第29卷第2期2011年4月
海洋科学进展
AD VA N CES IN M A RIN E SCIEN CE
V o l.29 N o.2
A pril,2011
2008年黄海浒苔绿潮ISSR标记溯源分析*刘晨临1,王秀良2,刘胜浩1,丛柏林1,黄晓航1,王宗灵1,
林学政1,臧家业1
(1.国家海洋局第一海洋研究所海洋生态中心,山东青岛266061;2.中国科学院海洋研究所,山东青岛266071)
摘 要:利用简单序列重复区间扩增多态性标记(ISSR),对2008年绿潮暴发期间我国黄海近海漂浮浒苔样品,以及青岛、大丰和温州等地对虾养殖池塘的浒苔样品进行种群间亲缘关系分析。结果表明青岛海域的漂浮绿潮浒苔与南黄海海域的漂浮绿潮浒苔遗传相似度达到0.95,应属于同一个种;此外沿海养殖池塘间尽管存在地理间隔,
ISSR标记分析表明其生长的浒苔亲缘关系很近,应属于同一种类;尽管养殖池塘生长的浒苔与暴发漂浮浒苔形态极其相似,但ISSR标记遗传分析显示两者遗传距离较远,应属于不同种类。因此,认为暴发绿潮浒苔的最初来源不是对虾养殖池塘内生长的浒苔。
关键词:绿潮;浒苔;ISSR;分子标记溯源
中图分类号:Q786 文献标识码:A 文章编号:1671 6647(2011)02 0235 06
2008年5月在黄海南部暴发、6月中旬开始在青岛沿海高密度聚集的浒苔绿潮是至今我国海域面积最大、危害最为严重的一次绿潮。该次绿潮影响海域面积超过2 104km2,浒苔总生物量达100 104t,仅青岛近海就打捞超过79 104t,是一次世界少见的严重绿潮事件[1]。丁兰平等根据该绿藻的形态等特征,鉴定其为绿藻门石莼目石莼科浒苔属的浒苔,学名为Enter omor p ha p rolif era[2]。它属于广温、广盐、耐干露性强的大型海藻,为世界性藻类,生长于世界海洋、河口以及海陆结合部的咸淡水交汇生境中。自然分布于俄罗斯远东海岸、日本群岛、马来群岛和欧洲沿岸等海域。我国各海区均有分布,属东海海域优势种,是青岛的习见种[3]。此前,绿潮在我国因危害较少未受到重视,目前关于此次近海绿潮形成原因、暴发过程还不甚明确。因此研究此次绿潮暴发时不同海域浒苔的地理亲缘关系,将有助于了解绿潮的起源,为以后的防灾、减灾工作提供帮助。
分子标记的手段已经被广泛地应用于海藻的群体遗传学、生物地理系统学、亲缘关系鉴定、杂种优势和种质鉴定等项研究中。相对于其它分子标记手段,简单序列重复区间扩增多态性标记(ISSR)的技术难度、可重复性以及成本都处于中等水平;ISSR利用人工合成的16~18个核苷酸重复序列作为引物,在引物的3 端或5 端加上2~4个随机选择但通常是简单的核苷酸,对简单重复序列之间的DNA序列进行PCR扩增;相比较其它DN A分子标记方法,ISSR的引物设计简单,不需知道所研究目标物种的基因组序列信息即可用引物进行扩增,具有多态性高、重复性好等特点[4]。ISSR分子标记技术在藻类方面已被广泛应用于物种遗传多样性的检测、地理种群变异的分析和种群间的亲缘关系的研究[5]。
关于黄海绿潮暴发的最初种子来源有许多假设。一些研究倾向于其来源于沿海分布的大量水产养殖池,这些养殖池通过排水和纳水闸门与外海相连,提供了绿潮暴发的营养盐等物质条件的同时,也很可能提供了绿潮种子来源[6]。刘峰等通过IT S rDNA和r bc L序列分析结合形态学鉴定,认为从江苏沿海的养殖池塘中发现了与黄海绿潮优势种及其相近甚至完全一致的石莼属海藻,但他同时表示仍缺乏直接的证据以证
*收稿日期:2010 04 14
资助项目:国家重点基础研究发展计划 我国近海藻华灾害演变机制与生态安全(2010CB428703);我国近海海洋综合调查与评价专项 生物生态补充调查(908 01 CB23)
作者简介:刘晨临(1974 ),女,山东滨州人,博士,研究员,主要从事藻类分子生物学方面研究.
(高 峻 编辑)
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海 洋 科 学 进 展29卷明黄海绿潮最初来源于水产养殖池[6]。我们运用简单序列重复区间扩增多态性标记(ISSR)技术,对我国黄海近海漂浮绿潮浒苔样品,与其它几个沿海区域对虾养殖池溏的浒苔样品进行了遗传相似性研究,拟对2008年暴发的浒苔绿潮进行溯源分析。
1 材料与方法
1.1 材料来源
实验所用材料为2008年绿潮暴发前后在不同地区采集的浒苔样品,样品信息详见表1。样品现场采集后选取颜色鲜绿健康的藻株放入塑料袋中,青岛本地样品采集后立即带回实验室,外地样品采集后,置于加冰袋的保温箱中低温保存,然后送到实验室,所有样品置于-20 冰箱冻存。
表1 浒苔样品信息
T able1 T he infor mation of E ntero mor p ha sp.samples
样品名称采样地点采样时间样品数量/株
山东省青岛市沿岸样品(QD)青岛沿岸的栈桥、第一海水浴场、奥帆基地、
石老人海水浴场以及大公岛沿岸海区的海
上漂浮样品
2008 07绿潮在青岛沿海
大规模暴发时
12
山东省日照市沿岸样品(RZH)包括日照沿海海上漂浮样品(RZH1)和固着
生长在岩石上的样品(RZH2)
2008 06下旬,绿潮在日
照海域还未严重暴发时
13
南黄海区域海上调查样品(LYG)大丰、连云港海域至胶南海域漂浮样品2008 07下旬16浙江省宁波市沿岸样品(NB)宁波市象山港漂浮样品2008 06下旬2山东省青岛市红岛虾池样品(QDS)红岛养虾池底沉或漂浮样品2008 07下旬8江苏省盐城市大丰虾池样品(DFS)大丰市养殖虾池漂浮样品2008 07中旬10浙江省温州市虾池样品温州地区虾池漂浮样品2008 06下旬7
1.2 DNA提取
每份样品选取单株藻体置入灭菌平皿中,经无菌蒸馏水清洗后,吸水纸吸干,液氮研磨后,用植物基因组试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取基因组DNA。经凝胶电泳检测合格后,用于ISSR扩增。
1.3 PCR扩增、条件优化和检测
ISSR引物由上海博亚生物技术有限公司合成,从20条引物中筛选出3条扩增条带清晰的引物(表2)。扩增反应使用T aqmix(北京天根生化科技有限公司):25 L反应体系包括2 Taqm ix,12.5 L,随机引物1 L,模板DNA1 L(约20ng)和双蒸水10.5 L,PCR扩增温度循环:95 预变性5m in;94 变性45 s,48 (或52 )复性45s,72 延伸1min,循环40次;72 反应10min。PCR扩增产物经质量浓度为1.5g/L琼脂糖电泳分离,EB染色后进行观察并拍照。
表2 选用的ISSR引物序列、扩增的条带数目及其退火温度
T able2 ISSR selected primers,sequences,number s of polymor phic amplified lo ci,and their annealing temperature 引物名称序列(5't o3')扩增条带数/多态性条带数条带数退火温度/ P1(gA)7gT13/1348
P7(Ag)8C19/1952
P8(Ag)8YC12/1252
2期刘晨临,等:2008年黄海浒苔绿潮ISSR标记溯源分析237 1.4 数据分析
选择扩增清晰的电泳条带进行数据分析,同一引物、同一位点、根据扩增产物的有(1)无(0)得到二元资料,形成0,1矩阵。Shanno n指数由软件POPGENE1.31[8]分析得出;用软件T FPGA[9]分析计算浒苔样品局群间的遗传距离和遗传相似度,并通过U PGM A(unw eig hted pair g roup methods using arithmetic mean)参数进行聚类,构建的系统树用Tr eeView1.6.6成像。
2 结 果
2.1 ISSR PCR扩增结果
从20条引物中筛选出3条引物对68份浒苔材料进行了ISSR多态性检测,3个引物共扩增出44条清晰条带,代表44个引物结合位点,平均每个引物扩增了14.7条带,44个位点全部是多态性的,总的多态位点比率为100.00%(图1)。
图1 引物P8在浒苔藻体中的扩增结果
F ig.1 T he amplificatio n r esults for E nter omor p ha with the P8primer
2.2 浒苔样品居群水平的遗传多样性分析
除来源于温州沿海虾池(WZH)的浒苔种群,种群内多态性位点数目(31;70.5%)及Shanno n指数(0.32)较高外,其它各种群的Shannon指数介于0.09~0.21,表明各种群的种群内遗传多样性不高,遗传变异主要来源于各种群之间(表3)。
表3 浒苔样品种群内遗传多样性
T able3 Genetic diver sities in Enter omor p ha sp.intr a po pulations
样品采集地多态性位点数目/个多态性位点数的百分比/%S hannon指数山东青岛红岛虾池(QDS)2045.50.21
江苏盐城大丰虾池(DFS)1227.20.14
山东日照沿海漂浮样品(RZH1)715.90.09
山东青岛沿海(QD)1329.60.17
南黄海区域海上(LYG)1534.10.19
浙江温州沿海(WZH)3170.50.32
山东日照沿海岩石上样品(RZH2)818.180.10
238 海 洋 科 学 进 展29卷
根据样品的不同地理分布将68个个体分成7个居群。7个居群间的聚类关系见图2。7个种群分成了2组,青岛沿海的浒苔样品与应急采样的南黄海海域的浒苔样品,及部分日照海上漂浮样品聚成1组,青岛虾池、温州虾池和大丰虾池以及部分日照样品聚成1组。
图2 7个居群浒苔间N ei 的遗传距离聚类图
Fig.2 N ei's genetic dist ance among t he 7po pulat ions of Enter omor p ha
根据PCR 扩增产物的电泳结果,按Nei 的方法计算出浒苔各种群的遗传相似度(I )和遗传距离(D )见表4。
表4 7个居群间的Nei 的遗传相似度(对角线上方)和遗传距离(对角线下方)
T able 3 N ei's g enet ic identity (abo ve the diag onal)and g enetic distance (below the diago nal)amo ng the 7populatio ns
青岛虾池(QDS)
大丰虾池(DFS)日照1(RZH 1)青岛(QD)黄海南部(LYG)温州虾池(W ZH )
日照2(RZH 2)青岛虾池(QDS)0.8953
0.88430.71450.76370.6506大丰虾池(DFS)0.11060.8683
0.66920.72730.6367日照1(RZH 1)0.1230
0.14120.7115
0.7452
0.88790.6863
青岛(QD)0.40170.34040.7482黄海南部(L YG)0.26950.31840.29410.04590.8173
0.8900温州虾池(W ZH )0.06530.06260.11890.29010.20170.6980
日照2(RZH2)
0.42990.4514
0.3764
0.0957
0.1166
0.3595
3 讨 论
群体间的遗传相似度和遗传距离揭示了群体遗传分化程度,反映了种内群体间或种间的亲缘关系的远近。Thorpe [10]分析研究后给出的同科属间的遗传相似度I 为0.1~0.5,同属种间的遗传相似度为0.2~0.8,而同种种群间的遗产相似度为0.8~0.97(遗传距离为0.03~0.20)。从表4可以看出,青岛沿海浒苔样品与应急采样的连云港海域、部分日照海域样品具有非常高的遗传一致度,分别达到0.9551和0.9088,基于T horpe [9]的研究结论,可以认为以上来源的浒苔样品属于同一种。利用EOS/M ODIS 卫星遥感资料,得到黄海绿潮浒苔区的分布及其随时间的变化。发现浒苔密集区在5月底位于连云港外海,先向西北移动,到达青岛沿海海域后,再沿山东半岛南部沿海向东移动[11]。我们利用ISSR 分子标记分析的结果与遥感资料分析的有关青岛近海浒苔来源的结果是一致的。
青岛虾池、大丰虾池、温州养池和日照部分样品的遗传相似性都在0.88~0.9,尤其几个虾池的样品达到了0.93,基于T hor pe [10]的研究结论,属于同1个物种。尽管在形态上很难区分,绿潮浒苔和养殖池塘浒
2期刘晨临,等:2008年黄海浒苔绿潮ISSR标记溯源分析239
苔这2个群体间的遗传相似性只有0.6~0.7,达到了同属间遗传相似度,但不属于同一个种。基于本研究所采集样品的研究结果,认为此次浒苔绿潮暴发的种子来源可能并不是水产养殖池。易俊陶等对盐城沿海2008年暴发浒苔绿潮的分析也指出,海水养殖塘口在春季是进水季节,很少有排水的塘口,可以排除从养殖塘口排出的可能[12]。
Pang等分析了26个样品的IT S rDNA和rbc L序列后,发现6个采自养殖池塘的浒苔样品与绿潮优势种聚类在一起,具有非常近的亲缘关系[6]。通常rbc L序列不能区分石莼目不同种间的区别,ITS序列可以用于区分不同种间的系统发育关系,作为石莼目绿藻的种质鉴定和系统进化研究的重要分子依据。而对浒苔属和石莼属存在争议的物种,必须结合其他方面的证据和特征,借助于分子生物学的多重方法进行深入的研究[15]。我们采用的ISSR分析是基于全基因组序列的分子标记技术,在遗传多样性分析方面较单一核酸序列标记更为可靠。
韩晓磊等通过ISSR分子标记技术对6个不同地区浒苔群体(浙江鳌江、浙江宁波、广东南澳、江苏南通、福建福鼎、浙江南麂岛)进行了遗传多样性分析。结果显示它们之间的遗传相似性系数均在0.8~0.9,认为浒苔不同地理种群间的遗传多样性较低,且不同地区浒苔的亲缘关系与其地理距离的远近没有相关性[13]。Blo mster等在对分布于欧洲的浒苔进行研究时同样指出其亲缘关系与地理间隔距离没有直接关系[14]。我们的研究也证实,尽管青岛、大丰和温州虾池间存在地理间隔,其亲缘关系仍然很近。
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ISSR Biomolecular Marker Analysis for Original Source of
Enteromorp ha During Green Tide in Yellow Sea in2008
LIU Chen lin1,WANG Xiu liang2,LIU Sheng hao1,CONG Bai lin1,H UA NG Xiao hang1,
WANG Zong ling1,LIN Xue zheng1,ZANG Jia ye1
(1.M ar ine Ecological Centr e Fir st I ns titute of Oceanog r ap hy,S OA,Q ingdao266061,China;
2.I nstitute of Oceanology,Chinese A cademy of Sciences,Qing dao266071,China)
Abstract:Not only the sam ples of Enteromo rpha floating in the offshor e w ater of the Yellow Sea in the al g al g reen tide but also the alg al samples co llected from shrimp ponds respectively in Q ingdao,Dafeng,and Wenzhou are analyzed by means of the simple sequence repeat interv al amplified polym orphism marker(IS SR)to study their inter populatio n genetic relatio nship.It is show n in the analysis results that the g enetic identity of the algae from the o ffshore w ater of Qingdao is0.95w ith the algae from the so uther n Yellow Sea,bo th belonging to the sam e species.The bio logical population relationships of the alg ae from tho se shrimp ponds are v ery clo se to each other although they are g eog raphicallly located far apart.A ll the algae fro m those ponds belong to another species,w hich are different from the species fo r the alg a collected dur ing the Q ingdao g reen tide no matter ho w similar the biolo gical m orpho logy of the both species,as it is show n in the g enetic analy sis by means of the ISSR marker.T herefo re the alg a causing the Q ingdao g reen tide do es not come fro m any of the shrimp ponds.
Key words:Green tide;Enter omor p ha;ISSR;Sour ce tracing
Received:April14,2010
各种肿瘤标志物及其临床意义为方便大家学习记忆肿瘤标志物的参考意义现总结归纳如下：甲胎蛋白(AFP):60%~70%原发性肝癌患者甲胎蛋白可升高,为肝癌的早期诊断提供重要依据特别是有乙肝、肝硬化的患者应定期监测。 癌胚抗原(CEA):胃肠道肿瘤,特别是肠癌,癌胚抗原会升高。癌胚抗原对手术后监测有重要意义,肠癌患者经过治疗癌胚抗原可下降或恢复正常,如果手术后癌胚抗原持续升高,就要考虑复发转移的可能,所以应定期监测。 前列腺特异抗原(PSA):广泛应用于前列腺癌的肿瘤标志物,65岁以上老年男性特别要注意,前列腺癌与前列腺肥大症状相似,两者都有尿频、尿急、排尿困难、夜尿增多等表现,如果出现这些症状,务必检测前列腺特异抗原,以排除是否患有前列腺癌。 糖类抗原19-9(CA19-9):对于诊断胰腺癌的临床应用价值较高,高敏性为91.7%,特异性为85% 糖类抗原125(CA-125):80%~90%女性卵巢癌患者糖类抗原125可升高。但也有不少非卵巢癌的恶性肿瘤可升高,如胰腺癌、肝癌、胃肠癌、乳腺癌。 化验患者血液或体液中的肿瘤标志物,可在肿瘤普查中早期发现肿瘤,并观察肿瘤治疗的疗效以及判断患者预后。目前临床上常用的肿瘤标志物有:
1)甲胎蛋白(AFP)为原发性肝癌、睾丸癌、卵巢癌等肿瘤的标志物; 2)癌胚抗原(CEA)为消化系统肿瘤、肺癌、乳腺癌等肿瘤的标志物; 3)糖类抗原125(CA125)为卵巢癌等肿瘤的标志物; 4）糖类抗原153(CA153)为乳腺癌等肿瘤的标忐物; 5)糖类抗原19-9(CA19-9)为消化系统肿瘤的标志物; 6)糖类抗原724(CA724)为胃癌、卵巢癌等肿瘤的标志物 7)糖类抗原242(CA242)为消化系统肿瘤的标志物; 8)糖类抗原50(CA50)为消化系统肿瘤、乳癌、肺癌等肿瘤的标志物; 9) CYFRA21-1(cy211)为非小细胞肺癌等肿瘤的标志物; 10）神经元特异性烯醇化酶(NSE)为小细胞肺、神经内分泌肿瘤等肿瘤的标志物; 11）前列腺特异性抗原(PSA)为前列腺癌的肿瘤标志物; 12）人绒毛膜促性腺激素(HCG)为胚胎细胞癌、滋养层肿瘤(绒癌、葡萄胎)等肿瘤的标志物: 13）甲状腺球蛋白(TG)为甲状腺癌的标志物 14）铁蛋白 (SF)为消化系统肿蜜、肝癌、乳腺、肺癌等肿瘤的标志物: 15）B2微球蛋白(B2MG)在慢性淋巴细胞白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、肺癌、甲状腺癌、鼻咽等患者体液中升高; 16）鱗状细胞抗原(SCC)为宫颈瘟、肺鳞癌、食管癌等肿瘤标志物。目前临床上检测的肿瘤标志物绝大多数不仅存在于恶性肿瘤中,也存在于良性肿瘤、胚胎组织甚至正常组织中。因此,肿瘤标志物有动态
常见肿瘤标记物意义： 1、甲胎蛋白（AFP）AFP是胚胎期肝脏和卵黄囊合成的一种糖蛋白，在正常成人血循环中含量极微＜20μg/L。AFP是诊断原发性肝癌的最佳标志物，诊断阳性率为60%～70%。血清AFP＞400μg/L持续4周，或200～400μg/L持续8周者，结合影像检查，可作出原发性肝癌的诊断。急慢性肝炎，肝硬化患者血清中AFP浓度可有不同程度升高，其水平常＜300ug/L。生殖胚胎性肿瘤（睾丸癌，畸胎瘤）可见AFP含量升高。 2、癌胚抗原（CEA）癌胚抗原是从胎儿及结肠癌组织中发现的一种糖蛋白胚胎抗原，属于广谱性肿瘤标志物。血清CEA正常参考值＜5μg/L。CEA在恶性肿瘤中的阳性率依次为结肠癌（70%）、胃癌（60％）、胰腺癌（55％）、肺癌（50％）、乳腺癌（40％）、卵巢癌（30％）、子宫癌（30%）。部分良性疾病直肠息肉，结肠炎，肝硬化，肺病疾病也有不同程度的CEA水平升高，但升高程度和阳性率较低。CEA属于粘附分子，是多种肿瘤转移复发的重要标志。 3、癌抗原125（CA125）CA125存在于上皮卵巢癌组织和病人血清中，是研究最多的卵巢癌标记物，在早期筛查、诊断、治疗及预后的应用研究均有重要意义。CA125对卵巢上皮癌的敏感性可达约70%。其他非卵巢恶性肿瘤（宫颈癌、宫体癌、子宫内膜癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、结/直肠癌、乳腺癌）也有一定的阳性率。良性妇科病（盆腔炎、卵巢囊肿等）和早期妊娠可出现不同程度的血清CA125含量升高。 4、癌抗原15-3（CA15-3）CA15-3可作为乳腺癌辅助诊断，术后随访和转移复发的指标。对早期乳腺癌的敏感性较低（60%），晚期的敏感性为80%，转移性乳腺癌的阳性率较高（80%）。其他恶性肿瘤也有一定的阳性率，如：肺癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、原发性肝癌等。 5、糖类抗原19-9（CA19-9）CA19-9是一种与胃肠道癌相关的糖类抗原，通常分布于正常胎儿胰腺、胆囊、肝、肠及正常成年人胰腺、胆管上皮等处。检测患者血清CA19-9可作为胰腺癌、胆囊癌等恶性肿瘤的辅助诊断指标，对监测病情变化和复发有很大意义。胃癌、结/直肠癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌等患者的血清CA19-9水平也有不同程度的升高。某些消化道炎症CA19-9也有不同程度的升高，如：急性胰腺炎、胆囊炎、胆汁淤积性胆管炎、肝炎、肝硬化等。 6、癌抗原50（CA50）CA50是胰腺和结、直肠癌的标志物，是最常用的糖类抗原肿瘤标志物，因其广泛存在胰腺、胆囊、肝、胃、结直肠、膀胱、子宫，它的肿瘤识别谱比CA19-9广，因此它又是一种普遍的肿瘤标志相关抗原，而不是特指某个器官的肿瘤标志物。CA50在多种恶性肿瘤中可检出不同的阳性率，对胰腺癌和胆囊癌的阳性检出率居首位，占94.4%；其它依次为肝癌（88%）、卵巢与子宫癌(88%)和恶性胸水（80%）等。可用于胰腺癌、胆囊癌等肿瘤的早期诊断，对肝癌、胃癌、结直肠癌及卵巢肿瘤诊断亦有较高价值。 7、糖类抗原242（CA242）CA242是与胰腺癌、胃癌、大肠癌相关的糖脂类抗原。血清CA242用于胰腺癌，大肠癌的辅助诊断，有较好的敏感性（80%）和特异性（90%）。肺癌，肝癌，卵巢癌患者的血清CA242含量可见升高。 8、胃癌相关抗原（CA72-4）CA72-4是目前诊断胃癌的最佳肿瘤标志物之一，对胃癌具
分子标记技术及其在植物药材亲缘关系鉴定中的应用 分子标记技术 分子标记（Molecular Markers）是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映[1]。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有极大的优越性：大多数分子标记为共显性，对隐性性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速[2]。 技术种类及原理 分子标记技术自诞生起已研究出数十种，尽管方法差异显著，但都具有一个共同点，即用到了分子杂交、聚合酶链式反应（PCR）、电泳等检测手段。应用较为广泛的技术有以下几种： 1.限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphisms，RFLP） RFLP是最早开发的分子标记技术，指基因型间限制性内切酶位点上的碱基插入、缺失、重排或突变引起的，是由Grodzicker等于1974年创立的以DNA-DNA杂交为基础的遗传标记。基本原理是利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况[3]。通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同带，然后与克隆DNA探针进行Southern 杂交和放射显影，即获得反映个体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异。 RFLP的等位基因其有共显性特点，可靠性高，不受环境、发育阶段或植物器官的影响。RFLP标记位点数量不受限制，通常可检测到的基因座位数为1—4个，标记结果稳定，重复性好。RFLP技术也存在一些缺陷，主要是克隆可表现基因组DNA多态性的探针较为困难；另外，RFLP分析工作量大，成本高，使用DNA量大，使用放射性同位素和核酸杂交技术，不易自动化，尽管结合PCR技术，RFLP仍在应用，但已不再是主流分子标记。 2.随机扩增多态性DNA（Random Amplification Polymorphism，RAPD） RAPD技术是1990年由William和Welsh等人利用PCR技术发展的检测DNA多态性的方法，其基本原理是利用随机引物（一般为8—10bp）通过PCR反应非定点扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性。扩增片段多态性便反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD所使用的引物各不相同，但对任一特定引物，它在基因组DNA序列上有其特定的结合位点，一旦基因组在这些区域发生DNA片段插人、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物数量和大小发生改变，表现出多态性[4]。就单一引物而言，其只能检测基因组特定区域DNA多态性，但利用一系列引物则可使检测区域扩大到整个基因组，因此，RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测，也可用于构建基因组指纹图谱。 与RFLP技术相比，RAPD技术操作简便快速，省时省力，DNA用量少，同时无需设计特定的引物，扩增产物具有丰富的多态性。但RAPD也存在一些缺点：(1)RAPD标记是一个显
DNA分子标记技术及其应用 摘要：分子遗传标记是近年来现代遗传学发展较快的领域之一。本文系统阐述了DNA分子标记的概念，以及RFLP、RAPD、ALFP、STS、SSR和SNP为代表的分子标记技术的原理和主要方法，并简单介绍了DNA分子标记技术的应用。最后探讨了其进展以及存在的一些问题。 关键词：分子标记；应用 分子遗传标记技术作为一种新的分子标记技术，在分子生物学特别是在分子遗传学的研究中得到了广泛的应用和发展，其所构建的遗传图谱具有高度的特异性。与其它遗传标记相比较，DNA分子标记具有诸多优点，如：遗传稳定，多态性高，多为共显性，数量丰富，遍及整个基因组，操作简便。这些优点使其广泛地应用于生物基因组研究、进化分类、遗传育种、医学等方面，成为分子遗传学和分子生物学研究与应用的主流之一。 1DNA分子标记的概念 遗传标记是基因型特殊的易于识别的表现形式，在遗传学的建立和发展过程中起着重要作用。从遗传学的建立到现在，遗传标记的发展主要经历了4个阶段，表现出了4种类型：1形态标记（Morphological Markers），指生物的外部特征特性,包括质量性状作遗传标记和数量性状作遗传标记；2细胞标记（Cytological Markers），主要指染色体组型和带型；3生化标记（Biochemical Markers），指生物的生化特征特性，主要包括同工酶和贮藏蛋白两种标记；4DNA分子标记（Molecular Markers）是以生物大分子（主要是遗传物质DNA）的多态性为基础的一种遗传标记。前3种标记是对基因的间接反映,而DNA分子标记是DNA水平遗传变异的直接反映。与其它遗传标记相比较，DNA分子标记具有诸多优点，如：遗传稳定，多态性高，多为共显性，数量丰富，遍及整个基因组，操作简便。这些优点使其广泛地应用于生物基因组研究、进化分类、遗传育种、医学等方面。目前，被广泛应用的DNA分子标记主要有RFLP（限制性片段长度多态性）、RAPD（随机扩增多态性DNA）、ALFP（扩增片段长度多态性）、STS（序列标记位点）、SSR（简单重复序列）和SNP（单核苷酸多态性）等。 2分子遗传标记技术的种类 2.1RFL P标记 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态性)标记,是人类遗传学家Botstein等于1980年提出的,是以Southern杂交为核心的第一代分子标记技术。它是用限制性内切酶切割不同个体基因组DNA后,用印迹转移杂交的方法检测同源序列酶切片段在长度上的差异。这种差异是由于变异的产生或是由于单个碱基的突变所导致的限制性位点增加或消失,或是由于DNA序列发生 插入、缺失、倒位、易位等变化所引起的结构重排所致。其差异的检测是利用标记的同源序列DNA片段作探针进行分子杂交,再通过放射自显影(或非同位素技术)实现的。 与传统的遗传标记相比,RFL P标记具有下列优点: (1)RF LP标记无表型效应,其检测不受外界条件、性别及发育阶段的影响；
分子标记 3分（内容丰富） 编辑词条 分子标记技术在搜搜百科中为本词条的同义词，已为您做自动跳转。 摘要 Molecular Markers 【分子标记的概念】 分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA 水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。 分子标记的概念有广义和狭义之分。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。狭义分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。 理想的分子标记必须达以下几个要求：(1) 具有高的多态性；(2) 共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；(3) 能明确辨别等位基因；(4) 遍布整个基因组；(5) 除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；(6) 选择中性(即无基因多效性)；(7) 检测手段简单、快速(如实验程序易自动化)；(8) 开发成本和使用成本尽量低廉；(9) 在实验室内和实验室间重复性好(便于数据交换)。但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满足以所有要求。 【分子标记的种类】 一、基于分子杂交技术的分子标记技术 此类标记技术是利用限制性内切酶解及凝胶电泳分离不同的生物 DNA 分子，然后用经标记的特异 DNA 探针与之进行杂交，通过放射自显影或非同位素显色技术来揭示 DNA 的多态性。 ①限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP) 1974年Grodzicker等创立了限制性片段长度多态性(RFLP)技术，它是一种以DNA—DNA杂交为基础的第一代遗传标记。RFLP基本原理：利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况。通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同带，然后与克隆DNA探针进行Southern
肿瘤标志物的联合检测及意义 核心提示:1、甲胎蛋白（AFP）AFP是胚胎期肝脏和卵黄囊合成的一种糖蛋白，在正常成人血循环中含量极微＜20g/L。AFP是诊断原发性肝癌的最佳标志物，诊断阳性率为60%～70%。血清AFP＞400g/L持续4周，或200～400g/L持续8周者，结合影像检查，可作出原发性肝癌的诊断。急 1、甲胎蛋白（AFP）AFP是胚胎期肝脏和卵黄囊合成的一种糖蛋白，在正常成人血循环中含量极微＜20μg/L。AFP是诊断原发性肝癌的最佳标志物，诊断阳性率为60%～70%。血清AFP＞400μg/L持续4周，或200～400μg/L持续8周者，结合影像检查，可作出原发性肝癌的诊断。急慢性肝炎，肝硬化患者血清中AFP浓度可有不同程度升高，其水平常＜300ug/L。生殖胚胎性肿瘤（睾丸癌，畸胎瘤）可见AFP含量升高。 2、癌胚抗原（CEA) 癌胚抗原是从胎儿及结肠癌组织中发现的一种糖蛋白胚胎抗原，属于广谱性肿瘤标志物。血清CEA正常参考值＜5μg/L。CEA在恶性肿瘤中的阳性率依次为结肠癌（70%）、胃癌（60％）、胰腺癌（55％）、肺癌（50％）、乳腺癌（40％）、卵巢癌（30％）、子宫癌（30%）。部分良性疾病直肠息肉，结肠炎，肝硬化，肺病疾病也有不同程度的CEA 水平升高，但升高程度和阳性率较低。CEA属于粘附分子，是多种肿瘤转移复发的重要标志。 3、癌抗原125（CA125）CA125存在于上皮卵巢癌组织和病人血清中，是研究最多的卵巢癌标记物，在早期筛查、诊断、治疗及预后的应用研究均有重要意义。CA125对卵巢上皮癌的敏感性可达约70%。其他非卵巢恶性肿瘤（宫颈癌、宫体癌、子宫内膜癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、结/直肠癌、乳腺癌）也有一定的阳性率。良性妇科病（盆腔炎、卵巢囊肿等）和早期妊娠可出现不同程度的血清CA125含量升高。 4、癌抗原15-3（CA15-3）CA15-3可作为乳腺癌辅助诊断，术后随访和转移复发的指标。对早期乳腺癌的敏感性较低（60%），晚期的敏感性为80%，转移性乳腺癌的阳性率较高（80%）。其他恶性肿瘤也有一定的阳性率，如：肺癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、原发性肝癌等。 5、糖类抗原19-9（CA19-9）CA19-9是一种与胃肠道癌相关的糖类抗原，通常分布于正常胎儿胰腺、胆囊、肝、肠及正常成年人胰腺、胆管上皮等处。检测患者血清CA19-9可作为胰腺癌、胆囊癌等恶性肿瘤的辅助诊断指标，对监测病情变化和复发有很大意义。胃癌、结/直肠癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌等患者的血清CA19-9水平也有不同程度的升高。某些消化道炎症CA19-9也有不同程度的升高，如：急性胰腺炎、胆囊炎、胆汁淤积性胆管炎、肝炎、肝硬化等。 6、癌抗原50（CA50）CA50是胰腺和结、直肠癌的标志物，是最常用的糖类抗原肿瘤标志物，因其广泛存在胰腺、胆囊、肝、胃、结直肠、膀胱、子宫，它的肿瘤识别谱比CA19-9广，因此它又是一种普遍的肿瘤标志相关抗原，而不是特指某个器官的肿瘤标志物。CA50在多种恶性肿瘤中可检出不同的阳性率，对胰腺癌和胆囊癌的阳性检出率居首位，占94.4%；其它依次为肝癌（88%）、卵巢与子宫癌(88%)和恶性胸水（80%）等。可用于胰腺癌、胆囊癌等肿瘤的早期诊断，对肝癌、胃癌、结直肠癌及卵巢肿瘤诊断亦有较高价值。 7、糖类抗原242（CA242）CA242是与胰腺癌、胃癌、大肠癌相关的糖脂类抗原。血清CA242用于胰腺癌，大肠癌的辅助诊断，有较好的敏感性（80%）和特异性（90%）。肺癌，肝癌，卵巢癌患者的血清CA242含量可见升高。 8、胃癌相关抗原（CA72-4）CA72-4是目前诊断胃癌的最佳肿瘤标志物之一，对胃癌具有较高的特异性，其敏感性可达28-80%，若与CA19-9及CEA联合检测可以监测70％以上的胃癌。CA72-4水平与胃癌的分期有明显的相关性，一般在胃癌的Ⅲ-Ⅳ期增高，对伴有转移
分子标记 1.分子标记技术及其定义 1974年,Grozdicker等人在鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时, 利用限制性内切酶酶解后得到的DNA片段的差异, 首创了DNA分子标记。所谓分子标记是根据基因组DNA存在丰富的多态性而发展起来的可直接反映生物个体在DNA水平上的差异的一类新型的遗传标记,它是继形态学标记、细胞学标记、生化标记之后最为可靠的遗传标记技术。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质分子。通常所说的分子标记是指以DNA多态性为基础的遗传标记。分子标记技术本质上都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映基因组之间差异。 2.分子标记技术的类型 分子标记从它诞生之日起, 就引起了生物科学家极大的兴趣,在经历了短短几十年的迅猛发展后, 分子标记技术日趋成熟, 现已出现的分子标记技术有几十种, 部分分子标记技术所属类型如下。 2.1 建立在Southern杂交基础上的分子标记技术 (1) RFLP ( Rest rict ion Fragment Length Polymorphism)限制性内切酶片段长度多态性标记； (2) CISH ( Chromosome In Situ Hybridization) 染色体原位杂交。 2.2 以重复序列为基础的分子标记技术 (1) ( Satellite DNA ) 卫星DNA； (2) ( Minisatellite DNA ) 小卫星DNA; (3) SSR( Simple Sequence Repeat ) 简单序列重复, 即微卫星DNA。 2.3 以PCR为基础的分子标记技术 (1) RAPD ( Randomly Amplif ied Polymorphic DNA ) 随机扩增多态性DNA； (2) AFLP( Amplif ied Fragment Length Polymorphism) 扩增片段长度多态性； (3) SSCP( Single Strand Conformation Polymorphism) 单链构象多态性； (4) cDNA-AFLP( cDNA- AmplifiedFragment Length Polymorphism) cDNA -扩增片段长度多态性； (5) TRAP( Target Region Amplified Polymorphism) 靶位区域扩增多态性； (6) SCAR ( Sequence Char acterized Amplified Region) 序列特征化扩增区域； (7) SRAP ( Sequencerelated Amplified Polymorphism) 相关序列扩增多态性。 2.4以mRNA为基础的分子标记技术
分子标记技术 摘要：分子标记技术就是利用现代分子生物学基础分析DNA分子特性，并借助 一些统计工具，将不同物种或同一物种的不同类群区分开来，或者将生物体的某些性状与DNA分子特性建立起来的关联关系，已广泛应用于植物遗传与育种研究的众多领域，包括遗传图谱的构建、遗传多样性分析、物种起源与进化、品种资源与纯度鉴定、分子辅助育种等多个方面，具有重大作用。 关键词：分子标记技术原理RFLP RAPD SSR AFLP EST SNP TRAP 分子标记技术应用 引言 分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA 水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。 一．常用分子标记原理 分子标记技术的种类根据不同的核心技术基础，DNA分子标记技术大致可分为三类: 第一类以Southern杂交为核心, 其代表性技术为RFLP；第二类以PCR 技术为核心，如RAPD、SSR、AFLP、STS、SRAP、TRAP等；第三类以DNA序列(mRNA 或单核苷酸多态性)为核心，其代表性技术为EST标记、SNP标记等。理想的分子标记应达到以下的要求：①具有高的多态性；②共显性遗传；③能够明确辨别等位基因；④分布于整个基因组中；⑤选择中性(即无基因多效性)；⑥检测手段简单、快速；⑦开发成本和使用成本尽量低廉；⑧在实验室内和实验室间重复性好。目前，没有任何一种分子标记均满足以上的要求，它们均具有各自的优点和不足。其特点比较见表一。 1．限制性内切酶片段长度多态性标记（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP） 1974年，Grozdicker 等人鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时，发现了经限制性内切酶酶解后得到的DNA片段产生了差异，由此首创了第一代DNA 分子标记技术——限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP)。其原理是由于不同个体基因型中内切酶位点序列不同(可能由碱基插入、缺失、重组或突变等造成)，利用限制性内切酶酶解基因组DNA时，会产生长度不同的DNA酶切片段，通过凝
肿瘤标志物 1、甲胎蛋白（AFP）：参考值：＜20ng／ml （放免法） ＜10.9ng/ml (化学发光法) ．原发性肝细胞癌>200ng/m1，且渐升高，可达400ng／m1。急慢性活动性肝炎可＞100ng/m1，但随转氨酶恢复正常可逐渐降低。 ．妊娠、睾丸及卵巢肿瘤、某些消化系肿瘤伴肝转移者水平增高。 2、癌胚抗原（CEA）：参考值：放免：＜15ng/m1 发光：＜5ng/ml ．对消化道肿瘤如：胃、结直肠、胰腺、胆囊肿瘤有较好的阳性检出率，亦可作为肺癌、乳腺癌等恶性肿瘤的辅助诊断指标。因其在良恶性疾病间可有交叉，对其特异性有一定影响，但良性病变一般仅有暂时低度增高。亦可作为肿瘤病人的一般追踪随访指标。 3、β2-微球蛋白（β2-Mg）： 参考值：血清1.675±0.335ug/ml，尿0.091±0.068ug/ml ．体内正常有核细胞均能合成，肿瘤细胞代谢活性增高，至血中水平升高，各类白血病、何杰金氏病、多发性骨髓瘤等诊断为有价值指标。 ．亦可作为其它肿瘤辅助指标。血、尿中β2-Mg可作为灵敏的肾功能评价指标。 4、血清铁蛋白（Ferritin，Fer或SF） 参考值：成年男性：28-397ng/ml，女性：6-159ng/m1 ．贫血或肝功能异常，可使Fer的水平增高。原发性肝癌患者70％以上Fer水平增高，与AFP联合应用可提高阳性率。 ．血液淋巴系统，及其它系统实体肿瘤可有一定程度增高。 5、糖类抗原CA-50：血清中阳性界值：＜25U/m1 ．广谱肿瘤标志物，主要为胃、结直肠肿瘤，其它消化系统及卵巢、膀胱，前列腺，肺、乳等均有一定阳性率。可作为其它肿瘤标志物的辅助指标。可做为放化疗及术后观察，或复发监测。 6、糖类抗原CA-19-9：血清中阳性界值：＜37U/m1 ．胰腺癌、胆管癌特异性升高，可大于200-240U／ml以上。胰腺炎，阻塞性黄疸病人可呈轻、中度升高，症状改善可恢复正常，持续高水平应警惕恶性肿瘤的存在。 ．结肠癌、胃癌也可有较高阳性率，可与胃肠道肿瘤标志物联合检测，提高阳性率。 ．用于肿瘤治疗中追踪、随访，对复发的早期诊断亦有重要价值。 7、糖类抗原CA-724：血清中阳性界值：＜6 U/ml ．对胃癌的敏感度为60％，亦适合术后及化疗后疗效观察和追踪复发的指标。 ．对胆道系统、结直肠、胰腺肿瘤等亦有一定敏感性，可作为联合检测指标。 8、糖类抗原CA-125：血清中阳性界值：<21 U/m1。 ．卵巢上皮细胞癌等卵巢肿瘤指标，并有助确定化疗疗程，监视病情发展和预后期。 ．对肝癌、肺癌、结直肠癌诊断有一定辅助参考价值. 9、糖类抗原CA-15-3：正常参考值：＜38U/ml ．乳腺癌治疗后追踪监视的特异指标； ．对卵巢癌、子宫内膜癌有一定阳性率。 1O、肺癌抗原CYFRA-21-1：阳性界值：＜3.3ng/ml ．各类非小细胞肺癌（NSCLC）．阳性检出率为70-75%，随临床分期升高。 ．可作为肺癌手术和放化疗后追踪早期复发的有效指标。 ．对其它肿瘤，如头颈部、乳腺、宫颈、膀胱、消化道肿瘤均有一定的阳性率。 11、神经特异性烯醇化酶（NSE）： 参考值：血清：4.7-14.7ng/ml 脑脊液：O.5-2.0ng/ml
分子标记在果树上的应用及前景展望 分子标记指可遗传并可检测到的DNA序列或蛋白质。蛋白质标记主要是指同工酶、等位酶、贮藏蛋白等等，本文主要介绍DNA标记。理想的分子标记应具有以下几个条件： ①以孟德尔方式遗传。 ②多态性好，自然条件下存在许多变异位点。③遍布整个基因组，能够检测到整个基因组的变异。 ④共显性遗传，即可以区别纯合体和杂合体。⑤表现“中性”，即不影响目标性状的表达。⑥重复性好，便于资源共享。⑦自动化程度高。近年来，关于分子标记的研究进展很快，本文仅就分子标记在果树研究中的应用及存在问题做一介绍，并对应用前景做一展望。 一、分子标记在果树研究中的应用： 1.分子标记在种质资源研究中的应用。 （1）系谱分析和分类。物种在进化过程中，其DNA是一个渐变的过程。遗传关系越近，基因组DNA的差异越小，反之，差异越大。HARADAT等用RAPD标记对两个三倍体苹果品种“乔纳金”和“陆奥”进行了分析，结果表明，作为母本的金冠提供了减数的二倍体配子。沈向等对杏进行了RAPD分析，将41个品种分为5类。 （2）种质保存和核心种质的建立。如何事理有效地管理和利用种质资源，当今世界出现了两种趋势，其中之一就是建立核心种质。目的是以最少的种质样品重复而最大地包含一个种及其野生种的遗传多样性。分子标记为人们提供了一个有效、快速的途径。目前已建立的核心种质涉及到谷物、豆类、牧草、蔬菜和果树等。AMY K SZEWC-MCFADDEN等用SSR结合园艺性状建立了苹果的核心种质，HOKANSON等也建立了苹果核心种质。 （3）构建指纹图谱和品种鉴别。高质量的指纹图谱可作为新品种登记、注册和产权保护的重要依据。特别是对于无性繁殖的果树来说，同物异名、同名异物现象很严重，利用分子标忘本中高效、准确地建立指纹图谱、鉴别果树品
常见肿瘤标志物的意义 1．甲胎蛋白（AFP） AFP是早期诊断原发性肝癌最敏感、最特异的指标，适用于大规模普查。与ALT结合用于肝炎和肝癌的鉴别。 2．癌胚抗原（CEA） CEA是一种重要的肿瘤相关抗原，70-90%的结肠腺癌患者CEA高度阳性，在其它恶性肿瘤中的阳性率顺序为胃癌（60-90％）、胰腺癌（70-80％）、小肠腺癌（60-83％）、肺癌（56-80％）、肝癌（62-75％）、乳腺癌（40-68％）、泌尿系癌肿（31-46％）。胃液（胃癌）、唾液（口腔癌、鼻咽癌）以及胸腹水（肺癌、肝癌）中CEA的阳性检测率更高。CEA的检测对肿瘤术后复发的敏感度极高，可达80%以上，往往早于临床、病理检查及X光检查。3．癌抗原125 （CA125） CA125是卵巢癌和子宫内膜癌的首选标志物，如果以65U/ml为阳性界限，Ⅲ-Ⅳ期癌变准确率可达100%。CA125迄今为止是用于卵巢癌的早期诊断、疗效观察、预后判断、监测复发及转移的最重要指标。 4．癌抗原15-3（CA15-3） CA15-3是乳腺癌的最重要的特异性标志物。其含量的变化与治疗效果密切相关，是乳腺癌患者诊断和监测术后复发、观察疗效的最佳指标，但要排除部分妊娠引起的含量升高。 5．癌抗原19-9（CA19-9） CA19-9是胰腺癌，胃癌，结、直肠癌、胆囊癌的相关标志物，是至今报道的对胰腺癌敏感性最高的标志物。胃肠道和肝的多种良性和炎症病变，如胰腺炎、轻微的胆汁郁积和黄疸，CA19-9浓度也可增高，但往往呈“一过性”，而且其浓度多低于120U/ml。 6．癌抗原72-4（CA72-4） CA72-4是目前诊断胃癌的最佳肿瘤标志物之一，对胃癌具有较高的特异性，与CA19-9及CEA联合检测可以监测70％以上的胃癌。与其它标志物相比，CA72-4最主要的优势是其对良性病变的鉴别诊断有极高的特异性，在众多的良性胃病患者中，其检出率仅0.7％。CA72-4与CA125联合检测，作为诊断原发性及复发性卵巢肿瘤的标志，特异性可达100%。7．非小细胞肺癌相关抗原（CYFRA 21-1） CYFRA 21-1是非小细胞肺癌最有价值的血清肿瘤标志物，尤其对鳞状细胞癌患者的早期诊断、疗效观察、预后监测有重要意义。CYFRA 21-1也可用于监测横纹肌浸润性膀胱癌的病程，特别是对预计膀胱癌的复发具有较大价值。在疾病的发展过程中，CYFRA 21-1值的变化常常早于临床症状和影像检查。 CYFRA 21-1与良性肺部疾病（肺炎、结核、慢性支气管炎、支气管哮喘、肺气肿）的鉴别特异性比较好。 8．小细胞肺癌相关抗原（神经元特异性烯醇化酶，NSE） NSE被认为是监测小细胞肺癌的首选标志物。小细胞肺癌患者首轮化疗后24-72小时内，由于肿瘤细胞的分解，NSE呈一过性升高。 NSE也可作为神经母细胞瘤的标志物，对该病的早期诊断具有较高的临床应用价值。血清NSE水平的测定对于神经母细胞瘤的监测疗效和预报复发均具有重要参考价值，比测定尿液中儿茶酚胺的代谢物更有意义。 9．总前列腺特异性抗原（TPSA） PSA是前列腺癌的特异性标志物，也是目前公认的唯一具有器官特异性肿瘤标志物,是
遗传标记的发展和应用 1 遗传标记的种类 遗传标记是指在遗传分析中区分不同遗传背景的研究对象的可遗传的标记，根据研究水平的不同，可分为形态学标记、同工酶标记和DNA分子标记。Mendel 在经典的豌豆杂交实验中就使用了花色等可用肉眼识别的形态标记。虽然在早期的很长一段时间里，科学家们都在利用形态标记进行连锁分析和遗传作图（Sax, 1923），但由于形态标记数目较少,而且易受环境因素的影响，在界定过程中也易受人为因素影响，不是很准确，因此就限制了其应用和发展。同工酶是指具同一底物专一性的不同分子形态的酶。同工酶的概念虽然早就被提出，但由于技术限制，直到五十年代淀粉凝胶电泳酶谱技术的发明（Hunter and Market, 1957），同工酶技术才得以在遗传学研究中被广泛利用。同工酶标记是一种共显性标记，在不同组织、不同发育阶段和不同物种间可能具多态性，稳定而不受环境影响。但其数目和多态性对于迅猛发展的遗传学研究来说，依然是远远不够的。 随着分子生物学的快速发展，对遗传物质—DNA的认识和体外操作技术水平的不断提高，产生了新的基于DNA水平的分子标记。这类分子标记的多态性是由于DNA水平上的各种变异如：倒位、易位、缺失、插入和单个碱基突变造成的。在长期的自然选择过程中，基因组中积累了大量这种可遗传的变异，并且是均匀地分布于全基因组中的。因此DNA分子标记相对于同工酶标记和形态学标记具有数目丰富、多态性高、稳定不受环境影响等优点。根据DNA分子标记的工作原理可将其分为两类，一为以限制性酶切和分子杂交技术为基础的RFLP标记（Bastein, 1980）, RFLP标记最早是应用于人类基因组研究中，现已广泛地在动、植物的基因组研究中使用于遗传作图，基因定位等方面（Burr et al., 1988; Apuya et al., 1988; Mccouch et al., 1988; Tanksley et al., 1992）。而另一类则是以聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction PCR）为基础的标记。随着PCR 技术的发明和广泛应用，一大批基于此技术的新型分子标记如RAPD（Williams et al., 1990）、AFLP（Zabeau and Vos, 1993）、SSR（Litt and Luty, 1989; Wu, 1993）等也迅速发展起来。RAPD是一种显性标记，以一段通常为10个碱基左右的随机寡核苷酸作为引物在基因组中进行扩增，由于引物的随机性，因此数量巨大，而且由于其主要是基于PCR技术，因此操作相对简便。AFLP标记是以两种限制性内切酶去酶切DNA，然后在两端分别加上两个接头，再进行两次选择性扩增，通常一次扩增可以得到相当多的带，在降低了错误扩增的几率后，AFLP是一种十分高效的标记，而且由于两种限制性内切酶可以任意组合，因此从理论上来说AFLP标记的数目几乎是无限的。AFLP标记可能为显性或共显性。SSR标记多为共显性标记，它是指在基因组中的一些有少数几个（2、3、4）核苷酸组成的简单重复序列，由于在生物的长期进化过程中这些重复序列所处的染色体位置
20种常见肿瘤标记物的意义 本文转自：好大夫在线本文原题：常见肿瘤指标的意义1.甲胎蛋白（AFP）AFP是早期诊断原发性肝癌最敏感、最特异的指标，适用于大规模普查，如果成人血AFP值升高，则表示有患肝癌的可能。AFP含量显著升高一般提示原发性肝细胞癌，70～95%患者的AFP升高，越是晚期，AFP含量越高，但阴性并不能排除原发性肝癌。AFP水平在一定程度上反应肿瘤的大小，其动态变化与病情有一定的关系，是显示治疗效果和预后判断的一项敏感指标。AFP值异常高者一般提示预后不佳，其含量上升则提示病情恶化。通常手术切除肝癌后二个月，AFP值应降至20 ng/ml以下，若降的不多或降而复升，提示切除不彻底或有复发、转移的可能。在转移性肝癌中，AFP值一般低于350～400 ng/ml。 妇产科的生殖腺胚胎癌、卵巢内胚窦癌AFP也会明显升高。AFP中度升高也常见于酒精性肝硬化、急性肝炎以及HBsAg 携带者。某些消化道癌也会出现AFP升高现象。孕妇血清或羊水AFP升高提示胎儿脊柱裂、无脑症、食管atresia或多胎，AFP降低(结合孕妇年龄)提示未出生的婴儿有Down’s 综合征的危险性。正常参考值：≤7 ng/ml2.癌胚抗原（CEA）在正常成人的血液中CEA很难测出。CEA是一种重要的肿瘤相关抗原，70～90%的结肠腺癌患者CEA高度阳性，在
其它恶性肿瘤中的阳性率顺序为胃癌（60～90％）、胰腺癌（70～80％）、小肠腺癌（60～83％）、肺癌（56～80％）、肝癌（62～75％）、乳腺癌（40～68％）、泌尿系癌肿（31～46％）。胃液（胃癌）、唾液（口腔癌、鼻咽癌）以及胸腹水（肺癌、肝癌）中CEA的阳性检测率更高，因为这些肿瘤“浸泡液”中的CEA可先于血中存在。CEA含量与肿瘤大小、有无转移存在一定关系，当发生肝转移时，CEA的升高尤为明显。 CEA测定主要用于指导各种肿瘤的治疗及随访，对肿瘤患者血液或其他体液中的CEA浓度进行连续观察，能对病情判断、预后及疗效观察提供重要的依据。CEA的检测对肿瘤术后复发的敏感度极高，可达80%以上，往往早于临床、病理检查及X光检查。 大量临床实践证实，术前或治疗前CEA浓度能明确预示肿瘤的状态、存活期及有无手术指征等。术前CEA浓度越低，说明病期越早，肿瘤转移、复发的可能越小，其生存时间越长；反之，术前CEA浓度越高说明病期较晚，难于切除，预后差。在对恶性肿瘤进行手术切除时，连续测定CEA将有助于疗效观察。手术完全切除者，一般术后6周CEA回复正常；术后有残留或微转移者，可见下降，但不恢复正常；无法切除而作姑息手术者，一般呈持续上升。CEA浓度的检测也能较好地反映放疗和化疗疗效。其疗效不一定与肿瘤体积成正比，
分子标记的发展及分子标记辅助育种 分子标记辅助选择育种(Marker Assisted Selection (MAS)或Marker Assisted Breeding)是利用与目标基因紧密连锁的分子标记或功能标记），在杂交后代中准确地对不同个体的基因型进行鉴别，并据此进行辅助选择的育种技术。通过分子标记检测，将基因型与表现型相结合，应用于育种各个过程的选择和鉴定，可以显著提高育种选择工作的准确性，提高育种研究的效率。 分子标记辅助育种示意图 DNA分子标记相对同类技术来说具有很强的优越性：因为大部分标记为共显性，对隐性性状的选择十分有利；数量极多，应对极其丰富的基因组变异；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用标记分析；不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁等等。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术也有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴定、基因库构建、基因克隆等方面。 分子标记的类型 分子标记按技术特性可分为三大类。第一类是以分子杂交为基础的DNA标记技术，主要有限制性片段长度多态性标记(Restriction fragment length polymorphisms，RFLP标记)；第二类是以聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR反应)为基础的各种DNA指
纹技术；第三类是一些新型的分子标记，如单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)，由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基的转换、颠换以及单碱基的插入／缺失等。 分子标记是以DNA多态性为基础，因而具有以下优点：①表现稳定，多态性直接以DNA 形式表现，无组织器官、发育时期特异性，不受环境条件、基因互作影响；②数量多，理论上遍及整个基因组；③多态性高，自然界存在许多等位变异，无需专门人为创造特殊遗传材料，这为大量重要性状基因紧密连锁的标记筛选创造了条件；④对目标性状表达无不良影响，与不良性状无必然连锁；⑤部分标记遗传方式为共显性，可鉴别纯合体与杂合体；⑥成本不高，一般实验室均可进行。对于特定探针或引物可引进或根据发表的特定序列自行合成。 各种分子标记的原理和优缺点 第一代分子标记：RFLP RFLP在20世纪70年代已被发现，是发现最早的一种分子标记。1980年，人类首先将其用于构建连锁图。 RFLP标记的原理：植物基因组DNA上的碱基替换、插入、缺失或重复等，造成某种限制性内切酶(restriction enzymes，简称RE)酶切位点的增加或丧失是产生限制性片段长度多态性的原因。对每一个DNA／RE组合而言，所产生的片段是特异性的，它可作为某一DNA 所特有的“指纹”。某一生物基因组DNA经限制性内切酶消化后，能产生数百万条DNA片段，通过琼脂糖电泳可将这些片段按大小顺序分离，然后将它们按原来的顺序和位置转移至易于操作的尼龙膜或硝酸纤维素膜上，用放射性同位素(如P32)或非放射性物质(如生物素、地高辛等)标记的DNA作为探针，与膜上的DNA进行杂交(即Southern杂交)，若某一位置上的DNA酶切片段与探针序列相似，或者说同源程度较高，则标记好的探针就结合在这个位置上。放射自显影或酶学检测后，即可显示出不同材料对该探针的限制性片段多态性情况。对于线粒体和叶绿体等相对较小的DNA分子，通过合适的限制性内切酶酶切，电泳分析后有可能直接检测出DNA片段的差异，就不需Southern杂交。RFLP探针主要有三种来源，即cDNA克隆、植物基因组克隆(Random Genome克隆，简称RG克隆)和PCR克隆。 优点: RFLP标记具有共显性的特点。共显性(co-dominant)标记指的是双亲的两个以上分子量不同的多态性片段均在F1中表现。它已被广泛用于多种生物的遗传分析，特别是构建植物遗传图谱。
(1) AFP：甲胎蛋白： 令狐采学 (2)CEA：癌胚抗原 (3)CA199：糖类抗原199 (4)CA125：癌抗原125 (5)CA153：肿瘤抗原153 (6)CA50：癌抗原50 (7)CA242：糖类抗原242 (8)β2—MG：β2—微球蛋白 (9)Fe Pro：血清铁蛋白： (10)NSE：神经元特异性烯醇化酶 (11)HCG：人绒毛膜促性腺激素 (12)TNF：肿瘤坏死因子 AFP：甲胎蛋白： 甲胎蛋白是一种糖蛋白，英文缩写AFP。正常情况下，这种蛋白主要来自胚胎的肝细胞，胎儿出生约两周后甲胎蛋白从血液中消失，因此正常人血清中甲胎蛋白的含量尚不到20微克／升。但当肝细胞发生癌变时，却又恢复了产生这种蛋白质的功能，而且随着病情恶化它在血清中的含量会急剧增加，甲胎蛋白就成了诊断原发性肝癌的一个特异性临床指标。
检测甲胎蛋白的方法有好几种，放射免疫法测得的甲胎蛋白大于500微克／升、且持续４周者，或甲胎蛋白在200～500微克／升、持续８周者，在排除其它引起甲胎蛋白增高的因素如急、慢性肝炎、肝炎后肝硬化、胚胎瘤、消化道癌症后，需再结合定位检查，如B超、CT、磁共振（MRI）和肝血管造影等即可作出诊断。不过，正常怀孕的妇女、少数肝炎和肝硬化、生殖腺恶性肿瘤等情况下甲胎蛋白也会升高，但升高的幅度不如肝癌那样高。肝硬化病人血清甲胎蛋白浓度多在25～200微克／升之间，一般在２个月内随病情的好转而下降，多数不会超过2个月；同时伴有转氨酶升高，当转氨酶下降后甲胎蛋白也随之下降，血清甲胎蛋白浓度常与转氨酶呈平行关系。如果甲胎蛋白浓度在 500 微克／升以上，虽有转氨酶升高，但肝癌的可能性大，转氨酶下降或稳定，而甲胎蛋白上升，也应高度怀疑肝癌。 甲胎蛋白在肝癌出现症状之前的8个月就已经升高，此时大多数肝癌病人仍无明显症状，肿瘤也较小，这部分患者经过手术治疗后，预后可得到明显改善，故肝硬化、慢性肝炎病人、家族中有肝癌患者的人应半年检测一次。 CEA：癌胚抗原 CEA最初发现于结肠癌和胎儿肠组织中，故名癌胚抗原。CEA 升高常见于大肠癌、胰腺癌、胃癌、小细胞肺癌、乳腺癌、甲状腺髓样癌等。但吸烟、妊娠期和心血管疾病、糖尿病、非特