西北大学
硕士学位论文
基于金磁微粒的化学发光免疫学检测梅毒螺旋体抗体方法的建
立
姓名：耿婷婷
申请学位级别：硕士
专业：生物化学与分子生物学
指导教师：陈超;崔亚丽
20090602
临床免疫学检验 1、免疫：是机体识别和排斥抗原性异物的一种生理功能 2、免疫防御（对外）；免疫自稳（防自身免疫病）；免疫监视（防肿瘤）。 3、中枢免疫器官：骨髓、胸腺；外周免疫器官：淋巴结、脾脏（最大）、黏膜相关淋巴组织 4、 B 细胞：通过识别膜免疫球蛋白来结合抗原，介导体液免疫；B细胞受体=BCR=mIg 表面标志：膜免疫球蛋白（SmIg）、 Fc 受体、补体受体、EB 病毒受体和小鼠红细胞受体。 成熟 B 细胞： CD19、CD20、 CD21、 CD22 （成熟 B 细胞的 mIg 主要为 mIgM和 mIgD）同时检测 CD5分子，可分为 B1 细胞和 B2 细胞。 B 细胞功能检测方法：溶血空斑形成试验（体液免疫功能）。 5、T 细胞：介导细胞免疫。共同表面标志是 CD3（多链糖蛋白）；辅助 T 细胞的标志是 CD4；杀伤 T 细胞的标志是 CD8； T 细胞受体 =TCR。 T 细胞和 NK细胞的共同表面标志是CD2（绵羊红细胞受体）； CD3＋ CD4＋CD8－ =辅助性T细胞（Th） CD3＋ CD4－CD8＋ =细胞毒性T 细胞（ Tc 或 CTL）（ T 细胞介导的细胞毒试验） CD4＋ CD25＋ =调节性T细胞（Tr或Treg） T 细胞功能检测：植物血凝素（ PHA）刀豆素（ CONA）刺激 T 细胞增殖。增殖试验有：形态 法、核素法。 T 细胞亚群的分离：亲和板结合分离法，磁性微球分离法，荧光激活细胞分离仪分离法 *E 花环试验是通过检测SRBC受体而对T 细胞进行计数的一种试验； 6、 NK细胞：具有细胞介导的细胞毒作用。直接杀伤靶细胞（肿瘤细胞和病毒感染的细胞） 表面标志： CD16（ ADCC）、 CD56。 测定人 NK细胞活性的靶细胞多用K562 细胞株，而测定小鼠胞株。NK细胞活性则常采 用 YAC-1 细 7、吞噬细胞包括：单核 - 吞噬细胞系统（MPS，表面标志外周血中的单核细胞和组织内的巨噬细胞）和中性粒细胞。CD14，包括骨髓内的前单核细胞、（表达 MHCⅡ类分子） 8、人成熟树突状细胞（DC）（专职抗原呈递功能）：表面标志为CD1a、CD11c和CD83。 9、免疫球蛋白可分为分泌型（ sIg ，主要存在于体液中，具有抗体功能）及膜型（ mIg，作为抗原受体表达于 B 细胞表面，称为膜表面免疫球蛋白） 10、免疫球蛋白按含量多少排序：IgG＞IgA＞IgM＞IgD＞IgE五类（按重链恒定区抗原性（CH）排序） 免疫球蛋白含量测定：单向环状免疫扩散法、免疫比浊法。 11、免疫球蛋白的同种型抗原决定簇位于恒定区（CH、CL） 12、抗体由浆细胞产生。抗体分子上VH和 VL（高变区）是抗原结合部位。
荧光和化学发光免疫分析方法 免疫分析是利用抗原抗体反应进行的检测方法，即利用抗原与抗体的特异性反应， 应用制备好的抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原。由于免疫的特异性结合，免疫分析方法具有很好的选择性，荧光免疫分析和化学发光免疫分析是其中典型的两种。本文将对这两种免疫分析方法进行详细的介绍。 一、免疫 免疫是指机体免疫系统识别自身与异己物质，并通过免疫应答排除抗原性异物，以维持机体生理平衡的功能。免疫是人体的一种生理功能，人体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏和排斥进入人体的抗原物质，或人体本身所产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，以维持人体的健康。 特异性免疫系统，是一个专一性的免疫机制，针对一种抗原所生成的免疫淋巴细胞（浆细胞）分泌的抗体，只能对同一种抗原发挥免疫功能。而对变异或其他抗原毫无作用。 1、抗原 1.1抗原的定义 抗原：是一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答(免疫原性) ，并能与相应抗体在体内或体外发生特异性结合的物质(免疫反应性)。 抗原一般为大分子物质，其分子量在10kD以上。 1.2抗原的分类
完全抗原：同时具有免疫原性和免疫反应性的抗原，如细菌、病毒、异种动物血清等。 半抗原：仅具有与相应抗原或致敏淋巴细胞结合的免疫反应性，而无免疫原性的物质。如大多数的多糖、类脂及一些简单的化学物质，它们本身不具免疫原性，但当与蛋白质大分子结合后形成复合物，便获得了免疫原性， 1.3抗原的性质 决定簇是指抗原分子表面的基团，它直接决定免疫学反映的特异性。 抗原通过抗原决定簇与相应淋巴细胞表面抗原受体结合，从而激活淋巴细胞，引起免疫应答，抗原也藉此与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合。 因此，抗原决定簇是被免疫细胞识别的靶结构，也是免疫反应具有特异性的物质基础。 2、抗体 2.1抗体的定义 抗体：是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白。 2.2抗体的结构 抗体是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞特别是浆细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白，因其具有免疫活性故又称作免疫球蛋白。 人免疫球蛋白有五类，分别为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。 3、抗原抗体的结合
梅毒螺旋体抗体胶体金法测定 1【目的】 定性检测血清或血浆中是否含有梅毒抗体 2【该SOP变动程序】 本标准操作程序的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并经下述人员批准：专业主管，科主任。 3原理 梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒（胶体金法）采用高度特异性的抗体抗原反应及免疫层析分析技术来定性检测血清/血浆中是否含有梅毒抗体，试剂盒含有被事先固定于膜上测试区（T）的重组特异性梅毒抗原和质控区（C）的相应抗体。 测试时，血浆/血清标本滴入试剂盒加样孔（S）内，血标本中的梅毒抗体与预包被在膜上的胶体金结合物反应。然后，混合物随之在毛细效应下向上层析，在测试区（T）与固定在膜上的重组特异性梅毒抗原反应。如果血清中含有抗梅毒抗体，在测试区内（T）会出现一条紫红色条带，表明时阳性结果。如果在测试区内（T）没有出现紫红色条带，则血标本中不含有抗梅毒抗体，表明是阴性结果。无论抗梅毒抗体是否存在于血标本中，混合物都会继续向上层析至质控区（C），质控区的相应抗体与胶体金结合物反应出现一条紫红色条带。质控区内（C）所显现的紫红色条带是判定层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。 4标本采集与处理： 4.1受检者准备： 4.1.1受检者的状态： a.不可变的生物因素：年龄，性别，生活环境遗传； b.可变的生物因素： A）情绪：原则上患者应在平静，休息的状态下以晨起空腹时采集标本，患者对采集标本时的恐惧、紧张会造成标本采集的失败。 B）运动：受检者应处于平静状态下采集标本，可减少由于运动带来的影响。 C）生理节律变化：昼夜的生理变化可能使测定结果不恒定，晨起固定时间空腹血尽可能减少昼夜节律带来的影响。 4.2采取标本时： A）体位：除非是卧床的病人，一般采血时取坐位。
医学免疫学复习……名词解释 1.免疫：是指机体免疫系统（immunity system，IS）识别“自我（self）”与“非我（non-self）” 抗原，从而维持内环境稳定的生理防御机制。 2.淋巴细胞再循环：是指淋巴细胞在血液、淋巴液、淋巴器官或组织间反复循环的过程。 3.抗原：是指能与TCR/BCR或抗体结合，具有启动免疫应答潜能的物质。或：指能够刺 激机体IS产生抗体或致敏淋巴细胞，并且能够与相应的抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合的物质。 4.抗原表位：是抗原分子中能与TCR/BCR及抗体特异结合的基本结构单位。是免疫应答 特异性的物质基础。 5.异嗜性抗原：指一类与种属无关的存在于人、动物、植物和微生物之间的共同抗原（或： 不同种属生物中存在的共同抗原表位），又名Forssman抗原。 6.佐剂：预先或与抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答类 型的非特异性免疫增强性物质。 7.超抗原：是指某些抗原物质，在极低浓度下即可激活大量的T细胞产生极强的免疫应答， 是一类多克隆激活剂。 8.共同抗原表位：不同抗原间的相同或相似决定基。 9.抗体：B淋巴细胞在抗原刺激下分化为浆细胞，产生的能与相应抗原发生特异性结合的 免疫球蛋白，称为抗体（Ab）。 10.免疫球蛋白：具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白统称为免疫球蛋白。 11.单克隆抗体：由单一克隆B细胞针对单一抗原表位产生的均一性的高特异性的抗体称 为单克隆抗体。 12.补体系统：是由补体、补体调节蛋白和相关膜蛋白（受体）共同组成的一个具有精密 调控机制的蛋白质反应系统。 13.过敏毒素：C3a、C5a被称为过敏毒素。它们可与肥大细胞或嗜碱性粒细胞表面的C3aR、C5aR结合，触发靶细胞脱颗粒，释放组胺和其他血管活性介质，介导局部炎症反应。 14.细胞因子：是由免疫原、丝裂原或其他因子刺激细胞（即活化的细胞）所产生的低分 子量可溶性蛋白质，具有调节固有免疫应答和适应性免疫应答，促进造血，刺激细胞活化、增殖和分化以及损伤组织修复等多种功能。 15.干扰素：由病毒或干扰素诱生剂刺激人或动物有核细胞产生的糖蛋白。具有抗肿瘤、 抗病毒及免疫调节的作用。 16.肿瘤坏死因子：是一类能使肿瘤发生出血、坏死的细胞因子。 17.集落刺激因子：指能刺激多能造血干细胞和不同发育分化阶段的造血祖细胞增殖、分 化的细胞因子。 18.白细胞分化抗原：造血干细胞在分化成熟为不同谱系、各个谱系分化不同阶段以及成 熟细胞活化过程中，出现或消失的细胞表面分子。 19.CD (cluster of differentiation): 应用以单克隆抗体鉴定为主的方法，将来自不同实验室的单克隆抗体所识别的同一分化抗原归为同一个分化群称CD。即用CD加同一阿拉伯数字表示。称为CD分子或CD抗原。 20.细胞粘附分子：泛指一类介导细胞与细胞间，细胞与细胞外基质（ECM）间相互接触和结合，起粘附作用的膜表面分子。 21.淋巴细胞归巢：成熟淋巴细胞离开中枢免疫器官后，经血液循环趋向性迁移并定居于 外周免疫器官或组织的特定区域，称为淋巴细胞归巢（定向迁移与居住）。 22.MHC：是“主要组织相容性复合体”的英文字头缩写。是由一群紧密连锁的基因群组成， 定位于动物或人某对染色体的特定区域，呈高度多态性。具有控制移植排斥、免疫应答和免疫调节等功能。 23.HLA：人类的主要组织相容性抗原，被称为HLA（human leukocyte antigen)抗原。人类的MHC，为编码HLA的一组紧密连锁的基因群，被称为HLA复合体/ HLA基因。定位于第6号染色体短臂上。 24.HLA和疾病关联：关联是指两个遗传学性状在群体中同时出现呈非随机分布。以相对风险率（RR）来评估。HLA和疾病关联是指带有某一特定HLA型别的个体，易患某一疾病（阳性关联）或对某一疾病有较强的抵抗力（阴性关联）。 25.连锁不平衡（linkage disequilibrium）：是指HLA基因复合体中，分属两个或两个以上基因座位的等位基因，同时出现在一条染色体上的几率高于（或低于）随机出现的频率的现象（HLA不同座位上的等位基因的非随机组合）。 26.HLA基因复合体的多基因性：是指在一个个体中，HLA复合体基因座位在数量上和 结构上具有多样性。 27.HLA基因复合体的多态性：是一个群体概念，是指群体中不同个体HLA等位基因拥 有状态上存在差别，是导致个体间免疫应答能力和对疾病易感性出现差异的主要免疫遗传学原因。 28.固有免疫：是生物体在长期种系发育和进化过程中逐渐形成的一系列防御机制。是机 体抵抗病原微生物的第一道防线，也是特异性免疫的基础。 29. ADCC：抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用。是一种细胞毒反应，指表达FcR的具有 杀伤活性的细胞（如NK、M-Mφ）通过识别Ab的Fc段直接杀伤被抗体包被的（带有Ag的）靶细胞（病毒感染细胞、肿瘤细胞、同种异体移植物）。 30.NKT细胞：在小鼠是指能够组成性表达NK细胞表面的CD56(小鼠NK1.1分子)和TCR-CD3复合受体分子的T细胞。它主要分布于骨髓、肝和胸腺。绝大多数为CD4-CD8-双阴性T细胞（DN），少数为CD4+单阳性T细胞（SP）。 31.初始T细胞：从未接受过Ag刺激的成熟的T细胞。 32.效应T细胞：执行细胞免疫效应的T细胞，CD45RO+T细胞，存活期短，高亲和力IL-2R 和粘附分子。 33.免疫球蛋白类别转换：在免疫应答中首先分泌IgM，但随后可表达IgG、IgA或IgE， 而其IgV区不发生改变，这种可变区相同而Ig类别发生变化的过程称为Ig的类别转换或同种型转换。 34.B1细胞：是指组成性表达CD5和单体IgM分子的B细胞。在胚胎肝脏发生和分化后 迁移到腹膜腔、胸膜腔和肠道固有层等部位，具有自我更新能力。 35.模式识别受体（pattern recognition receptor, PRR）:是指存在于固有免疫细胞表面或胞内器室膜上的一类能够直接识别病原微生物或宿主衰老、损伤和凋亡细胞表面的某些共有特定分子结构的受体。表达于固有免疫细胞表面的PRR称为膜型PRR，主要包括甘露糖受体、清道夫受体和Toll受体等。存在于血清中的PRR称为分泌型PRR，主要包括某些急性期蛋白如MBL和CRP等。 36.病原相关分子模式（pathogen associated molecular pattern,PAMP）:是PRR识别结合的配体，主要指病原微生物表面某些共有的高度保守的特定分子结构（如G-菌的脂多糖、G+的肽聚糖和脂磷壁酸等），也包括宿主凋亡细胞表面某些共有的特定分子结构如磷脂酰丝氨酸。 37.抗原提呈细胞（APC）：是指能够摄取、加工处理抗原，并将抗原肽提呈给T淋巴细胞的一类免疫细胞。如巨噬细胞、树突状细胞和B细胞等。（或：所有表达MHC分子并能处理和提呈抗原的细胞都称为APC。或：APC是指能够表达被特异性T淋巴细胞识别的Ag肽：MHC分子复合物的任何细胞。） 38.内源性抗原：指在APC内新合成的抗原，如病毒感染细胞合成的病毒蛋白等。 39.外源性抗原：并非由APC合成、来源于细胞外的抗原。 40.抗原提呈：是指转移至APC或靶细胞表面的Ag肽与MHC分子结合的复合物被提呈 给T淋巴细胞，并与T淋巴细胞表面的TCR结合为TCR-Ag肽-MHC三元体，从而活化T细胞的全过程。 41.T细胞抗原识别：初始T细胞膜表面的TCR与APC表面的抗原肽:MHC分子复合物特异结合的过程称为抗原识别，它是T细胞特异活化的第一步。 42.记忆性T细胞：是指对特异性抗原具有记忆能力、寿命较长的T淋巴细胞，参与再次免疫应答。 43.免疫耐受：机体免疫系统对某种抗原刺激表现为免疫不应答（即：不能产生特异免疫 效应细胞或/和特异性抗体）的现象。 44.中枢耐受：是指在胚胎期及出生后T与B细胞发育的过程中，遇到自身抗原所形成的 耐受。 45.外周耐受：是指成熟的T及B细胞，遇内源性或外源性抗原，不产生正免疫应答，而 显示免疫耐受。 46.耐受分离：是指口服Ag，经胃肠道诱导派氏集合淋巴结及小肠固有层B细胞，产生SIgA，发挥局部黏膜免疫效应，但却致机体对该Ag产生全身免疫耐受，这种现象称为耐受分离。 47.免疫忽视：是指对低水平或低亲和力的自身抗原不发生自身反应性免疫应答的现象。（或：自身应答T细胞（ART）克隆与相应组织特异性Ag并存，在正常情况下，不引起自身免疫病的发生，这种现象称为免疫忽视） 48.免疫隔离部位：是指体内某些与免疫系统在解剖位置上隔绝的部位，如脑、睾丸、眼的晶状体等。 49.超敏反应：指机体受到某些抗原刺激时，出现生理功能紊乱和/或组织细胞损伤的异常 适应性免疫应答。（或：抗原刺激引起免疫应答导致组织损伤和/或生理功能紊乱者。） 50.变应原：引起超敏反应的抗原。又叫过敏原。 51.自身免疫：是指机体免疫系统对自身细胞或自身成分发生免疫应答（即产生自身抗体 或致敏淋巴细胞）的现象。 52.自身免疫性疾病：因自身免疫应答而产生自身组织损伤或功能障碍，出现临床症状。 53.免疫缺陷病：免疫系统先天发育不全或后天损害而使免疫细胞的发育、分化、增殖和代谢异常，并导致免疫功能不全所出现的临床综合征。 54.肿瘤抗原：是指细胞癌变过程中出现的新抗原、肿瘤细胞异常或过度表达的抗原物质 的总称。 55.肿瘤特异性抗原：某种肿瘤细胞特有的或只存在于某种肿瘤细胞而不存在于正常细胞
三种梅毒螺旋体检测方法的临床评价 作者：凌聪作者单位：广东省南雄市人民医院检验科，广东南雄512400 【摘要】目的：探讨三种血清梅毒螺旋体检测方法的应用价值。方法:应用甲苯胺红不加热血清学试验(TRUST),酶联免疫吸附试验(ELISA)、梅毒螺旋体明胶凝集试验(TPPA)分别检测596份标本，其中57例确诊为梅毒感染。结果:ELLSA法与TPPA法检测结果之间无显著性差异(P > 0.05)，二者敏感性和特异性分别为94.7 %,98.1%和91.2%, 97.2%;TRWST与ELISA法、TPPA法之间有显著性差异(P< 0 .05)。结论:ELISA法和TPPA法在临床的诊断中是较好的血清梅毒螺旋体的检测方法。 【关键词】梅毒螺旋体; 甲苯胺红不加热血清学试验; 酶联免疫吸附试验; 梅毒螺旋体明胶凝集试验 Research on Three Method for Detecting Treponema Pallidum LING Cong The People's Hosptial of Nanxiong, Guangdong Nanxiong 512400, China Abstract: Objective: To explore three kinds of method for detecting treponema pallidum. Method: 596 specimens were detected with TRUST, ELLSA and treponema pallidum particle assay respectively, 57 of them infected treponema pallidum. Result: There's no significance difference between ELISA and TPPA method (P>0.05). The sensibility and specifity was 94.7%, 98.1% and 91.2%, 97.2& while, there's significant difference among TRUST, ELISA and TPPA (P<0.05). Conclusion: It's a good way to detect treponema pallidum with ELISA and PPPA method. Key words: Treponema pallidum; TRUST; ELISA TPPA 梅毒是一种经典的性传播疾病，梅毒螺旋体属于密螺旋体属苍白螺旋体的苍白亚种，是引起人类梅毒的病原体。其传染性强，危害性大，感染后可以引起全身各组织、器官的损害，危害较大。近年梅毒的发病呈上升趋势，因此对梅毒的早期诊断和及时治疗已成为当前重要问题，尤其对控制其蔓延至关重要。实验室如何更合理地选用检测方法，避免错诊、误诊、漏诊而产生医患纠纷等问题是非常必要的。为此，就如何更合理地利用甲苯胺红不加热血清学试验(TRUST)、梅毒酶联免疫吸附试验(ELISA)、梅毒螺旋明胶凝集试验(TPPA)三种不同方法为临床对梅毒的辅助诊断在此进行探讨。我们对2007年1月至2007年12月门诊和妇产科采集的596份标本采用甲苯胺红不加热血清学试验(TRUST)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、梅素螺旋体明胶凝集试验(TPPA)方法进行梅毒检测，结果分析如下。 1 对象与方法 1.1 一般资料：本组596例，男134例，女462例，年龄25～70岁;均为我院皮肤科、外科门诊就诊患者和妇产科住院病人。根据2000年中国卫生部防疫司颁布的性病诊断标准，其中57例临床确诊为梅毒感染。 1.2 方法：596份标本分别采用TRUST,TPPA,ELISA三种方法检测，检测所用试剂在有效期内使用，严格按照试剂操作说明书操作。 1.3 试剂与仪器：①TRUST 试剂由上海荣盛生物技术有限公司提供、仪器使用江苏省姜堰市天力医疗器械TL-2000A型梅毒自动旋转仪；②TPPA 试剂由日本富士欧必株式会社提供；③ELISA 试剂由为厦门新创科技有限公司提供、仪器使用美国生产的Stat fax-2100酶标仪和Stat fax-2600洗板机。 1.4 统计学方法：应用S PS S14.0统计软件，不同方法间的比较采用X2检验。 2 结果
免疫学检验试题（一） 1. 免疫监视功能低下时易发生（）。 A．自身免疫病 B．超敏反应 C．肿瘤 D．免疫缺陷病 E．移植排斥反应答案C 解析免疫系统的功能之一是对自身偶尔产生的有癌变倾向的细胞进行清除，此即免疫监视功能，免疫监视功能低下时易发生肿瘤。 2. 免疫自稳功能异常可发生（）。 A．病毒持续感染 B．肿瘤 C．超敏反应 D．自身免疫病 E．免疫缺陷病答案D 解析免疫系统的功能之一是对自身衰老的组织细胞进行清除，即免疫自稳功能，免疫自稳功能异常可发生自身免疫病。 3. 既具有抗原加工提呈作用又具有杀菌作用的细胞是（）。A．树突状细胞 B．巨噬细胞
C．中性粒细胞 D．B 细胞 E．T 细胞答案B 解析树突状细胞、巨噬细胞和B 细胞都有抗原加工提呈作用，但只有巨噬细胞兼有吞噬杀菌作用。 4. 免疫应答过程不包括（）。 A．T 细胞在胸腺内分化成熟 B．B 细胞对抗原的特异性识别 C．巨噬细胞对抗原的处理和提呈 D．T 细胞和B 细胞的活化、增殖和分化 E．效应细胞和效应分子的产生和作用答案A 解析免疫应答过程指免疫系统针对抗原的反应过程，不包括免疫细胞的发育过程。 5. 关于外周免疫器官的叙述，不正确的是（）。 A．包括淋巴结、脾和黏膜相关淋巴组织 B．发生发育的时间晚于中枢免疫器官 C．是免疫应答发生的场所 D．是免疫细胞发生和成熟的场所 E．是所有淋巴细胞定居的场所答案D 解析免疫细胞发生和成熟的场所在中枢免疫器官，故 D 项不正确。
5. 在正常血清中，含量最高的补体成分是（）。 A．C1 B．C3 C．C4 D．C5 E．C4Bp 答案B 解析在正常血清中含量最高的补体成分是C3。 7. 细胞因子不包括（）。 A．单核因子 B．淋巴因子 C．生长因子 D．抗体 E．集落刺激因子答案D 解析细胞因子是生物活性的小分子多肽，抗体不是。 8. 体内抗病毒、抗毒素、抗细菌最重要的抗体为（）A．IgM B．IgA C．IgG D．IgE E．IgD 答案C 解析IgG 是体内抗感染的最主要的抗体。
化学发光免疫分析技术原理简介 20 世纪60 年代即有人利用化学发光法测定水样中细菌含量和菌尿症患者尿液检查。1977 年Halman 等将化学发光系统与抗原抗体反应系统相结合，创建了化学发光免疫分析法，保留了化学发光的高度灵敏性，又克服了它特异性不足的缺陷。近年来对技术与仪器的不断改进，使此技术已成为一种特异，灵敏，准确的自动化的免疫学检测方法。1996 年推出的电化学发光免疫技术，在反应原理上又具有一些新的特点。这两种技术目前已在国内一些大型医院实验室用于常规免疫学检验。 一、化学发光免疫分析法 化学发光免疫分析法( chemiluminescence immunoassay , CLlA) 是把免疫反应与发光反应结合起来的一种定量分析技术，既具有发光检测的高度灵敏性，又具有免疫分析法的高度特异性。在CLIA中，主要有两个部分，即免疫反应系统和化学发光系统。免疫反应系统与放射免疫测定中的抗原抗体反应系统相同化学发光系统则是利用某些化合物如鲁米诺( luminol) 、异鲁米诺(isolu-minol) 、金刚烷( AMPPD) 及吖啶酯( AE) 等经氧化剂氧化或催化剂催化后成为激发态产物，当其回到基态时就会将剩余能量转变为光子，随后利用发光信号测量仪器测量光量子的产额。将发光物质直接标记于抗原(称为化学发光免疫分析)或抗体上(称为免疫化学发光分析) ，经氧化剂或催化剂的激发后，即可快速稳定的发光，其产生的光量子的强度与所测抗原的浓度可成比例。亦可将氧化剂(如碱性磷酸酶等)或催化剂标记于抗原或 抗体上，当抗原抗体反应结束后分离多余的标记物，再与发光底物反应，其产生的光量子的强度也与待测抗原的浓度成比例。发光免疫分析的灵敏度高于包括RIA 在内的传统检测方法，检测范围宽，测试时间短，仅需30 - 60min 即可。试
梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒（胶体金法） [产品名称] 通用名称：梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒（胶体金法） 英文名称：Diagnostic Kit for Antibody to Treponema Pallidum（Colloidal Gold） [包装规格] 一人份/袋，100袋/盒；25人份/筒，100人份/盒；单支/袋，50支/盒。 [临床意义] 快速检测人血清或血浆中的梅毒螺旋体特异性抗体。 [检验原理] 应用免疫层析式双抗原夹心法原理 [主要组成成份] 由纯化的基因重组梅毒螺旋体（Treponema Pallidum）抗原，免疫重组梅毒螺旋体抗体，固相硝酸纤维膜，胶体金交联的重组梅毒螺旋体抗原及其他试剂制成。 [储存条件及有效期] 4-30℃避光干燥处密封储存，切勿冰冻。有效期24个月。 [样本要求] 采集静脉血1-2ml与干净容器中分离出血或血浆样本，如不及时测定可置4℃冰箱贮存，超过三天应加入0.1%硫柳汞防腐，不可使用冻干样本。 [检验方法] 1、待测样本、检测试纸或其他检测用材料等均在室温平衡后取出试纸条或测试卡。 2、条型产品将测试条有剪头的一段插入血清或血浆样本容器中，约10秒后取出平放，15 分钟内观察显示结果。测试纸插入样本深处不可超过MAX标志线。 3、板型产品用所配滴管加2-3滴（约80μl-120μl）样本于加样孔中，15分钟在观察孔中 观察显示结果。 [检验结果的解释] 阳性：在检测线位置及对照线位置各出现一条反应线。 阴性：仅在对照线位置出现一条反应线。 无效：测试纸无反应线出现或仅在检测线位置出现一条反映现，表明试验失败或检测试纸失效。请用新测试纸重试。如果问题仍然存在，请停止使用本批产品，并与当地经销商联系。[试验方法的局限性] 1、由于技术上和操作上可能出现的失误，以及样本中可能存在的干扰物质，会导致错误的 结果。对可疑结果请重新测试。 2、本试剂只是定性的筛查梅毒螺旋体特异性抗体的存在，它不能确定被测物在样本中的具 体含量。 3、本试剂仅是一种临床辅助诊断工具，如结果呈阳性，请及时采用其他方法做进一步检查 并以医师诊断为准。 [产品性能指标] 测试临床2400多人份临床血清/血浆样本，并与临床所用确诊试剂比较，结果证明该产品的临床诊断灵敏度为98.6%，临床诊断特异性为99.7%。 [注意事项] 1、本品为一次性使用体外诊断试剂，应在有效期内使用。
一、名词解释 第1章概论 1.免疫学： 2.免疫分子： 3.补体： 4.临床免疫学： 第2章抗原抗体反应 5.抗原抗体反应： 6.抗原抗体反应特异性 7.可逆性 8.比例性 9.抗原抗体反应的等价带（zoneofequivalence） 10.最适比（optimalratio） 11.带现象（zonephenomenon） 第3章免疫原和抗血清的制备 12.免疫原(immunogen)
13.半抗原 14.免疫佐剂 15.多克隆抗体(polyclonal antibody, pcAb) 第5章凝集反应 16.凝集反应 17.直接凝集反应 18.间接凝集反应 19.明胶凝集试验 第6章沉淀反应 20.沉淀反应 21.絮状沉淀试验 22.免疫浊度测定 23.凝胶内沉淀试验 24.单项扩散试验
25.双向扩散试验 26.免疫电泳技术 27.对流免疫电泳 28.火箭免疫电泳 29.免疫电泳 30.免疫固定电泳 第19章补体检测及应用 31.补体 32.免疫溶血法 33.补体结合试验 第22章感染性疾病与感染免疫检测34.感染 第23章超敏反应性疾病及其免疫检测35.超敏反应
36.Ⅰ型超敏反应 37.Ⅱ型超敏反应 38.Ⅲ型超敏反应 39.Ⅳ型超敏反应 第24章自身免疫性疾病及其免疫检测 40.自身耐受 41.自身免疫 42.自身免疫病 43.自身抗体 44.抗核抗体 第25章免疫增殖性疾病及其免疫检测 45.免疫增殖性疾病 46.免疫球蛋白增殖病 47.本周蛋白
48.血清区带电泳 49.免疫电泳 50.免疫固定电泳 第26章免疫缺陷性疾病及其免疫检验 51.免疫缺陷病 52.获得性免疫缺陷综合征 第27章肿瘤免疫与免疫学检验 53.肿瘤免疫学 54.肿瘤抗原 55.肿瘤标志物 第28章移植免疫及其免疫检测 56.移植 57.主要组织相容性复合体 58.移植排斥反应
罗氏电化学发光免疫分析 技术是罗氏公司开发的,但全自动机械制造却由日本的日立公司承担,所以仪器上还有Hitachi的标志。这个仪器让大家吃惊的一大原因就在于一直在实验室研究的电致化学发光居然已经真正地产业化了,其中我们一直无法解决的诸多问题(尤其是重现性均已得到解答,看来罗氏的确花了不少心血开发这款仪器。 罗氏电化学发光免疫分析技术的性能特点——创新的技术,与众不同 一、最先进的检测原理 电化学发光免疫测定,是目前最先进的标记免疫测定技术,是继放射免疫、酶免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定以后的新一代标记免疫测定技术,具有敏感、快速和稳定的特点,在固相标记免疫测定中技术上居领先地位。 电化学发光(ECL是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应,实际上是电化学和化学发光两个过程的完美结合。电化学发光与普通化学发光的主要差异在于前者是电启动发光反应,循环及多次发光,后者是通过化合物混合启动发光反应,是单次瞬间发光。因此ECL反应易精确控制,重复性极好。 电化学发光免疫测定是电化学发光(ECL和免疫测定相结合的产物,直接以[Ru(bpy3]2+标记抗体,反应时标记物直接发光。且[Ru(bpy3]2+在电极表面的反应过程可以周而复始进行,产生许多光子,使光信号得以增强。 二、专利的包被技术 链霉亲和素(streptoavidin,SA和生物素(biotin,B是具有很强的非共价相互作用的一对化合物,特异性强且结合紧密。一分子SA可与四分子B 相结合,增大了抗体结合量,达到放大效果。在ECL的试剂中,SA通过特殊的蛋白结合物均匀牢固地包被在磁性微粒上,形成通用的能与B结合的固相载体,另一试剂为活化的B衍生物化合的抗原或抗体。两种试剂混合时,抗原或抗体即包被在磁性微粒上。 三、独特的载体
医学免疫学模拟试题及答案(一) 1 同种异型抗原（ A） A．同一种属不同个体间的遗传标记不同 B．同一种属的所有个体分布相同 C．是定义同种类型蛋白的抗原 D．不能诱导同一种属动物间的免疫应答 E．在免疫球蛋白中，只限于 2．与抗原结合后，激活补体能力最强的是（E ） A．2 B．3 C． D． E． 3．哪两类的H 链有4 个功能区：（B ） A．和 B．和 C．和 D．和 E．和 4．在旁路激活途径中C3 转化酶是（A） 5b6789n 4b2b3b 4b2b 3 5b678 5．半抗原：（D ） A．只有和载体结合后才能和抗体分子特异结合 B．是大分子物质C．通常是多肽D．本身没有免疫原性E．本身没有抗原 6 .①外源性抗原的递呈，②胸腺内阳性选择，③细胞杀伤过程，④巨噬细胞对抗原的加工上述哪些过程与限制性有关（A） A.①+② B.②+③ C.①+③ D.②+④ E.①+④ 7.补体系统经典途径激活的顺序是D 12345-9 13245-9 C. C14325-9 14235-9 12453-9 8.抗体与抗原结合的部位是( B ) 区区区 区区 9．下列哪种作用特点是细胞因子所不具备的（ E ） A．网络性B．重叠性C．多效性D．高效性E．特异性 10．人类的定位的染色体是D A．第9 对染色体B．第17 对染色体C．第2 对染色体D．第6 对染色体 E．第22 对染色体 11．兄弟姐妹间进行器官移植引起排斥反应的物质是（ C ） A．异种抗原B．自身抗原 C．同种异体抗原D．异嗜性抗原E．超抗原 12．可被胃蛋水解酶切成为B A.2 段段 (’)2 段′段 C.2 段′段 段段 (’)2 段段 13．免疫对机体（ C ） A．正常情况下有利，某些条件下造成损伤B．有利C．有利也有害 D．有害E．无利也无害
梅毒螺旋体特异性抗体检测 1.实验原理 梅毒的病原是苍白螺旋体（TP），感染后患者血清学反应较复杂，可产生2种抗体，一种是非梅毒螺旋体抗体；另一种是TP特异性抗体。前者在疾病活动期可检出，但治疗后很快下降，一般用RPR等检测。后者在治疗后相当长时间内都可检测到。Syphagen-TPHA是一种检测TP抗体的特异、灵敏的间接血球凝集试验。适用于梅毒 确诊检查。 2. 标本采集 2.1 标本采集前病人准备：空腹采血 2.2 标本种类：血清或EDTA抗凝血浆 2.3 标本要求：检测标本可以是血清，对于大范围筛选实验，也可用含EDTA的血浆。如果出现可疑结果，用血清标本来确证。用含抗凝剂（EDTA）的试管收集血液，离 心收集血浆，在24小时内检测。 3. 标本储存：血清于2-8℃可存放48小时，在-20℃可存放4周；血浆则用含抗凝 剂（EDTA）的试管收集血液，离心收集血浆，在24小时内检测。 4. 标本运输：室温运输。 5. 标本拒收标准：溶血、脂血或污染标本。 6. 试剂 6.1 试剂名称：梅毒螺旋体抗体诊断试剂 6.2 试剂生产厂家：（日本）富士瑞必欧珠式会社 6.3 包装规格：100人份 6.4 试剂盒组成：溶解液，血清稀释液，致敏粒子，未致敏粒子，阴性对照血清， 阳性对照血清，滴管2支，使用说明书。 6.5 试剂储存条件及有效期 6.6存放于2-10℃，有效期为12个月，不同批号的试剂不得混用。 7. 操作步骤
7.1.1 每人份需4个孔，其中2个用于样品稀释。在第1个孔中加100ul（4滴）稀释液，在第2孔至第4孔中各加25ul（1滴）稀释液。 7.1.2 在第1孔加入25ul标本后，混匀后取25ul加入第2孔，混匀后取25ul加入第3孔，混匀后取25ul丢弃。 7.1.3 在第3孔加25ul（1滴）未致敏粒子；在第4孔加25ul致敏粒子。 7.1.4 轻轻摇晃混匀后，加盖静置于室温，120分钟后观察结果。 7.2 定量检测 7.2.1在第1个孔中加100ul（4滴）稀释液，在第2孔至最后一孔中各加25ul（1滴）稀释液。 7.2.2 在第1孔加入25ul标本，混匀后取25ul加入第2孔，混匀后取25ul加入第3孔，以同样的方式稀释至最后一孔，最后一孔混匀后取25ul丢弃。 7.2.3 在第3孔加25ul（1滴）未致敏粒子；在第4孔至最后一孔分别加25ul致敏粒子。 7.2.4 轻轻摇晃混匀后，加盖静置于室温，120分钟后观察结果。 8. 结果判断与分析 8.1 －粒子成纽扣状聚集，呈现出外周边缘均匀且平滑的圆形 8.2 ±粒子形成小环状，呈现出外周边缘且平滑的圆形 8.3 ＋粒子环明显变大，其外周边缘不均匀且杂乱地聚集在周围 8.4 ＋＋产生均一的聚集，凝集粒子在底部整体上呈膜状延展 未致敏粒子（最终稀释倍数1：40）的反应图像判定为阴性，致敏粒子（最终稀释倍数1:80以上）的反应图像判定为阳性时，最终判定为阳性。 9. 临床意义：如结果为阳性，说明有梅毒抗体，曾经受到梅毒的感染；如果结果为阴性说明不含梅毒抗体；如果出现临界结果，说明梅毒抗体水平低，处于梅毒早期阶段，或者是预后残留有抗体，并应进一步检查。 10. 操作性能：快速简便、特异性强、灵敏度高 11. 方法局限性：严重溶血或脂血标本会影响结果判断
抗体 Antibody discovery 20世纪30年代，从血浆中分离出活性抗体。同时证明抗体是γ球蛋白。Immunoglobulin (Ig) 即免疫球蛋白 是指具有抗体活性，或化学结构与抗体相似的所有球蛋白。 抗体：是机体免疫细胞被抗原激活后，由分化成熟的终末B细胞（即浆细胞）所合成并分泌的一类能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。 Ab是重要的免疫分子，主要存在于血液、体液和粘膜分泌液中，介导体液免疫的重要效应分子。 Ab=Ig Ig≠Ab (Ab是功能描述，Ig是化学结构描述) Discovery structure of antibody 1959年，分别对抗体研究发现： ⑴抗体有四链组成； ⑵其氨基端结合抗原，决定抗原结合特异性；其羧基端不能结合抗原。 ⑶抗体可变区是与其抗原结合的部位。 Basic structure of Ab (1) 四条肽链的对称结构 (2) 两条重链（H）和两条轻链（L）借二硫键而彼此连接在一起，呈Y字形 (3) H链和L链分为氨基端(N) 和羧基端(C) 轻链(Light chain, L): ⑴由214个氨基酸组成，分子量为25kDa。 ⑵根据其结构和恒定区抗原性可分为两型: κ、λ型。 ⑶它们在组成人各类Ig时比例都约为2:1。 ⑷根据λ链恒定区AA不同，可分为四个亚类λ1～4。 重链(Heavy chain, H): ⑵由450～550个氨基酸组成，分子量为50 ~75kDa。 ⑵根据重链恒定区抗原性的不同，分为：γ、α、μ、δ、ε。 ⑶由它们组成的Ig分别为：IgG 、IgA、IgM、IgD、IgE。 ⑷根据链内结构又分为不同亚类IgG1-4，IgA1-2。
免疫学检查 免疫学检查是什么 1、免疫学检查是机体识别“自身”与“非己”抗原，对自身抗体形成天然免疫耐受，对非己抗原产生排斥作用的一种生理功能的检测。正常情况下，这种生理功能对机体有益，可产生抗感染、抗肿瘤等维持机体生理平衡和稳定的免疫保护作用。在一定条件下，当免疫功能失调时，也会对机体产生有害的反应和结果，如引发超敏反应、自身免疫病和肿瘤等。 2、血清免疫学检测，是主要的免疫学检查。检查内容主要为：免疫球蛋白G（IgG），免疫球蛋白A（IgA），免疫球蛋白M（IgM），免疫球蛋白D（IgD），免疫球蛋白E（IgE），心肌肌钙蛋白T（cTnT），肌红蛋白（Mb），类风湿因子（RF）。部分男性因为出现免疫性不育，即体内存在非正常的精子抗体，可以通过免疫学检查来诊断并对症治疗。 3、不孕不育的免疫学检查包括男性抗精子自身免疫不育、女性抗精子同种免疫不育和女性抗透明带免疫不育。用免疫学技术来检测精浆和血清中抗精子抗体，是了解男性不育原因的重要手段之一。 免疫学检查的意义与适应症 免疫学检查的意义在于检查不明原因的不孕不育男女。精子具有抗原性，在一定条件下能诱发特异性抗精子抗体产生，用免疫学方法检测原因不明的不育男女，发现有部分不育男性血清和（或）精浆、女性血清和（或）宫颈粘液中存在抗精子抗体，所以，目前公认抗精子抗体是免疫不育的重要原因。 检测抗精子抗体，除检测血清中抗体外还要注意生殖道内产生的局部抗体，如精浆和宫颈粘液中的抗体。抗精子抗体的检测方法很多，可能结果会不尽相同，应尽量采用新的、标准化的方法测定，结合病史和其他指标做综合判断。 免疫学检查的适应症是针对男性出现不育以及女性出现不孕的情况。当免疫学检查中如果出现异常结果，通过多项免疫学检查说明不孕不育，则需要进行针对性的治疗。 免疫学检查项目 免疫学检查项目包括免疫球蛋白G（IgG），免疫球蛋白A（IgA），免疫球蛋白M（IgM），免疫球蛋白D（IgD），免疫球蛋白E（IgE），心肌肌钙蛋白T（cTnT），肌红蛋白（Mb），类风湿因子（RF）。 免疫学检查项目：免疫球蛋白G 正常参考值：IgG 7.0-16.6克/升（7.0-16.6g/L） 意义： （1）IgG增高： ① IgG、IgA、IgM在机体的防御中发挥重要作用。若IgG、IgA、IgM几种不同的免疫
常见化学发光免疫分析技术比较 1、化学发光免疫分析 化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay，CLIA)，英音：[,kemi,lju:mi'nes?ns] [,imju:n?u?'sei] 是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。 CLIA是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。 1.1、化学发光免疫分析原理 化学发光免疫分析包含两个部分, 即免疫反应系统和化学发光分析系统。化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化, 形成一个激发态的中间体, 当这种激发态中间体回到稳定的基态时, 同时发射出光子(hv) , 利用发光信号测量仪器测量光量子产额。免疫反应系统是将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体) 直接标记在抗原(化学发光免疫分析) 或抗体(免疫化学发光分析) 上, 或酶作用于发光底物。 1.2、化学发光免疫分析类型
化学发光免疫分析法以标记方法的不同而分为两种: (1)化学发光标记免疫分析法; (2)酶标记、以化学发光底物作信号试剂的化学发光酶免疫分析法 1.2.1化学发光标记免疫分析 化学发光标记免疫分析又称化学发光免疫分析(CL IA ) , 是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法。常用于标记的化学发光物质有吖啶酯类化合物-acridiniumester (AE) , 是有效的发光标记物，其通过起动发光试剂(NaOH-H2O2) 作用而发光, 强烈的直接发光在一秒钟内完成, 为快速的闪烁发光。吖啶酯作为标记物用于免疫分析, 其化学反应简单、快速、无须催化剂; 检测小分子抗原采用竞争法, 大分子抗原则采用夹心法, 非特异性结合少, 本底低; 与大分子的结合不会减小所产生的光量, 从而增加灵敏度。 1.2.2化学发光酶免疫分析 从标记免疫分析角度, 化学发光酶免疫分析(chemiluminescent enzyme immunoassay，CLEIA ) , 应属酶免疫分析, 只是酶反应的底物是发光剂, 操作步骤与酶免分析完全相同: 以酶标记生物活性物质(如酶标记的抗原或抗体) 进行免疫反应, 免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物, 在信号试剂作用下发光, 用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP) 和碱性磷酸酶(AL P) , 它们有各自的发光底物。 12.2.1HRP 标记的CLEIA
自身免疫病中多种自身抗体的检测及分析【摘要】目的：通过对自身免疫病患者常用自身抗体的综合检测、分析，评价其在自身免疫病中的意义及价值。方法：选取临床上已确诊为自身免疫病患者216例作为疾病组（其中SLE患者102例，RA患者54例，MCTD患者18例，SS患者16例，PSS患者16，PM/DM患者10例），健康体检者30例作为对照组，抽取血液，分离血清，分别采用间接免疫荧光法、欧蒙免疫印迹法和ELISA法检测ANA、抗ds DNA、ENA多肽谱、RF。结果：6种自身免疫性疾病中，RF的阳性检出率以类风湿性关节炎（RA）患者为最高（74.2%），干燥综合症（SS）患者次之（62.5%），而多发性皮肌炎（PM/DM）患者中未检出；ANA在6种自身免疫病患者中均有较高的阳性检出率，以系统性红斑狼疮（SLE）患者为最高（94.1%），混合性结缔组织病（MCTD）患者次之（88.9%），RA患者最低（33.3%）；抗ds DNA则只在2种自身免疫病患者中检出，其中SLE患者阳性检出率最高（80.4%），而RA患者较低（3.7%）；6种自身免疫病患者中，ENA多肽谱的各种抗体的检出率差别较大，其中，抗SSA/R0均有检出，但阳性率不高（均低于40.0%），而抗Histones只在SLE患者中有检出，抗Scl70只在系统性硬皮病（PSS）患者中有检出，抗J01则只在PM/DM患者中有检出，但抗U1snRNP 则在MCTD患者中检出率较高（88.9%），抗Centromere均无检出。结论：自身免疫病患者同时检测多种自身抗体有助于疾病的特异性诊断和筛查。
【关键词】 RF； ANA；抗ds DNA； ENA多肽谱；自身免疫病 ［ABSTRACT］Objective: To evaluate the significance of multiple autoantibody detection and analysis in the process of diagnosing and screening autoimmune diseases. Methods: 216 cases of autoimmune diseases were compared with 30 health volunteers. 102 out of these cases are SLE, 54 are RA, 18 are MCTD, 16 are SS, 16 are PSS and 10 are PM/DM, Autoantibody including ANA, anti ds DNA, ENA antibodies and RF were detected. Results: Among six kinds of autoimmune diseases mentioned above, RA has the highest positive rate of RF (74.2%) followed by SS (62.5%). On the contrary, in PM/DM, RF was detected as negative. SLE has the highest positive rate of ANA (94.1%) followed by MCTD (88.9%) and RA (33.3%). Anti ds DNA was only detected in SLE and RA with a positive rate of 80.4% and 3.7%, respectively. The positive rates of ENA antibodies in autoimmune diseases are obvious different among each other. Conclusion: Detection of multiple autoantibodies is a useful way of diagnosis and screening autoimmune diseases. ［KEY WORDS］ RF； ANA； Anti ds DNA； ENA antibodies；Autoimmune diseases