2010级博士病理学作业
姓名张海峰
专业病理学与病理生理学
学号1025041005
哺乳动物细胞自噬的研究方法
摘要：
细胞自噬参与多种生理和病理过程。因此，科学研究中需要对细胞自噬进行精确识别、定量以及对自噬过程进行操作。然而，因为细胞自噬是动态和复杂的过程，所以对其进行的分析经常是不准确的。在本文中，我们讨论监控细胞自噬和调控细胞自噬活动的方法，尤其关注哺乳动物细胞巨型自噬。
前言
过去十年，对称之为自噬的细胞基本生物学过程有了“爆炸”性的研究。细胞自噬过程中所必需的进化保守基因的发现（最先在酵母中确认），促使科学家揭示了一系列关于细胞自噬对内环境稳态、发育过程以及其他生理功能的影响。此外，更多的证据提示细胞自噬的异常可以引起很广泛的哺乳动物疾病(Levine and Kroemer, 2008; Mizushima et al., 2008)。因此，科学家就急迫需要对多种多样生物过程中的细胞自噬进行检测及功能研究，尤其是在哺乳动物中。
哺乳动物细胞自噬研究历来受两个主要因素的困扰。第一，用静态的检测手段捕获一个动态的过程本身就是一个困难，以及基于这些检测手段的生物学干预的先天性限制。第二，区分形态和功能是另一个挑战，在特定的生理条件下对细胞自噬的研究中，要避免由于检测手段的缺陷将这种生理功能认定为细胞自噬。过去我们对哺乳动物细胞自噬功能的误解主要是以上两种原因导致的。比如，在特定的神经、肌肉退行性疾病中，由于细胞自噬早期中间产物积累增多，似乎代表了细胞自噬通路后期阶段被抑制，这些疾病就被认为或部分被认为是由于细胞自噬增多引起（基于细胞自噬过程中早期中间产物数量的增多）(Levine and Kroemer, 2008; Mizushima et al., 2008; Rubinsztein, 2006)。细胞自噬是一种常见的细胞死亡过程中的形态特征，经常被错误的认定为是一种细胞死亡通路，然而现在可以明确细胞自噬主要功能之一是：在恶劣条件下，细胞自噬使细胞能存活(Kroemer and Levine, 2008)。
在阐明细胞自噬分子机制过程的研究中，由于新技术方法的发展和应用，过去研究细胞自噬的部分困难被克服。因此在过去十年里，针对细胞自噬动态过程
的观察和在特定细胞过程中研究调控细胞自噬功能的多种新技术应运而生。本文的目的是综述目前研究哺乳动物细胞自噬的各种实用技术以及这些技术在解释细胞自噬中的局限。关于每种技术的具体细节可以参照以下其他综述(Klionsky et al., 2008a; Mizushima, 2004; Mizushima and Y oshimori, 2007; Rubinsztein et al., 2009)。
细胞自噬引言
细胞自噬是一个描述包括细胞器在内的胞浆物质进入溶酶体而被降解过程的通用术语(Levine and Kroemer, 2008; Mizushima et al., 2008; Rubinsztein, 2006)。在巨型自噬、微型自噬和分子伴侣介导型自噬这三种细胞自噬类型中，巨型自噬的研究最为深入。分子伴侣介导型自噬过程中，胞质蛋白借助分子伴侣的蛋白折叠效应直接跨膜进入溶酶体。微型自噬涉及溶酶体膜的内陷，膜的内陷可以使一部分细胞质进入溶酶体。
巨型细胞自噬（文中以下部分简称细胞自噬）是本文关注的重点。从酵母到哺乳动物，细胞自噬是一个由自噬体介导的保守过程。起初，被称为独立膜或吞饮泡的小囊泡逐渐延伸并包裹胞浆，最后形成双层膜结构的自噬体（图1和图2）。随后，自噬体的外层膜与溶酶体融合形成自噬溶酶体，介导被包裹物质连同自噬体内层膜的降解。自噬体在于溶酶体结合之前也可以同内涵体融合。由自噬降解产生的氨基酸和其他小分子物质重新运回胞浆中被再利用或产能。以下描述的方法用于检测自噬过程的不同阶段的物质包括早期自噬体、自噬溶酶体和自噬降解产物，我们应该综合应用这些实验方法避免错误的解释实验结果，比如自噬中间产物的增多是否能说明细胞自噬的真正增加，或者自噬最后完成阶段的阻滞（图3和图4）。
在生理条件下，细胞自噬具有许多重要作用比如在饥饿状态、胚胎植入前和发育过程中维持氨基酸库的稳定、抑制神经退行性病变、抗衰老、肿瘤抑制、细胞内微生物的清除以及先天固有免疫和后天适应免疫的调节(Cecconi and Levine, 2008; Deretic and Levine, 2009; Levine and Kroemer, 2008; Mizushima et al., 2008; Rubinsztein, 2006) 。细胞自噬特征之一是它的动态调节；在基础状态下，细胞自噬水平很低，但是自噬可以被很多刺激因素明显激活。无论是从酵母到哺乳动物的培养细胞还是完整的有机体，细胞自噬最常见的诱导因素是营养饥饿。除了
饥饿激活细胞自噬外，激活细胞自噬的因素还包括其他生理性应激刺激（缺氧、能量消耗、内质网应激、高温和高密度环境）、激素刺激、药物刺激（雷帕霉素等其他化合物）、固有免疫信号分子和疾病包括细菌、病毒、寄生虫感染、急性胰腺炎、心脏病和蛋白沉积。相反，细胞自噬的抑制也往往与特定疾病相联系，包括癌症的亚型、部分神经退行性疾病和感染性疾病以及炎症性肠道疾病，细胞自噬功能降低是衰老的共同特征。由于细胞自噬与多种生理和病理过程相联系，细胞自噬研究中就需要更多的科学方法来确定（1）在特定的生物环境下细胞自噬是否存在、上调或抑制；（2）细胞基础自噬和/或修饰自噬是否参与并如何调节特定的生理或病理过程。
细胞自噬涉及一系列进化保守基因产物的参与，比如独立膜和自噬体形成所需要的Atg蛋白（表1）。自噬体形成分为两个主要步骤：独立膜成核阶段和延伸阶段。ULK/Atg1激酶复合物、自噬特异性PI3K激酶复合物和PI3P效应物以及同它们相关的蛋白在成核阶段起着重要作用，而Atg12-LC3/Atg8偶联系统在延伸阶段起着重要作用。此外，自噬体与溶酶体融合过程、溶酶体的酸化及溶酶体消化过程也需要其他蛋白参与，与自噬相关的具有整合环境因素的调节信号也参与这些过程中。有关自噬分子调节机制的具体细节可参考以下文献(He and Klionsky, 2009; Longatti and Tooze, 2009)。在哺乳动物细胞，大多数Atg蛋白（比如ULK1/2, Atg13, FIP200, Atg101, Beclin 1, Atg14, LC3, Atg12, Atg16L1）分布在独立膜上，在完整的自噬体上Atg蛋白分布较少(Longatti and Tooze, 2009)（图1和表1）。酵母Atg8的哺乳动物同源体微管相关蛋白轻链（LC3）是目前唯一发现存在于自噬体的蛋白，因此LC3蛋白广泛用于作为自噬体的标记物（图1和图4B）(Kabeya et al., 2000; Mizushima et al., 2004)。对细胞自噬过程的认识极大促进细胞自噬的检测（基于LC3的生物化学和显微镜的检测方法），同样也使对细胞自噬过程的操作成为可能（通过敲出或降低自噬基因的表达或者主要的自噬抑制蛋白基因的表达）。利用化学物质干预自噬体形成或下游的降解过程也使一种操作细胞自噬过程的方法（图1）。
检测细胞自噬活动
细胞内自噬体数量增多总是说明细胞自噬活动增加是一个普遍存在的错误概念。因为自噬体是动态过程中的中间产物，所以在任何特定时间观察到的自噬
体数量是代表自噬体产生效率和它们转变为自噬溶酶体效率之间的平衡。这样以来，自噬体的积累增多可能代表自噬活动被诱导，或者相反是由于自噬体形成的下游被阻断引起自噬体增多。比如，相对于基础水平的细胞自噬（图3A），细胞自噬激活后可以导致所有自噬中间产物的增多包括独立膜、自噬体和自噬溶酶体（图3B）。如果自噬体形成过程中的上游某个步骤被阻断，那么所有自噬中间结构产物的数量就会降低（图3C）。相反，当自噬体形成过程中的下游某个步骤被阻断，自噬结构的中间产物数量就会增多，而自噬溶酶体数量就会减少（图3D）。很明显，在这两个截然相反的情况下，自噬的激活（即增加自噬性降解）（图3B）和自噬过程下游被阻断（即减少自噬性降解）（图3D）都可引起自噬体数量增多。因此，简单的自噬体数量多少检测还不足以对自噬活动进行评估。甚者，应该利用不同的方法共同区分基础水平自噬、诱导性自噬、自噬上游水平的抑制和自噬下游水平的抑制。细胞自噬流是一个用来描述自噬体形成的动态过程、向溶酶体转移自噬性物质以及自噬性物质在溶酶体降解过程的术语。自噬流是显示细胞自噬活动的指标，比测定自噬体数量更为可靠。以下章节，我们讨论检测细胞自噬体数量和细胞自噬流的各种不同方法。
自噬体数量检测
目前，主要有三种方法用来定量检测自噬体数量，包括电子显微镜和光学显微镜检测LC3亚细胞定位，生物化学方法检测与自噬体膜相关的LC3。
电子显微镜
电子显微镜是最常用的研究方法，事实上哺乳动物细胞自噬就是1950年后期电子显微镜工作者研究溶酶体过程中发现的。在超微机构水平，自噬体被定义为是一个双层膜机构包裹着未被消化的胞浆物质，该双层膜结构没有与溶酶体融合（图2和图4A）。自噬体中经常包涵诸如线粒体和内质网碎片在内的细胞器。根据自噬体明确的定义，识别自噬体识别就很容易，因为这些细胞器包涵细胞内物质。然而，如何解释双层膜结构特异包裹细胞内病原体不是很清楚：一些病原体的生命周期经过了自噬样中间结构的转化，而最终没有进入溶酶体；在其他一些情况下，细胞内病原体进入自噬通路被溶酶体降解。自噬体传统经典定义也包括双层膜结构所包含的不同细胞内容物。这些都是巨型细胞自噬过程所描述的事情，然而还存在着细胞器特异性自噬比如过氧化物酶体自噬、线粒体自噬、核小
体自噬和内质网自噬等(van der Vaart et al., 2008)。因为哺乳动物细胞存在病原体特异性和细胞器特异性自噬，与传统的巨型细胞自噬不同，所以必须对基于形态学指标的自噬体检测重新审视。
相对于包含细胞内容物的自噬体而言，如何区分自噬溶酶体和具有膜结构的细胞组分经常比较困难。自噬溶酶体是由自噬体和溶酶体（或内涵体）融合而成的细胞器，具有限制性单层膜结构和包含了胞浆物质的不同阶段降解物。在早期，自噬溶酶体内容物可以识别其来源于胞浆，然而当降解比较完全时就很难识别其来源。甚者，自噬溶酶体和细胞内吞结构以及其他来源不清楚的囊泡结构之间的识别也往往很困难。尤其是没有或含有较少内容物的囊泡就不能认为是自噬结构。其他对自噬体错误解释的典型例子见以下综述(Eskelinen, 2008)。尽管电子显微镜是一个强大的工具，但因其在功能研究上的潜在局限性，所以电子显微镜不是完美的研究方法，其功能研究的局限性将在下文讨论。
荧光显微镜
利用电子显微镜技术评估自噬体要求研究者具备相当多的专业技能，逐渐被光学显微镜和生物化学方法所替代，后两种方法相对于不同领域科研工作者更容易做到。前文提到，哺乳动物自噬蛋白LC3作为自噬体的标记物（图1和图4B）。在四种LC3同源异构体中，LC3B最常被用作标记物。合成开始不久，初始LC3的C末端被Atg4加工变成LC3-I，LC3-I的C末端含有甘氨酸残基。随后，通过泛素样酶促反应LC3-I和磷脂酰乙醇胺（PE）结合变成LC3II（LC3-PE）。LC3-I 位于胞浆内，而LC3II位于自噬体外层和内层膜上（图4B）。自噬体与溶酶体融合后，外层膜上的LC3在Atg4裂解作用下离开膜，内层膜上的LC3被溶酶体酶降解，最终导致自噬溶酶体的LC3含量极低。因此，在荧光显微镜下观察到的内源性LC3或GFP偶联的LC3会弥散性分布在胞浆内，这些点状结构主要代表自噬体（图5A）。
尽管细胞中的含LC3或GFP-LC3的点状结构数量可以精确测量自噬体的数量，但这种方法有一些不足。首先是存在主观性，研究者需要建立和应用统一的标准来制定定量的方法和对斑块的定性标准。斑块结构的数量可以人工计数（要求计数人对实验条件不清楚）或者用电脑图像分析软件自动计数（Top Hat algorithm of MetaMorph version 7.0 by Molecular Devices, and G-Count by
G-Angstrom）。自噬激活后，这些斑块数量会明显增加，然而在正常情况下也会观察到少量斑块（图5A）。因此，含有GFP-LC3斑块的细胞有百分之多少的可能性是细胞自噬，这个标准并不合适（理论要求100%），除非建立一个清楚的可以有效区分自噬激活和自噬非激活状态的阈值；这样，只有斑块数量大于一定数量的细胞才可以被认为是自噬。总之，在对所有细胞进行评估时，该方法优于对每个细胞中GFP-LC3斑块平均数量的定量。细胞内GFP-LC3斑块总面积可以用图像软件分析，但在这种情况下，排除由于大的GFP-LC3斑块聚集而导致的实验误差是很重要的（见下）。
第二个不足是，当过表达LC-3或共表达易集聚性蛋白，GFP-LC3或甚者内源性LC3很容易集聚(Kuma et al., 2007)。荧光显微镜很难区分聚集的GFP-LC3和真正的自噬体。然而，一些特定的预防方法可以减少GFP-LC的集聚。推荐应用稳定的GFP-LC3转化细胞株，我们可以挑选能够适度表达GFP-LC3的克隆以避免集聚造成的假象。当GFP-LC3重组体被用来进行瞬时转染实验时，就需要采取一些方法避免过度表达GFP-LC3导致的集聚假象。此外，通过设立阴性对照组可以区分GFP-LC3非特性的集聚和GFP-LC3特异性的向自噬体集聚，阴性对照组是GFP-LC3的C末端甘氨酸突变体GFP-LC3G120A，这个突变体缺乏泛素样偶联磷脂酰乙醇胺（PE）的功能(Tanida et al., 2008)。通过设立对照组，当自噬体数量确实增加时（相对于GFP-LC3非特性的集聚），我们可以识别野生型GFP-LC3斑块的增加而不是突变体GFP-LC3G120A斑块增加（假设野生型和突变型GFP-LC3在同等表达水平）。
通过建立GFP-LC3转基因小鼠，GFP-LC3标记方法已成功应用于在体哺乳动物自噬研究(Mizushima et al., 2004)。相似的方法也已应用在其他生物体模型中，包括果蝇(Rusten et al., 2004; Scott et al., 2004)、线虫(Meléndez et al., 2003)、植物(Y oshimoto et al., 2004)、斑马鱼(He et al., 2009)。在GFP-LC3转基因小鼠，GFP-LC3的表达毫无列外的受CAG启动子控制，在为期24小时进食后GFP斑块的增多可以在几乎所有组织中观察到（图5B）。大脑似乎是个例外，即使48小时饥饿也很难观察到GFP-LC3斑块的堆积。这可能反映大脑中缺乏营养调控性细胞自噬，或者自噬体的快速形成。除了GFP-LC3转基因鼠外，组织特异性GFP-LC3和mCherry-LC3转基因鼠也被建立(Iwai-Kanai et al., 2008; Zhu et al.,
2007)。这些系统性或组织特异性模型已被成功应用于显示自噬基因缺失小鼠的自噬诱导实验中的自噬体数量。也被应用于疾病和应激状态下的自噬研究，比如肝细胞表达α1-抗胰蛋白酶Z突变体(Kamimoto et al., 2006)，突变体细胞毒性对浦肯野细胞轴突的退变研究(Wang et al., 2006)，心肌遭受过量表达的突变αβ晶体蛋白(Tannous et al., 2008; Zhu et al., 2007)。因此，检测GFP-LC3转基因鼠的GFP-LC斑块是一种很好的方法，用来评估在体不同生理和病理生理刺激对自噬体数量的调节。
生物化学方法
LC3除了应用于荧光显微镜的检测方法外，也可以应用于生物化学方法检测自噬体数量。内源性LC3-I向LC3-II的转变以及GFP-LC3-I向GFP-LC3-II的转变可以借助LC3和GFP抗体用免疫印迹的方法检测。尽管LC3-II分子量比LC3-I 大，但由于LC3-II的疏水性其在SDS-PAGE凝胶状的泳动速度比LC3-I快，这种情况经常被误认为是由于LC3-II在处理过程碎裂（图4C和图6A）。LC3-II 的量与自噬体的数量具有很好的相关性，更精确的说是自噬体膜上标记的LC3-II(Kabeya et al., 2000)。然而，并非所有的LC3-II都存在于自噬体膜上，一些LC3-II会异常的在非自噬过程中产生。比如，大量的LC3-II存在于FIP-200和Atg14缺陷的小鼠胚胎成纤维细胞(Hara et al., 2008; Matsunaga et al., 2009)，Beclin1缺陷的胚胎干细胞(Matsui et al., 2007)和RNAi干扰抑制Beclin1、Atg13 、Atg14和Vps34表达的细胞中(Hosokawa et al., 2009; Itakura et al., 2008; Matsui et al., 2007; Zeng et al., 2006)，尽管自噬体形成和自噬流被完全或几乎完全抑制（见下）。在酵母中，当Atg1、2、6、9、13、14、16和17突变时，Atg8会发生酯化(Suzuki et al., 2001)。因此，在当自噬过程中的特定物质被基因阻断或药物干预的情况下，即使检测到LC3-II，细胞自噬也有可能被抑制。在这种情况下，就要用到诸如GFP-LC3标记法和自噬流检测来评估自噬活动。
注意
在这个领域，大多数研究者在应用这些特定手段研究自噬时并没有考虑合适的测定自噬体数量或自噬活动。比如，溶酶体数量和活动并不是细胞自噬可信的通用指标，尽管在果蝇研究中是这样的。因此，在研究哺乳动物细胞自噬时，不推荐使用Lyso Tracker，吖啶橙和MDC，MDC起初被推荐作为特异性自噬体标
记物，后来发现其与溶酶体具有很高的亲和力(Bampton et al., 2005; Mizushima, 2004)。其二，尽管哺乳动物LC3、Atg8和其他特定自噬基因在可以诱导自噬的应激条件刺激下可以转录上调(He and Klionsky, 2009)，但是并没有明确的证据说明细胞自噬活动增加。此外，相对于Atg蛋白表达水平的调节而言，它们的持续表达、翻译后修饰以及与自噬过程中其他组分的相互作用在自噬过程中更为重要。因此，Atg的mRNA和蛋白表达水平并不适合作为检测细胞自噬的指标。自噬流检测
以上章节讲述的试验方法用来检测细胞自噬体的数量，自噬体数量并不能总是反映细胞自噬活动的水平。正如以上的讨论（图3），自噬体的蓄积并不能反映细胞自噬的诱发，可能是自噬体产生增多或者是在自噬体成熟和自噬过程被阻断。这和LC3-II的测量相似。比如，用可以破坏溶酶体酸化的药物氯喹培养细胞时，即使非饥饿状态下LC3-II也会积累，因为基础状态细胞自噬中LC3-II的周转量被阻断（图6）。因此，简单的自噬体数量测定（电子显微镜和光学显微镜测定LC3或GFP-LC3斑块）和LC3-II水平测定（免疫印迹）不能区分真正的细胞自噬诱导（比如饥饿）和自噬体成熟过程中被阻断或破坏。在多数实验中，区分自噬体蓄积是自噬诱导结果还是自噬下游步骤被阻断是必要的，细胞自噬流的测定可以区分这两种情况（图4D-4H）。通过电子显微镜定量分析自噬体和自噬溶酶体数量可以区分自噬激活（自噬体和自噬溶酶体数量都增加）和自噬体成熟受抑制（自噬体数量增加而自噬溶酶体数量不变）（图4A）。然而电镜不能直接观察溶酶体降解自噬底物的过程，所以电镜不能作为检测自噬流的方法。
LC3周转量测定法
当前测定细胞自噬流的主要方法之一是测定LC3周转量，这种方法基于LC3-II在自噬溶酶体中降解的观察。如前文描述的一样，如果用抑制溶酶体酸化或抑制自噬体和溶酶体融合的药物氯化铵、氯喹或巴佛洛霉素A1处理细胞，或者是溶酶体蛋白酶抑制剂E64d和抑肽素A，LC3-II的降解就会被阻断，导致LC3-II的累积(Tanida et al., 2005)。于是，溶酶体抑制剂处理和不处理的样本之间LC3-II量的差别就代表了运输到溶酶体被降解的LC3量（图4D）(Klionsky et al., 2008a; Mizushima and Y oshimori, 2007; Rubinsztein et al., 2009)。比如，在非饥饿状态下氯喹处理后LC3-II水平增加（图6B，比较1和2泳道）。然而在饥饿状
态下，氯喹处理和非处理时LC3-II的差别更大（图6B，比较3和4泳道），提示饥饿时自噬流增加。
尽管理论上测定LC3周转量很简单，但在一些实验中可以获得有意义的结果和可靠地测定自噬流。这或许反映了测定方法的高敏感性的本质，尤其是在基础状态下高的自噬流也可以测定（比如HeLa细胞在正常培养基中生长），但这种情况下由于自噬增加而引起的LC3周转量的改变却很难测定。在一些情况下，LC3周转量可以作为自噬流可靠的指标，然而在其他一些情况下，细胞自噬流测定就需要联合其他技术手段进行测定（见下）这种联合会得出更多的有用信息。LC3降解和自噬底物测定
当LC3自噬降解时，总LC3的消失反倒成为测定自噬流很好的指标（图4E）。当自噬诱导后LC3-II会短暂增加，然后更长时间自噬激活后LC3-II就会降低（比如2小时或更长的饥饿）(Mizushima and Y oshimori, 2007)。同样，饥饿状态的细胞会有大量的GFP-LC3斑块，但GFP-LC3胞浆和胞核信号在自噬诱导后双双减弱（图5A）。流式细胞仪可以定量的和敏感的测定总GFP-LC3的减少(Shvets et al., 2008)。因此，通过免疫印迹、流式细胞仪或荧光显微镜测定细胞总LC3量可以反映与细胞自噬流的关系。总LC3量的减少可以解释免疫组化研究LC3。LC3染色增加作为自噬激活的证据，然而也可认为是自噬受抑制的证据，由于自噬降解LC3减弱引起。
除了LC3外，其他自噬底物也可以用来测定自噬流。传统认为自噬是一个随机降解系统，但近期研究提示某些物质可以被自噬特异性降解，研究最为广泛的是p62。p62通过直接与LC3结合被特异的并入自噬体，通过自噬有效地降解（图4E）(Bj?rk?y et al., 2005)；因此，细胞内总p62表达量可以逆过来反映自噬活动，即细胞内总p62表达量减少提示自噬增加。比如，饥饿诱导p62水平降低不能在自噬缺陷细胞中观察到，相反p62水平增加(Mizushima and Y oshimori, 2007)。在很多研究中，细胞p62这个指标能与其他自噬流指标具有很好的关联性，总之这个指标似乎相当不错。然而，p62是否只通过自噬降解或者部分同通过泛素蛋白酶途径降解还是不清楚的。此外，和LC3一样，p62可以通过转录进行调节(He and Klionsky, 2009; Nakaso et al., 2004)，这样以来用p62和LC3作为自噬流指标就很混淆。考虑到这些潜在的限制，当用自噬底物水平测定评估细胞
自噬流时，建议联合应用其他实验方法。
mRFP-GFP-LC3溶酶体运输测定
GFP标记的自噬底物比如GFP-LC3在溶酶体中荧光淬灭，基于这个原理的自噬流测定也使很有用的方法（图4F）。GFP是稳定折叠蛋白，对溶酶体蛋白酶相对抵抗。然而，溶酶体内低的pH可以是GFP应该淬灭，这样使得跟踪GFP-LC3向溶酶体转运变得困难；事实上，多数GFP-LC3斑块并不定位在溶酶体(Bampton et al., 2005; Kabeya et al., 2000)。相反，红色荧光蛋白比如mCherry在酸性细胞器中荧光比较稳定(Katayama et al., 2008)，mRFP-LC3能够在自噬溶酶体中稳定的检测到（表2）。根据这两种荧光蛋白在溶酶体中的荧光淬灭不同，可以利用mRFP-LC3融合蛋白从形态学上跟踪自噬流（图4F和图5C）(Kimura et al., 2007)。利用这些新奇的荧光蛋白，自噬体和自噬溶酶体可以分别被黄色（红色和绿色荧光综合）和红色（仅仅有红色荧光）信号标识。如果自噬流增加，黄色和红色斑块都会增加；如果，自噬体向自噬溶酶体转变过程被阻断，那么仅仅有黄色斑块的增加而不会伴随有红色斑块增加。尽管这种方法可以用作自噬流检测指标，但不能像其他检测方法那样提供溶酶体降解过程的详细信息。这种检测方法依据自噬体的酸化和降解能力。因此，有时也会观察到自噬溶酶体呈现黄色，这取决于溶酶体酶活性以及酸性溶酶体pH淬灭GFP荧光信号的速度。
GFP-LC3裂解方法
尽管GFP荧光在溶酶体酸性环境中能淬灭，但GFP仍然可以通过免疫印迹检测到，并且GFP比GFP-LC3融合蛋白更稳定（融合蛋白在溶酶体中被部分降解，出现GFP片段）(Gao et al., 2008; Hosokawa et al., 2006)。因此，另一个检测自噬流的方法就是利用GFP抗体通过免疫印迹检测由溶酶体降解GFP-LC3融合蛋白而产生的GFP片段（图4G）。表达GFP-Atg8的酵母细胞中已经广泛应用这种方法检测自噬流，但却在哺乳动物细胞中很受限制。在一些情况下，由于溶酶体活性和酸度的不同（在不同细胞类型中有差别），用自噬体溶酶体降解GFP检测手段评估自噬流并不适合。
长寿命蛋白降解
1970年发展起来的评估细胞自噬流的传统方法之一是检测长寿命蛋白的降解（图4H）。在这个方法中，细胞在同位素标记的氨基酸（[14C]- or [3H]-valine or
leucine）培养液中培养较长时间，用来标记长寿命蛋白，然后正常培养短暂时间用于洗脱同位素标记的短寿命蛋白，这些短寿命蛋白主要被蛋白酶降解。用自噬诱导刺激处理细胞后，测定细胞释放的降解蛋白量（通过测定上清液的放射性）。这可能是最定量的方法，因为这种方法可以提供精确的数量来反映所有细胞内长寿命蛋白命运以及避免由于测定单一自噬底物引起的缺陷。为了正确测定自噬降解长寿命蛋白（由于其他途径对长寿命蛋白的降解），必须比较自噬抑制剂处理和非处理组的长寿命蛋白自噬降解率。这种方法的缺点是实验结果的诠释依赖于所用自噬抑制剂的特异性和抑制效率（原因见下）。
注意
回顾本节，目前有几种不同的方法用于检测细胞自噬流，包括LC3周转量测定、自噬底物总水平测定（LC3、GFP-LC3或p62）、mRFP-GFP-LC3颜色改变的分析、由GFP-LC3裂解产生的GFP测定和依赖于溶酶体降解的长寿命蛋白测定。在不同的细胞类型和不同的实验条件下，每种方法的有效性和局限性有所差别；因此，我们建议合理的选择不同方法用于测定自噬流。由于不同方法的局限性往往不重叠，所以推荐联合使用这些方法测定自噬流。这样，我们就可以在多数哺乳动物组织培养条件下可靠的测定自噬流或自噬活性。然而，尽有极少的方法用于测定在体的自噬流(Iwai-Kanai et al., 2008)。尽管有报道提示在自噬缺陷小鼠的组织中p62水平增高(Komatsu et al., 2007)，但不清楚p62水平增高是否与在体自噬诱导有关。GFP-LC3转基因鼠用来测定在体自噬体数量，那么也可以建立GFP-RFP-LC3转基因鼠来测定在体自噬流。如何在病人体内或病人来源的血液和组织样本中建立测定自噬流的方法更为困难且极其重要。
抑制自噬活动
为全面了解特定生物过程，设定实验来调控该过程活动经常是很关键的。当前研究自噬中最严重问题之一就是缺乏高度特异的自噬抑制剂和激动剂。尽管如此，目前还是有几种调节剂可以利用，并且基因操作技术也能提供强有力的工具（图1）(Rubinsztein et al., 2007)。本章节以及下章节，我们分别讨论不同的药物方法和基因方法对自噬的抑制和激活。
因为自噬体形成需要III型PI3K蛋白激酶活性，所以体外最常用的药物法抑制自噬活动就用到PI3K抑制剂，比如渥曼青霉素、LY294002或
3-MA(Blommaart et al., 1997; Itakura et al., 2008; Matsunaga et al., 2009)。然而所有这些抑制剂可以同时抑制I型PI3K蛋白激酶（抑制细胞自噬）和III型PI3K蛋白激酶（细胞自噬所需）(Knight et al., 2006)，其中一些III型PI3K蛋白激酶抑制剂比如L Y294002和渥曼青霉素可以抑制mTOR（自噬抑制蛋白分子, 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白），通过其ATP结合位点起作用(Brunn et al., 1996)。此外，I 型和III型PI3K蛋白激酶都可以调节多种细胞信号和膜转运过程，这些PI3K蛋白激酶抑制剂不是自噬所特有的。3-MA在非常高的浓度时（通常10 mM）可以抑制自噬，但它也作用于其他蛋白激酶并影响其他细胞过程如糖原代谢、溶酶体酸化(Caro et al., 1988)、胞吞作用(Punnonen et al., 1994)和线粒体通透性改变(Xue et al., 2002)。事实上，3-MA可以抑制蛋白酶水解过程甚者在Atg5缺失细胞，提示3-MA对蛋白降解作用已超出其抑制细胞自噬的范畴(Mizushima et al., 2001)。
尽管PI3K抑制剂可以阻断自噬体形成，但其他实验中用到的主要药物抑制剂可以阻断自噬后期阶段（图1）。微管破坏剂（长春碱和有丝分裂抑制剂）可以抑制自噬体和溶酶体的融合，这个融合过程需要微管参与(Jahreiss et al., 2008; Kimura et al., 2008)。自噬溶酶体对自噬底物最后降解过程可以被氯化铵、巴佛洛霉素A1和溶酶体蛋白酶抑制剂比如E64d和抑肽素A等抑制（图1）。巴佛洛霉素A1最初报道可以抑制自噬体和溶酶体融合(Y amamoto et al., 1998)，最近的一项研究提示它主要的功能是通过抑制溶酶体酸化从而影响其自身的降解，至少在特定条件下(Klionsky et al., 2008b)。
微管破坏和溶酶体降解抑制除了影响自噬外，也可影响其他细胞功能如有丝分裂和胞吞作用，这就是一个主要的缺陷。因此，当应用PI3K抑制剂处理细胞时，对观察到的细胞表型变化必须给予解释。由于缺乏特异性细胞自噬抑制剂，我们建议研究者在应用药物抑制细胞自噬时不要对自噬功能下确定的结论。此外，药物学方面的研究应该和基因干预的方法联合起来，更特异的抑制细胞自噬。
特异性抑制细胞自噬通路可以通过基因敲除或基因降低不同ATG基因的方式完成。到目前，自噬缺失或减弱已经在多种细胞建立，这些细胞缺乏Atg3(Sou et al., 2008)、Atg5(Mizushima et al., 2001)、Beclin1(Qu et al., 2003; Yue et al., 2003)、Atg7(Komatsu et al., 2005)、Atg9a(Saitoh et al., 2009)、Atg16L1(Cadwell et al., 2008; Saitoh et al., 2008)、FIP200(Hara et al., 2008)和Ambra1(Fimia et al., 2007)。Atg4C
(Mari?o et al., 2007) 、LC3B (Cann et al., 2007) 和ULK1 (Kundu et al., 2008) 基因缺失对在体表型的改变影响轻微，可能因为相关同分异构体对该基因的补偿。因此，这些基因不能作为RNAi干扰细胞自噬实验的首选沉默基因，尽管在特定细胞类型中，siRNA-ULK1对抑制自噬是有效的(Chan et al., 2007)。RNAi介导抑制细胞自噬的另一个问题是，自噬活动中某些特定Atg蛋白在很低水平时其功能也正常，比如Atg5 (Hosokawa et al., 2006)；这种情况下，RNAi介导沉默就需要完全抑制蛋白表达来观察细胞自噬受抑制。因此，在利用基因沉默方法研究细胞自噬时，我们推荐研究者不仅要确定每一个siRNA对自噬蛋白表达能有效抑制，同时要确定自噬通路被有效抑制，可以通过已知的自噬诱导剂如饥饿来验证。
基因抑制自噬的另一个成功方法是利用自噬蛋白的显性失活突变体。这些突变体包括ULK1激酶活性失活突变体（ULK1 K46N, ULK1 K46R, and ULK1 K46I）(Chan et al., 2009; Hara et al., 2008)、Atg4B C74A (Fujita et al., 2008a)和Atg16L1的缠绕区(Fujita et al., 2008b)。此外，野生型Atg12和Atg16L1(Fujita et al., 2008b)过表达以及偶联功能缺失的Atg5突变体（Atg5 K130R）(Pyo et al., 2005)都可以引起显性失活效应。因为这些显性失活突变体的效应有时是根据环境而改变的或者说是细胞特异性的，因此每次实验确定其抑制效应是很重要的。
必须注意到多数ATG基因缺失或显性失活自噬突变蛋白能够阻断自噬体形成的启动（图1，表1）。然而在Atg3敲除细胞(Sou et al., 2008)、Atg5敲除细胞(Mizushima et al., 2001; Nishiyama et al., 2007)和Atg4B C74A过表达细胞(Fujita et al., 2008a)中可以观察到异常延伸的膜结构，这就提示这些因子对完成自噬体闭合具有重要作用（图1），这些因子属于Atg12和Atg8/LC3偶联系统。
理论上，自噬基因敲除抑制细胞自噬比药物试剂更加特异。然而，必须注意到Atg蛋白并不完全是自噬专有的；它们还具有自噬非依赖性功能，包括在细胞死亡、胞吞过程以及免疫相关GTP酶转运中的作用(Kroemer and Levine, 2008; Virgin and Levine, 2009)。此外，不同ATG基因敲除小鼠的表型没有重叠提示不同Atg蛋白具有不同功能。Atg3 (Sou et al., 2008) 、Atg5 (Kuma et al., 2004) 、Atg7 (Komatsu et al., 2005) 、Atg9a(Saitoh et al., 2009)和Atg16L1(Saitoh et al., 2008)基因缺失小鼠的表型在本质上是一样的（即新生致死），而Beclin1(Qu et al., 2003; Yue et al., 2003)、FIP200(Gan et al., 2006)和Ambra1(Fimia et al., 2007)基因
缺失小鼠会出现胚胎致死。因为每种独立的Atg蛋白都有可能具有自噬非依赖性功能，所以建议联合应用不同基因方法来抑制自噬基因，增加观察真正由于自噬活动抑制而引起表型改变的可靠性。
自噬活动激活
自噬激活的研究越来越受关注，不仅在于研究目的同时也在于其潜在的治疗目的。和自噬抑制剂一样，已有几种方法来研究自噬激活，但是这些激活缺乏特异性。如前所述，饥饿是自噬活动最有效用的生理性诱导剂，在体内和体外都具有作用（体外实验中去除氨基酸比去除血清或生长因子更有效）（图1）。多数细胞系，自噬诱导在去除氨基酸一小时后就可以观察到；一个特殊的例外是某些肿瘤细胞系对饥饿诱导自噬有抗性。激活自噬的另一种方法是调节营养感应信号通路。最好的作用位点是mTOR，它是一个有效的自噬抑制剂。雷帕霉素（mTOR 的抑制剂）以及类似物如CCl-779在体内和体外都可以激活自噬(Ravikumar et al., 2004)。在哺乳动物细胞，雷帕霉素在诱导细胞自噬和4E-BP1去磷酸化中似乎仅发挥了一部分效应(Thoreen et al., 2009)，这是雷帕霉素的一个局限。近期研发了mTOR的ATP竞争性抑制剂比如Torin1(Thoreen et al., 2009)和PP242(Feldman et al., 2009)，这些药物对mTOR具有较高的抑制作用，可能是有前途的自噬诱导剂。值得注意的是饥饿和mTOR抑制都不是自噬特异性诱导剂；这些处理因素除了激活细胞自噬外，可以影响广泛的细胞应答、尤其是蛋白合成和细胞代谢。
几种mTOR非依赖性自噬激活剂也有报道出现（图1）。锂通过抑制肌醇单磷酸酶（mTOR非依赖性）诱导自噬，但是锂也可以通过抑制GSK-3 （mTOR 非依赖性）削弱自噬(Sarkar et al., 2008)；因此，如果锂被用于激活自噬，那么必须联合应用mTOR抑制剂。BH3类似物ABT737通过竞争性破坏Beclin1和Bcl-2或Bcl-X L之间的相互作用从而诱导自噬(Maiuri et al., 2007)。海藻糖和雷帕霉素小分子增强剂可以诱导自噬，其机制不清(Sarkar et al., 2007a; Sarkar et al., 2007b)。经过两次筛选由FDA认证的可以诱导mTOR非依赖性自噬的药物包括氟司必林、三氟拉嗪、哌咪清、尼卡地平、尼古地平、洛哌丁胺、胺碘达隆(Zhang et al., 2007)和维拉帕米、米诺地尔和可乐定(Williams et al., 2008)。为了能够在体外或病人体内诱导最大的细胞自噬，需要联合应用mTOR非依赖性自噬的药物雷帕霉素或mTOR抑制剂的叠加效应以达到激活自噬的目的。
结论
我们讨论了当前用于测定和调控哺乳动物细胞自噬活动的技术和方法。没有一种完美的方法可以测定自噬体数量或自噬流，也没有一种完美的方法特异性的激活或抑制自噬通路。因此，必须强调没有单一金标准的方法测定或调控自噬活动。应该综合考虑同时应用不同的实验方法准确评估在任何给定的生物环境中自噬活动的状态和功能，这些方法没有重叠的限制条件。随着自噬分子机制的阐明，预料会有更好的方法用于测定细胞自噬和特异性药物用于调控自噬。这些研究进展会促进对自噬生物学功能的了解以及成功开发临床药物调控自噬达到治疗疾病。
参考文献
1.Bampton ETW, Goemans CG, Niranjan D, Mizushima N, Tolkovsky AM. The dynamics of
autophagy visualized in live cells: from autopha-gosome formation to fusion with endo/lysosomes. Autophagy. 2005;1:23–36. [PubMed]
2.Bj?rk?y G, Lamark T, Brech A, Outzen H, Perander M, ?vervatn A, Stenmark H, Johansen
T. p62/SQSTM1 forms protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect on huntingtin-in-duced cell death. J. Cell Biol. 2005;171:603–614. [PMC free article] [PubMed]
3.Blommaart EFC, Krause U, Schellens JPM, Vreeling-Sindelárová H, Meijer AJ. The
phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors wortmannin and LY294002 inhibit autophagy in isolated rat hepatocytes. Eur. J. Biochem. 1997;243:240–246. [PubMed]
4.Brunn GJ, Williams J, Sabers C, Wiederrecht G, Lawrence JC, Jr, Abraham RT. Direct
inhibition of the signaling functions of the mammalian target of rapamycin by the phosphoinositide 3-kinase inhibitors, wortmannin and LY294002. EMBO J.
1996;15:5256–5267. [PMC free article] [PubMed]
5.Cadwell K, Liu JY, Brown SL, Miyoshi H, Loh J, Lennerz JK, Kishi C, Kc W, Carrero
JA, Hunt S, et al. A key role for autophagy and the autophagy gene Atg16l1 in mouse and human intestinal Paneth cells. Nature. 2008;456:259–263. [PMC free article] [PubMed]
6.Cann GM, Guignabert C, Ying L, Deshpande N, Bekker JM, Wang L, Zhou B, Rabinovitch
M. Developmental expression of LC3alpha and beta: absence of fibronectin or autophagy phenotype in LC3beta knockout mice. Dev. Dyn. 2007;237:187–195. [PubMed]
7.Caro LH, Plomp PJ, Wolvetang EJ, Kerkhof C, Meijer AJ. 3-Methyladenine, an inhibitor
of autophagy, has multiple effects on metabolism. Eur. J. Biochem. 1988;175:325–329.
[PubMed]
8.Cecconi F, Levine B. The role of autophagy in mammalian development: cell makeover
rather than cell death. Dev. Cell. 2008;15:344–357. [PMC free article] [PubMed]
9.Chan EYW, Kir S, Tooze SA. siRNA screening of the kinome identifies ULK1 as a
multidomain modulator of autophagy. J. Biol. Chem. 2007;282:25464–25474. [PubMed]
10.Chan EYW, Longatti A, McKnight NC, Tooze SA. Kinase-inactivated ULK proteins inhibit
autophagy via their conserved C-terminal domains using an Atg13-independent
mechanism. Mol. Cell Biol. 2009;29:157–171. [PMC free article] [PubMed]
11.Deretic V, Levine B. Autophagy, immunity, and microbial adaptations. Cell Host
Microbe. 2009;5:527–549. [PMC free article] [PubMed]
12.Eskelinen EL. To be or not to be? Examples of incorrect identification of autophagic
compartments in conventional transmission electron microscopy of mammalian cells.
Autophagy. 2008;4:257–260. [PubMed]
13.Feldman ME, Apsel B, Uotila A, Loewith R, Knight ZA, Ruggero D, Shokat KM. Active-site
inhibitors of mTOR target rapamycin-resistant outputs of mTORC1 and mTORC2. PLoS Biol. 2009;7:e38. [PMC free article] [PubMed]
14.Fimia GM, Stoykova A, Romagnoli A, Giunta L, Di Bartolomeo S, Nardacci R, Corazzari
M, Fuoco C, Ucar A, Schwartz P, et al. Ambra1 regulates autophagy and development of the nervous system. Nature. 2007;447:1121–1125. [PubMed]
15.Fujita N, Hayashi-Nishino M, Fukumoto H, Omori H, Yamamoto A, Noda T, Yoshimori T.
An Atg4B mutant hampers the lipidation of LC3 paralogues and causes defects in autophagosome closure. Mol. Biol. Cell. 2008a;19:4651–4659. [PMC free article] [PubMed]
16.Fujita N, Itoh T, Omori H, Fukuda M, Noda T, Yoshimori T. The Atg16L complex specifies
the site of LC3 lipidation for membrane biogenesis in autophagy. Mol. Biol. Cell.
2008b;19:2092–2100. [PMC free article] [PubMed]
17.Gan B, Peng X, Nagy T, Alcaraz A, Gu H, Guan JL. Role of FIP200 in cardiac and liver
development and its regulation of TNFalpha and TSC-mTOR signaling pathways. J. Cell Biol. 2006;175:121–133. [PMC free article] [PubMed]
18.Gao W, Ding WX, Stolz DB, Yin XM. Induction of macroautophagy by exogenously
introduced calcium. Autophagy. 2008;4:754–761. [PMC free article] [PubMed]
19.Hara T, Takamura A, Kishi C, Iemura S, Natsume T, Guan JL, Miz-ushima N. FIP200,
a ULK-interacting protein, is required for autopha-gosome formation in mammalian
cells. J.Cell Biol. 2008;181:497–510. [PMC free article] [PubMed]
20.He C, Klionsky DJ. Regulation mechanisms and signaling pathways of autophagy. Annu.
Rev. Genet. 2009;43:67–93. [PMC free article] [PubMed]
21.He C, Bartholomew CR, Zhou W, Klionsky DJ. Assaying autophagic activity in transgenic
GFP-Lc3 and GFP-Gabarap zebrafish embryos. Autophagy. 2009;5:520–526. [PMC free article] [PubMed]
22.Hosokawa N, Hara Y, Mizushima N. Generation of cell lines with tetracycline-regulated
autophagy and a role for autophagy in controlling cell size. FEBS Lett.
2006;580:2623–2629. [PubMed]
23.Hosokawa N, Hara T, Kaizuka T, Kishi C, Takamura A, Miura Y, Iemura S, Natsume T,
Takehana K, Yamada N, et al. Nutrient-dependent mTORC1 association with the
ULK1-Atg13-FIP200 complex required for autophagy. Mol. Biol. Cell.
2009;20:1981–1991. [PMC free article] [PubMed]
24.Itakura E, Kishi C, Inoue K, Mizushima N. Beclin 1 forms two distinct
phosphatidylinositol 3-kinase complexes with mammalian Atg14 and UVRAG. Mol. Biol.
Cell. 2008;19:5360–5372. [PMC free article] [PubMed]
25.Iwai-Kanai E, Yuan H, Huang C, Sayen MR, Perry-Garza CN, Kim L, Gottlieb RA. A method
to measure cardiac autophagic flux in vivo. Autophagy. 2008;4:322–329. [PubMed]
26.Jahreiss L, Menzies FM, Rubinsztein DC. The itinerary of autophagosomes: from
peripheral formation to kiss-and-run fusion with lysosomes. Traffic.
2008;9:574–587. [PMC free article] [PubMed]
27.Kabeya Y, Mizushima N, Ueno T, Yamamoto A, Kirisako T, Noda T, Kominami E, Ohsumi
Y, Yoshimori T. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in
autophagosome membranes after processing. EMBO J. 2000;19:5720–5728. [PMC free article] [PubMed]
28.Kamimoto T, Shoji S, Hidvegi T, Mizushima N, Umebayashi K, Perlmutter DH, Yoshimori
T. Intracellular inclusions containing mutant alpha1-antitrypsin Z are propagated in the absence of autophagic activity. J. Biol. Chem. 2006;281:4467–4476. [PubMed]
29.Katayama H, Yamamoto A, Mizushima N, Yoshimori T, Miyawaki A. GFP-like proteins
stably accumulate in lysosomes. Cell Struct. Funct. 2008;33:1–12. [PubMed]
30.Kimura S, Noda T, Yoshimori T. Dissection of the autophagosome maturation process
by a novel reporter protein, tandem fluorescent-tagged LC3. Autophagy.
2007;3:452–460. [PubMed]
31.Kimura S, Noda T, Yoshimori T. Dynein-dependent movement of autophagosomes mediates
efficient encounters with lysosomes. Cell Struct. Funct. 2008;33:109–122. [PubMed]
32.Klionsky DJ, Abeliovich H, Agostinis P, Agrawal DK, Aliev G, Askew DS, Baba M,
Baehrecke EH, Bahr BA, Ballabio A, et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy in higher eukaryotes. Autophagy. 2008a;4:151–175.
[PMC free article] [PubMed]
33.Klionsky DJ, Elazar Z, Seglen PO, Rubinsztein DC. Does bafilomycin A1 block the fusion
of autophagosomes with lysosomes? Autophagy. 2008b;4:849–950. [PubMed]
34.Knight ZA, Gonzalez B, Feldman ME, Zunder ER, Goldenberg DD, Williams O, Loewith
R, Stokoe D, Balla A, Toth B, et al. A pharmacological map of the PI3-K family defines
a role for p110alpha in insulin signaling. Cell. 2006;125:733–747. [PMC free article]
[PubMed]
35.Komatsu M, Waguri S, Ueno T, Iwata J, Murata S, Tanida I, Ezaki J, Mizushima N, Ohsumi
Y, Uchiyama Y, et al. Impairment of starvation-induced and constitutive autophagy in Atg7-deficient mice. J. Cell Biol. 2005;169:425–434. [PMC free article] [PubMed]
36.Komatsu M, Waguri S, Koike M, Sou YS, Ueno T, Hara T, Mizushima N, Iwata JI, Ezaki
J, Murata S, et al. Homeostatic levels of p62 control cytoplasmic inclusion body formation in autophagy-deficient mice. Cell. 2007;131:1149–1163. [PubMed]
37.Kroemer G, Levine B. Autophagic cell death: the story of a misnomer. Nat. Rev. Mol.
Cell Biol. 2008;9:1004–1010. [PMC free article] [PubMed]
38.Kuma A, Hatano M, Matsui M, Yamamoto A, Nakaya H, Yoshimori T, Ohsumi Y, Tokuhisa
T, Mizushima N. The role of autophagy during the early neonatal starvation period.
Nature. 2004;432:1032–1036. [PubMed]
39.Kuma A, Matsui M, Mizushima N. LC3, an autophagosome marker, can be incorporated
into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization. Autophagy. 2007;3:323–328. [PubMed]
40.Kundu M, Lindsten T, Yang CY, Wu J, Zhao F, Zhang J, Selak MA, Ney PA, Thompson CB.
Ulk1 plays a critical role in the autophagic clearance of mitochondria and ribosomes during reticulocyte maturation. Blood. 2008;112:1493–1502. [PMC free article] [PubMed]
41.Levine B, Kroemer G. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell. 2008;132:27–42.
[PMC free article] [PubMed]
42.Longatti A, Tooze SA. Vesicular trafficking and autophagosome formation. Cell Death
Differ. 2009;16:956–965. [PubMed]
43.Maiuri MC, Le Toumelin G, Criollo A, Rain JC, Gautier F, Juin P, Tasdemir E, Pierron
G, Troulinaki K, Tavernarakis N, et al. Functional and physical interaction between Bcl-X(L) and a BH3-like domain in Beclin-1. EMBO J. 2007;26:2527–2539. [PMC free article] [PubMed]
44.Mari?o G, Salvador-Montoliu N, F ueyo A, Knecht E, Mizushima N, López-Otín C.
Tissue-specific autophagy alterations and increased tumorigenesis in mice deficient in Atg4C/autophagin-3. J. Biol. Chem. 2007;282:18573–18583. [PubMed]
45.Matsui Y, Takagi H, Qu X, Abdellatif M, Sakoda H, Asano T, Levine B, Sadoshima J.
Distinct roles of autophagy in the heart during ischemia and reperfusion: roles of AMP-activated protein kinase and Beclin 1 in mediating autophagy. Circ. Res.
2007;100:914–922. [PubMed]
46.Matsunaga K, Saitoh T, Tabata K, Omori H, Satoh T, Kurotori N, Maejima I,
Shirahama-Noda K, Ichimura T, Isobe T, et al. Two Beclin 1-binding proteins, Atg14L and Rubicon, reciprocally regulate autophagy at different stages. Nat. Cell Biol.
2009;11:385–396. [PubMed]
47.Meléndez A, Tallóczy Z, Seaman M, Eskelinen E-L, Hall DH, Levine B. Autophagy genes
are essential for dauer development and life-span extension in C. elegans. Science.
2003;301:1387–1391. [PubMed]
48.Mizushima N. Methods for monitoring autophagy. Int. J. Biochem. Cell Biol.
2004;36:2491–2502. [PubMed]
自噬（Autophagy）及其研究方法概述汉恒Th物技术服务手册
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产品厂商规格A14292,Premo自噬TB/GFP TR-FRET invitrogen6000Tests LC3B抗体试剂盒 pllabs0.1mg Anti-MAP1A/LC3A/B自噬微管相关蛋白 轻链3抗体 pllabs0.1mg Anti-MAP1LC3A(microtubule- associated protein1light chain 3)自噬微管相关蛋白轻链3抗体 Invitrogen1mg/1ml 兔抗人、大、小APG4B细胞自噬相关 抗体\Anti-APG4B/AUTL1 BD1mg/1ml 自噬微管相关蛋白轻链3抗体\ Anti-MAP1LC3A Anti-SQSTM1/p62antibody abcam Sigma1g 溶酶体抑制剂Hydroxychloroquine （羟氯喹） mTOR抑制剂rapamycin Sigma20mM 自噬抑制剂3-Methyladenine（3-MA）Sigma100mg
Southern杂交: 是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列。 将RNA转移到薄膜上，用探针杂交，则称为Northern杂交。 RNAi技术: 是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。可以利用siRNA或siRNA表达载体快速、经济、简便的以序列特异方式剔除目的基因表达，所以现在已经成为探索基因功能的重要研究手段。 Southern杂交一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量]。 扫描电镜技术：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。 细胞显微分光光度计：用来描述薄膜、涂层厚度超过1微米的物件的光学性能的显微技术。 免疫荧光技术：将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。 电镜超薄切片技术：超薄切片是为电镜观察提供极薄的切片样品的专门技术。用当代较好的超薄切片机，大多数生物材料，如果固定、包埋处理得合适，可以切成50-100微米的超薄切片。 Northern印迹杂交（Northern blot）。这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。 放射自显影技术：放射自显影技术是利用放射性同位素的电离辐射对乳胶（含AgBr或AgCl）的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究的一种细胞化学技术。放射自显影技术（radioautography；autoradiography）用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。其原理是将放射性同位素（如14C和3H）标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，将标本制成切片或涂片，涂上卤化银乳胶，经一定时间的放射性曝光，组织中的放射性即可使乳胶感光。 核磁共振技术：可以直接研究溶液和活细胞中相对分子质量较小(20，000 道尔顿以下)的蛋白质、核酸以及其它分子的结构，而不损伤细胞。 DNA序列分析：在获得一个基因序列后，需要对其进行生物信息学分析，从中尽量发掘信
自噬（Autophagy）及其研究方法概述 一、背景 概念: 目前根据发生过程分为三类：Macroautophagy，Microautophagy和Chaperone-mediated autophagy CMA), 大自噬（Macroautophagy）即我们说的自噬（autophagy）;微自噬（Microautophagy）：是指溶酶体主动、直接吞噬胞浆成分的一种方式;分子伴侣介导的自噬(Chaperone-mediated autophagy，CMA)：一些分子伴侣，如hsp70，能帮助未折叠蛋白转位入溶酶体。通常说的自噬泛指Macroautophagy. 自噬是细胞内的一种“自食（Self-eating）”的现象，凋亡是“自杀（Self-killing）”的现象，二者共用相同的刺激因素和调节蛋白，但是诱发阈值和门槛不同，如何转换和协调目前还不清楚. 自噬是指膜（目前来源还有争议，大部分表现为双层膜，有时多层或单层）包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体（autophagosome），最后与溶酶体融合形成自噬溶酶体（autophagolysosome），降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳态和细胞器的更新。自噬的步骤可以大概总结为下面四步: 步骤1：细胞接受自噬诱导信号后，在胞浆的某处形成一个小的类似“脂质体”样的膜结构，然后不断扩张，但它并不呈球形，而是扁平的，就像一个由2层脂双层组成的碗，可在电镜下观察到，被称为Phagophore，是自噬发生的铁证之一。 步骤2：Phagophore不断延伸，将胞浆中的任何成分，包括细胞器，全部
揽入“碗”中，然后“收口”，成为密闭的球状的autophagosome，即“自噬体”。电镜下观察到自噬体是自噬发生的铁证之二。有2个特征：一是双层膜，二是内含胞浆成分，如线粒体、内质网碎片等。 步骤3：自噬体形成后，可与细胞内吞的吞噬泡、吞饮泡和内体融合（这种情况不是必然要发生的）。 步骤4：自噬体与溶酶体融合形成autolysosome，期间自噬体的内膜被溶酶体酶降解，2者的内容物合为一体，自噬体中的“货物”也被降解，产物（氨基酸、脂肪酸等）被输送到胞浆中，供细胞重新利用，而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。 自噬的特性： 1）自噬是细胞消化掉自身的一部分，即self-eating，初一看似乎对细胞不利。事实上，细胞正常情况下很少发生自噬，除非有诱发因素的存在。这些诱发因素很多，也是研究的热门。既有来自于细胞外的（如外界中的营养成分、缺血缺氧、生长因子的浓度等），也有细胞内的（代谢压力、衰老或破损的细胞器、折叠错误或聚集的蛋白质等）。由于这些因素的经常性存在，因此，细胞保持了一种很低的、基础的自噬活性以维持自稳。 2）自噬过程很快，被诱导后8min即可观察到自噬体（autophagosome）形成，2h后自噬溶酶体（autolysosome）基本降解消失。这有利于细胞快速适应恶劣环境。 3）自噬的可诱导特性：表现在2个方面，第一是自噬相关蛋白的快速合成，这是准备阶段。第二是自噬体的快速大量形成，这是执行阶段。 4）批量降解：这是与蛋白酶体降解途径的显着区别
龙源期刊网 https://www.doczj.com/doc/1d13003750.html, 哺乳动物细胞悬浮驯化方法研究进展 作者：陆陈晨谭树华 来源：《科学与财富》2018年第13期 摘要：哺乳动物细胞表达系统是药用蛋白的主要表达方式，传统的贴壁细胞培养有诸多不利，本文介绍常用的贴壁细胞悬浮驯化的方法，通过将贴壁细胞驯化成悬浮细胞，提高哺乳动物细胞表达水平，降低生产成本。 关键词：哺乳动物细胞；驯化；无血清培养 重组蛋白表达是研究蛋白质功能与结构、药物筛选以及后续应用的关键环节，常规的蛋白表达系统有原核表达和真核表达两大类。现代医药工业的快速发展需要重组蛋白拥有接近天然蛋白分子的复杂结构、理化性质和生物功能，特别是糖蛋白及抗体类药物。这就要求表达的重组蛋白需要正确的翻译后修饰、组装和折叠，这是原核表达系统所欠缺的[1-2]。真核表达系统包括酵母表达系统、昆虫杆状病毒表达系统和哺乳动物细胞表达系统，其中以哺乳动物细胞表达系统较为常用。 1 贴壁细胞表达外源蛋白的缺点 传统细胞培养或表达外源重组蛋白采用贴壁细胞进行表达，这种表达方式虽然操作简便，但细胞密度和表达量较低，并且培养时需要加入血清，亦具很多缺点[3]： 1.1 血清组分复杂，含有多种杂蛋白不利于目的蛋白纯化； 1.2 血清批间差异较大，不同批次的血清浓度不稳定，影响工艺的连贯性； 1.3 血清中可能携带有未充分灭活的动物病毒或支原体，有细胞污染和传染人类的风险。 2 细胞无血清悬浮培养的优势 细胞无血清悬浮培养由于具有培养基的化学成分限定、批间产品质量稳定、简化下游生产、生理环境易于控制等优点，在重组蛋白表达、单克隆抗体制备和疫苗生产等中应用广泛。 3 贴壁细胞驯化成悬浮细胞的方法 3.1 分子生物学手段改造 贴壁细胞驯化成悬浮细胞通常有两种方法，一种是通过分子生物学手段，改造贴壁细胞。Noelle-Anne Sunstrom， Sugiyono 等人通过将编码胰岛素样生长因子 I（IGF-I）和转铁蛋白的基因稳定整合到CHO-K1细胞系的基因组中，使用 lac 操纵子/阻遏子系统调控 IGF-I 基因的表
线粒体自噬 线粒体自噬研究概论 关于线粒体自噬 线粒体自噬(mitophagy)是指细胞通过自噬的机制选择性地清除线粒体的过程。选择性清除受损伤或功能不完整的线粒体对于整个线粒体网络的功能完整性和细胞生存来说十分关键。 线粒体自噬主要的作用有几个方面： 1.选择性清除功能受损的线粒体 2.选择性调节细胞内线粒体数量 3.通过线粒体影响诸多生理和病理学过程 Fig:The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria Cell Death and Differentiation(2013)20,31–42
线粒体自噬的信号通路 1)Pink/Parkin pathway 2)Bnip3/Nix pathway 3)FUNDC1pathway Fig.Mitophagy pathway:Pink1/Parkin OR Bnip3/Nix Pink1/Parkin pathway：E3泛素连接酶Parkin和蛋白激酶Pink1一起介导了线粒体膜电位下降,引起的线粒体自噬的发生,当线粒体损伤后,线粒体膜电位下降,引起Pink1蛋白在损伤线粒体上的积累,能够吸引Parkin到损伤的线粒体上。Parkin使得线粒体外膜上的很多蛋白发生泛素化,从而能够募集其他一些相关蛋白,介导线粒体自噬的发生。
线粒体自噬 汉恒线粒体自噬研究工具与研究方法 汉恒生物有多种线粒体自噬病毒研究工具可以提供，便于直接感染目的细胞后直观地观察线粒体自噬的变化 一、汉恒线粒体自噬表型研究工具 1）Ad-GFP-LC3腺病毒病毒系统，可高效感染目的细胞，表达GFP-LC3，感染感染后细胞可在荧光显微镜下实时观察自噬的整体水平（由于GFP荧光偏弱，暂停Ad-GFP-LC3销售， 慢病毒单标LV-GFP-LC3荧光正常，正常销售）； 2）Ad-HBmTur-Mito腺病毒系统（红光标记），为汉恒生物自主研发的线粒体特异性定位荧光探针（pHBmTur-Mito）可准确定位标记线粒体，结合汉恒独家推出的双荧光LC3细胞自噬腺病毒的使用，即可准确实时地追踪线粒体自噬的动态过程； 使用方法：Ad-GFP-LC3+Ad-HBmTur-Mito共感染目的细胞，confocal检测双荧光共定位的情况，如果共定位，则存在线粒体自噬！（下图说明：红色标记为线粒体，绿色标记自噬小体，二者有共定位时代表自噬发生） 二、汉恒线粒体自噬通路研究工具 1）Ad-Parkin-EGFP 2）Ad-Bnip3-EGFP+Ad-Nix-EGFP 3）Ad-FUNDC1-EGFP
细胞由于体积小，一般需在显微镜下观察，显微镜一般分为光学显微镜与电子显微镜。显微镜的放大倍数由目镜与物镜决定：放大倍数=物镜×目镜。清晰与否由分辨率（指能够分辨出相邻两质点间的最小距离，距离越小，分辨率越高）决定。一般来说，光镜分辨率为0.2微米，电镜分辨率为0.2纳米。分辨率的限制因素为：入射光波长，介质折射率，物镜镜口角。 光学显微镜结构为：光学显微系统，光源，机械支撑系统，有些还有图像采集系统。常见有三种：复式显微镜，相差显微镜以及荧光显微镜。 复式显微镜分为单筒显微镜，双筒显微镜。复式光学显微镜较为简单，照明系统为可见光，光学系统为玻璃透镜（目镜，物镜以及聚光镜），另外还有机械与支架系统。普通复式显微镜的缺点：由于光的干涉，衍射现象，光线通过样品时，两个相邻焦点的图像可能发生重叠，进而无法分辨，导致存在分辨极限。 相差显微镜是指利用光线的干涉，衍射特征，时相位差转变为振幅差，增强样品的明暗对比，从而观察无色透明样品的装置。相差显微镜的特殊构件为相差板，环状光阑。相差显微镜的特点：样品无需染色，可观察活细胞及细胞器动态。 荧光原理：荧光分子吸收入射光能量以后，电子由基态跃迁到激发态。激发态电子不稳定，会自发跃迁回基态，并辐射荧光。荧光显微镜原理：利用短波长电磁波为光源，激发样品辐射荧光，之后利用样品产生的自发荧光或诱发荧光，对细胞内特异性蛋白质进行定性与定位研究的装置。荧光显微镜的优点：荧光显微镜主要用于定性，定位研究细胞内特异性蛋白质，可以观察活细胞。缺点：无法排除来自样品焦平面以外的荧光，使得图像的反差与分辨率降低。 光学显微镜样品的制备：固定，包埋，切片，染色 固定：目的是杀死细胞，稳定细胞成分，以便进一步处理和切片是不受破坏。
发表时间：2011-6-2 来源：《中外健康文摘》2011年第8期作者：刘杉珊李薇[导读] 自噬是真核细胞特有的普遍生命现象，在维持细胞自我稳态、促进细胞生存方面起重要作用。 刘杉珊李薇（吉林大学第一医院血液肿瘤中心吉林长春130021） 【中图分类号】R329 【文献标识码】A【文章编号】1672-5085 (2011)8-0448-04 【摘要】自噬是真核细胞特有的普遍生命现象，在维持细胞自我稳态、促进细胞生存方面起重要作用，广泛参与多种生理和病理过程。自噬与细胞卫士p53的关系密切，目前已成为肿瘤研究中的一个新热点。本文对自噬的概念、生物学特性、自噬过程及其信号调控、以及与p53的关系作以概述，同时简要概述了目前自噬的研究方法和检测方法并提出问题和展望，为进一步研究自噬奠定基础。 【关键词】自噬分子机制p53 近年来，自噬作为II型程序性细胞死亡，越来越成为除凋亡之外备受关注和研究的领域。目前自噬不仅被证实是一种细胞自我死亡的方式，同时也是一种细胞的自我保护机制，在肿瘤、老化和神经退化等细胞增殖和死亡紊乱疾病中发挥着重要的作用。因此通过对自噬的发生过程、分子机制、信号调控、及与细胞卫士P53之间关系的总结，为进一步研究其机制调控和临床应用奠定坚实的基础。 1 自噬的概念 自噬又称为II型程序性细胞死亡(type II programed cell death)是以胞质内出现双层膜结构包裹长寿命蛋白和细胞器的自噬体为特征的细胞“自我消化”的一系列生化过程。正常细胞内的物质主要有两种降解途径，一种通过蛋白酶体被降解，另一种是通过自噬作用。自噬主要降解细胞质的长寿命蛋白和一些细胞器的降解，这种降解有助于细胞内组分和细胞器的正常更新，而蛋白酶体主要降解胞内的短寿命蛋白[1]。 根据细胞内底物运送到溶酶体腔方式的不同，哺乳动物细胞可分为3种主要方式：大自噬(macroautophagy)、小自噬(microautophagy)和分子伴侣介导自噬(chaperone—mediated autophagy, CMA)。无论大自噬还是小自噬都可以选择性和非选择性吞噬大的物质，CMA为胞浆内蛋白结合到分子伴侣后转运到酶体腔中，被溶体酶消化。由于目前对大自噬及其在疾病发生的作用的研究日益增多，所以本综述着重介绍大自噬。 2 自噬的诱导
哺乳动物自噬研究方法 【摘要】 自噬涉及到许多的生理和病理过程，因此，我们越来越需要科学地准确认识，并且量化操控自噬的过程。但是，由于自噬涉及了许多动态复杂的过程，关于它的研究分析经常不正确。在本文中，我们探讨监控自噬以及调控自噬活性的各种方法，主要集中关注哺乳动物中的大自噬。 【简介】 过去的十年中，有大量的研究围绕一个基本的细胞生物学通路“自噬”（希腊语中意味自我吞噬）。一系列进化上保守的基因（最初在酵母中被鉴定）被发现是自噬过程中所必需的，这一发现使得科学家能够去发现大量的自噬的功能，如：维持自身平衡稳态、参与细胞发展和其他生理活动。此外，越来越多的证据证明自噬的失控可能与许多哺乳动物的疾病发生有关。因此，科学家们迫切需要能够准确的检测自噬和研究在不同生物学进程中的功能的方法，特别是在哺乳动物系统。 在哺乳动物自噬的研究历史中一直有两个主要的困扰。首先的挑战在于如何将“一个动态的进程”和“静态的测量”进行捕获，并且这个固有的局限性与基于这些测量作出的生物学推论相关。第二个挑战在于将“形式”与“功能”分离，并且避免在给定的生理条件下，基于自身检测到（或没有）导致的将生理功能归至自噬的这个常见陷阱。这两个挑战可能导致了在我们研究哺乳动物自噬功能的历史中的许多误解。例如，一些神经退行性和肌退化性疾病最初被认定的结果，至少一部分被认为是由于自噬的增加（基于显微镜下观察到通路中早期的中间产物的增加）。然而实际上，早期中间产物的蓄积在这些疾病中代表着后阶段自噬通路的阻滞。自噬的一个常见的形态特征是细胞的垂死状态，但这也被错误的认为是一种细胞死亡通路，然而，现在似乎已经很明确自噬的主要功能是帮助细胞抵抗各种“生死攸关”的应激条件并使细胞存活。 这些哺乳动物自噬研究中的历史挑战部分已经通过将阐述自噬分子机制的最新进展运用到新的自噬研究的方法被克服。因此，在过去的十年里，许多新的技术被发明，用于动态监控自噬和通过调控自噬来明确其在给定的细胞状态下的功能。本文的目的在于提供一个重要的关于目前可行的研究哺乳动物自噬的技术和这些技术在解释过程中的限制的概述。更多的各种技术的细节信息可以再其他综述中获得。 自噬的基础知识 自噬是一般用于描述细胞内物质包括细胞器到溶酶体中降解的过程。在自噬的三种类型中（大自噬、小自噬和分子伴侣介导的自噬），研究得最多的就是大自噬。分子伴侣介导的自噬是通过伴侣蛋白展开蛋白质，直接将细胞质蛋白转移，穿过溶酶体膜。小自噬涉及溶酶体膜表面的内陷提供一小部分细胞质进入溶酶体内腔。 大自噬（简称自噬）是本文主要关注的通路。这个通路从酵母到哺乳类都呈现保守，它是通过一些特定的细胞器（自噬体）介导的。在初始的诱导阶段，一个小的囊状的称作隔离膜或者延长的吞噬膜，随后封闭一部分细胞质，导致双层膜结构即自噬体的形成。然后自噬体的外膜融合至一个溶酶体（形成自噬溶酶体），导致所封闭的物质和自噬体的内膜共同降
自噬现象及其分子机制的研究进展 发表时间：2011-06-02T10:04:12.903Z 来源：《中外健康文摘》2011年第8期作者：刘杉珊李薇 [导读] 自噬是真核细胞特有的普遍生命现象，在维持细胞自我稳态、促进细胞生存方面起重要作用。 刘杉珊李薇（吉林大学第一医院血液肿瘤中心吉林长春 130021） 【中图分类号】R329 【文献标识码】A【文章编号】1672-5085 (2011)8-0448-04 【摘要】自噬是真核细胞特有的普遍生命现象，在维持细胞自我稳态、促进细胞生存方面起重要作用，广泛参与多种生理和病理过程。自噬与细胞卫士p53的关系密切，目前已成为肿瘤研究中的一个新热点。本文对自噬的概念、生物学特性、自噬过程及其信号调控、以及与 p53的关系作以概述，同时简要概述了目前自噬的研究方法和检测方法并提出问题和展望，为进一步研究自噬奠定基础。 【关键词】自噬分子机制 p53 近年来，自噬作为II型程序性细胞死亡，越来越成为除凋亡之外备受关注和研究的领域。目前自噬不仅被证实是一种细胞自我死亡的方式，同时也是一种细胞的自我保护机制，在肿瘤、老化和神经退化等细胞增殖和死亡紊乱疾病中发挥着重要的作用。因此通过对自噬的发生过程、分子机制、信号调控、及与细胞卫士P53之间关系的总结，为进一步研究其机制调控和临床应用奠定坚实的基础。 1 自噬的概念 自噬又称为II型程序性细胞死亡(type II programed cell death)是以胞质内出现双层膜结构包裹长寿命蛋白和细胞器的自噬体为特征的细胞“自我消化”的一系列生化过程。正常细胞内的物质主要有两种降解途径，一种通过蛋白酶体被降解，另一种是通过自噬作用。自噬主要降解细胞质的长寿命蛋白和一些细胞器的降解，这种降解有助于细胞内组分和细胞器的正常更新，而蛋白酶体主要降解胞内的短寿命蛋白[1]。 根据细胞内底物运送到溶酶体腔方式的不同，哺乳动物细胞可分为3种主要方式：大自噬(macroautophagy)、小自噬(microautophagy)和分子伴侣介导自噬(chaperone—mediated autophagy, CMA)。无论大自噬还是小自噬都可以选择性和非选择性吞噬大的物质，CMA为胞浆内蛋白结合到分子伴侣后转运到酶体腔中，被溶体酶消化。由于目前对大自噬及其在疾病发生的作用的研究日益增多，所以本综述着重介绍大自噬。 2 自噬的诱导 当细胞受到饥饿、高温、低氧及荷尔蒙等外界刺激, 或细胞器的损坏、突变蛋白的积聚及微生物的侵袭等应激时, 可引起细胞自噬的发生。雷帕霉素靶点TOR蛋白激酶(target of rapamycin)作为细胞中氨基酸、ATP和激素的感受器, 是调控细胞生长的关键因子之一,其是细胞氮水平的负调节剂，参与自噬反应的调节[3]。研究表明, TOR对自噬反应的调节与细胞的营养条件有关,当营养充足时, 细胞中TOR被激活而抑制自噬，而当细胞处于饥饿状态时, TOR被抑制而促进自噬。在哺乳动物细胞中又有Tor蛋白，同时Tor蛋白也随着周围环境的改变来调节自噬但是调节机制要较酵母细胞复杂。在哺乳动物细胞中mTor的上游负调节有I型PI3K激酶，PDK1和AKt/PKB,而PTEN能拮抗PI3K而促进自噬。同时伴随着自噬的发生。TOR 的失活引起Atg结构的改变, 如Atg13p部分去磷酸化, 在营养充足时Atg13可高度磷酸化而不易于Atg1激酶结合从而抑制自噬发生。相反，在细胞处饥饿状态时Atg13可很快与Atg1结合，从而增加自噬。同时mTor可增强与Atg17p和Atg1p之间的相互作用,从而调节其激酶活性。 3 自噬过程 自噬其发生过程大致分为3个阶段：(1)在饥饿、氧化应激损伤等情况下，粗面内质网的非核糖体区域、高尔基体等来源的自噬体膜脱落形成杯状分隔膜，包绕在被降解物（如蛋白质降解产物，细胞器和核糖体等）周围[3,4] ；(2)分隔膜逐渐延伸，将要被降解的胞浆成分完全包绕形成双层膜自噬体；(3)自噬体通过细胞骨架微管系统运输至溶酶体，与之融合形成自噬溶酶体并降解其内成分，自噬体膜脱落再循环利用。因此自噬可被视为细胞的“回收工厂”，其不仅促进能量的利用同时转运无功能的蛋白和细胞器。而调节这个复杂的过程的分子水平有五个关键阶段[5]:（1）形成吞噬泡（2）Atg5-12复合物与Atg16L并且多聚化（3）LC3形成并且插入吞噬泡膜（4）包绕预被降解物（5）自噬体与溶酶体融合。 3.1吞噬泡的形成 酵母细胞的吞噬泡膜形成于PAS，而哺乳动物细胞吞噬泡膜来其于内质网[6,7]，高尔基体[3,8,9]等，甚至可能在严密调控下来源于细胞核[10]。酵母细胞形成吞噬泡膜需要Atg1激酶与Atg13和Atg17复合物，该复合物可能通过跨膜蛋白Atg9补充脂质而促进吞噬泡膜的扩增[4,11]。这个过程可通过Tor激酶调节，其磷酸化Atg13从而阻止其与Atg1激酶作用[13]哺乳动物细胞吞噬泡的形成过程仍需要进一步研究。III型PI3K激酶，Vps34和Atg6/Beclin-1在哺乳动物细胞的吞噬泡形成和自噬的作用已经很好的认识。Vps34参与细胞膜的形成，但其需要与Beclin-1和其他调控蛋白来选择性的参与自噬过程[14]。PI3P在吞噬泡的延伸和不断补充Atg蛋白过程中起重要作用，Vps34与PI3K以PI为底物获得PI3P过程中，Vps34是十分重要的[15]。Vps34与Beclin-1作用可增加PI3P的水平。其他与Vps34与Beclin-1复合物结合促进自噬调节蛋白为UCRAG，BIF-1，Atg14L和AMBRA[16,17] ,或抑制自噬蛋白Rubicon, Bcl-2[18,19]. Beclin-1与Bcl-2结合可破坏Beclin-1与Vps34的作用，所以Beclin-1与Bcl-2，Bcl-XL作用与内质网可抑制自噬[21]。 3.2 Atg5-Atg12复合物形成 由Atg3、Atg5、Atg7、Atg10、Atgl2和LC3(Microtubule—associated protein 1 light chain 3，MAP1-LC3)参与组成的两条泛素样蛋白加工修饰过程,在Atg 12结合过程和LC3修饰过程起着至关重要的作用。有的两个泛素样蛋白系统参与形成Atg5-Atg12复合物和LC3, Atgl2首先由El样酶Atg 7活化，之后转运至E2样酶Atgl0，最后与Atg5结合，形成自噬体前体。Atg5-12复合物与Atg16L结合形成Atg5、Atgl2和Atgl6L 以复合物形式存在，这种结合一方面促进了自噬泡的伸展扩张，使之由开始的小囊泡样、杯样结构逐渐发展为半环状、环状结构；另一方面，Atg5复合物与自噬泡膜的结合还促进了LC3-向自噬泡的募集。Atg5-12复合物不依赖于自噬的作用，一旦自噬体形成，Atg5-Atgl2-Atgl6L复合物就脱离胞膜，使之Atg5-12复合物不是自噬的标志物。 3.3 LC3形成 第二条泛素样蛋白加工修饰过程参与LC3B 的形成，LC3B由哺乳动物细胞Atg8同源染色体编码。LC3B 被Atg4分解，生成LC3B-I，并暴露出其羧基末端的甘氨酸残基。同样LC3B-I也被E1样酶Atg7活化，转运至第二种E2样酶Atg3，并被修饰成膜结合形式LC3B-II。LC3B-II定位于前自噬体和自噬体，使之成为自噬体的标志分子。一旦自噬体与溶酶体融合，自噬体内的LC3II即被溶酶体中的水解酶降解。哺乳动物
一、章（节、目）授课计划第页
二、课时教学内容第 技术的进步在一门学科的建立与发展过程中起着巨大的作用。没有 显微镜的发明就没有细胞的发现，更不会有细胞学说的建立，没有电子显微技 术及其分子生物学技术的结合，就不会有细胞生物学今天的发展。 细胞生物学研究方法：一般来说，凡是用来解决细胞生物学问题所采用的 方法，都属于细胞生物学研究方法。当前细胞生物学研究中常用到的方法有: 核酸和蛋白质成分的分析和序列测定、研究特异DNA、RNA常用的southern杂交、Northwre杂交及蛋白质免疫印迹技术、基因打靶技术等等。 第一节细胞形态结构的观察方法 一、有关显微镜的一些概念 （1）分辨率（resolution）：指分辨物体最小间隔的能力。 光学显微镜的分辨率 R=λ/N．sin（α/2）． 其中λ为入射光线波长； N =介质折射率；空气中N =1 α=物镜镜口角（样品对物镜镜口的张角）。 （2）放大倍数（magnification）：是指眼睛看到像的大小与对应标本大小的 比值。它指的是长度的比值而不是面积的比值。 例：放大倍数为100×，指的是长度是1μm的标本，放大后像的长度是 100μm，要是以面积计算，则放大了10,000倍。 显微镜的总放大倍数等于物镜和目镜放大倍数的乘积。 （3）有效放大倍数（effective magnification）：物镜的数值孔径（NA）决 定了显微镜有效放大倍数。有效放大倍数，就是人眼能够分辨的d′与物镜的 d间的比值，即不使人眼看到假像的最小放大倍数： M=d′/d 二、显微镜的分类 现代显微镜可以分为两大类：一类是光学显微镜，另一类是非光学
MDC:取12 mg粉末溶于720 nl DMSO使其浓度为50 mmol/L,分装后-20冰箱保存。 临用前用MEM稀释到终浓度50 umol/L; Rapamycin:用MEM培养基配成终浓度为1 umol/L,现用现配; 400ng/ml喹乙醇:称取4 mg喹乙醇,DMSO预溶(体积<0.1%)后加入10 ml MEM培养液至完全溶解,现用现配,避光保存; 3-MA:首先用PBS溶解粉末,临用前加热至完全溶解后再加入MEM培养基至终浓度10mmol/L; PI3K抑制剂（3-MA，Wortmannin）可干扰或阻断自噬体的形成 用RAPAMYCIN诱导自噬我也查过一部分文献，有用无血清的，也有用，一般培养基的，浓度从25nM到100nM都有，用的是50nM的雷帕霉素，加入一般的培养基中，目的是排除无血清所诱导出来的自噬。 文献说饥饿初期激活的是大分子自噬，在4-6小时活力达到最大，24h后以CMA途径为主Earle's balanced salts solution (EBSS) for 48 h sigma的EBSS，货号E2888，有碳酸氢钠，有酚红的，酚红到不是很必须，只是一个PH指示作用，好看些 无血清诱导自噬：EBSS 诱导6个小时就可以了。 EBSS一定可以诱导出来，只是需要说明的是时间点的设置，因为从饥饿诱导开始半个小时就可能开始自噬了，一直到24小时都持续，所以应该设置不同的时间点观察这个作用。另外一个很大的问题是，饥饿诱导的一个很大的弊端是细胞死亡，这也是我面临的问题，就是在细胞收养的时候蛋白浓度太小了。24小时就很少了，更不要说48小时和72小时了 Hank's诱导，也就是通常所说的饥饿诱导，细胞培养到对数生长期后以Hank's替代常规完全培养基，3h后就可诱导出自噬。我用Hank's诱导了3h后电镜观察有30%细胞都有自噬这种现象，但不如国外报道的高。 sigma的氯喹的货号C6628。用氯喹做自噬抑制剂，293T细胞50uM就可以。1. 可以用双蒸水配制2. 配制后4度保存 不同的自噬抑制剂机制不同。抑制的步骤也不同。有的不能抑制lc3的剪切，但能抑制后续的步骤，Chloroquine抑制自噬体与溶酶体的融合过程，autophgy不能完成，所以lc3才会累积。因此加了抑制剂lc3之后会比不加的要高。氯喹能提高溶酶体中的pH值，使溶酶体中的酸性水解酶丧失活性，从而导致“自噬溶酶体”不能降解，因此，位于自噬体和自噬溶酶体膜上的LC3不能按时降解，表现为LC3荧光长时间的保留或WB中LC3条带变粗。 Z-VAD-FMK（caspase-3 抑制剂）抑制EV71感染所引起的细胞凋亡，观察细胞的自噬情况。研究发现，抑制细胞凋亡能增加LC3-I转化为LC3-II以及p62的降解。 1. 雷帕霉素：作为以mTOR 为靶点最经典的诱导剂已经被广为应用，推荐工作浓度为1μmol-10μmol； 2. 氯喹：氯喹（Chloroquine）作为溶酶体的抑制剂，可以抑制自噬体与溶酶体的融合从而可以用来作为自噬以及自噬流的抑制剂用于实验研究，推荐使用浓度：10umol-50umol。 正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察，因此，必须对自噬进行人工干预和调节，经报道的
第二章细胞生物学研究方法 (the research method in the cell biology) 教学目的 1、了解主要工具和常用方法，侧重掌握基本原理和基本应用； 2、认识工具和方法与学科发展的相关性。 教学内容 本章从以下5个方面介绍了细胞生物学的研究方法: 1．显微成像技术 2．细胞化学技术 3．细胞分选技术 4．细胞工程技术 5．分离技术 6．分子生物学方法 计划学时及安排 本章计划3学时。 教学重点和难点 生命科学是实验科学，它的很多成果都是通过实验才得以发现和发展的。许多细胞生物学的重要进展以及新概念的形成,往往来自新技术的应用。因此,方法上的突破,对于理论和应用上的发展具有巨大的推动作用，这是学习本章应确立的基本思想。 1．显微成像包括直接成像和间接成像。显微技术是细胞生物学最基本的研究技术, 包括光学显微技术和电子显微技术。在光学显微技术中要掌握几种常用显微镜成像的基本原理,包括普通双筒显微镜、荧光显微镜、相差显微镜、暗视野显微镜、倒置显微镜。电子显微镜是研究亚显微结构的主要工具, 透射和扫描电镜的是两类主要的电子显微镜, 对其基本结构、工作原理和样品制备方法则是学习的重点。 2．细胞化学技术介绍了酶细胞化学技术、免疫细胞化学技术、细胞分选技术, 其中流式细胞分选技术是细胞生物学和现代生物技术中的重要技术, 应重点掌握。 3．细胞工程技术是细胞生物学与遗传学的交叉领域，主要利用细胞生物学的原理和方法，结合工程学的技术手段，按照人们预先的设计，有计划地改变或创造细胞遗传性的技术。包括体外大量培养和繁殖细胞，或获得细胞产品、或利用细胞体本身。主要内
I C M Y K —] 430 ·综述． 线粒体自噬在血管性认知障碍中的 研究进展＊ 刘山＊解丽＊张强A董艳红＊畴 【关键词】线粒休自噬血管性认知障碍慢性脑低灌 注脑缺血再灌注损伤 血管性认知障碍(vascular cognitive impairment,VCI)指 由脑血管病的危险因素（高血压病、糖尿病、高脂血症和高 同型半胱氨酸血症等）、显性脑血管病（脑梗死和脑出血等） 及非显性脑血管病（白质疏松和弥漫性脑缺血等）引起的一 组从轻度认知损害到痴呆的综合征。线粒体是缺血后神经 细胞死亡的关键靶区，机体可通过自噬控制线粒体数最，其 功能紊乱是慢性脑低灌注(chronic cerebral hypoperfusion, CCH)、脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury, CIR)所致VCI的主要机制。通过阐述线粒体自噬机 制及其在CCH、CIR所致VCI中的作用，有利千寻找药物作 用靶点，早期干预VCI的发生发展，提升患者生存质掀。 1线粒体自噬 线粒体自噬指损伤线粒体利用自噬机制选择性清除 受损的蛋白质和细胞器，控制线粒体质最与数最，在营养 不良或外界刺激时维持细胞稳态四线粒体自噬可以通过 相关分子通路介导和影响线粒体动力学平衡发生。 1.1线粒体自噬相关分子通路 1.1.1 PINKl/Parkin分子通路同源性磷酸酶张力蛋白诱导 激酶1(phosphatase and tensin homologinduced putative kinasel, PINKl)是一种丝氨酸／苏氨酸激酶。各种原因使得线粒体 功能紊乱时，线粒体膜电位降低，膜上的PINKl聚集，将 Parkin蛋白从细胞质募集到线粒体，其具有E3泛索连接 酶活性，将标记的泛索化底物通过微管相关蛋白1轻链 doi: 10.3969/j.issn.1002-0152.2020.07.012 女河北省中医药管理局科研计划项目（编号：2019158)；河北省 卫生厅科研基金项目青年科技课题（编号：20160459) ＊ 河北医科大学研究生学院（石家庄050000) A 华北理工大学 米河北省人民医院神经内三科 。通信作者(E-mail:d_yanhongniu@https://www.doczj.com/doc/1d13003750.html,) | C hin? 2020 LC3相互作用区域在自噬体上募集LC3，最终导致线粒体 与自噬体结合发生自噬性降解[2]。 1.1.2 HIF -la/BNIP3/Beclinl信号通路低氧诱导因子－l (hypoxia inducible factor-I, HIF -1)是由HIF-la亚基和 HIF-lb亚基组成的异二聚体，而HIF-la在调节氧稳态中 起着关键作用。BNIP3是Bcl-2蛋白家族成员，主要表达于 线粒体和内质网。Beclinl是磷脂酰肌醇3，是细胞自噬过 程中最重要的正性调节因子。缺血缺氧时，HIF-la表达上 调，BNIP3蛋白表达上调，BNIP3和Beclinl竞争Bcl-2结 合位点，释放Beclinl，参与线粒体自噬的激活，降解受损 的线粒体，对抗各种凋亡因子[3]。 1.1.3 PI3K-Akt-mTOR通路PI3K,即磷酸肌醇激酶3; Akt,即蛋白激酶B;mTOR,哺乳动物雷帕霉索靶蛋白 (mammalian Target Of Rapamycin)，是雷帕霉素的作用靶 点。LV等[4]的研究表明，缺血／低氧条件下，线粒体能量代 谢障碍，在某种程度上通过阻断PI3K/AKT/mTOR信号通 路，增强线粒体自噬，清除受损的线粒体，保护线粒体的正 常生理功能。 1.2线粒体动力学变化线粒体通过线粒体融合、分裂蛋白 精确调控，在融合和分裂形态中不断变换维持平衡。线粒 体融合蛋自主要有视神经萎缩蛋自1(Opa l)、线粒体融合 蛋自Mfnl和Mfn2。Opal或Mfnl/2缺乏的细胞可导致线 粒体碎片聚集及线粒体自噬[5--6]。D rp l(DLPl, Dymple)主要 调控线粒体分裂，其具有G TP酶活性。D rp l的下调及敲除 可抑制线粒体自噬而导致功能紊乱的线粒体聚集［7]。如果 线粒体裂变和融合失衡，则会引发线粒体膜电位改变，进 而激活线粒体自噬，导致神经元死亡。 2线粒体自噬与血管性认知障碍 在所有认知障碍性疾病中，VCI是目前唯一一个可干 预的认知障碍性疾病。干预VCI的早期阶段，延缓疾病的 发生发展，对千提升患者及其家庭的生活质最至关重要。 从临床研究来讲，CCH、CIR都是与脑血管病有关的病因， 二者均可导致VCI。CCH指长期脑血流降低导致血流动力 学性脑缺血。既往研究表明，CCH可通过诱导血管损伤，血 脑屏障系统功能失调，神经递质紊乱等因素最终导致认知 障碍[8]。CIR损伤是指脑缺血一定时间恢复血液供应后，其 功能不但未能恢复，反而出现了更加严重的脑机能障碍。 已有国内外研究表明CIR损伤可能通过能量代谢障碍、突 触损伤、炎症反应等引起认知障碍[9］。从基础研究层面来 讲，目前VCI动物模型采用两种方法较多：CD永久结扎双 侧颈总动脉的CCH模塑；＠反复结扎再灌注双侧颈总动脉 的CIR模型。在分子机制上，VCI发病涉及自噬、氧化应激、
自噬荧光研究方法及具体步骤 自噬（Autophagy）一词来源于古希腊语，是“auto”（自我）与“phagein”（吞噬）的结合。自噬发生在细胞内，是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器，使其包被进入双层膜囊泡（自噬体），进而与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程，自噬的意义在于实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。在自噬过程中，自噬体的形成是关键，其直径平均500nm，囊泡内包裹胞质成分和某些细胞器如线粒体、内吞体、过氧化物酶体等。与其他细胞器相比，自噬体的半衰期很短，只有8min 左右，说明自噬是细胞对于环境变化的有效反应。细胞质中的线粒体等细胞器首先被囊泡所包被，这种囊泡主要来自于内质网和高尔基体；囊泡最终形成双层膜结构，即自噬体（autophagosome）；自吞噬体与胞内体融合形成中间自体吞噬泡，最终自体吞噬泡的外膜与溶酶体融合形成自噬溶酶体（autolysosome），由溶酶体内的酶降解自体吞噬泡中的内容物和内膜。 自噬观察检测方法： 1．透射电镜下直接观察自噬体Phagophore 的特征为：新月状或杯状，双层或多层膜；自噬体的特征为：双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等；自噬溶酶体的特征为：单层膜，胞浆成分已降解。 2．利用Western Blot 检测LC3-II/I 比值的变化以评价自噬形成自噬形成过程中，胞浆型LC3（LC3-I）会酶解掉一段多肽，转变为膜型LC3 （LC3-II）。故而LC3-II/LC3-I 比值的大小可估计自噬水平的高低。 3．在荧光显微镜下采用GFP-LC3 融合蛋白来示踪自噬形成无自噬时，
自噬研究方法工具汇总---BIO-RAD 细胞自噬 细胞自噬(autophagy)是依赖溶酶体途径对胞质蛋白和细胞器进行降解的一 种过程。这个过程可以清除功能异常的细胞器、细胞内病原体以及再循环细胞组分。尽管自噬最早被发现是应答饥饿，现在发现自噬受到各种胁迫信号的诱导，基础水平的自噬有利于细胞内稳态的维持。很多因素包括激素刺激的天然免疫信号及能量耗尽或高温等引起的物理胁迫会诱导自噬上调。相反，很多疾病如癌症、传染性疾病和神经退行性疾病及衰老和自噬的下调都有关联。 自噬主要有三种信号通路： ●Microautophagy小自噬通过溶酶体的膜内陷“吞入”目标分子，起到降解细胞质中小体积物质的作用。这个过程研究得不是很清楚，膜内陷相关的GTPaseVps1p 蛋白和自噬相关蛋白(Atg)参与其中。 ● 分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediatedautophagy,CMA)直接将细胞质蛋白 带到溶酶体。带KFERQ-序列的蛋白质和热休克蛋白Hsc70及其它分子伴侣相互作用形成的复合体和溶酶体膜上的Lamp-2A受体结合后，导致Lamp-2A聚合引发复合体中的底物易位穿越溶酶体膜。 ● Macroautophagy大自噬被研究得最多，可以降解更大量的胞浆物质，由特殊的细胞器自噬小体介导。大自噬起始于吞噬泡装配点（PAS）的形成和 Unc51-likekinase (Ulk)复合体的组装，这启动了自噬小体的形成（图1）。接着是成核阶段，Ulk复合物与由beclin-1、Vps15、Vps34、Atg14组成classIII PI3K 复合物相互作用形成吞噬泡。接着吞噬泡膜扩展形成自噬小体，在这个过程中Atg12/5/16复合物促成了磷脂酰乙醇胺（PE）和LC3（酵母中是Atg8）的偶联，这是自噬小体膜唯一已知的标志物。PE-LC3偶联物在几个关键步骤中起作用：自噬泡膜的扩展、自噬体的识别及自噬溶酶体的形成。整个过程涉及30多个自噬相关基因（Atg蛋白），包括Beclin-1、溶酶体相关膜蛋白(Lamp-1 and Lamp-2)和微管相关蛋白1A/1Blight chains 3A/B (MAP1LC3A/B 或简称LC3)，这些都是自噬常见的标志物。最后一步，完全形成的自噬小体与溶酶体融合释放内含的物质被降解。