免疫学技术原理与应用
PAIT-11
淋巴细胞功能测定
孙汭
中国科技大学生命科学学院
免疫学研究所
PAIT-11
淋巴细胞功能测定
一、常用的淋巴细胞功能测定
二、T淋巴细胞功能测定
三、B淋巴细胞功能测定
四、NK细胞细胞毒试验
一、常用的淋巴细胞功能测定
1、淋巴细胞增殖实验
①3H-TdR掺入法
原理：淋巴细胞在丝裂原或特异性抗原刺激下转化为淋巴母细胞，发生转化过程中，细胞DNA合成大量增多。此时在细胞培养液中加入氚标记的胸腺嘧啶核苷（3H-Thymidine riboside, 3H-TdR), 使3H-TdR掺入新合成的DNA中，经β-液体闪烁仪检测淋巴细胞DNA 的3H-TdR掺入量，根据掺入细胞内的核素的量可判断淋巴细胞增殖的程度。
②MTT比色法
原理：MTT（（3-4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯基溴化四唑）是一种黄色可溶性噻唑盐，掺入细胞后，在细胞活化增殖时通过线粒体能量代谢过程，MTT代谢形成蓝色的甲攒（Formazan)沉积于细胞内或细胞周围，形成甲攒的量与细胞增殖程度成正相关。甲攒经异丙醇溶解后呈紫蓝色，借助酶标仪测定OD值，可反映细胞增殖水平。
2、细胞毒实验
①51Cr释放法
原理：用放射性核素51Cr（Na251-CrO4，鉻酸钠）标记靶细胞，51Cr即可进入靶细胞，与胞浆蛋白结合。然后将51Cr标记的靶细胞与待检细胞（效应细胞）共同孵育一定时间后，若待检细胞能够杀伤靶细胞，则51Cr从靶细胞释放出来。51Cr的释放量与效应细胞的活性成正相关。即靶细胞被杀伤的越多，释放到上清中的游离51Cr越多，用 计数仪测定上清中51Cr的放射活性（cpm）值，以计算待检细胞的细胞毒活性。
（一）、用51Cr铬酸钠标记靶细胞
1．用RPMI-1640培养液洗涤107靶细胞，去上清液。用0.5ml不含碳酸氢钠的完全培养液悬浮细胞。加入100μCi（3.7MBq）51Cr铬酸钠，37℃水浴中标记1小时，每5～10分钟摇晃一次，混匀细胞。
2．用RPMI-1640培养液洗涤细胞3次，每次400×g 10分钟。用50ml RPMI-1640培养液悬浮细胞，置37℃水浴30分钟，以减少非特异的自然释放。
3．离心200×g 10分钟，去上清液。小心用RPMI-1640培养液悬浮细胞，尽量减少振荡引起的细胞损伤以降低靶细胞的自然释放率，将细胞浓度调整为0.5×105或1×105/ml备用。
（二）、4小时51Cr释放实验
1．在96孔圆底细胞培养板中加入51Cr标记的靶细胞，每孔加100μl。
2．向各孔加100μl效应细胞，效应细胞与靶细胞的比例（效靶比，E：T）根据要求而定，通常为5：1～50：1。阴性对照孔（自然释放）不加效应细胞只加100μl完全培养液，阳性对照孔（最大释放）中加100μ1％NP40（或2％SDS，1mol/L盐酸）。每个实验置三个复孔。
3．稍稍离心培养板（100×g 3分钟）后，置37℃5％CO2的二氧化碳培养箱中培养4小时。
（三）、放射性活性（cpm) 测定和特异性杀伤活性的计算
离心培养板200×g 10分钟，每孔吸出100μl上清液置一次性使用的检测管中，在γ－计数仪上（或液闪计数仪上）测定上清液中的每分钟放射性活性（cpm值）。
（实验组cpm－自然释放组cpm）
细胞毒性（％）＝×100％
（最大释放组cpm－自然释放组cpm）
②CFSE法
原理：根据CFSE 和PI两种荧光染料的光谱不重叠的特性，用流式细胞仪在FL1 和FL3 通道可区分CFSE 和PI (碘化丙碇)，用CFSE 和PI 同时标记靶细胞, CFSE标记靶细胞, PI 标记DNA，如果细胞膜已破坏的靶细胞则PI+。E：T为50∶1～25∶1 ,共孵育2～4h,流式细胞仪收集1 000 个靶细胞并测定被杀细胞的百分率。
优点：CFSE/PI 双荧光染料标记的流式细胞分析检测细胞毒具有多个优点:避免放射性试剂的应用,敏感性增强,单细胞水平的分析。
（一）、用CFSE标记靶细胞
YAC-1 cells was used as targets. Target cells were labelled with CFSE for 10 min at 37 ?C and 5% CO2 using a final concentration of 7.5mmol/l. After labelling, the cells were washed once and diluted in CM.
（二）、杀伤实验
Effector (E) and target (T) cells were mixed to a final volume of 200 μl in CM 10 ng rrIL-2 was added to all tubes except control samples with target cells only. The tubes were mixed and spun down at 120×g for 2 min. The samples were incubated in a water bath at 37 ?C and 5% CO2 for 18–20 h.
At the end of the incubation time, the samples were put in an ice water bath and 50 μl, 50 μg/ml, propidium iodide (PI) (Sigma, Sweden) was added for DNA labelling of dead cells. The samples were then incubated for 5 min and analysed by flow-cytometry within 60 min.
Percentm specific target cell death
dead targets in the sample (%) ? spontaneously dead targets (%) (cytotoxicity%) = ×100
100 ? spontaneously dead targets (%)
The proportion of spontaneously dead targets normally varies between 2 and 7%
二、T淋巴细胞功能测定
1、T淋巴细胞增殖实验
①形态学方法-T淋巴细胞转化实验
原理：人或小鼠T细胞表面有PHA或ConA受体，T细胞在体外受PHA或ConA的刺激后能转化为体积较大、代谢旺盛、且能进行分裂的淋巴细胞，以此测定T细胞的功能。
②CFSE
Fig. 1. CD4+CD25? T cell proliferation monitored using CFSE labeling. CFSE labeled
CD4+CD25? T cells (2×104 c/well) were cultured in the presence of autologous irradiated PBMC (feeder cells) and were either unstimulated (A) or stimulated with anti-CD3 Ab (2 μg/ml) (B). After 5 days, cells were harvested, stained for CD4 expression and analyzed by means of flow cytometry. Target cells (ratio 1:0) were gated by a combination of forward and side scatter signal (lymphocyte gate) and bright CD4+ signal (CD4+ T cell gate). Prelabeling (harvested) cells with 7-AAD demonstrated that N95% of cells in the CD4+ T cell gate were viable (7-AAD negative; data not shown). CFSE histograms from one representative HC is shown (n=5). Cells under M1 represent non-divided CFSE labeled responder cells whereas others bins (M2-M6) indicate daughter cell populations which have subsequently lost half of their CFSE signal with each division round.
Journal of Immunological Methods 322 (2007) 1–11
③Mitogen assay
Figure 8. Effects of rhPRL on splenic T-cell mitogen responsiveness after congenic bone marrow transplantation.
C57BL/6-Ly5.1 mice received 950 cGy total body irradiation followed by infusion of 1 million
C57BL/6-Ly5.2 congenic mice then received PBS or 50 g rhPRL 5 times per week IP for 3 weeks. Mice were euthanized at day 21 and spleen cells proliferative response to ConA was measured, as described in “Materials and Methods.” Data shown are from 3 separate experiments. *P<.05; ***P <.001 compared with PBS-treated controls.
Biology of Blood and Marrow Transplantation 9:426-434 (2003)
2、抗原特异性T细胞检测
原理：抗原肽-MHC分子四聚体是根据T细胞活化的双识别原理，用生物工程技术将MHC分子在体外组装，并结合抗原表位肽，形成抗原肽-MHC分子复合物。用生物素标记的抗原肽-MHC分子复合物与荧光标记的亲和素结合，由于一个荧光标记的亲和素能结合4个生物素分子，这样将4个抗原肽-MHC分子复合物组装在一起，成为四聚体。用流式细胞技术即可确定待检标本中抗原特异性T细胞的频率。MHC I类、MHCII类分子和CD1d分子与抗原肽形成的四聚体复合物可分别鉴定表达特异性TCR的CD8+T细胞、D4+T细胞和NKT细胞。
Figure 5. Csf-2 Controls Functional Maturation of iNKT Cells in a Cell-Intrinsic Manner (A) Radiation BM chimeras were generated as indicated, and 8 weeks after transplantation, iNKT cell numbers were monitored in the thymus, spleen, and liver. Numbers within plots represent % iNKT cells among total lymphocytes. Representative of two independent experiments. Immunity 25, 487–497, September 2006
3、细胞因子检测
①ELISport
Figure 4. Administration of Csf-2 during Development but Not in the Periphery Rescues iNKT Cell Function
(B) Splenocytes from C57BL/6, Csf-2-, and CD1d1-deficient mice were stimulated with 100
ng/ml aGC+Csf-2 for 4 days. IL-4 and IFN-g secreted by activated iNKT cells were measured by ELISA after 1, 2, 3, and 4 days. Representative results from 2-day culture are shown (left). Splenocytesfrom C57BL/6, Csf-2-deficient mice were similarly stimulated for 24 hr, and secreted IFN-g was captured and detected by ELIspot assay (right). Representative of two independent experiments performed in triplicates; bars indicate mean 6 SEM.
Immunity 25, 487–497, September 2006
②FACS
Figure 6. Csf-2 Controls Development of Rapid Cytokine Secretion by Activated iNKT Cells
(A) Csf-2+/2 and Csf-22/2 mice were injected i.p. with 5 mg aGC (open histograms) or vehicle (gray histograms). After 2 hr, B220loCD3+ tetramer+ cells were electronically gated and intracellular IFN-g (top), and IL-4 (bottom) expression was monitored. Numbers refer to
MFI. Representative of three independent experiments. Numbers represent MFI. (B) Splenocytes from Csf-2+/2 and Csf-22/2 mice were incubated with vehicle (gray histograms) or 100 ng/ml of aGC(open histograms) for 5 days. CD3+tetramer+ iNKT lymphocytes were identified and analyzed as described in (A). Representative of two independent experiments. Numbers represent geometric MFI.
Immunity 25, 487–497, September 2006
4、信号分子检测
Figure 1. iNKT Cells Express Functional Csf-2R
(C) Purified thymic 4get iNKT cells were activated with 100 ng/ml PMA and 2 mM ionomycin, 100 ng/ml rmCsf-2, or 100 ng/ml LPS. After 15 min, total and phosphorylated IkBa were determined by immunoblot. Representative of three independent experiments.
Immunity 25, 487–497, September 2006
三、B淋巴细胞功能测定
1、B细胞Mitogen assay-3H-TdR掺入法
Figure 6. Effects of rhPRL on splenic B-cell mitogen responsiveness after congenic bone marrow transplantation.
C57BL/6-Ly5.1 mice received 950 cGy total body irradiation followed by infusion of 1 million
C57BL/6-Ly5.2 congenic bone marrow cells. The mice then received PBS or 50 g rhPRL 5 times per week IP for 3 weeks. Mice were euthanized at day 21 and spleen cells proliferative response to LPS was measured as described in “Materials and Methods.” Data shown are from 3 separate experiments. * = P<.05; ** =P< .01 compared with PBS-treated controls.
Biology of Blood and Marrow Transplantation 9:426-434 (2003)
2、抗体形成细胞测定（溶血空斑实验）
原理：溶血空斑试验（plaque forming cell assay, PFC):是体外检测B淋巴细胞抗体形成功能的一种方法。原理是将绵羊红细胞（SRBC）免疫家兔或小鼠，取家兔淋巴结或小鼠脾脏制成细胞悬液，与高浓度的SRBC混合后加入琼脂凝胶中、，其中每个释放溶血性抗体的细胞可致敏其周围的SRBC，在补体参与下，抗体形成细胞周围的SRBC溶解，在其周围形成一个肉眼可见的空斑，一个空斑代表一个抗体形成细胞，空斑的数量反映机体的体液免疫功能。
3、抗体形成细胞检测-ELISport
4、信号分子检测
四、NK细胞细胞毒试验
1、ADCC实验
ADCC (Antibody dependent cell-mediated cytotoxicity) : 选用适当的靶细胞，加相应的免疫血清，再加入效应细胞，作用一段时间后，观察细胞被破坏的程度并推测效应细胞的ADCC 作用。常用的靶细胞为鸡、鸭、羊红细胞，也可用HeLa等传代细胞，检测方法：形态学检测法或51Cr释放试验检测靶细胞是否被破坏。ADCC试验用于检测NK细胞、巨噬细胞及中性粒细胞的细胞毒作用。
2、NK细胞的细胞毒实验-51Cr释放法
细胞介导的细胞毒试验-NK细胞的细胞毒实验: 将淋巴细胞作为效应细胞（NK）与相应的靶细胞作用，NK细胞一旦与靶细胞结合，即可被活化，发生细胞内颗粒重排，继而释放NK细胞毒因子（NKCF）、穿孔素等物质破坏靶细胞，一般历时4-6小时，可完成细胞毒作用。测定靶细胞生长情况即可判断效应细胞的活性。
测定方法：51Cr释放法
效应细胞:外周血淋巴细胞、动物脾脏淋巴细胞
靶细胞：人NK敏感细胞为：K562细胞株（人红白血病细胞）
小鼠NK敏感细胞为：Yac-1细胞株（小鼠T淋巴瘤细胞）
Fig 3. Cytotoxicity and cytolysis effector molecules of human NK-92 cells in the presence of PRL and cytokine. NK-92 cells were harvested immediately after 12 h incubation in the presence of PRL (100 ng/ml) plus IL-2 (10 U/ml) or plus IL-15 (10 U/ml). The NK cells were admixed with 51Cr-labeled K562 target cells for cytotoxicity at an effector to target (E:T) ratio of 10:1, 5:1, 2.5:1 and 1.25:1 as described in Materials and Methods (A, B).
Cell Research (2004); 14(1):67-73
3、Hepatic NK Cytotoxicity Assay
Purpose
The assay for measuring the cytotoxicity of hepatic MNCs against freshly isolated primary mouse hepatocytes by using a 4-hour AST release assay.
Cells
Target Cells: Fresh hepatocytes 1x104/100ul/well (96-well round-bottom plate)
Effect cells: Hepatic MNCs
Procedure
1.Separated hepatocytes: primary mouse hepatocytes were
isolated by perfusion of mouse livers with EGTA solution and digestion with 0.075% collagenase type I solution.
2.Separated hepatic MNCs: Hepatic MNCs isolated as effectors cells.
3Placed hepatocytes 1x104 cells/100ml (105/ml) and 100 ml hepatic MNCs at various ratios into 96-well round-bottom plates cultured in RPMI1640 medium with 10%FBS (total volume of 200 ml) for 4 hours at 37oC in a 5% CO2 incubator.
E:T (50:1) 25:1, 12.5:1, 6.25:1, 3.125:1, 1.6:1
Maximum release: 0.05% triton-100 in 10% FBS RPMI1640
Spontaneous : 10% FBS RPMI1640
4. The supernatant was harvested and AST activity was measured.
5. The specific cytotoxicity (%) was calculated as
AST experimental-AST spontaneous
Specific cytotoxicity (%) = x 100%.
(AST maximum-ASTspontaneous )
Figure 1. IL-6 treatment reduces the cytotoxicity of Con A-treated hepatic MNCs and NKT cells against primary mouse hepatocytes.
(A) and (B) C57BL/6 mice were intravenously (i.v.) administrated with saline or IL-6 (2μg/g), followed 6 hours later by injection (i.v.) of Con A (15 μg/g). After 2 hours, hepatic MNCs (panel A) or hepatic NKT cells (panel B) were isolated and their cytotoxicities were tested against primary hepatocytes from C57BL/6 mice at the indicated effector-to-target (E/T) ratios as described in “Materials and Methods.”
The Journal of Immunology, 2004; 172:
Review Question
1、淋巴细胞丝裂原反应的检测方法及原理
2、细胞毒试验有几种？简述其原理
3、抗原特异性T细胞检测的方法的特点及原理
4、如果研究一种新的蛋白质或药物对机体免疫功能的影响，怎样用所学过的免疫学方法进
行体内外研究？
Reading Paper Question
1、比较Figure 1和Figure 3 所用的两种杀伤方法有何不同？分别在什么样的研究中应用？
Figure 1. IL-6 treatment reduces the cytotoxicity of Con A-treated hepatic MNCs and NKT cells against primary mouse hepatocytes.
(A) and (B) C57BL/6 mice were intravenously (i.v.) administrated with saline or IL-6 (2μg/g), followed 6 hours later by injection (i.v.) of Con A (15 μg/g). After 2 hours, hepatic MNCs (panel
A) or hepatic NKT cells (panel B) were isolated and their cytotoxicities were tested against primary hepatocytes from C57BL/6 mice at the indicated effector-to-target (E/T) ratios as described in “Materials and Methods.”
The Journal of Immunology, 2004; 172:
Fig 3. Cytotoxicity and cytolysis effector molecules of human NK- 92 cells in the presence of PRL and cytokine.
NK-92 cells were harvested immediately after 12 h incubation in the presence of PRL(100 ng/ml) plus IL-2 (10 U/ml) or plus IL-15 (10 U/ml). The NK cells were admixed with 51Cr-labeled K562 target cells for cytotoxicity at an effector to target (E:T) ratio of 10:1, 5:1, 2.5:1 and 1.25:1 as described in Materials and Methods (A, B).
Cell Research (2004); 14(1):67-73
2、Figure 8的实验主要检测什么免疫功能？有什么意义？简述原理。
Figure 8. Effects of rhPRL on splenic T-cell mitogen responsiveness after congenic bone marrow transplantation.
C57BL/6-Ly5.1 mice received 950 cGy total body irradiation followed by infusion of 1 million C57BL/6-Ly5.2 congenic mice then received PBS or 50 mg rhPRL 5 times per week IP for 3 weeks. Mice were euthanized at day 21 and spleen cells proliferative response to ConA was measured, as described in “Materials and Methods.”Data shown are from 3 separate experiments. *P<.05; ***P <.001 compared with PBS-treated controls.
Biology of Blood and Marrow Transplantation 9:426-434 (2003)
3、Figure 5所用的标记方法与常规的表面标志标记有何不同？有何优点？在什么样的研究中应用？所检测的阳性细胞群代表的是什么细胞群？
Figure 5. Csf-2 Controls Functional Maturation of iNKT Cells in a Cell-Intrinsic Manner (A) Radiation BM chimeras were generated as indicated, and 8 weeks after transplantation, iNKT cell numbers were monitored in the thymus, spleen, and liver. Numbers within plots represent % iNKT cells among total lymphocytes. Representative of two independent experiments.
Immunity 25, 487–497, September 2006
Reference
1. Journal of Immunological Methods 322 (2007) 1–11
2. Immunity 25, 487–497, September 2006
3. Biology of Blood and Marrow Transplantation 9:426-434 (2003)
4. The Journal of Immunology, 2004; 172:
免疫组化在医学中的应用 免疫组化是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(或免疫细胞化学技术 免疫组化技术是用标记物标记的抗体与组织或细胞的抗原反应，结合形态学检查，对抗原作定性、定量、定位检测的技术。现广泛应用的有酶免疫组化、免疫金银组化、免疫电镜技术等。 免疫组化的分类 免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。 免疫组化实验所用的组织和细胞标本 实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。 其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。 免疫组化实验所用的抗体 免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。单克隆抗体是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。 免疫组化常用的染色方法 根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。这种方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素—抗生物素染色法最常用。 免疫组化操作步骤 免疫组化（LP 法）操作步骤： 1．切片常规脱蜡至水。如需抗原修复，可在此步后进行 2. 缓冲液洗3min/2 次。 3. 为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色, 将切片放在Hydrogen Peroxide Block 中孵育10-15 分钟。 4. 缓冲液洗5min/2 次。 5. 滴加Ultra V Block ，在室温下孵育5 分钟以封闭非特异性的背景染色。 （注：孵育不要超过10 分钟，否则会导致特异性染色降低。如果一抗的稀释液中含有 5 －10% 正常羊血清，这一步可以省略。） 6. 缓冲液洗5min/2 次。 7. 滴加一抗工作液37 ℃孵育1 －2 小时。（具体孵育时间和温度由试验者最终决定）
第十章免疫学应用 【学习建议】 本章内容介绍了如何应用免疫学理论和技术进行感染性疾病和非感染性疾病如超敏反应性疾病、自身免疫病、肿瘤、器官移植等疾病的预防、诊断和治疗。学习本章内容需掌握人工自动免疫和人工被动免疫的基本概念、特点、区别、用途、获得方式及常用制剂。熟悉应用人工免疫时的注意事项。了解免疫学检测的常用方法种类和用途。 【知识结构图】 【 一、免疫学预防 （一）特异性免疫的获得方式 （二）人工自动免疫和人工被动免疫 （三）用于免疫预防的生物制剂 二、免疫治疗 （一）免疫调节剂 （二）免疫抑制剂
三、免疫学检测法 （一）抗原抗体的体外检测法 （二）抗原抗体反应的特点及影响因素 （三）淋巴细胞的鉴定及其功能检测 1．T淋巴细胞数量和功能检测 2．B淋巴细胞数量和功能检测 【概念简释】 1．自然免疫：指机体通过自然方式获得的免疫力，包括自然自动免疫和自然被动免疫。机体受到各种病原微生物的感染后所自主产生的特异性免疫称为自然自动免疫。机体在胚胎期和婴儿期通过胎盘和母乳获得的来自母体的免疫力称为自然被动免疫。 2．人工免疫：机体通过人工接种疫苗、类毒素或注射抗毒素、免疫效应细胞等物质所获得特异性免疫力的方式称为人工免疫。人工免疫包括人工自动免疫和人工被动免疫，通常用于免疫预防和免疫治疗。 3．主动免疫（自动免疫）：机体本身接受抗原性异物刺激后产生特异性免疫应答而建立的免疫。主动免疫的获得方式包括天然自动免疫和人工自动免疫。前者是通过隐性感染或患传染病后获得；后者是通过人工给予疫苗、类毒素后获得。 4．被动免疫：机体直接接受他人或动物产生的特异性免疫应答效应物质而立即获得的特异性免疫力。被动免疫包括天然（自然）被动免疫和人工被动免疫。前者是指母体内的抗体通过胎盘或初乳传递给胎儿或新生儿，使之被动获得免疫力。后者是将制备好的免疫物质如抗毒素、抗病毒血清等直接注入机体，使之被动获得某种特异性免疫力。 5．人工自动免疫：是指给机体接种疫苗、类毒素等抗原性物质，刺激机体免疫系统产生特异性免疫应答和免疫记忆，从而获得对某种病原的特异性抵抗力。人工自动免疫可长期、有效地预防传染病发生，但产生作用较慢。 6．人工被动免疫：是直接给机体注入免疫应答产物如含有特异性抗体的免疫血清，使机体立即获得免疫力，主要用于紧急预防和免疫治疗，但在体内维持时间较短。 7．生物制品：用于人工免疫和免疫诊断的生物制剂的总称，包括疫苗、类毒素、抗毒素、小分子免疫肽如转移因子、胸腺肽、细胞因子、免疫效应细胞、以及用于免疫诊断的制剂如诊断菌液、诊断血清等。 8．疫苗：由病原微生物或其抗原成分制备的人工自动免疫制剂统称为疫苗，包括由细菌制备的菌苗、由病毒、立克次体等制备的疫苗。根据疫苗所用的微生物制品的性状及制备方式，又可将疫苗分为活疫苗、死疫苗、亚单位疫苗、重组疫苗等不同类型。 9．活疫苗：采用毒力高度减弱或基本无毒的病原体株制备的疫苗，如碳疽菌苗、卡介苗、脊髓灰质炎疫苗、麻疹疫苗等。 10．死疫苗：选用抗原性强的病原体标准株人工培养，经物理或化学方法杀死或灭活后制备的疫苗。如狂犬疫苗、乙型脑炎疫苗等。 11．亚单位疫苗：提取病原体中可刺激机体产生保护性免疫的有效免疫原成分制备的疫苗。亚单位疫苗的优点是不含病原体核酸成分，避免了某些病毒的致癌危险。亚单位疫苗可以通过化学试剂裂解病原体提取有效成分制备，也可通过基因重组方法制备，如乙型肝炎病毒表面抗原制备的乙肝亚单位疫苗就是用基因重组方法制备的，因此也是基因工程疫苗。 12．合成疫苗：用人工合成的多肽抗原（含能诱导机体产生保护性免疫应答的抗原成分）连接在适当载体和佐剂上制备的疫苗。优点是可大量人工合成，避免了有些病毒不能人工培养制备疫苗的缺憾。 13．自身疫苗：从病灶中分离病原体，经处理制备成死疫苗后再给患者自身进行多次皮下注射，用于治疗反复发作、抗生素治疗无效的慢性化脓性感染，如葡萄球菌引起的慢性、顽固性感染。 14．类毒素：细菌外毒素经0.4％甲醛处理后，毒性消失而仍保留抗原性，称为类毒素。类毒
常用免疫学检验技术的基本原理 免疫学检测即是根据抗原、抗体反应的原理，利用已知的抗原检测未知的抗体或利用已知的抗体检测未知的抗原。由于外源性和内源性抗原均可通过不同的抗原递呈途径诱导生物机体的免疫应答，在生物体内产生特异性和非特异性T 细胞的克隆扩增，并分泌特异性的免疫球蛋白（抗体）。由于抗体－抗原的结合具有特异性和专一性的特点，这种检测可以定性、定位和定量地检测某一特异的蛋白（抗原或抗体）。免疫学检测技术的用途非常广泛，它们可用于各种疾病的诊断、疗效评价及发病机制的研究。 最初的免疫检测方法是将抗原或抗体的一方或双方在某种介质中进行扩散，通过观察抗原－抗体相遇时产生的沉淀反应，检测抗原或抗体，最终达到诊断的目的。这种扩散可以是蛋白的自然扩散，例如环状沉淀试验、单向免疫扩散试验、双向免疫扩散实验。单向免疫扩散试验就是在凝胶中混入抗体，制成含有抗体的凝胶板，而将抗原加入凝胶板预先打好的小孔内，让抗原从小孔向四周的凝胶自然扩散，当一定浓度的抗原和凝胶中的抗体相遇时便能形成免疫复合物，出现以小孔为中心的圆形沉淀圈，沉淀圈的直径与加入的抗原浓度成正比。 利用蛋白在不同酸碱度下带不同电荷的特性，可以利用人为的电场将抗原、抗体扩散，例如免疫电泳试验和双向免疫电泳。免疫电泳首先将抗原加入凝胶中电泳，将抗原各成分依次分散开。然后沿电泳方向平行挖一直线形槽，于槽内加入含有针对各种抗原的混合抗体，让各抗原成分与相应抗体进行自然扩散，形成沉淀线。然后利用标准的抗原－抗体沉淀线进行抗原蛋白（或抗体）的鉴别。上述的方法都是利用肉眼观察抗原－抗体反应产生的沉淀，因此灵敏度有很大的局限。比浊法引入沉淀检测产生的免疫比浊法就是利用浊度计测量液体中抗原－抗体反应产生的浊度，根据标准曲线来计算抗原（或抗体）的含量。该方法不但大大提高了检测的灵敏度，且可对抗原、抗体进行定量的检测。
浅谈免疫学在生物学、医学、药学等领域得应用 摘要:免疫学技术在国内外得应用已就是日趋广泛。近年来,由于任何有关抗原抗体得研究均可使用免疫技术,使免疫学技术早已超越了医学领域,广泛应用于植物学、动物学、药学、生物学等其她科学领域,免疫学技术本身也在迅速发展。免疫学就是生命科学及医学领域中得前沿学科,本文仅就免疫学在某些领域得具体应用做简要得评述。 关键词:免疫酶;免疫检测;免疫与中医药 一、免疫学在分子生物学中得应用 免疫学技术已从早年应用于微生物学发展到应用于分子生物医学研究得许多方面。目前,它已成为兴学科生物学研究得重要工具之一。在此次免疫技术涉及得分子生物学应用中,我们所涉及到免疫电泳技术、放射免疫技术、免疫酶技术、免疫荧光定位技术等等,我们就免疫酶技术做一概述。 免疫酶技术就是一项定位,定性与定量得综合性技术,已就是将一定得酶通过共价桥而标记抗体,在抗原抗体结合时,酶与底物作用,产生有色物质,对后者可进行定位或定量检测。现已有酶免疫测定法,酶联免疫吸附试验与均向酶免疫测定等方法。后一种方法就是利用游离抗原与标记抗原竞争结合抗体,如果游离抗原浓度高,就会抢去抗体,使供氢体得以接触酶而使酶得活性增加。用分光光度记可测出反应前后酶活性得变化。免疫酶技术如与新技术进一步结合,可提高其灵敏度与可靠性。
二、免疫学在医学中得应用 免疫学在医学中广泛应用于传染病预防,疾病治疗,免疫诊断。现代免疫学认为,机体得免疫功能就是对抗原刺激得应答,而免疫应答又表 现为免疫系统识别自己与排除非己得能力。免疫功能根据免疫识别发挥作用。这种功能大致有对外源性异物(主要就是传染性因子)得免疫防御;去除衰退或损伤细胞得免疫,以保持自身稳定;消除突变细胞得免疫监视,即免疫防御,免疫自稳,免疫监视。 免疫学细胞免疫测定。 近代免疫学广泛采用了细胞生物学、免疫血清学、免疫标记、免疫组化等多方面技术,不断发展与完善了一系列细胞免疫检测技术,用于 检测各类免疫细胞得表面标志(包括抗原及受体)、细胞得活化、增殖、吞噬、杀伤功能、各种细胞因子得活性或含量等方面。这些技术为深入研究与认识机体免疫系统得生理、病理改变,阐明某些疾病得发病机制与临床诊治提供了有用得手段。随着细胞免疫学得迅猛发展,时有新得细胞免疫检测技术出现。近年来,新发展得项目集中在对有关细胞因子以及细胞受体方面得检测。我们以此为例简述淋巴细胞转化试验。 淋巴细胞转化试验:人类淋巴细胞在体外与特异性抗原(如结核菌素)或非特异性有丝分裂原(如植物血凝素,PHA)等一起孵育,T细胞即被激活而向淋巴母细胞转化。T细胞转化过程可伴随有DNA、RNA、蛋白质得合成增加,最后导致细胞分裂。在光学显微镜下可计数转化后得
免疫组化是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应,即抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂(酶、荧光素、金属离子、同位素)显色来确定组织、细胞内抗原(多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及定量的研究,称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry,IHC)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry,ICC). 一、标本制备 石蜡切片:组织取材、固定、包埋,切片(一般的组织化学染色切片厚度要求5～7 μm,常规病理切片2～3 μm) 二、实验试剂 PBS、柠檬酸三钠?2H2O、30%H2O2、柠檬酸、山羊血清、第一抗体、第二抗体 三、操作步骤: 1)常规石蜡切片脱蜡至水 2)PBS洗 3次,5分钟/次. 3)抗原修复:用0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH6.0)于微波炉(750W煮沸3分钟,90W11.5分 钟)修复后,组织切片自然晾至室温. 4)封闭内源性过氧化物酶:3%H2O2室温湿盒孵育10分钟. 5)PBS洗3次,5分钟/次. 6)正常山羊血清室温湿盒封闭30分钟. 7)一抗孵育:将组织切片于稀释的一抗溶液中4℃湿盒孵育过夜. 8)室温复温15分钟. 9)1PBS洗 3次,5分钟/次. 10)二抗室温湿盒孵育30～60分钟. 11)PBS洗 3次,5分钟/次. 12)DAB显色,室温1～10分钟,显微镜下掌控. 13)ddH2O洗 3次,5分钟/次. 14)苏木素复染1～10分钟,1％盐酸酒精分化,显微镜下掌控. 15)脱水:95％乙醇2次,10分钟/次→无水乙醇2次,10分钟/次. 16)透明:二甲苯2次,10分钟/次. 17)中性树胶封片.
《免疫学基础》命题作业: 例举免疫学在生物学、医学、药学等领域的一项应用，并简述该应用的基本原理。 作业要求：（以下为举例，学生可另举说明）根据抗原的性质、出现结果的现象，参与反应的成分不同，可将抗原抗体反应分为凝集反应、沉淀反应、补体参加的反应、采用标记物的抗原抗体反应。其中，借助标记物的抗原抗体反应，用标记物标记抗体或抗原进行抗原抗体反应借以提高免疫学诊断的敏感性。免疫标记技术是用荧光素、酶、放射性核素或化学物质等标记抗体或抗原，进行的抗原抗体反应，是目前应用最广泛的免疫学检测技术。标记物与抗体或抗原连接后不改变其免疫特性，并提高了方法的灵敏度，具有快速、定性或定量，甚至定位等优点。 一、免疫学在生物学领域的具体应用 免疫学技术已从早年应用于微生物学发展到应用于分子生物医学研究的许多方面。目前，它已成为兴学科生物学研究的重要工具之一。在此次免疫技术涉及的分子生物学应用中，我们所涉及到免疫电泳技术、放射免疫技术、免疫酶技术、免疫荧光定位技术等等，我们就免疫酶技术做一概述。 免疫酶技术是一项定位，定性和定量的综合性技术，已是将一定的酶通过共价桥而标记抗体，在抗原抗体结合时，酶与底物作用，产生有色物质，对后者可进行定位或定量检测。现已有酶免疫测定法，酶联免疫吸附试验和均向酶免疫测定等方法。后一种方法是利用游离抗原与标记抗原竞争结合抗体，如果游离抗原浓度高，就会抢去抗体，使供氢体得以接触酶而使酶的活性增加。用分光光度记可测出反应前后酶活性的变化。免疫酶技术如与新技术进一步结合，可提高其灵敏度和可靠性。 二、免疫学在医学中的应用 免疫学在医学中广泛应用于传染病预防，疾病治疗，免疫诊断。现代免疫学认为，机体的免疫功能是对抗原刺激的应答，而免疫应答又表现为免疫系统识别自己和排除非己的能力。免疫功能根据免疫识别发挥作用。这种功能大致有对外源性异物(主要是传染性因子)的免疫防御；去除衰退或损伤细胞的免疫，以保持自身稳定；消除突变细胞的免疫监视，即免疫防御，免疫自稳，免疫监视。 免疫学细胞免疫测定：
免疫学在食品科学中的应用 吉林大学生物与农业工程学院 09级食品质量与安全 （45090729）
免疫学在食品科学中的应用 1.免疫学在食品检测中的应用 现今食品检测技术已日趋成熟，在可检出方法中挑选出快速、灵敏、准确，并且还能进行多组分分析的检测技术也就显得特别重要。免疫反应最大的特点是高度选择性，抗原抗体的亲和数通常为109或更高。作为一种分析手段，免疫分析技术操作简单、速度快、分析成本低，在食品安全检测中已表现出巨大的应用潜力。随着免疫技术的发展，标准化的抗体将会生产与供应；灵敏、抗干扰强的标记物和标记方法的发展；加上多残留组分免疫测定技术的应用和免疫分析的自动化；免疫分析技术与其他技术联用，分子印迹技术、流动注射免疫分析技术和免疫核酸探针技术等新方法在食品检验中的应用，免疫学检测技术必将在食品安全检验中发挥越来越重要的作用[1-2]。下面就介绍3种食品检测中常用的免疫学方法。 1.1免疫酶技术（Enzyme immunoassay EIA） 1.1.1基本原理 免疫酶技术[3]是将抗原、抗体特异性反应和酶的高效催化作用原理有机结合的免疫学分析技术，该方法可在细胞水平上进行抗原或抗体的定位研究，还可定性或定量地检测体内的半抗原、抗原或抗体。其原理是将酶与抗原或抗体用交联剂等结合起来，此种标记抗原或抗体可与组织内的或固相载体上的相应抗体或抗原发生特异性反应。底物加入相应酶时，底物被酶催化生成可溶性或不溶性呈色产物。可用肉眼或分光光度计定性或定量。根据呈色深浅，确定待测抗原或抗体的浓度与活性。不溶性呈色产物，则可用光学显微镜或电镜进行检测。 1.1.2主要特点及其在食品科学中的应用 免疫酶技术所用的酶要求纯度高、催化反应的转化率高、专一性强、性质稳定、来源丰富、价格不贵、制备成的酶标抗体或抗原性质稳定，继续保留着它的活性部分和催化能力。目前在食品科学中出现的许多快速检测沙门氏菌的方法是利用免疫酶技术。其中酶联免疫吸附试验已用于食品、饲料以及生物材料中黄曲霉毒素（AFT）测定。AOAC及IUPAC已将该方法列入了正式方法[4]。并且许多商品性试剂盒也被研制成功，应用于对AFT的快速检测。1.2放射免疫技术(Radio Immunoassay，RIA) 1.2.1基本原理 应用放射性同位素标记待测物，形成标记抗原。以一定量的标记抗原，与各种不同量的
第一章免疫学概论 1、机体的免疫功能：①免疫防御：防止外界病原体的入侵及清除已入侵病原体及其他有害物质（超敏反应/免疫缺陷病）；②免疫监视：随时发现和清除体内出现的“非己”成分，如由基因突变而发生的肿瘤细胞以及衰老、凋亡细胞（恶性肿瘤）；③免疫自身稳定：通过自身免疫耐受和免疫调节两种主要的机制来达到免疫系统内环境的稳定（自身免疫病）。 2、根据免疫应答识别的特点、获得形式以及效应机制，可分为固有免疫（先天性免疫/非特异性免疫）和适应性免疫（获得性免疫/特异性免疫）。 3、固有免疫和适应性免疫的比较 固有免疫适应性免疫 获得形式固有性（或先天性）获得性无需抗原激发需要接触抗原 发挥作用时相早期、快速（数分钟~4天）4~5天后发挥效应 免疫原识别受体模式识别受体（识别的是病原 体相关模式分子） 特异性抗原识别受体（由于细胞发 育中基因重排产生多样性） 免疫记忆无有，产生记忆细胞 举例抑菌、杀菌物质，补体，炎症 因子（效应分子：补体，溶 菌酶，细胞因子）吞噬细胞（单 核-巨噬细胞），树突状细胞， 粒细胞，NK细胞，NK T细胞 T细胞（细胞免疫-效应T细胞等） B细胞（体液免疫-抗体） 4、适应性免疫应答可分为三个阶段：①识别阶段：T细胞和B细胞分别通过TCR和BCR精确识别抗原，其中T细胞识别的抗原必须由抗原提呈细胞（APC）来提呈；②活化增殖阶段：识别抗原后的淋巴细胞在协同刺激分子的参与下，发生细胞的活化、增殖和分化，产生效应细胞（如杀伤性T细胞）、效应分子（如抗体、细胞因子等）和记忆细胞；③效应阶段：由效应细胞和效应分子清除抗原。 5、适应性免疫的三个主要特点：特异性、耐受性、记忆性。 6、关系：固有免疫往往是适应性免疫的先决条件；适应性免疫的效应分子可大大促进固有免疫应答。 7、免疫：是机体识别“自己”，排除“异己”过程中所产生的生物学效应的总和，正常情况下是维持内环境稳定的一种生理性防御功能。（是指机体免疫系统识别自身与异己物质，并通过免疫应答排除抗原性异物，以维持机体生理平衡的功能。） 第二章免疫器官组织 1、免疫系统的组成 免疫器官 免疫细胞免疫分子 中枢外周膜型分子分泌型分子骨髓脾脏干细胞系TCR 免疫球蛋白胸腺淋巴结淋巴细胞BCR 补体分子 法氏囊(禽类) 黏膜相关相关分子 单核巨噬细胞CD分子细胞因子 其他APC（树突状细胞、内皮细胞） 粘附分子 皮肤相关淋巴组织 MHC 其他免疫细胞（粒细胞、肥大细 胞、血小板、红细胞等） 其他
华南农业大学 免疫学课题论文 论文题目：免疫学基础知识及其应用姓名：郭伟雄 专业：生物技术 学号：201130700105 2013年10月20日星期四
目录 摘要………………………………………………………………………………I Abstract…………………………………………………………………………II 前言 (1) 1．免疫系统 (1) 1．1 免疫系统的定义 (1) 1．2 免疫系统的组成 (1) 1．2．1 免疫器官和组织 (1) 1．2．2 免疫细胞 (1) 1．2．3 免疫分子 (1) 1．3 人体的三道防线 (1) 1．3．1第一道防线 (1) 1．3．2第二道防线 (1) 1．3．3第三道防线 (1) 1．4 免疫系统的工作原理 (1) 1．5 免疫的功能 (1) 2．免疫与传染病 (2) 2．1 传染病的概念及其特点 (2) 2．2 传染病流行过程的基本环节 (2) 2．3传染病的预防措施 (2) 2．3．1管理传染源 (2) 2．3．2切断传播途径 (2) 2．3．3保护易感人群 (2) 3．安全用药 (2) 3．1 防止滥用药物 (2) 3．2 尽量少联合用药 (2) 3．3 按药品说明书使用 (2) 3．4 防止药物过敏 (2) 3．5 掌握剂量 (3) 3．6 用温开水服药 (3) 3．7 按时按要求服药 (3) 3．8 禁服过期药品 (3) 3．9 使用新药物时须慎重 (3) 4. 保护自己的免疫系统 (3) 5．总结 (3) 参考文献 (3)
摘要 从本质上讲，免疫是人体的一种生理性保护功能，人体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏和排斥进入人体的抗原物质，以维持人体的健康。它包括机体对异物( 病原生物性或非病原生物性的)的识别、排除或消灭等一系列过程。这种过程可能引起自身组织损伤，也可能没有组织损伤。概括起来说，免疫系统的功能主要表现为三方面，即防御功能、稳定功能及免疫监视作用，这些功能一旦失调，即产生免疫病理反应。本文主要对免疫系统，免疫与传染病，安全用药和保护自己的免疫系统进行了综述。 关键词：免疫；传染病；预防；安全用药 Abstract Essentially, immunization is a physiological protection function of the human body, human body relies on this kind of feature recognition "yourself" and "f" composition, undermining and rejection antigen, which entered the body material, in order to maintain the health of human body. It includes the body of foreign bodies (pathogenic biological or pathogenic biological) to identify, eliminate or wipe out and a series of process. This process may cause their own tissue damage, or may not have tissue damage. Said in summary, the function of the immune system is mainly characterized by three aspects, namely the defence function, stable function, and immune surveillance function, these functions once disorders, namely the immune pathological reaction. This paper mainly on the immune system, immune and infectious disease, medication safety and to protect our immune systems are reviewed. Keywords: immune; Infectious diseases; Prevention; Safe drug use
免疫检测的原理、方法和例子 生工0902 陈志国 0909030201 1.免疫学在食品检测中的应用 现今食品检测技术已日趋成熟，在可检出方法中挑选出快速、灵敏、准确，并且还能进行多组分分析的检测技术也就显得特别重要。免疫反应最大的特点是高度选择性，抗原抗体的亲和数通常为 109或更高。作为一种分析手段，免疫分析技术操作简单、速度快、分析成本低，在食品安全检测中已表现出巨大的应用潜力。随着免疫技术的发展，标准化的抗体将会生产与供应；灵敏、抗干扰强的标记物和标记方法的发展；加上多残留组分免疫测定技术的应用和免疫分析的自动化；免疫分析技术与其他技术联用，分子印迹技术、流动注射免疫分析技术和免疫核酸探针技术等新方法在食品检验中的应用，免疫学检测技术必将在食品安全检验中发挥越来越重要的作用[1-2]。下面就介绍 3 种食品检测中常用的免疫学方法。1.1 免疫酶技术（Enzyme immunoassay EIA） 1.1.1 基本原理 免疫酶技术[3]是将抗原、抗体特异性反应和酶的高效催化作用原理有机结合的免疫学分 析技术，该方法可在细胞水平上进行抗原或抗体的定位研究，还可定性或定量地检测体内的半抗原、抗原或抗体。其原理是将酶与抗原或抗体用交联剂等结合起来，此种标记抗原或抗体可与组织内的或固相载体上的相应抗体或抗原发生特异性反应。底物加入相应酶时，底物被酶催化生成可溶性或不溶性呈色产物。可用肉眼或分光光度计定性或定量。根据呈色深浅，确定待测抗原或抗体的浓度与活性。不溶性呈色产物，则可用光学显微镜或电镜进行检测。 1.1.2 主要特点及其在食品科学中的应用 免疫酶技术所用的酶要求纯度高、催化反应的转化率高、专一性强、性质稳定、来源丰富、价格不贵、制备成的酶标抗体或抗原性质稳定，继续保留着它的活性部分和催化能力。目前在食品科学中出现的许多快速检测沙门氏菌的方法是利用免疫酶技术。其中酶联免疫吸附试验已用于食品、饲料以及生物材料中黄曲霉毒素（AFT）测定。AOAC 及 IUPAC 已将该方法列入了正式方法[4]。并且许多商品性试剂盒也被研制成功，应用于对 AFT 的快速检测。1.2 放射免疫技术(Radio Immunoassay，RIA) 1.2.1 基本原理 应用放射性同位素标记待测物，形成标记抗原。以一定量的标记抗原，与各种不同非标记待测物和一定浓度的特异性抗待测物抗体相互作用，其反应遵照质量作用定律，标记待测
免疫学方法及其应用 1. 内容 1.抗原抗体反应的一般规律：特异性、可逆性、定比性、阶段性、条件依赖性 2. 抗原抗体间的主要反应：凝集反应、沉淀反应、补体结合试验、中和试验。 3.免疫标记技术：免疫荧光技术、免疫酶技术、放射免疫测定法、免疫电镜技术、发光免疫测定法。 2. 练习 一、填空 1.抗原、抗体反映的一般规律____、_____、______、_____和____ 答案：特异性，可逆性，定比性，阶段性，条件依赖性 2.可溶性抗原与其相应的抗体在合适的比例和适当的条件下的反应，并出现肉眼可见的 沉淀现象，成为____。 答案：沉淀反映 二、判断 1、免疫测定法包括面面免疫标记技术、免疫亲和层析、免疫定位分析、免疫生物传感 器技术等，其中尤其以免疫亲和层析技术的发展最快、应用最广。（） 答案：N 三、简答 1、什么是凝集反应？简述两种凝集反应的具体方法 答案：颗粒性抗原与相应的抗体在合适的条件下反映并出现肉眼可见的凝集团现象，称凝集反应。 方法：（1）直接法：包括玻片法和试管法等.（2）间接法：典型的间接凝集试验，基本原理是将可溶性抗原吸附到适当载体上，使其成为人工的“颗粒性抗原”，从而也会产生凝集反应而可用肉眼检出。 3. 测验 一、填空 1．由特异性抗体抑制相应抗原的生物学活性的反应，称为____。 2.补体结合试验的优点_____、________、_______。 二、简答 1.血清学反映的一般规律有哪些？试一一加以简介。
2.补体结合实验的基本原理是什么？有何优缺点？ 4. 案例 5. 资源下载 课程讲义资源（Word文档）、教学课件资源（PPT）、视频录像资源（视频录像）。 6. 扩展学习 使用教材： 微生物学教程第3版周德庆主编高等教育出版社2011 参考书目： 1.沈萍主编，《微生物学》，高等教育出版社，2000； 2.沈萍、范秀容、李广武编，《微生物学实验》第3版，高等教育出版社，1999； 3.Prescott LM, Harley JP, and Klein DA. Microbiology (5th ed.), Higher education press and McGraw-Hill Companies, 2002. 4. 闵航（2005）：微生物学. 浙江大学出版社 参考期刊： 微生物学报中国科学院微生物研究所；中国微生物学会主办 微生物学通报中国微生物学会；中国科学院微生物研究所主办 参考网址： 中国微生物信息网络hppt://159.226.80.1/chinese.html 中国微生物资源信息共享https://www.doczj.com/doc/1713289017.html,/sdinfo 中国微生物信息网络https://www.doczj.com/doc/1713289017.html,/