CNAS T0354
CNAS T0426
抗生素微生物检定法测定药品含量 能力验证计划结果报告
中国合格评定国家认可委员会
上海市食品药品检验所
二○一○年二月
组织机构：中国合格评定国家认可委员会
能力验证负责人：翟培军
联系人：何平
联系地址：北京市崇文区南花市大街8号
邮政编码：100062
联系电话：（010）67105287
传真：（010）67105055
实施机构：上海市食品药品检验所
计划负责人：林梅
联系人：杨美成
联系地址：上海市浦东新区张衡路1500号邮政编码：201203
联系电话：（021）50798202/50798211 传真：（021）50798211
统计专家：杨美成唐海霞
技术专家：林梅钱维清杨美成
目录
一．前言 (4)
二．本次计划的特点 (4)
1．计划的目的和意义 (4)
2．参加实验室的范围 (5)
3．计划测试项目和要求 (6)
4．样品情况描述 (6)
5．保密性要求 (6)
6. 日程安排 (6)
三．统计分析的设计及能力评价原则 (6)
四．统计处理结果及能力评价 (7)
1．检测结果统计量 (7)
2．检测结果情况综述 (8)
3．有问题结果及不满意结果实验室代码汇总 (8)
五．技术分析与建议 (8)
1．参加实验室采用的检验方法等技术信息 (8)
2．技术分析 (9)
六. 附录 (11)
附录 A 实验室的检测结果和统计处理 (12)
附录 B 样品制备和均匀性检验、稳定性情况 (19)
附录 C 相关文件（被测物品接受状态确认表和作业指导书） (24)
附录 D 参考文献 (29)
一．前言
本报告是对CNAS T0426《抗生素微生物检定法测定药品含量》能力验证计划结果的总结，由上海市食品药品检验所负责起草，中国合格评定国家认可委员会（CNAS）秘书处审核并批准发布。
CNAS T0426《抗生素微生物检定法测定药品含量》能力验证计划由CNAS组织，上海市食品药品检验所作为技术支持机构负责计划的协调及实施。
CNAS依据ISO/IEC导则43：1997的要求运作能力验证计划。
CNAS要求申请认可和获准认可的实验室必须通过参加能力验证活动（包括CNAS组织实施或承认的能力验证计划、实验室间比对和测量审核）证明其技术能力。只有在能力验证活动中表现满意，或对于不满意结果能证明已开展了有效纠正措施的实验室，CNAS方受理或予以认可；对于未按规定的频次和领域参加能力验证的获准认可实验室，CNAS将采取警告、暂停、撤销资格等处理措施。
对参加了CNAS组织及其承认的能力验证活动且有稳定满意表现的机构，在CNAS的各类评审中可适当根据情况简化相关项目的能力确认过程。
获CNAS认可的实验室，在参加能力验证中出现不满意结果时，CNAS要求其立即停止在相关项目的证书/报告中使用CNAS的认可标识，并按其体系文件规定程序实施有效的纠正措施。实验室只有将实施纠正措施的记录以及纠正措施有效性证明材料在规定的期限内报CNAS确认后，方可恢复使用认可标识。
如果实验室的结果虽为不满意，但仍符合认可项目依据标准所规定的判定要求，实验室可向CNAS提出，经CNAS确认后，可恢复使用认可标识，但实验室仍需采取相关改进措施；对于出现可疑结果的机构，CNAS建议其采取相应的自查措施。
二．本次计划的特点
1．计划的目的和意义
抗生素微生物检定法不仅在中国药典和中国兽药典等国家标准中有收载，在美国药典、英国药典、日本药典、欧洲药典等国外药品权威标准中也都有收载，是药品质量检测的常用分析方法。
本次能力验证计划的目的是为了评价参加实验室采用抗生素微生物检定法的技术水平和能力，促进参加实验室进一步提高检测技术和加强实验室管理，尤其是检测结果不好的实验室，更要寻找原因，采取措施，保证日常检测结果的准确、可靠。
2．参加实验室的范围
本次能力验证计划共有85个实验室报名参加，分布于26个省、直辖市、自治区。参加实验室主要为国家、省、地市等各级药品检验所，也有兽药饲料检验机构、药品生产企业的分析测试中心等，见表1。在这些实验室中，检测项目已通过CNAS 认可的有42家，占参加实验室总数的49％。所有报名的实验室都报告了检测结果。
表1 实验室分布情况
省、自治区、直辖市食品药品检
验机构
兽药饲料检
验机构
其他检验机
构
合计
北京市 2 2 4 上海市 2 1 3 重庆市 1 1 2 江苏省8 1 9 广西壮族自治区8 8 浙江省11 1 12 广东省 5 1 6 吉林省 2 1 3 山东省7 1 8 辽宁省 2 1 3 河北省 1 1 2 四川省 2 1 3 福建省 2 1 3 陕西省 2 1 3 黑龙江省 1 1 安徽省 1 1 2 青海省 1 1 山西省 1 1 内蒙古自治区 1 1 2 新疆维吾尔自治区 1 2 3 河南省 1 1 甘肃省 1 1 海南省 1 1 湖北省 1 1 贵州省 1 1 宁夏回族自治区 1 1 总计62 20 3 85
3．计划测试项目和要求
3.1 本次能力验证计划采用抗生素微生物检定法测定琥乙红霉素含量，推荐的检测依据为中国药典2005年版二部，要求实验室按照日常检测程序和方法进行检测。因结果报告的含量值是以无水物计算，故需同时检测水分。
3.2 本次能力验证计划在向每个参加实验室发送检测样品的同时，附有作业指导书、结果报告单、被测物品接受状态确认表。见附录C。
4．样品情况描述
4.1 本次能力验证计划向每个参加实验室提供2份白色粉末样品，分别标注为：“ 实验室代码－1”和“实验室代码－2”，每瓶装量约 1.6g。本次能力验证计划的样品为分割水平设计的样品对，分别定义为A样和B样。A样是普通琥乙红霉素原料，B样是琥乙红霉素精制原料；1号样、2号样与A样、B样间的对应关系见附录A1检测结果和统计处理的第3页的注1。
4.2 本次能力验证计划样品在发放前已进行了均匀性检验，相关情况见附录B，结果表明样品的均匀性符合要求。本次能力验证计划结果报告中出现的不满意结果或离群值不是由样品的差异所致。
5．保密性要求
每个参加实验室被随机分配一个唯一性代码，为保证参加实验室秘密，报告中的参加实验室均以代码表示。
6. 日程安排
2009年4月邀请实验室参加2009年能力验证计划并开始报名。
2009年6月向参加实验室发出能力验证样品。
2009年7月反馈结果。
2009年8月汇总实验室数据，专家审核及统计工作。
2009年 9月～10 月编写能力验证计划结果报告。
三．统计分析的设计及能力评价原则
本次能力验证计划统计分析采用稳健（Robust）技术处理，即采用稳健统计的中位值作为指定值，标准化四分位距（NIQR）为变动性度量值（目标标准偏差）计算各
实验室结果的Z比分数（Z值）。本次能力验证计划中测定样品为按分割水平设计的样品对，因此，对抗生素微生物检定法测得结果分别计算实验室间Z比分数（ZB）和实验室内Z比分数（ZW）。
对本次能力验证计划实验室的检测结果，按下式计算Z值：
Z=(x-X)/σ
式中：x - 实验室测试结果；
X - 指定值；
σ- 变动性度量值（目标标准偏差）。
本次能力验证计划涉及的统计量有结果数、中位值、标准化四分位距（NIQR ）、稳健的变异系数（CV）、最小值、最大值和极差等。各统计量的意义及相关计算方法参见CNAS GL02：2006《能力验证结果的统计处理和能力评价指南》。
本次能力验证计划以Z比分数（包括实验室间Z比分数ZB和实验室内Z比分数ZW）评价实验室的结果，即：若∣Z∣≤2，检测结果为满意结果；若2<∣Z∣<3，检测结果为有问题；若∣Z∣≥3，检测结果为不满意结果或离群值。
为了清晰表示各实验室参加能力验证计划的结果，附录A中给予了Z比分数柱状图以及尤登图。从这两种图上，每一个实验室很容易将其结果与其他参加实验室进行比较，了解其结果在本次计划中所处的水平。
四．统计处理结果及能力评价
1．检测结果统计量
表2是检测结果统计量汇总。
表2 检测结果统计量汇总表
检测项目样品
标识
结果
数
中位值
(单位/mg)
标准化四
分位距
(单位/mg)
稳健变
异系数
（％）
最大值
(单位/mg)
最小值
(单位/mg)
极差
(单位/mg)
A样 85 764.7 10.82 1.41 869.1 721.4 147.7
红霉素
含量
B样
85 807.8 12.53 1.55 867.6 709.4 158.2
2．检测结果情况综述
参加本次能力验证计划的实验室共85家。在Z比分数的统计中，有69家的结果
为满意，有11家的结果有问题，5家的结果为不满意，各占总数的81.2％、12.9％
和5.9％。
3．有问题结果及不满意结果实验室代码汇总
表3 有问题结果及不满意结果实验室代码汇总表
检测项目结果情况实验室代码
有问题结果5、6、31、34、36、49、60、64、72、81、83
红霉素
含量
不满意结果 25、28、47、62、76
五．技术分析与建议
1．参加实验室采用的检验方法等技术信息
参加本次能力验证计划的85家实验室中除部分兽药监察所采用的检测方法为中
国兽药典2005年版二部外，均采用了作业指导书推荐的中国药典2005年版二部琥乙
红霉素项下规定的方法，采用抗生素微生物检定法（中国药典2005年版二部附录Ⅺ
A）来测定琥乙红霉素的含量。经查阅中国药典2005年版二部的抗生素微生物检定法
与中国兽药典2005年版二部的抗生素微生物检定法基本一致。但有部分实验室结果报
告单检测方法项的填写不规范，如仅填写“管碟法”、“二剂量法”、“三剂量
法”。
根据各参加实验室提交的记录对影响检验结果准确性的主要技术信息汇总、分析
如下：
1）使用的培养基 85家实验室所用培养基共涉及14家厂商，从结果看不同生产商的培养基对本次能力验证结果无影响。
2）抗生素抑菌圈的测量器具 各参加实验室均采用了抗生素抑菌圈面积测定仪进行结果的测量、计算和统计，没有用游标卡尺测量后手动计算结果的实验室。从结果看不同生产商的测量器具对本次能力验证结果无影响。
3）琥乙红霉素供试品的水解条件 药典规定了室温放置16小时或40℃放置6小时的两个条件。有66家实验室采用了40℃放置6小时的条件；另有19家采用了室温放置16小时的条件，他们的代码为：1、5、7、8、22、23、27、28、35、42、49、50、51、57、58、61、66、71、83。将这两个方法分组，剔除离群值（Z>=3）后，进
=1.99（p=0.95，v=80），表行t检验，得到t值分别为1.21和0.27，均小于临界值t p
（v）
明这两个方法无显著性差异。实施方也做过两种水解条件的对比，证明药典提供的两个条件均能适用，对检验结果没有影响。
结果为“有问题”和“不满意”的实验室共有16家（见表3），其中采用40℃放置6小时的实验室为13家，采用室温放置6小时的为3家。
其中代码为49的实验室在室温放置时间达22小时，代码为71的实验室将两个样品分别各采取一个水解条件，这都属于对标准方法的偏离。
4）结果报告的平均值形式85家实验室中有77家实验室按算术平均值报告结果值；另有8家实验室按加权平均值报告结果值，他们的代码是7、12、18、43、45、49、63、65。实施方将他们报告的加权平均值与按算术平均值计算的结果一一作了对比，两者差基本在0.0～±1.1u/mg之间，仅有一个样品两者之差为2.3u/mg。
在中国药典以及《中国药品检验标准操作规范》中均没有提及用加权平均值报告结果值。
2．技术分析
抗生素微生物检定法属于生物测定范畴，不确定因素较多，与一般理化分析比较更依赖于操作者的经验、熟练程度、甚至于手法和视力等。而这些信息是无法从反馈的有限信息中获得的，我们仅能从总体上进行技术分析，以供参考。
1）标准品的影响
除兽药监察系统内的一些实验室所用红霉素标准品来源为中国兽医药品监察所外，大多数实验室所用红霉素标准品均为来自中国药品生物制品检定所的批号为
130307——200716、纯度为938u/mg的红霉素标准品。但也有四家实验室（代码为4、5、25、81）没有遵守抗生素标准品新批号发布老批号自动作废的规定，使用了批号为130307－200215或3079312的过期作废标准品。这四家实验室中，代码为25的实验结果为不满意，代码为5、81的实验结果为有问题，仅代码为4的实验结果尚在满意范围内。抗生素类标准品易受保存温度、湿度、时间等影响发生降解而使其纯度发生变化，在抗生素药品的含量测定中，所用标准品的效期和保存条件是影响结果准确性的重要因素。
2）标准品和供试品的称量和稀释的影响
抗生素微生物检定法是根据量反应平行线原理设计的方法，要求标准品高、低剂量溶液的浓度与供试品高、低剂量溶液的浓度一致。建议应根据《中国药品检验标准操作规范》中抗生素微生物检定法中称量和稀释的要求进行，即：调节标准品和供试品的第一步稀释使浓溶液的浓度均为每1ml中含500单位，然后平行地在500单位/ml整数浓度的基础上用移液管各取相同的整数体积进一步稀释，最终制备成整数的高、低浓度供试液。但是本次能力验证计划中有部分实验室第一步稀释后所得标准品溶液和供试品溶液的单位浓度就不相同，接下来用移液管各取相同的整数体积作第二、第三步的稀释，则其最终溶液的单位浓度也不相同，且该差异未在实验结果的统计计算予以消除，从而影响实验结果的准确性。
3）抑菌圈直径的影响
在抗生素微生物检定法中，要求二剂量法标准品溶液的高浓度所致的抑菌圈直径在18～22mm之间，如抑菌圈直径太小会增加实验误差；还要求高、低浓度所致抑菌圈直径也应有适当差距，这是因为方法统计学的可靠性测验中剂间必须有显著差异。故要求实验人员通过摸索适宜的加菌量，或选择适宜的高、低供试浓度得到理想的抑菌圈直径，这也是保证实验结果准确性的重要因素之一。
4）向小钢管滴加溶液所用工具和时间的影响
向小钢管滴加标准品和供试品溶液是抗生素微生物检定法关键的技术操作步骤之一。一般要求用毛细滴管按SH→TH→TL→SL的顺序滴加至液面与小钢管口“平满”，影响因素有小钢管内径的均匀性、操作者对液面“平满”的判断、每碟滴加所用时间、操作者的视力、手式、经验等等。
根据反馈信息有部分实验室采用微量加样器滴加溶液以克服可能存在的小钢管内径不均匀问题及液面“平满”的判断问题。但也有实验室（代码为30）在结果报告单中记录了微量加样器枪头内有“挂壁”的现象，可能引入操作误差。
因在滴加溶液的同时小钢管内抗生素溶液已在不断向菌层培养基扩散，所以滴加时间应尽可能短。绝大多数实验室滴加溶液所用时间平均在每碟0.5~1分钟左右，但也有些实验室滴加时间过长，如代码为19、20的实验室的平均滴加时间为每碟3分钟左右，甚至个别实验室（代码为47）记录滴加12个碟子用了80分钟，平均每碟6.7分钟。这将增加剂间、碟间的差异从而影响实验的结果。
由于离群值产生的原因多种多样，在此无法一一罗列，希望数据离群的实验室结合检测过程，找出离群的可能原因。
六. 附录
附录A . 实验室的检测结果和统计处理
A1 检测结果和统计处理
A2 Z比分数柱状图
A3 尤登图
附录B. 样品制备和均匀性检验、稳定性情况
B1 样品制备报告
B2 均匀性检验报告
B3 稳定性情况说明
附录C. 相关文件（被测物品接收状态确认表和作业指导书）
C1 被测物品接收状态确认表
C2 作业指导书
附录D. 参考文献
附录 A
实验室的检测结果和统计处理
附录A1 检测结果和统计处理
抗生素微生物检定法测定
实验室代码
A样B样 S i D i ZB i ZWi
01 769.0 797.8 1107.9 20.4 -0.25 -1.00
02 768.3 790.1 1102.0 15.4 -0.70 -1.49
03 769.2 821.0 1124.4 36.6 1.02 0.60
04 749.8 803.4 1098.3 37.9 -0.99 0.72
05 759.0 831.9 1124.9 51.5 1.06 2.07*
06 753.4 773.7 1079.8 14.4 -2.40* -1.59
07 751.5 812.8 1106.1 43.3 -0.38 1.26
08 769.4 811.8 1118.1 30.0 0.53 -0.06
09 775.5 822.6 1130.0 33.3 1.45 0.27
10 760.6 813.8 1113.3 37.6 0.16 0.70
11 769.2 806.0 1113.8 26.0 0.21 -0.45
12 744.5 811.4 1100.2 47.3 -0.84 1.65
13 752.5 803.7 1100.4 36.2 -0.82 0.56
14 765.8 808.2 1113.0 30.0 0.14 -0.06
15 756.6 803.0 1102.8 32.8 -0.64 0.22
16 747.3 799.0 1093.4 36.6 -1.36 0.59
17 776.2 828.0 1134.3 36.6 1.78 0.60
18 776.7 821.9 1130.4 32.0 1.47 0.14
19 772.9 805.2 1115.9 22.8 0.36 -0.76
20 777.9 809.1 1122.2 22.1 0.85 -0.83
21 772.2 817.1 1123.8 31.7 0.97 0.12
22 773.9 815.0 1123.5 29.1 0.95 -0.15
23 769.1 795.6 1106.4 18.7 -0.36 -1.16
24 776.2 822.6 1130.5 32.8 1.48 0.22
25 721.4 786.4 1066.2 46.0 -3.45§ 1.52
26 767.6 793.6 1103.9 18.4 -0.55 -1.20
27 762.6 805.9 1109.1 30.6 -0.16 0.01
28 746.0 769.6 1071.7 16.7 -3.02§ -1.36
29 768.6 799.4 1108.7 21.8 -0.18 -0.86
30 768.8 821.6 1124.6 37.3 1.03 0.67
31 749.6 780.6 1082.0 21.9 -2.23* -0.85
32 763.0 808.0 1110.9 31.8 -0.02 0.13
33 757.6 807.6 1106.8 35.4 -0.34 0.47
34 782.5 835.1 1122.7 6.9 2.50* 0.65
i
35 757.0 819.2 1116.5 35.8 0.26 1.32
36 789.0 798.7 1115.6 33.0 0.88 -2.33*
37 764.2 814.8 1117.7 36.2 0.41 0.51
38 765.5 812.2 1114.0 34.1 0.34 0.24
39 764.7 815.9 1108.2 26.0 0.50 0.56
40 763.6 811.8 1110.5 48.6 0.22 0.35
41 765.2 802.0 1117.3 35.9 -0.23 -0.45
42 750.9 819.6 1120.1 25.4 -0.05 1.77
43 764.7 815.4 1118.0 34.4 0.47 0.52
44 774.1 810.0 1118.4 34.9 0.69 -0.51
45 766.2 814.9 1228.0 -1.1 0.53 0.38
46 766.1 815.5 1122.3 22.3 0.55 0.43
47 869.1 867.6 1083.4 21.1 8.96§ -3.11§
48 777.8 809.4 1099.9 48.2 0.86 -0.81
49 751.2 781.0 1111.7 37.3 -2.12* -0.93
50 743.7 811.8 1109.0 28.8 -0.86 1.73
51 759.7 812.5 1111.9 30.5 0.04 0.67
52 763.8 804.5 1134.1 35.5 -0.17 -0.17
53 764.6 807.8 1110.0 33.2 0.05 0.00
54 776.8 827.0 1111.1 12.6 1.76 0.49
55 761.4 808.4 1094.6 33.5 -0.09 0.26
56 776.8 794.6 1099.0 14.1 0.00 -1.77
57 750.3 797.7 1108.1 21.8 -1.27 0.29
58 767.1 787.1 1084.3 25.7 -0.93 -1.61
59 768.1 799.0 1133.4 19.1 -0.23 -0.86
60 748.6 784.9 1063.2 -60.0 -2.05* -0.48
61 787.9 814.9 1121.8 35.0 1.70 -1.13
62 794.2 709.4 1081.7 21.1 -3.67§ -8.90§
63 768.5 818.0 1112.3 30.8 0.82 0.44
64 750.0 779.8 1134.3 31.2 -2.25* -0.93
65 764.7 808.3 1110.8 29.3 0.09 0.03
66 780.0 824.1 1102.4 26.3 1.77 0.06
67 764.7 806.2 1102.5 27.7 -0.03 -0.12
68 760.9 798.1 1079.3 30.5 -0.67 -0.42
69 760.0 799.2 1124.0 39.9 -0.66 -0.28
70 759.3 798.0 1107.2 12.3 -0.76 -0.31
i
71 761.5 804.7 1094.8 29.1 -0.28 0.00
72 741.6 784.8 1106.2 -23.8 -2.44* 0.00
73 766.6 823.0 1109.5 30.3 0.99 0.92
74 774.2 791.6 1113.9 38.1 -0.30 -1.79
75 753.6 794.7 1106.6 28.1 -1.25 -0.15
76 799.0 765.4 1122.8 33.0 -0.38 -5.34§
77 763.1 806.0 1123.2 51.8 -0.12 -0.02
78 760.7 814.6 1117.7 29.3 0.21 0.74
79 762.6 802.4 1082.7 34.4 -0.35 -0.24
80 770.6 817.3 1118.0 14.9 0.89 0.24
81 757.6 830.8 1117.8 14.4 0.92 2.09*
82 769.6 811.0 1107.9 20.4 0.50 -0.13
83 741.2 789.9 1102.0 15.4 -2.18* 0.38
84 780.0 801.1 1124.4 36.6 0.53 -1.54
85 780.2 800.6 1098.3 37.9 0.51 -1.59
结果数 85 85 85 85
中位值
764.7 807.8 1111.1 30.55
(单位/mg)
标准化IQR
10.82 12.53 13.05 10.17
(单位/mg)
稳健CV(%) 1.41 1.55 1.17 33.29
极小值
721.4 709.4 1063.2 -59.96
(单位/mg)
极大值
869.1 867.6 1228.0 51.76
(单位/mg)
范围
147.7 158.2 164.8 111.72
(单位/mg)
注：1、实验室代码为6n+1，6n+2，6n+3的1号样为A样，2号样为B样；
实验室代码为6n+4，6n+5，6n+6的1号样为B样，2号样为A样；
n为0～14的整数。
2、标“§”的为不满意结果；
标“ * ”的为可疑结果。
附录A2 Z比分数柱状图
实验室间Z比分数（ZB）柱状图
实验室内Z比分数（ZW）柱状图
附录A3 尤登图
附录 B
样品制备和均匀性检验、稳定性情况
附录B1
样品制备报告
本次能力验证计划为分割水平对设计，2个样品分别定义为A样和B样。A样是普通琥乙红霉素原料，B样是琥乙红霉素精制原料。
在温度为20±2℃、相对湿度≤50％的环境下，将以上两种原料按预定的程序分两天分装到玻璃瓶，轧铝盖，各得140瓶，每瓶约1.6g。每个参加实验室按单盲分配表获得“A样”和“B样”各一瓶。