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tRNA（transfer ribonucleic acid）3′端加工成熟过程，是指剪切掉tRNA前体3′端的多余碱基序列以及在其末端添加CCA的过程。只有加工成熟后的并带有3′CCA末端的tRNA才能进行氨基酰化，执行其在蛋白合成过程中的功能。真核生物、古生菌和一些细菌的tRNA基因不编码3′末端CCA，其CCA需要在tRNA3′末端加工成熟后再添加上去，这类tRNA的3′末端的加工成熟需要核酸内切酶tRNase Z参与。
粟酒裂殖酵母Schizosaccharomyce spombe中含有两种tRNase Z基因：sptrz1+ (SPAC1D4.10) 和sptrz2+(SPBC3D6.03c)，它们编码的蛋白分别定位于细胞核和线粒体中。本实验组已经证实两种tRNase Z都是必需基因。我们已经完成了对sptrz1+的功能的相关研究，本实验的主要内容是得到一株sptrz2+的温度敏感型突变菌株，并利用该菌株进行SpTrz2p功能的相关研究。
在我们实验进行的过程中,冷泉港实验室Danielle V.报道sptrz2-A623V的突变会使菌株产生温度敏感的表型。本实验中，我们把sptrz2-A623V突变引入到遗传背景比较清楚的菌株S. pombe yAS56中的，得到具有温度敏感型的菌株tsD。根据对tsD中sptrz2-A623V的基因型进行测序鉴定以及带有sptrz2+的外源质粒限制性温度下救活实验的结果，我们确认tsD即为sptrz2+的温度敏感型菌株，可以用于对SpTrz2p相关功能的进一步研究。
我们也对温敏菌株sptrz2+加标签实验，选择了三种标签：HA、3HA、GFP，从而可以利用western技术跟踪细胞内SpTrrz2蛋白的表达量。得出温度敏感型菌株产生的原因，但是在实验过程中发现标签对Sptrz2p蛋白功能有影响：HA、3HA对蛋白功能的影响较GFP严重。我们成功的给野生型s.pombe Yas56 加上了GFP标签，但无法给温度敏感型菌株加上标签，我们进而采用重组蛋白的方法制备Sptrz2p的抗体。
关键词：S. pombe，tRNase Z，温敏菌株，GFP
Abstract
tRNA 3'-end maturation is a process through which the 3'-trailer sequence of precursor tRNAs (pre-tRNAs) is removed, and processed tRNAs acquire the CCA end which is absolutely essential for tRNA aminoacylation and protein synthesis. As for eukaryotes,archaea and some bacteria, the 3'-CCA sequence is not genomically encoded. The 3'-trailer sequence of pre-tRNAs is removed by tRNase Z and the 3'-CCA tail is added post-transcriptionally.
In Schizosaccharomyces pombe there exists two tRNase Z genes, designated sptrz1+(SPAC1D4.10) and sptrz2+(SPBC3D6.03c), encoding the nuclear and mitochondrial tRNase Zs, respectively. In our previous study, we have demonstrated that both of the two tRNase Zs in Schizosaccharomyces pombe are essential. We have carried out studies on sptrz1+ and drawed some definite conclusions. In this study, we intented to obtain a ts strain of sptrz2+ and carried out studies on the function of it.
During our research work, we learned about that the sptrz2-A623V mutation induced temperature-sensitive phenotype to the strain DI13, which was discovered by the Dirvine from Cold Spring Harbor Institute. We asked Dirvine for the plasmid with trz2-A623V .Other members in our laboratary inserted the kanMX6 gene into the vector to construct the targeting vector pBSⅡK -sptrz2-kanMX6. Then we introduced the trz2-A623V mutation into S.pombe yAS56 and obtained our ts strain tsD. After a series of testing experiments, such as phenotype verification, genotype verification and complementation of the temperature-sensitivity by sptr2+, we drawed the conclusion that tsD was the very ts mutation strain that could be used for further fuctional complementation study on sptrz2+.
Key words: S. pombe, tRNase Z, ts strain, high-copy suppressor gene
第1章综述
tRNA（transfer ribonucleic acid）是携带并转运氨基酸到核糖体上，在mRNA指导下合成蛋白质的一类小分子核糖核酸。tRNA的研究是分子生物学中一个重要而且活跃的研究领域。在所有的真核生物体、古生菌和一些细菌体内，tRNA分子先转录形成前体，经过一系列的加工后成为具有功能的成熟tRNA分子 。这些加工步骤包括去除5'前导序列、3'末端序列、切除内含子、进行碱基修饰等[2-3]、添加末端CCA(主要在真核生物中)如图1.1)。目前tRNA分子5'端加工机制已研究得比较清楚，而其3'末端的加工还在进一步研究中。
tRNase Z（transfer RNA (tRNA) 3'processing endoribonuclease）是一种催化tRNA前体3'末端加工成熟的核酸内切酶。tRNA3'末端的加工在1979年就已发现[4]，但相应的内切酶及基因序列直到2002年才被发现[2]。这种蛋白最早是从小麦中纯化出来的，根据其序列在三界（细菌、古生菌、真核生物）中鉴定出了众多的同源物[5]。这种新的酶被命名为tRNase Z。
1.1 tRNA前体3'末端的加工
tRNA前体3'末端的加工途径取决于tRNA前体3'末端是否含有CCA序列[6-10]。已知在所有的生物中，只有3'末端带有CCA序列的tRNA才能在tRNA-氨酰合成酶作用下氨基酰化，并行使其功能。
1.1.1 原核生物tRNA 前体 3'末端的加工
在原核生物体中，有些tRNA基因编码末端CCA序列，而有些则不编码末端CCA序列。末端含有CCA序列的tRNA前体其3'末端CCA下游序列主要由核酸外切酶剪切，而末端不含有CCA序列的tRNA前体的3'末端则由核酸内切酶tRNaseZ加工完成产生此过程，然后才能在tRNA 核苷酸转移酶的作用下正确添加CCA序列。目前对大肠杆菌Escherichia coli和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis tRNA前体3'末端的加工研究最为透彻[9][11-12]。Escherichia coli所有的tRNA基因都编码末端CCA序列，这些tRNA前体3'末端的成熟主要由核酸外切酶RNase T和RNase PH加工完成[9,12]。Rnase D,RNase BN和RNase Ⅱ等核酸外切酶也可参与切除3'末端序列，其活力比较低[12]，但也有内切酶参与到其中（图1.2B）。在Bacillus subtilis中，约有三分之二的tRNA基因编码末端CCA序列，含有末端CCA序列的tRNA前体3'末端的加工类似于E.coli中的tRNA 前体3'末端的加工，而不含有末端CCA序列的tRNA前体3'末端的加工则是由核酸内
切酶tRNase Z完成。tRNase Z能在“区别碱基”（discriminator nucleotide，位于CCA 5' 的未配对核苷酸）后精确切割tRNA前体3'末端序列。CCA是tRNase Z 内切酶活性的强抑制子，可以防止CCA被反复合成和切除[8,13]。但有一种特殊的细菌海栖热袍菌Thermotoga maritima中tRNase Z可以切除到CCA的3'端，T. maritima有46个tRNA基因，其中有45个编码CCA序列，这45个tRNA前体3'端加工时由TmaTrz在CCA的3'端进行剪切，将CCA留在tRNA 3'端(图1.2B)；一个不编码CCA序列的是tRNA Met，由TmaTrz在“区别碱基”后进行切割。TmaTrz将CCA motif作为了切割的指导序列而不是被其抑制[14]。在古生菌（archaea）中，绝大多数tRNA 基因不编码末端CCA序列，tRNA前体3'末端的加工由核酸内切酶tRNase Z完成[5]。
1.1.2 真核生物tRNA 前体 3'末端的加工
相对于原核生物体，我们对真核生物体中的tRNA前体3' 末端加工机制的研究尚处在初步阶段。已知在所有的生物中，只有3'末端带有CCA序列的tRNA才能在tRNA-氨酰合成酶作用下氨基酰化。tRNA前体的3'末端必需经tRNase Z加工，产生一个正确的3'末端后，才能在tRNA核苷酸转移酶的作用下添加CCA。真核生物体中的tRNA基因不编码末端CCA序列，tRNA前体3'末端的加工主要通过核酸内切酶tRNase Z完成。耶鲁大学的Wolin实验室发现，在酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae和粟酒裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe中，当酵母La蛋白存在条件下，tRNA前体3'末端的加工通常由核酸内切酶完成。在缺乏酵母La蛋白时，tRNA 前体3'末端序列由未知核酸外切酶切除[15-18]。
图1.1 不编码CCA序列的tRNA前体的加工（摘自甘旭华博士论文）tRNA前体含有5'端和3'端多余序列以及内含子，需要去除这些序列才能产生有功能的成熟tRNA。其5'端引导序列由核酸外切酶PNase P去除，核酸内切酶tRNase Z去除3'端多余序列，产生3'端为羟基的tRNA前体，再由tRNA核苷酸转移酶添加CCA。许多真核生物和古细菌tRNA基因有内含子，需要由剪接内切酶去除，有些核苷酸还需要特殊的修饰。图中，D表示区别碱基核苷酸，位于CCA序列的5'端[13]。
图1.2 含有CCA 序列的tRNA 前体的加工（摘自甘旭华博士论文）
许多细菌、部分古生菌的tRNA 基因编码CCA 序列，A.大肠杆菌中的所有tRNA 基因都编码CCA ，其tRNA 前体长长的3'末端多余序列先由核酸内切酶RNase Z 剪切，之后再由核酸外切酶RNase T 和RNase PH 剪切。B.海栖热袍菌中，含有CCA 序列的tRNA 前体由tRNase Z 在 CCA 的3'端进行剪切，将CCA 留在tRNA 3'端，产生的tRNA 可以被氨基酰化。D 代表位于CCA 序列5'端的区别碱基核苷酸[13]。
1.2 tRNase Z 的结构与功能研究
1.2.1 tRNase Z 的两种类型
tRNase Z 存在于细菌、古生菌及真核生物中，有两种类型，长型 （tRNase Z L ）含有648-1174个氨基酸残基，只存在于真核生物中；短型（tRNase Z S )含有395-554氨基酸残基，广泛存在于上述三界生物中[2]。三界生物中所含有的tRNase Z 的类型和数目是不一样的。一般来说，真核生物至少含有一种tRNase Z L ，例如线虫Caenorhabditis elegans 、黑腹果蝇Drosophila melanogaster 和酿酒酵母S.cerevisiae 都只含有一种tRNase Z L ,不含有短型tRNase Z S ；人有一种tRNase Z S （HsaTrz1/ELAC1) 和一种tRNase Z L (HsaTrz2/ELAC2)[19]；粟酒裂殖酵母S.pombe 有两种tRNase Z L ；拟南芥A.thaliana 有两种tRNase Z L 和两种tRNase Z S 。目前还不清楚为什么不同的生物中存在着不同种类和不同数目的tRNase Z 。
Anticodon
3' Anticodon
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tRNase Z L可在细胞核和线粒体内都有分布。目前预测出许多tRNase Z L在N-端有细胞核定位序列或线粒体定位序列，而tRNase Z S缺少这些结构域，所以推测tRNase Z S可能主要存在于细胞核和细胞质中。如果生物体只含有一种tRNase Z L，那么这种酶可能同时在细胞核、线粒体和叶绿体中发挥作用。例如黑腹果蝇D. melanogaster只有一种tRNase Z L，它具有核定位序列和线粒体定位序列，在体内可同时加工细胞核和线粒体tRNA前体[20]。蛋白亚细胞定位研究发现，芽殖酵母的tRNase Z L位于细胞核和线粒体中[21]，裂殖酵母的2个tRNase Z L分别定位于细胞核和线粒体中，提示它们可能分别在细胞核和线粒体中参与tRNA前体3'末端的加工[6]。序列分析显示,人的ELAC2 的N-端含有一个很强的线粒体信号肽，但不清楚ELAC2是否同时参与细胞核和线粒体tRNA 前体3'末端的加工。
某些真核生物出现两种类型的tRNase Z，暗示了它们可能在细胞中发挥不同的作用。tRNase Z L和tRNase Z S除了有不同的细胞定位、不同的最适反应条件外，它们识别和催化的底物也有不同。tRNase Z L即能以正常pre-tRNA为底物，也能识别变异的pre-tRNA；tRNase Z S只能催化正常pre-tRNA，这种差异可能是因为tRNase Z L N-端具有底物结合特异性[22]。
1.2.2 tRNase Z的功能
前体tRNA 3'末端由核酸内切酶参与加工早在30年前就被发现[37-38]。然而直到2002年，相应的核酸内切酶的蛋白和基因序列才被确定[19]。研究者首先从小麦胚胎中分离纯化出一种大小为43kDa的蛋白具有相应的pre-tRNA 3'末端加工活性，再通过蛋白质测序获得了这种蛋白的蛋白质序列以及相应的基因序列；通过在体外表达拟南芥（Arabidopsis thaliana）和甲烷球菌（Methanococcus janaschii）中该蛋白的同源蛋白，证实它们都具有pre-tRNA 3'末端加工活性。这种蛋白就是我们今天所熟知的tRNase Z。自此，关于tRNA 3'端加工成熟的研究有了飞速进展，并有数种tRNase Z的晶体结构被解析。
目前，已获得的关于tRNase Z的研究数据多来自体外实验。迄今为止，所有在体外重组表达的tRNase Z S和tRNase Z L都具有pre-tRNA 3'末端加工活性[39-44,34]；而关于tRNase Z体内生物学功能的研究报道相对较少。Pellegrini等[40]发现，抑制枯草杆菌tRNase Z S的表达，会导致不含CCA的pre-tRNA的积累，但对含CCA的pre-tRNA没有影响。在果蝇中，通过RNA 干扰的方法沉默tRNase Z L的表达会导致细胞核和线粒体中3'末端未加工的tRNA前体的积累，表明果蝇tRNase Z L同时参与细胞核和线粒体pre-tRNA 3'末端的加工[23]。本课题组最近的研究结果也显示，在粟酒裂殖酵母La蛋白（Sla1p）缺失菌株中，tRNase Z L1（SpTrz1p）至少对于部分pre-tRNA 3'末端的加工是必需的[24]。
所有的体外实验都显示tRNase Z具有pre-tRNA 3'末端加工活性，体内的实验数据也显示tRNase Z在体内参与了pre-tRNA 3'末端加工，因此，有理由认为pre-tRNA 3'末端加工活性是tRNase的主要功能，但这并不能排除tRNase Z在体内还具有其它生理功能。比如芽殖酵母tRNase Z L基因为必需基因却并非因为pre-tRNA 3'末端加工功能，因为芽殖酵母的核pre-tRNA 3'末端加工还有备份的外切核酸酶途径[25]，而线粒体RNA代谢在含葡萄糖培养基中是非必需的[47]。另一项研究结果显示，芽殖酵母的tRNase Z L温敏突变型菌株能够被REX2基因互补救活；Rex2p蛋白是定位于线粒体中的一种外切核酸酶，参与包括U4snRNA、5.8SrRNA、U5 snRNA、RNase P RNA等小分子RNA的加工成熟；因此，芽殖酵母tRNase Z L还可能参与线粒体中小分子RNA的加工[26]。大肠杆菌的tRNase Z参与某些特殊mRNA的降解作用[27]。在线虫中，tRNase Z是种系增殖所必需的，降低tRNase Z的表达量会引起不育性的产生[28]。果蝇的tRNase Z能够被保幼激素诱导，暗示其可能参与调节细胞的增殖与分化[29]。人ELAC2能够与γ-微管蛋白复合体相互作用，高表达ELAC2能够导致细胞循环进程的延迟[30]。
1.3 tRNase Z与疾病
目前已发现有120种tRNA 基因的突变与疾病相关，其中有些突变和tRNA 前体3' 末端的加工有关。例如人的tRNA前体3'末端加工酶的基因[31] ELAC2突变会导致前列腺癌[32]，但这种致病机理还有待进一步研究。线粒体tRNA 基因的突变与疾病紧密相关。例如，线粒体DNA7445A→G突变与非综合征型耳聋的发病有关[33]，这个突变导致转录成的线粒体tRNA Ser UCN前体中的“区别碱基”后的U74 突变为C。体外研究发现这个突变使tRNase Z不能加工线粒体tRNA Ser UCN前体的3'末端，说明tRNA前体3' 末端加工的缺陷可能会导致某些疾病。
1.4 粟酒裂殖酵母
粟酒裂殖酵母是一种单细胞真核微生物，最初是从东非粟米啤酒中分离到的，该酵母因此得名，在1890年从东非传到德国，后来进一步得到培养出纯菌种。P.inder首次在1893年的酿造杂志中用德文记录了裂殖酵母，并命名为“pombe”，在斯瓦希里语中是啤酒的意思。粟酒裂殖酵母的无性繁殖方式全都是裂殖，因而又称为裂殖酵母，有单倍体和双倍体两种营养体，双倍体可产生孢子。
其在许多方面与较之复杂很多的真核生物有相似性。通过基因序列比较和系统进化分析，它与芽殖酵母在3.3～4.2亿年前已经分化，而与后生动物在10～12亿年以前已经分化[34]。粟酒裂殖酵母和芽殖酵母之间基因序列的差异程度与它们和人类之间基因序列的差异程度相当，这提示真菌的进化速度比后生动物更
快。在真核生物中，对粟酒裂殖酵母进行遗传操作的简便性仅次于芽殖酵母，这使得其成为进行细胞周期调控、有丝分裂和无丝分裂[35]、DNA修复和重组研究[36]的模式生物，
裂殖酵母基因组全序列已在2002年被测定[35]。粟酒裂殖酵母单倍体染色体基因组的大小为13.8 Mb，分布在三条染色体上，其大小分别为5.7 Mb(I)、4.6Mb (II)和3.5 Mb(III)。粟酒裂殖酵母含有4824个开放阅读框（ORFs）（芽殖酵母超过5500个），是已知真核生物中最少的，甚至比一些细菌还少。因而，粟酒裂殖酵母作为一种模式系统运用于粟酒裂殖酵母的遗传学、分子生物学、细胞生物学和蛋白组学技术非常成熟，便于开展各种研究。
1.5粟酒裂殖酵母必需基因的研究方法
维持某种生物细胞生长所必需的基因被称为是这个物种的必需基因，如果这个基因被敲除细胞就会表现出致死表型。目前粟酒裂殖酵母的许多必需基因的分子功能和遗传功能没有被详细的研究，主要一部分原因是很难用这些必需基因的缺失突变型进行研究。应用于粟酒裂殖酵母失活必需基因的方法有以下几种：一种是构建该基因的条件致死突变体，条件致死突变体的生长和代谢特点能够通过简单地改变培养条件，例如温度进行控制，被认为是遗传和生化研究的有力工具[37-38]。另一种是采用可以迅速被抑制的启动子置换原有启动子的方法来关闭目标基因的表达。第三种是构建热诱导的降解决定子（heat-inducible-degron)结构域与编码序列相融合的基因。用可热诱导的降解决标记目标蛋白，带有标记物的目标蛋白在37℃被降解而失活[39]。
这里主要介绍前两种方法。温度敏感型突变是指仅在某个温度范围内显有与野生型不同表型的突变型。其中包括在某个温度以上显示出和野生型不同表型的高温敏感突变型，及在某个温度以下才显有与野生型不同表型的低温敏感突变型。一般来说，高温敏感突变型是由于突变基因的产物（某种特定的蛋白质或RNA）在高于某种温度时不稳定，失去了其原有功能，结果它的表型就成为高温敏感。如果发生这类突变的基因控制的特性是生长繁殖不可缺少的，那么就会形成条件致死突变型。在实验中，只要改变培养温度就可不断观察到这类突变型的表型如何从野生型变到突变型，温度敏感型突变体对温度适应性的变化涉及到一系列生理生化特性的改变，体现了基因功能结构域突变后基因功能的异常。因此，温度敏感型突变体提供了研究功能基因的好材料，是研究蛋白质与蛋白质互作的良好体系，成为研究基因结构与功能的有效手段[40]。但是温度敏感型突变体产生的机率很低，筛选突变体比较困难。
1.6遗传学方法筛选抑制基因
在酵母中进行功能互补试验是一种研究基因功能的常用方法。对酵母中某个经突变或敲除而在细胞水平表现出明显表型的基因，用外源表达的基因进行功能互补实验验证酵母细胞能否恢复为正常表型，这一实验方法已经成为对目标基因的功能进行分析的标准实验方案[41]。涉及到功能互补分析的实验在实验设计中必须注意多方面的问题，因为很多因素会导致实验出现不稳定的结果，这些因素包括所用的载体的拷贝数、所用的用于筛选的抗生素的性质、载体中启动子的类型及启动强度、启动子和插入基因间的距离、外源基因的序列特征等[42]。
很多情况下，简单地提高基因的剂量就会产生完全不同的表型。通过遗传相互作用筛选与某一突变基因间存在功能互补的基因，这一研究方法的原理可以归结为以下：a）抑制子产物可以“帮助”突变基因产物以稳定的结构存在；
b）抑制子产物作为“替补”，与突变基因产物的配体进行相互作用；
c）抑制子产物激活旁路代谢途径；
d）抑制子产物是能识别无义突变的tRNA分子，并通过在该无义突变位点插入氨基酸而“修正”该无义突变。
图1.3高表达抑制基因作用的原理
摘自：Susan L. Forsburg ：The art and design of genetic screens:yeast.
1.7 GFP研究进展
有NLS介导的蛋白进入细胞核是细胞内信号传递网络中物质交流的重要环节，对细胞的增值，分化，调节和转化起着重要的作用。因而对NLS的研究成了细胞科学研究的一个热点。鉴定NLS的第一步常用的是确定目的蛋白与示踪蛋白分子融合，已明确全长蛋白的定位情况，再根据预测的情况，将全长分子切割成若干截短突变体，通过观察这些突变体的定位情况明确NLS的具体位置。目前在观察蛋白质定位时常用的是绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，简称GFP）或者加强型的绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，简称EGFP）。
绿色荧光蛋白是海洋生物水母体内的一种发光蛋白，分子量27KD，有238个氨基酸组成，该蛋白65-67位Ser-Tyr-Gly三种氨基酸环化加氧形成特殊的生色团结构，这一氧化和环化过程不需要任何外源底物或辅助因子[43]。
GFP首先是由Shimomura 和John son 等人在1962 年首先从水螅水母类动物A equorea V ictoria中分离、纯化出来的。GFP在激发光488nm，不加任何底物及其他因子时，就能发出绿色荧光，荧光性质稳定，不一淬灭。转染的细胞可继续传代，作为活细胞的分子探针GFP连接上目的基因后转染细胞。
GFP(S65T)是一种加强型的荧光蛋白（EGFP），它可以加强、丰富荧光特性。1995年，Heim 等曾以不同的氨基酸分别取GFP环形三肽中的65 位Ser,结果发现,当以A la、L eu、Cys、Thr 取代Ser时,激发峰均在490nm 和510nm 之间, 而其振幅则是野生型的四至六倍,其中,以Thr 取代Ser时,其激发和发射光波最长(490nm和510nm),并且它们的生色基的形成速度比野生型快四倍，荧光强度提高了二十五倍[44]，目前GFP及其突变体作为新的报告基因和遗传标记已被广泛应用应用于动植物研究中。同其他的报告基因相比，它具备许多优点[45]：①检测方便：因为GFP 荧光反应不需要外加底物,酶或其它共反应因子, 也就不存在这些物质可能难于进入细胞的问题；而且,GFP 发射的荧光用肉眼或荧光显微镜就可以检测到,不会损伤正在生长的细胞和组织。②荧光稳定：GFP 对光致漂白作用有强烈的耐受性,能耐受长时间光照,从而延长了可探测时间。③无毒害：GFP 对生活细胞基本无毒害。④共用性和通用性：GFP基因表达几乎没有受体范围的限制,在原核和真核生物中都获得了成功的表达,其次,因为GFP较小,只含有238个氨基酸,不至于使质粒过大影响转化频率,其融合蛋白不影响结合蛋白的生物学功能。
但是利用GFP基因作为遗传标记也存在着一些问题[46]：①GFP的检测不是很灵敏,而且不易对其荧光进行定量测定。②GFP基因的表达可能有假象存在:一方
面,细胞本身存在一些可以受光激发的物质,能产生一定量荧光；另一方面,GFP 基因在受体内的表达频率并不高。
1.8 展望
tRNA分子在蛋白质加工过程中具有重要作用，研究清楚tRNA分子的加工成熟过程具有重大意义。每一个RNA聚合酶Ⅲ转录产物tRNA前体都要经过很复杂的成熟加工过程，包括5'端和3'端的加工、去除内含子及许多修饰步骤。其中5' 端的加工已研究得比较清楚，原核生物中tRNA3' 端加工成熟机理的比较清楚，而真核生物tRNA 3'端加工的研究才刚刚起步，且对真核生物tRNase Z的研究主要集中在果蝇、拟南芥、线虫、酿酒酵母及人中，对粟酒裂殖酵母的研究还未见报道。此外，真核生物体中tRNase Z的研究主要是在体外进行，在细胞内的功能尚未明确。我们以模式生物粟酒裂殖酵母S. pombe为材料，研究tRNA 3'端加工机制，为进一步利用粟酒裂殖酵母来研究ELAC2的功能及其突变体致癌机理奠定基础
一种海洋真菌——裂殖壶菌的营养成分分析 朱路英1,2，张学成2,*，王淑芳1，常林瑞1 (1.鲁东大学生命科学学院，山东 烟台 264025；2.中国海洋大学海洋生命学院，山东 青岛 266003)摘 要：为评价海洋真菌裂殖壶菌的营养价值，测定该菌的基本营养成分、氨基酸组成及脂肪酸组成。结果显示，在两种不同的氮源条件下，裂殖壶菌的总蛋白、总脂、总糖及灰分分别为9.35%、42.83%、5.27%、4.85%(豆粕水解物为氮源)和42.51%、18.98%、6.38%、5.72%(酵母提取物为氮源)。以轮虫蛋白的必需氨基酸(EAA)为标准，裂殖壶菌的必需氨基酸指数EAAI ＞0.9，为轮虫的优质蛋白源，但精氨酸或异亮氨酸不能完全满足轮虫需要。而以牡蛎蛋白的EAA 为标准，该菌的EAAI 为0.78～0.79，为牡蛎的可用蛋白源。该菌中含有高水平的DHA ，含量可达14.29%，是一种优质的DHA 强化饵料。另外，培养基中氮源种类的不同直接影响该菌的基本营养成分、氨基酸及脂肪酸组成。 关键词：裂殖壶菌；氨基酸组成；脂肪酸组成；营养价值 Analysis of Nutritional Components of a Marine Fungus: Schizochytrium limanium ZHU Lu-ying 1,2，ZHANG Xue-cheng 2,*，WANG Shu-fang 1，CHANG Lin-rui 1 (1. College of Life Sciences, Ludong University, Yantai 264025, China ；2. College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, Qingdao 266003, China) Abstract ：In order to evaluate nutritional values of a marine fungus, Schizochytrium limanium , its basic nutritional components,amino acid and fatty acid compositions were analyzed. Results indicated that the contents of proteins, lipids, carbohydrates and ash in Schizochytrium limanium were 9.35%, 42.83%, 5.27% and 4.85% using soybean hydrolysates as nitrogen resource and 42.51%,18.98%, 6.38% and 5.72% using yeast as nitrogen resource, respectively. Using rotifer protein as the reference, essential amino acid index (EAAI) in Schizochytrium limanium were more than 0.90; using oyster protein as the reference, EAAI in Schizochytrium limanium were 0.78－0.79, which suggested that Schizochytrium limanium was the best quality protein material for rotifer and oyster. However, Schizochytrium limanium had limited amino acids such as Arg and Ile for rotifer. Totally 14.29% DHA was determined in Schizochytrium limanium , which also suggested it was a good DHA source. Moreover, nitrogen sources exhibited a direct effect on contents of nutritional components, amino acid and fatty acid compositions. Key words ：Schizochytrium limanium ；amino acid composition ；fatty acid composition ；nutritional value 中图分类号：S963.2 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2009)24-0272-04 收稿日期：2009-06-28 基金项目：鲁东大学学科建设经费资助项目 作者简介：朱路英(1974－)，女，讲师，博士，研究方向为生物化学。E-mail ：ly zh u @123.co m *通讯作者：张学成(1939－)，男，教授，研究方向为海洋生物学。E-mail ：xczhang@https://www.doczj.com/doc/1813830695.html, 在水产养殖业中，饵料所含的营养对水产动物种苗的成活率、生长速率及抗逆、抗病能力有很大影响[1-2]。目前，轮虫和卤虫无节幼体是广泛使用的海洋仔稚鱼的重要天然饵料。但是，常用的几种轮虫和卤虫体内普遍缺乏海洋仔稚鱼必需的n-3多不饱和脂肪酸(PUFA)，因此，生物饵料营养强化技术在海洋鱼类育苗生产中受到关注，以轮虫和卤虫无节幼体为载体，增加仔稚鱼对 n-3 PUFA 的摄入量[3]。目前，大量培养轮虫的常用饵料有微藻，如小球藻、酵母类、乳化鱼油微粒或微 囊等。小球藻含有高水平的二十碳五烯酸(EPA)和二十碳四烯酸(AA)但缺乏二十二碳六烯酸(DHA)[3]；一些酵母类所含的n-3 PUFA 由于含量的限制仍然满足不了仔稚鱼的需要[3]。因此，寻找天然的更有效的生物饵料添加剂已成为人们研究热点之一。 日本研究者从西太平洋红树林地区分离到了一株富含D H A 的海洋真菌—裂殖壶菌(S c h i z o c h y t r i u m l i m a n i u m )。该菌属于真菌中的卵囊菌纲、破囊壶菌属，营养体为单细胞，球形，直径7～15μm [4]。目前
第30卷第6期温州大学学报·自 然 科 学 版2009年12月V ol 30, No 6 Journal of Wenzhou University · Natural Sciences Dec, 2009 裂殖壶菌油脂提取方法的研究 马建设1，韩方方1，叶海仁2，周茂洪2，黄可新1，赵肖为2,? (1．温州医学院药学院；2．温州大学生命与环境科学学院，浙江温州 325035) 摘要：比较了有机溶剂提取法、酸热法和超声波提取法对于裂殖壶菌油脂的提取能力．酸热法和超 声波提取法的提取得率高于有机溶剂提取法．当氯仿和甲醇以1∶1的体积比混合时，油脂提取得率最 高．当氯仿和甲醇以2∶1的体积比混合时，提取所得油脂中的DHA含量最高．但总提取得率还是以 氯仿和甲醇的体积混合比为1∶1时为最佳． 关键词：裂殖壶菌；油脂；酸热法；有机溶剂提取法；超声波提取法 中图分类号：TS224 文献标志码：A 文章编号：1674-3563(2009)06-0021-04 DOI：10.3875/j.issn.1674-3563.2009.06.004 本文的PDF文件可以从https://www.doczj.com/doc/1813830695.html,获得 裂殖壶菌（Schizochytrium）正在成为工业化生产DHA（二十二碳六烯酸，Docosahexaenoic Acid）或者富含DHA的油脂的重要菌种[1]．国内外已有许多关于提取微生物油脂的研究报道，李植峰等人[2]比较了索氏法、超临界CO2萃取法、酸热法和有机溶剂法从雅致枝霉（Thamnidium elegans）、拉曼被孢霉（Mortierella ramanninace）、少根根霉（Rhizopus arrhizus）和畸雌腐霉（Pythium irregulare）等微生物中提取油脂的效果，认为酸热法快速、简便、有效，但对二十碳以上的长链脂肪酸的提取能力有待进一步考察．本文研究从裂殖壶菌提取油脂（特别是二十碳以上的长链脂肪酸）的方法． 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌体 菌体由裂殖壶菌（Schizochytrium）WZU4771[3]经发酵、冷冻干燥而得． 1.1.2 试剂 DHA甲酯、花生酸甲酯和花生酸购自美国SIGMA公司；正己烷、甲醇、氯仿和三氟化硼-乙醚等试剂均为市售国产分析纯． 1.2 油脂提取方法 1.2.1 有机溶剂提取法[4] 称取一定量的菌体至圆底烧瓶中，加入一定比例的氯仿-甲醇混合溶剂，65℃水浴回流2 h， 收稿日期：2009-05-20 基金项目：浙江省科技计划项目(2007C22G2250004) 作者简介：马建设(1982- )，男，河南武陟人，硕士研究生，研究方向：生物化工．? 通讯作者，sherwood@wzu. https://www.doczj.com/doc/1813830695.html,
发酵工业中常用常见的酵母菌 （一）酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 这是发酵工业上最常用的菌种之一（图2-84）。按细胞长与宽的比例可将其分为三组。 1）细胞多为圆形或卵形，长与宽之比为1～2。这类酵母除了用于酿造饮料酒和制作面包外，还用于乙醇发酵。其中德国2号和12号（RasseII和RasseXII）最有名，但因其不能耐高浓度盐类，故只适用于以糖化的淀粉质为原料生产乙醇和白酒。 2）细胞形状以卵形和长卵形为主，也有些圆形或短卵形细胞，长与宽之比通常为2。常形成假菌丝，但不发达也不典型。这类酵母主要用于酿造葡萄酒和果酒，也可用于酿造啤酒、蒸馏酒和酵母生产。葡萄酒酿造业称此为葡萄酒酵母（Sac．ellisoideus）。 3）大部分细胞长宽之比大于2，它以俗名为台湾396号酵母为代表。我国南方常将其用于糖蜜原料生产乙醇。其特点为耐高渗压，可忍受高浓度盐类。该酵母原称魏氏酵母（Sac．willanus）。 在啤酒酿造中最早采用的酵母是卡尔斯伯啤酒厂的E．C．Hansen（1842～1909年）在1883年分离的卡尔斯伯酵母（Saccharomyces carlsbergensis），这是一种底面发酵酵母。酿酒酵母也可用于啤酒酿造，但属上面发酵酵母，这两种酵母发酵的过程和啤酒风味都有所不同。 目前在分类上皆采用酿酒酵母的学名。 底面发酵酵母其细胞为圆形或卵圆形，直径为5～10μm。它与酿酒酵母在外形上的区别是，卡氏酵母部分细胞的细胞壁有一平端。另外，温度对这两类酵母的影响也不同。在高温时，酿酒酵母比卡氏酵母生长得更快，但在低温时卡氏酵母生长较快。酿酒酵母繁殖速度最高时的温度为33℃，而卡氏酵母需在36℃。但在8℃时卡氏酵母较酿酒酵母繁殖速度几乎快一倍。
《生物信息学》上机指南2 实验二、BLAST 1学时 教学要求： 了解什么是BLAST，它有哪些应用，几种常用的BLAST程序包。 理解为什么会有BLAST程序包。掌握如何在NCBI网站上进行BLAST搜索、如何获取BLAST 帮助。 掌握如何下载并使用单机版的BLAST+程序 重点： 分析、理解BLAST的输出结果和评分标准，如Bit Scores, E-values。 难点： 理解BLAST不同参数的含义，以及如何调整和适用情况。 实验步骤： 一、在线Blast的使用 1、打开NCBI主页：https://www.doczj.com/doc/1813830695.html,/，点击Blast进入比对页面。 2、在Basic BLAST选项中，选择protein blast子程序。在Enter Query Sequence框中输入CAO79269， Database选择非冗余蛋白数据库，其它参数默认。 3、稍待片刻，出现Blast结果，分析结果(来自什么物种，具有什么功能) 4、回到protein blast主页面(后退或重新打开protein blast)。将下面这条序列粘帖到Enter Query
Sequence框中，，其它参数默认。运行Blast，并分析结果。结果与第3步相比，说明什么？ 1 MSARAPVAAN QGVTRGQQSQ QGDYTLALLA KDVYSTGSQG VGGFTRLNDS ALLGAGIDPA 61 SLHDSASGFQ AGIYSDNQQY VLAFAGTNDM RDWLSNVRQA TGYDDVQYNQ AVAVAKSAKA 121 AFGEALVIAG HSLGGGLAAT AALATGTVAV TFRRRRFRLH AEPYGDRSGG EERCPSGGIR 181 RYSEQYDMLT GTQESTSLIP DAIGHKITLA NNDTLSGIDD WRPSKHVDRS LTAHGIDKVI 241 SSMAEQKPWE TRANA 5、回到Basic BLAST主页面，选择nucleotide blast子程序，在Enter Query Sequence框中输入： CTTCTTCGCCAGAGGTTT ，Database中选择Nucleotide collection(nr/nt) 6、确认Automatically adjust parameters for short input sequences已经选择，运行Blast，分析结果， 判断这段序列是什么序列。如果不选Automatically adjust parameters for short input sequences，结果会出现什么？
1.酵母表达系统的特点大肠杆菌表达系统是常用的外源基因表达系统，人们已利用该系统表达了多种蛋白。大肠杆菌基因结构简单，易于进行基因操作，而且它生长迅速，周期短，营养需求简单，适于工业化生产。但同时该系统还存在很多缺陷。它是原核表达系统，缺少真核生物的翻译后加工过程，产生的外源基因产物往往无活性，它表达的蛋白多以包含体形式存在，需要经过复性，过程复杂，它产生的杂蛋白较多，不易纯化，所以产物中有可能会含有原核细胞中的有毒蛋白或有抗原性的蛋白。昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统都是真核细胞表达系统，它们可以进行多种蛋白的转录后加工，很适合于真核基因的表达。但是，它们遗传背景复杂，操作困难，易污染，生产成本高，所以并不利于实际应用[2,3] 2.核生物基因和制备有功能的表达蛋白质。某些酵母表达系统具有外分泌信号序列，能够将所表达的外源蛋白质分泌到细胞外，因此很容易纯化[4]。所以近年来，酵母表达系统已广泛应用于工业生产，为社会创造了极大的经济效益 3.酵母一般可分成三大类：(1) 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，又称面包酵母；(2) 粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；(3) 非常规酵母(Nonconventional yeast)，是指除酿酒酵母和粟酒裂殖酵母外的酵母统称 4.酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）又名面包酵母，它是单细胞真核微生物，一直以来酿酒酵母被称为真核生物中的―大肠杆菌‖。它是最早应用于酵母基因克隆和表达的宿主菌。自1981年Hitzemom等用酿酒酵母表达人干扰素获得成功后，人们还用酿酒酵母表达了多种原核和真核蛋白，目前科学家对酿酒酵母表达系统的研究已非常深入。 5.2.1.2 用于基因表达的宿主菌——酿酒酵母在遗传学方面，人们对酿酒酵母进行了广泛的研究，酿酒酵母基因组序列（约1.2×107bp）早在1996年就完成，它有16条染色体，约6000个ORF，仅4%的酵母基因有内含子。由于人们对酿酒酵母的遗传背景十分清楚，因此酿酒酵母是很理想的真核表达宿主菌。
本论文不同意在《中国食品学报》上发表 吐温对裂殖壶菌发酵生产DHA的影响 常明，李婧 ，李翔宇，刘睿杰，金青哲，王兴国* （食品科学与技术国家重点实验室食品，安全与营养协同创新中心，江南大学食品学院，无锡214122） 摘要裂殖壶菌作为好氧型产油微生物，是目前工业化生产DHA的主要菌株之一。吐温是一种表面活性剂，作为培养基添加物，可起到改变细胞膜渗透性、增强底物与氧气传质、促进生长、提高脂质积累的效果。实验探究了吐温系列（tween-20、tween-40、tween-60和tween-80）对裂殖壶菌生长、脂质积累和脂肪酸组成的影响。结果表明，在1%（v/v）添加量下，吐温20与40促进菌体生长；4种吐温均显著增强了菌体总脂积累能力，DHA产量分别比对照组提高了28.68%、29.33%、16.29%和20.67%；吐温20和40将最终总脂产量由22.68 g/L提升至29 g/L以上，DHA产量由10.74 g/L提升至约13.8 g/L。 关键词裂殖壶菌；吐温；发酵；DHA Effect of Tween on DHA production by Schizochytrium sp. SR21 LI Jing, Chang Ming*, Li Xiangyu, Liu Ruijie, Jin Qingzhe, Wang Xingguo (State Key Laboratory of Food Science and Technology, Synergetic Innovation Center Of Food Safety and Nutrition, School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122) Abstract Schizochytrium, one of the main sources of DHA, is aerobic oleaginous microorganism. Tween series, as non-ionic surfactants, added to the medium were known to interfere with the permeability of cell membranes, enhance the nutritional input and oxygen transfer, as well as improve growth and oil production of microorganisms. This research works were focus on the effect of Tween series (Tween-20, Tween-40, Tween-60 and Tween-80) on the growth, lipid accumulation and fatty acid composition in Schizochytrium sp. The results showed that total lipid content was significantly higher with Tween series (1%) and DHA yield were increased by 28.68%, 29.33%, 16.29% and 20.67% with Tween-20, Tween-40, Tween-60 and Tween-80 respectively. In addition, accompanying with the increasing of biomass, the total lipid and DHA production of Schizochytrium sp. were improved to 29 g/L and 13.8 g/L from 22.68 g/L and 10.74 g/L with 1% Tween 20 or Tween 40 respectively. Key words Schizochytrium; Tween; fermentation; DHA 二十二碳六烯酸（22:6 n-3）（DHA）是一种重要的ω-3系列多不饱和脂肪酸（ω-3 polyunsaturated fatty acids），具有促进婴幼儿智力和视力发育、预防心血管疾病、抗癌、抗炎、增强免疫力等功效[1]， 近年来受到广泛关注。微生物发酵法生产出的DHA避免了传统来源——深海鱼油存在的诸多问题， 例如品质不稳定、外源性污染、气味不良、纯化成本高、含有EPA和胆固醇等[2]，具有广阔的应用前 景。裂殖壶菌（Schizochytrium）属于破囊壶菌科的一类海洋微藻，是目前工业化生产DHA的热点菌 株。Schizochytrium藻油的安全性已得到美国FDA认可，2012年3月我国卫生部出台了《食品营养强 基金项目：中国国家自然科学基金（31401619）；江苏省自然科学基金（BK20140156） 作者简介：李婧（1990-），女，硕士研究生，研究方向为微生物油脂 *通讯作者：常明（1979-），男，副教授，研究方向为油脂生物技术
索取号：密级：加密 tRNA（transfer ribonucleic acid）3′端加工成熟过程，是指剪切掉tRNA前体3′端的多余碱基序列以及在其末端添加CCA的过程。只有加工成熟后的并带有3′CCA末端的tRNA才能进行氨基酰化，执行其在蛋白合成过程中的功能。真核生物、古生菌和一些细菌的tRNA基因不编码3′末端CCA，其CCA需要在tRNA3′末端加工成熟后再添加上去，这类tRNA的3′末端的加工成熟需要核酸内切酶tRNase Z参与。 粟酒裂殖酵母Schizosaccharomyce spombe中含有两种tRNase Z基因：sptrz1+ (SPAC1D4.10) 和sptrz2+(SPBC3D6.03c)，它们编码的蛋白分别定位于细胞核和线粒体中。本实验组已经证实两种tRNase Z都是必需基因。我们已经完成了对sptrz1+的功能的相关研究，本实验的主要内容是得到一株sptrz2+的温度敏感型突变菌株，并利用该菌株进行SpTrz2p功能的相关研究。 在我们实验进行的过程中,冷泉港实验室Danielle V.报道sptrz2-A623V的突变会使菌株产生温度敏感的表型。本实验中，我们把sptrz2-A623V突变引入到遗传背景比较清楚的菌株S. pombe yAS56中的，得到具有温度敏感型的菌株tsD。根据对tsD中sptrz2-A623V的基因型进行测序鉴定以及带有sptrz2+的外源质粒限制性温度下救活实验的结果，我们确认tsD即为sptrz2+的温度敏感型菌株，可以用于对SpTrz2p相关功能的进一步研究。 我们也对温敏菌株sptrz2+加标签实验，选择了三种标签：HA、3HA、GFP，从而可以利用western技术跟踪细胞内SpTrrz2蛋白的表达量。得出温度敏感型菌株产生的原因，但是在实验过程中发现标签对Sptrz2p蛋白功能有影响：HA、3HA对蛋白功能的影响较GFP严重。我们成功的给野生型s.pombe Yas56 加上了GFP标签，但无法给温度敏感型菌株加上标签，我们进而采用重组蛋白的方法制备Sptrz2p的抗体。 关键词：S. pombe，tRNase Z，温敏菌株，GFP
★根据能否进行有性繁殖，可将酵母菌分为： ●假酵母：只有无性繁殖过程。 ●真酵母：既有无性繁殖，又有有性繁殖过程。 1、芽殖 是yeast无性繁殖的主要方式。 一个酵母能形成的芽数是有限的，（平均24个） 出芽方式： 多边出芽、两端出芽、三边出芽、单边出芽。 环境适宜时，可出现假菌丝 芽殖过程： 母细胞形成小突起（A—D） 核裂（E—G） 原生质分配（H—I） 新膜形成（J—K） 形成新细胞壁（L） 出芽痕和诞生痕： 酵母出芽繁殖时，子细胞与母细胞分离，在子、母细胞壁上都会留下痕迹。在母细胞的细胞壁上出芽并与子细胞分开的位点称出芽痕，子细胞细胞壁上的位点称诞生痕。由于多重出芽，致使酵母细胞表面有多个小突起。 ◆芽痕 ◆假菌丝: Saccharomyces cerevisiae的芽殖过程 有的酵母菌进行芽殖后，长大的子细胞不与母细胞立即分离，并继续除芽，细胞成串排列，这种菌丝状的细胞串就称为假菌丝。假菌丝的各细胞间仅以狭小的面积相连，呈藕节状。而霉菌的菌丝为真菌丝，即相连细胞间的横隔面积与细胞直径一致，呈竹节状的细胞串，称为真菌丝。 借细胞横分裂法繁殖,与细菌类似.如Schizosaccharomyces octosporus（八孢裂殖酵母）。进行裂殖的酵母菌种类较少. 2、裂殖； 掷孢子（ballistospore）是掷孢酵母属等少数酵母菌产生的无性孢子，外形呈肾状。这种孢子是在卵圆形的营养细胞上生出的小梗上形成的。孢子成熟后通过一种特有的喷射机制将孢子射出。因此，如果用倒置培养皿培养掷孢酵母并使其形成菌落，则常因其射出掷孢子而可在皿盖上见到由掷孢子组成的菌落模糊镜像。 此外，有的酵母如Candida albicans等还能在假菌丝的顶端产生厚垣孢子。产生掷孢子等无性孢子 适宜的条件下，二倍体细胞减数分裂形成子囊孢子殖。 1、有性繁殖的过程：一般通过邻近的两个性亲和性不同的细胞各自伸出一根管状的原生质突起，随即相互接触、局部融合并形成一个通道，再经过质配、核配形成双倍体细胞——接合子。接合子进行减数分裂，形成4个或8个子核，每一个子核和周围的细胞质一起，在其表面形成孢子壁后就形成子囊孢子，形成子囊孢子的细胞称为子囊。一般一个子囊可产生4-8个子囊孢子。孢子数目、大小、形状因种而异。 酵母的二倍体营养体细胞
微生物在葡萄酒酿造中的作用 08生物（2）班徐玉尚20080804243 摘要：在整个葡萄酒的酸造生产过程中，有多种微生物参与。不同的微生物起着不同的作用，酿酒酵母将粉朴化成酒精，乳酸菌会将苹果酸转化成乳酸等，这些是正常的发酵过程;而醋酸菌会使萄萄酒发生酸败，产膜酵母会使葡萄酒起膜浑浊，霉菌会影响酒的风味等，这些是有害微生物的作用。[1-2] 关键词：葡萄酒；微生物；酵母；乳酸菌 葡萄汁转化为葡萄酒本质上是一个微生物作用的过程。所涉及到的微生物种类很多，既有有益菌的作用，如酵母菌直接参与发酵，把糖变成酒，其副产物对葡萄酒的口味和香气有着重要的影响;乳酸菌是高酸度葡萄酒，尤其是红葡萄酒二次发酵的主角起着降低酸度、改善口味、增强香气、提高稳定性的作用;灰葡萄孢是一种霉菌，其感染的贵腐葡萄酿造的贵腐葡萄酒是一种风味独特的高档葡萄酒。另外还有有害微生物，如某些酵母、细菌、霉菌的侵染会影响酒的风味，甚至引起酒变质，导致酿酒失败。因此了解葡萄酒生产中的微生物知识，一些前沿科学技术在葡萄酒生产中的应用，对葡萄酒的产业化生产更是有着巨大地推动作用。[3] 在主发酵期间，首先是添加酵母，经过活化的葡萄酒酵母按照一定比例加人到葡萄汁中，会在发酵液中迅速形成生长优势，抑制其他微生物的生长;另外，会抑制细菌生长。通过这两项措施，主发酵期间的有害微生物可及时加人的S0 2 以得到很好的控制。 随着主发酵的结束，发酵酵母的大量死亡沉降，发酵液中的游离S0 含量大 2 大降低，其他杂菌开始生长繁殖。因此，后发酵期和原酒储藏期是微生物控制的关链时期。 的办法;而有控制细菌和有害酵母应分别对待。对细菌的控制采用补加S0 2 不敏感，会在酒液表容酵母如酒香酵母、假丝酵母、毕赤氏酵母等，它们对S0 2 面生成菌膜，造成酒的浑浊，甚至造成成品酒发酵，有的能把乙醇、乙酸、柠橡酸等有机物权化分解成水和C0 ,使酒变质。 2 1 葡萄酒生产中酵母的使用及降酸作用 1.1 酵母的使用
第三章植物病原真菌—概述 真菌（Fungi）是一类真正具有细胞核的异养生物。营养体通常是丝状分支的菌丝体，细胞壁的主要成分是几丁质或纤维素，无根、茎、叶的分化，通过产生各种类型的孢子进行有性生殖或无性繁殖。 与人类的关系：有机物分解利用；食用、药用；食品工业；医学工业：青霉素；动植物产品霉变和腐败；人的疾病，植物病害。 五界分类系统：原核生物界（Monera）、原生生物界（Protista）、植物界（Plantae）、真菌界（Fungi）和动物界（Animalia）。 第二节真菌的一般性状 （一）、真菌主要特征 1、真核生物 2、营养体多为分支的丝状体，细胞壁主要成分几丁质，没有根、茎、叶分化。 3、繁殖产生有性孢子和无性孢子 4、营养方式异养 （二）真菌营养体 真菌典型的营养体是很细小而且分支的丝状体，单根菌丝成为菌丝（hypha），相互交织成的菌丝集合体称为菌丝体（mycelium）。 （三）菌丝的变态 1、吸器（haustorium）短小分支，从寄主细胞内吸收养分的菌丝变态结构，不穿破寄主原生质膜，主要功能是增加寄生真菌吸收营养的面积，提高自寄主细胞吸收养分的效率。 2、附着胞（appressorium）是植物病原真菌孢子萌发形成的芽管或菌丝顶端的膨大部分，常分泌黏液而牢固地附着在寄主表面，同时其下方产生侵入钉穿透寄主角质层和细胞壁。 3、假根（rhizoid）真菌菌体的特定部位长出多根有分支的根状菌丝称作假根，可以伸入基质内吸取养分，并固着菌体。如根霉属（Rhizopus）。 4、附着枝（Hyphopodium）菌丝两侧长出1-2各细胞的耳状结构，吸收营养和固定菌体的功能。 5、菌环和菌网 捕食性真菌常由菌丝分支特化成菌丝或菌网组织来捕捉线虫等小动物，然后再由菌丝侵入线虫体内吸取营养。
一、酿造干白葡萄酒的酵母 （一）、VL1 （1）葡萄品种：用于各种白葡萄品种 （2）酿酒特性：酒精发酵过程中生成的乙烯苯酚特别少，尤其遇到光照不足、降雨量多的年份，部分腐烂的葡萄用该菌种是最佳的首选，可限制乙烯苯酚的产生。 （3）风格：该菌种能最大限度地将葡萄含有的天然芳香物质和产地的种植土壤特点在酒中得以还原。从而使获得的葡萄酒幽雅芬芳，丰满肥硕。 （4）酿酒类型：浓郁高端耐久存干白。 （二）、VL3 （1）葡萄品种：霞多丽等。 （2）酿酒特性：该菌种可以显示和优化各种白葡萄酒的芳香潜力。通过它对葡萄酒中香味母体的作用，其酶促结构使它显示各种特性香味。 （3）风格：具有黄杨和黑醋栗的芽等香味，浓郁丰富，令人喜爱。 （4）酿酒类型：浓郁顶级耐久存干白。 （三）、ST （1）葡萄品种：琼瑶浆等。 （2）酿酒特性：该菌种和SO2的结合潜力低，并且非常灵敏，容易使发酵停止，具有达到15%酒精发酵能力，挥发酸、硫化氢聚集较少。 （3）风格：完美和谐，口感均衡。 （4）酿酒类型：高档甜型葡萄酒。 （四）、BO213 （1）葡萄品种：各种白葡萄 （2）酿酒特性：适用于低温发酵的甜葡萄酒和白葡萄酒，具有抵抗高酒度的良好特性。特别是具有再启动停止发酵的巨大潜力。 （3）酿酒类型：停止发酵的再启动。 （五）、CY3079 （1）葡萄品种：霞多丽、雷司令、贵人香、白品乐等。 （2）酿酒特性：起酵缓慢、发酵平稳，挥发酸、硫化氢聚集较少，泡沫低、沉淀好，发酵结束后具有陈酿的酒泥香。 （3）风格：新鲜的黄油味、烤面包、蜂蜜、坚果、香子兰和杏仁等香味，陈酿的酒泥香伴有烤面包、榛子和木质对等香气特点。 （4）酿酒类型：浓郁顶级耐久存干白。 （六）、R-HST （1）葡萄品种：雷司令、贵人香。 （2）酿酒特性：发酵力强，在较低温度下迅速启动，既能保留葡萄品种固有的新鲜果香，又能提高结构感，也适合陈酿。 （3）风格：能展露出雷司令、贵人香等品种的典型性香气，果香浓郁、醇和爽口、酒体完整、回味延绵，陈酿后表现亦佳。 （4）酿酒类型：醇香中短期陈酿高档干白。
葡萄酒的发酵过程 葡萄酒的发酵过程一、酒精发酵(alcoholic fermentation) 这是一种由酵母参与，将糖转化成酒精和二氧化碳的过程。这个过程的另一个副产物是热量和风味物质。如果外界温度低于5℃，酒精发酵便无法开始。在合适的温度下，当所有的糖分消耗殆尽，或者酒精度过高(通常为15度)导致酵母死亡时，酒精发酵就会停止。如果糖分或酵母的养分已经耗尽，酒精发酵也会停止。如果温度达到35-38℃，酿酒师可以通过多种方式停止酒精发酵，如添加二氧化硫杀死酵母;或添加一些酒精，使葡萄酒的酒精度提升到15度;或冷却葡萄酒后过滤掉酵母。如果酒精发酵初期的糖浓度很高，酒精发酵也会无法进行(如甜型葡萄酒的发酵)。一般情况下，酒厂会先将葡萄破碎后，再加入酵母进行酒精发酵。其中最重要的酵母菌株是酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)，因为它可以忍受高含量的酒精度和二氧化硫，并且可以为葡萄酒增加香气。许多生产商会通过添加二氧化硫的方式来抑制外界酵母(ambient)的数量，而使用人工培养的酵母菌株来代替。外界酵母虽然可以令葡萄酒的香气更为精致，但是这种酵母却很少受酿酒师的控制。最糟糕的是，一些不合适的酵母可能会产生一些不愉快的香气，最终导致酿好的葡萄酒无法进行销售。 通过使用筛选好的培养菌株，酿酒师可以更好的控制酒精发
酵，他们可以根据需要的风味特征来选择酵母菌株。当外界酵母被二氧化硫控制后，酿酒师会添加一些筛选好的酵母菌株，它们可以快速地控制酒精发酵。一些酿酒师认为，只使用一种酵母会减少葡萄酒风味的复杂性。温度控制对酿酒来说非常重要，因为发酵过程中会产生热量，过热的环境可能会导致酵母菌死亡。低温发酵可以避免一些精致香气的损失，促进白葡萄酒中水果风味的发展。较高的发酵温度常与“咸香”风味联系起来，且对颜色浸渍和单宁提取来说都非常重要。人们会通过监控发酵罐(发酵桶)的温度，来确保发酵在合适的温度下进行。精确的温度控制，对最终酿成葡萄酒的品质非常重要。 二、苹果酸-乳酸发酵(malolactic fermentation，简称mlf) 一旦酒精发酵结束，苹果酸-乳酸发酵就会开始。乳酸菌会将葡萄酒中的苹果酸转化为乳酸，并产生风味物质和二氧化碳。所有的红葡萄酒都会进行苹果酸-乳酸发酵，但是有一些白葡萄酒会避免这个过程。苹果酸-乳酸发酵可以柔化葡萄酒的尖酸味道，并降低酸含量，这个过程也是一些风味物质(如黄油、榛子)的来源。另一方面，一些纯净、新鲜的水果香味也会随之消失，白葡萄酒会变得丰富、圆润、柔顺，不过新鲜的味道会减弱。如果酒精发酵后不添加二氧化硫，或者适当升高温度，可以促进苹果酸-乳酸发酵的进行。反之，添加二氧化硫，过滤葡萄酒中的菌类，低温的环境也会阻止苹果酸-乳酸发酵的进行。 白萄酒的酿造过程1、采收： 白葡萄比较容易被氧化，采收时必需尽量小心保持果粒完整，以免影响品质。
酵母菌的生活史 上代个体经一系列生长、发育阶段而产生下一代个体的全部过程，称为该生物的生活史或生命周期。 各种酵母的生活史可分为三种类型： 1. 单倍体型 2. 双倍体型 3. 单双倍体型 1、单双倍体型 单双倍体型 以啤酒酵母为代表 特点：单倍体营养细胞和双倍体营养细胞均可进行芽殖。营养体既可以单倍体形式也可以双倍体形式存在；在特定条件下进行有性生殖。 单倍体和双倍体两个阶段同等重要,形成世代交替 2、单倍体型 单倍体型 以八孢裂殖酵母为代表 特点:营养细胞是单倍体；无性繁殖以裂殖方式进行；双倍体细胞不能独立生活，因为双倍体阶段短，一经生成立即减数分裂。 3、双倍体型 以路德类酵母为代表 特点：营养体为双倍体，不断进行芽殖，双倍体营养阶段长，单倍体的子囊孢子在子囊内发生接合。单倍体阶段仅以子囊孢子形式存在，故不能独立生活。 （六）上面酵母与下面酵母 并非分类学上的名称，而是在啤酒酿造业中根据酵母菌在容器内的情况而对酵母菌株进行的分类： 上面酵母——在发酵过程中细胞浮游在液体上层，是较活跃的发酵剂； 下面酵母——在发酵过程中细胞沉于容器底层，是较缓慢的发酵剂。 （七）噬杀酵母 噬杀酵母——是指某些在其生长繁殖过程生长能向菌体外分泌一种称作噬杀毒素的毒性蛋白的酵母菌株。噬杀酵母对噬杀毒素具有免疫力。噬杀酵母能杀死同族及亲缘酵母，这种特性为一般物质抗生物质所没有。 中性菌株——既不能杀死别的酵母，也不能被噬杀酵母杀死的酵母菌株。 敏感酵母——可以被噬杀酵母杀死的酵母菌株。 酵母菌的代表属 1、酵母菌属 例：啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) 2、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces spp.) 3、假丝酵母属(Candida spp.) 例：热带假丝酵母(Candida tropicalis)、解脂假丝酵母和产朊假丝酵母 4、球拟酵母属 5、红酵母属
Acetobacter aceti 醋化醋杆菌 Acetobacter pasteurianus 巴氏醋酸杆菌 Actinomyces bovis 牛型放线菌 Aspergillus flavus 黄曲霉 Aspergillus niger 黑曲霉 Aspergillus oryzae 米曲霉 Azotobactern chroococcum 褐球固氮菌 Bacillus anthracis 炭疽芽孢杆菌 Bacillus cereus 腊样芽孢杆菌 Bacillus megaterium 巨大芽孢杆菌 Bacillus subtilis 枯草芽孢杆菌 Bacillus thuringiensis 苏云金杆菌 Bacterioides fragilis 脆弱拟杆菌 Bacterium casei 乳酪杆菌 Beauveria bassiana 白僵菌 Candida utilis 产朊假丝酵母 Chlamydia pneumoniae 肺炎衣原体 Chlamydia psittaci 鹦鹉热衣原体 Chlamydia trachomatis 沙眼衣原体 Clostridium acetobutylicum 丙酮丁醇羧菌Corynebacterium glutamicum 谷氨酸棒杆菌Corynebacterium pekinese 北京棒杆菌 Diplococcus pneumoniae 肺炎双球菌 Escherichia coil 大肠杆菌 Fusarium solani 腐皮镰刀霉 Geotrichum candidum 白地霉 Gibberella fujikuroi 腾仓赤霉 Hansenula anomala 异常汉遜酵母Lactobacilus bulgeriaus 保加利亚乳杆菌 Lactobacilus lactis 如酸乳杆菌 Lactobacterium delbrllckii 德氏乳酸杆菌 Leuconostos mesenteroides 明串珠菌 Micrococcus aureus 金色微球菌 Micrococcus lysodeikticus 溶壁微球菌Micromonospora echinospora 棘袍小单孢菌Micromonospora purpura 绛红小单孢菌 Mucor mucedo 大毛霉 Mucor racemosus 总状毛霉 Mucor rouxianus 总状毛霉 Monascus purpureus 紫色红曲霉Mycobacterium tuberculosis 结核分枝杆菌 Neisseria gonorrhoeae 淋球菌 Neurospora crassa 粗糙脉孢霉，俗称红色面包霉Nocaridia asteroides 星状诺卡氏菌
裂殖壶藻在水产养殖中的作用及其开发 裂殖壶藻（Schizochytrium），又名裂殖壶菌、裂壶藻，属于真菌门、卵菌纲、水霉目、破囊壶菌科的一类海洋真菌，单细胞、球形（Nakahara 和Yokochi,1996）。裂殖壶藻细胞富含大量对人体有用的活性物质，如油脂、色素、角鲨烯等。对裂殖壶藻营养成分研究分析表明，其生化组分主要为脂类、蛋白和总糖，其中脂肪含量可占细胞干重50%以上，而ω-3 不饱和脂肪酸DHA 就高达20%以上（李美玉等，2012;朱路英等，2007）。 裂壶藻能够在异养条件下培养，易于大规模商业化生产，还可通过培养基及发酵工艺的调整来控制细胞内的DHA 含量，是一种富含DHA的重要资源。 1 裂殖壶藻在水产养殖中的应用途径 研究表明，保证饲料中充足的DHA,可显着提高鱼、虾、蟹等水产动物对环境变化的忍耐力，降低白化病发病率，从而提高存活率，并促进生长发育。国内一些裂殖壶藻产品的生产企业也相继开展了一系列裂殖壶藻DHA 的应用试验，主要是在水产饲料中的添加效果方面，表明裂殖壶藻DHA 对改善虹鳟、鲟鱼、石斑鱼的鱼卵孵化率，以及鱼苗成活率、肉质、肉色、饵料系数、鱼肉DHA含量等均具有良好的效果。 1.1 直接投喂新鲜藻液裂殖壶藻体型微小（4 ~13 μm），可作为水产动物苗种的直接开口饵料，其富含DHA 且易于培养、产量高。直接投喂，相当于婴儿母乳，可作为一种高DHA 含量的优良强化饵料，提高苗种生长性能和成活率。大量研究表明，多数虾蟹贝及部分鱼类的幼体阶段大多以植物性饵料为食，单细胞藻类的种类、数量与质量直接决定其人工育苗的成败（王维娜等，2000）。孙杰等（2008）通过微藻与西施舌混养不仅降低了水体中氨氮质量浓度，而且提高了幼贝的成活率及生长量。朱路英等（2009）研究表明，裂殖壶藻可作为海水仔稚鱼、牡蛎等贝类的一种高DHA 含量的优良强化饵料。 1.2 作为配合饲料的营养添加剂规模化培养富含DHA 的裂殖壶藻，经过处理可作为仔鱼等基础饲料的营养强化添加剂，即微藻DHA 饲料。焦建刚等（2014）研究表明，在对虾基础饲料中0.5%的裂殖壶藻发酵粉可明显促进其生长，降低饲料系数（FCR）3.4%, 同时提高了肌肉中蛋白（约2%）及DHA（约1%）的含量,从而改善对虾品质。Matthew 等（2007）研究表明，在大西洋鲑鱼的饮食中用裂殖壶藻油替代鱼油可显着提高鱼肉组织中的DHA 含量。Ganuza 等（2008）也指出了裂殖壶藻作为鱼油DHA 替代资源在金头海鲷养殖上的巨大潜力。Li 等（2009）通过在斑点叉尾鮰饲料中添加裂殖壶藻粉的研究表明，其可增加鱼的体重及饲料转化率（FCR），2%的添加量可显着提高肌肉中的DHA 和总ω-3 长链多不饱和脂肪酸（LC-PUFAs）水平。黄亮华等（2014）研究发现，饲料中添加裂殖壶藻粉能提高刺参的生长性能，并可明显提高其体腔液中超氧化物歧化酶（SOD）、酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、溶菌酶（LZM）等的活性;1.25%的添加量可显着提高肠道蛋白酶、淀粉酶的活性，刺激其生长。 1.3 对动物性水产饵料进行营养强化一些用于投喂鱼虾等幼体的动物性饵料如轮虫、卤虫、桡足类和枝角类等水产养殖次级饵料生物，相当于婴儿食品，其本身缺乏足量的DHA,但在投喂之前，可先用富含PUFA 的裂殖壶藻进行营养强化，提高次级饵料的营养值，从而达到促进鱼虾生长、提高存活率等效果（Takashi Yamasaki 等，2007）。 以经过裂殖壶藻强化的卤虫喂养半滑舌鳎稚鱼的研究发现，其体长、体重、碱性磷酸酶和类胰蛋白酶活力以及T3和T4水平等都显着优于对照组（马静等，2012）。通过采用裂殖壶藻对褶皱臂尾轮虫进行营养强化研究也表明，添加量为80 mg/L时，12 h 后轮虫体内的DHA/FA 值为13.44%,干燥轮虫粉中DHA 含量为8.14 mg/g, 与对照组相比轮虫密度增长