 1021 CGGTTGCTGG CGCCTATATC GCCGACATCA CCGATGGGGA AGATCGGGCT CGCCACTTCG 1081 GGCTCATGAG CGCTTGTTTC GGCGTGGGTA TGGTGGCAGG CCCCGTGGCC GGGGGACTGT 1141 TGGGCGCCAT CTCCTTGCAT GCACCATTCC TTGCGGCGGC GGTGCTCAAC GGCCTCAACC 1201 TACTACTGGG CTGCTTCCTA ATGCAGGAGT CGCATAAGGG AGAGCGTCGA GATCCCGGAC 1261 ACCATCGAAT GGCGCAAAAC CTTTCGCGGT ATGGCATGAT AGCGCCCGGA AGAGAGTCAA 1321 TTCAGGGTGG TGAATGTGAA ACCAGTAACG TTATACGATG TCGCAGAGTA TGCCGGTGTC 1381 TCTTATCAGA CCGTTTCCCG CGTGGTGAAC CAGGCCAGCC ACGTTTCTGC GAAAACGCGG 1441 GAAAAAGTGG AAGCGGCGAT GGCGGAGCTG AATTACATTC CCAACCGCGT GGCACAACAA 1501 CTGGCGGGCA AACAGTCGTT GCTGATTGGC GTTGCCACCT CCAGTCTGGC CCTGCACGCG 1561 CCGTCGCAAA TTGTCGCGGC GATTAAATCT CGCGCCGATC AACTGGGTGC CAGCGTGGTG 1621 GTGTCGATGG TAGAACGAAG CGGCGTCGAA GCCTGTAAAG CGGCGGTGCA CAATCTTCTC 1681 GCGCAACGCG TCAGTGGGCT GATCATTAAC TATCCGCTGG ATGACCAGGA TGCCATTGCT 1741 GTGGAAGCTG CCTGCACTAA TGTTCCGGCG TTATTTCTTG ATGTCTCTGA CCAGACACCC 1801 ATCAACAGTA TTATTTTCTC CCATGAAGAC GGTACGCGAC TGGGCGTGGA GCATCTGGTC 1861 GCATTGGGTC ACCAGCAAAT CGCGCTGTTA GCGGGCCCAT TAAGTTCTGT CTCGGCGCGT
pET-23(+) 编号 名称 北京华越洋VECT--‐170 pET--‐23(+) pET23载体基本信息 载体名称: pET--‐23a 质粒类型: 大肠杆菌表达载体；蛋白纯化 高拷贝/低拷贝: 低拷贝 克隆方法: 多克隆位点；限制性内切酶 启动子: T7/ l acI 载体大小: 3592 b p 5' 测序引物及序列: T7 F wd: 5'd[TAATACGACTCACTATAGGG]3' 3' 测序引物及序列: --‐--‐ 载体标签: His T ag （C--‐端） 载体抗性: 氨苄青霉素（Ampicillin） 克隆菌株: DH5a 表达菌株: BL21系列 备注: pET--‐23a，b，c仅阅读框（读码框）不同，彼此相差1个 bp。 稳定性: 稳表达 组成型/诱导型: 诱导型（IPTG) 病毒/非病毒: 非病毒 pET23载体质粒图谱和多克隆位点信息
pET23载体简介 pET--‐23(+) (Cat. No. 69771--‐3) is a transcription vector designed for expression from bacterial translation s ignals c arried w ithin a c loned i nsert. I t t herefore l acks t he r ibosome b inding s ite a nd ATG start codon present on the pET translation vectors. A C--‐terminal His?Tag? sequence is available. U nique s ites a re s hown o n t he c ircle m ap. N ote t hat t he s equence i s n umbered b y t he pBR322 convention, so the T7 expression region is reversed on the circular map. The cloning/expression region of the coding strand transcribed by T7 RNA polymerase is shown below. The f1 origin is oriented so that infection with helper phage will produce virions containing single--‐stranded DNA that corresponds to the coding strand. Therefore, single--‐stranded sequencing should be performed using the T7 terminator primer (Cat. No.
pET-5a(+) 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT4350 pET--‐5a(+) pet5a载体基本信息 质粒类型: 未知 克隆方法: 多克隆位点 载体大小: 4134 备注: 宿主菌: E.coli. 相关载体: p BR322. 稳定性: 瞬时表达 组成型/诱导型: 诱导表达 病毒/非病毒: 非病毒 pet5a载体质粒图谱和多克隆位点信息 pet5a载体序列 ORIGIN 1 TTCGGATCCG CGACCCATTT GCTGTCCACC AGTCATGCTA GCCATATGTA TATCTCCTTC 61 TTAAAGTTAA ACAAAATTAT TTCTAGAGGG AAACCGTTGT GGTCTCCCTA TAGTGAGTCG 121 TATTAATTTC GCGGGATCGA GATCTCGATC CTCTACGCCG GACGCATCGT GGCCGGCATC 181 ACCGGCGCCA CAGGTGCGGT TGCTGGCGCC TATATCGCCG ACATCACCGA TGGGGAAGAT 241 CGGGCTCGCC ACTTCGGGCT CATGAGCGCT TGTTTCGGCG TGGGTATGGT GGCAGGCCCC 301 GTGGCCGGGG GACTGTTGGG CGCCATCTCC TTGCATGCAC CATTCCTTGC GGCGGCGGTG 361 CTCAACGGCC TCAACCTACT ACTGGGCTGC TTCCTAATGC AGGAGTCGCA TAAGGGAGAG 421 CGTCGACCGA TGCCCTTGAG AGCCTTCAAC CCAGTCAGCT CCTTCCGGTG GGCGCGGGGC 481 ATGACTATCG TCGCCGCACT TATGACTGTC TTCTTTATCA TGCAACTCGT AGGACAGGTG 541 CCGGCAGCGC TCTGGGTCAT TTTCGGCGAG GACCGCTTTC GCTGGAGCGC GACGATGATC 601 GGCCTGTCGC TTGCGGTATT CGGAATCTTG CACGCCCTCG CTCAAGCCTT CGTCACTGGT 661 CCCGCCACCA AACGTTTCGG CGAGAAGCAG GCCATTATCG CCGGCATGGC GGCCGACGCG
查看完整版本: [-- pET原核表达手册(中文版) --] 西部药学论坛-> 生物制药 -> pET原核表达手册(中文版)[打印本页]登录 -> 注册 -> 回复主题 -> 发表主 题 红色法拉利2006-06-01 21:50原核表达手册(中文版) 可以说是原核表达宝典级读物,MERCK公司产品,让你对原核表达有个更深的认识,不错的东东，推荐大家读读 红色法拉利2006-06-01 21:57之所以首先介绍Novagen公司的产品是因为用过它的系列载 体，感觉很好用。Novagen的母公司是德国默克（Merck）公司，它是国际著名的化学及制药公司总部位于德国的Darm stadt，已有300多年的历史。已在全世界55个主要国家设立了分公司，其中在28个国家建有62个生产基地。 Novagen公司出品的系列载体是目前应用最为广泛的原核表达系统，已经成功地在大肠杆菌中表达了各种各样的异源蛋白。系列载体是利用大肠杆菌T7噬菌体转录系统进行表达的载体，其表达原理见下图。 T7噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为T7表达系统。T7噬菌体基因编码的T7RNA聚合酶选择性的激活T7噬菌体启动子的转录。它是一种高活性的RNA聚合酶，其合成m RNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍左右。并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。在细胞中存在T7 RNA聚合酶和T7噬菌体启动子的情形下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬菌体转录体系，最终受T7噬菌体启动子控制的基因的转录能达到很高的水平。 T7噬菌体启动子的转录完全依赖于T7 RNA聚合酶，因此T7 RNA聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式。噬菌体DE3是λ噬菌体的衍生株，一段含有lacⅠ，lacUV5启动子和T7 RNA聚合酶基因的 DNA片段倍插入其int基因中，用噬菌体DE3的溶源菌，如BL21(DE3)、 HMS174(DE3)等作为表达载体的宿主菌，调控方式为化学信号诱导型，类似于Lac表达系统。 从开始涉及表达的时候可以根据是否要用基因本身的起始密码子进行选择，Novagen公司仅提供三个载体：-21(+)，-24(+)和 -23(+)。如果你打算利用载体的起始密码子，那么就有许多选择。 根据是否要可溶性表达，选择加有不同标记的载体。一般说来在大肠杆菌中不加标记外源蛋白都会以不溶的包涵体形式表达。为了让外源蛋白融合表达一般说来有三个策略： 1. 与一个高度可溶的多肽联合一起表达，比如：谷胱甘肽S转移酶 （glutathione S transferase, GST）、硫氧还蛋白 （thioredoxin, Trx）和N利用质A（N utilization substance A, NusA）。 2. 转入一个酶催化二硫键的形成，如：硫氧还蛋白，DsbA，DsbC。 3. 插入一个定位到周质空间的信号序列。 不同载体提供不同的标记，有的可以同时带有多个标记。如果你不希望在蛋白的N末端加入任何的多肽，你也可以选择用NdeⅠ直接从起始密码子后插入外源片断，或者在得到表达产物后利用蛋白氨基酸的酶切位点把多余的多肽切除。在重组技术上，Novagen除了传统的酶切、连接方式外，还有不需要连接的克隆方式：Ligation-Independent cloning，简称LIC。采用LIC方法的载体是线性化的，在末端有12-15个突出的碱基以在退火时和目的片断互补。在设计PCR扩增引物时加入与LIC载体互补的序列，PCR产物用3’→5’的内切酶消化出单链与载体互补的序列。通过这种方式就可以把目的片断定向、高效地插入LIC载体上。 一般的载体是先在不含DE3片段的菌株中进行克隆筛选，之后再把阳性克隆转化进入表达菌株，如BL21（DE3）中，通过IPTG诱导进行表达。而coco载体它引入了低拷贝控制元件，F附加体上的oriS和 repE元件与parABC 共同作用下使质粒在细菌中保持单拷贝，这样即可以使质粒在细菌内稳定存在又可以减少外源蛋白对细胞的毒害作用。当我们需要大量表达时加入树胶醛醣诱导trfA基因表达，质粒在细胞内的拷贝数就可以增加到25-50。coco载体同时兼容了DE3调控模型，在加入IPTG后诱导表达量达升高2500倍。 在保证质粒稳定性这一点上除了coco的方法还有另一种方法就是将重组质粒转化进入含有T7 RNA聚合酶抑制剂的T7溶菌酶表达基因的菌株中，在含有pLysS的pLysE宿主菌内重组质粒的本底表达被进一步抑制，质粒可以更稳定地存在。