微生物与发酵工程实验
济南大学化学与化工学院生物技术系
2007年6月
实验一细菌生长曲线的测定
一、目的要求
1．了解比光电比浊计数法原理
2．学习掌握光电比浊计数法的操作方法
3．通过细菌光密度的测量，了解细菌生长特征和规律，绘制生长曲线
二、基本原理
当光线通过微生物菌悬液时，由于菌体的散射及吸收作用使光线的通过量降低。在一定范围内，微生物细胞浓度与透光度成反比，与光密度成正比，而光密度或透光度可以由光电池准确测出。测定细菌浊度，光波通常选择400~700nm。光电比浊计数法的优点是简便、迅速，可以连续测定，适合于自动控制。
大多数细菌的繁殖速度很快。将一定的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期，对数生长期、稳定期/衰亡期四个阶段。以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速率为纵坐标作图所绘制的曲线称为该细菌的生长曲线。不同的细菌在相同的培养条件下其生长曲线不同，同样的细菌在不同培养条件下所绘制的生长曲线也不同。测定细菌的生长曲线，了解其生长规律，这对人们根据不同的需要，有效地利用和控制细菌的生长具有重要意义。
三、试剂和仪器
1．菌种：放射状土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)
2．培养基：
蔗糖 2%，酵母膏 0.05%, 尿素0.05%, NaCl 0.01%, K2HPO4 0.5%，(NH4)2SO4 0.02%，MgSO4?7H2O 0.02%, pH 7.0
3．仪器及其他用具
755型分光光度计，振荡摇床，无菌吸管等。
四、实验步骤
1．接种
用接种环接种一环细菌到盛有6ml液体培养基的试管中，30℃120rpm摇床振荡过夜培养。
2．转接及取样
将上述培养液接种到盛有54ml液体培养基的三角瓶内，30℃120rpm摇床振荡培养，每隔2小时用无菌吸管取样3ml测定比浊。
3．OD600测定
用未接种的液体培养基作空白对照，选用600nm波长进行光电比浊测定。（注：这里以水为对照，测定空白培养基的OD值，最后把这个差减去即可。）
4．结果分析及讨论
五、实验结果
1．将测定的OD600填入下表：
培养时间（hr）对照0 2 4 6 8 10 12 光密度（OD600）
2．绘制土壤杆菌的生长曲线
以培养时间为横坐标，以OD600为纵坐标作图绘制土壤杆菌的生长曲线，找出生长时间及生长量的关系，区分土壤杆菌的延迟期、指数生长期、稳定期、衰亡期。
思考题：
1. 光电比浊计数的原理是什么？
2. 如何区分土壤杆菌的延迟期、指数生长期、稳定期、衰亡期，并说出不同培养时期的培养特征。
实验二纤维素酶的固体发酵
一、实验目的：
1.学习固体发酵技术
2.掌握发酵产物纤维素酶的提取及酶活测定
二、实验原理
纤维素是地球上数量最丰富的可再生生物质资源。全球每年光合作用的产物高达1500-2000亿吨，其中80%以上为木质纤维素类物质。自然界中，具有降解纤维素能力的微生物有近200种，其中丝状真菌是研究最多的纤维素降解类群。纤维素酶是一种多组分酶，包括C1酶、C X酶和β-葡萄糖苷酶三种主要组分。其中C1酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素，C X酶的作用是将无定形纤维素继续水解成纤维寡糖，β-葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在540nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。
三、实验材料、主要仪器和试剂
1．实验材料
羧甲基纤维素钠（CMC），麸皮
2．主要仪器
（1）752型分光光度计、（2）恒温水浴槽、（3）沸水浴锅、（4）电炉子、（5）剪刀、（6）万分之一分析天平、（7）恒温干燥箱、（8）冰箱、（9）试管架、（10）胶头滴管
（11）具塞刻度试管 20mL×24
（12）移液管或加液器 0.5 mL×3；2mL×7
（13）容量瓶 100 mL×6；1000 mL×3
（14）量筒 50 mL×2；100 mL×1；500 mL×1
（15）烧杯 100 mL×6；500mL×3；1 000 mL×1
3．试剂（均为分析纯）
（1）浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液
将葡萄糖在恒温干燥箱中105℃下干燥至恒重，准确称取100mg于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至100mL，充分混匀。4℃冰箱中保存（可用12～15天）。
（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）溶液
准确称取DNS 6.3g于500mL大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，加入2mol/L NaOH溶液262mL，再加到500mL含有185g酒石酸钾钠（C4H4O6KNa · 4H2O，MW=282.22）的热水溶液中，再加5g结晶酚（C6H5OH，MW=94.11）和5g无水亚硫酸钠（Na2SO3，MW=126.04），搅拌溶解，冷却后移入1 000mL容量瓶中用蒸馏水定容至1 000mL，充分混匀。贮于棕色瓶(或放置避光处)中，室温放置一周后使用。
（3）0.05 mol/L pH4.5的柠檬酸缓冲液
A液（0.1 mol/L 柠檬酸溶液）：准确称取C6H8O7· H2O（MW=210.14）21.014g于500mL 大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入1 000mL容量瓶中用蒸馏水定容至1 000mL，充分混匀。4℃冰箱中保存备用。
B液（0.1 mol/L 柠檬酸钠溶液）：准确称取Na3C6H5O7· 2H2O（MW=294.12）29.412g 于500mL大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入1 000mL容量瓶中，然后用蒸馏水定容至1 000mL，充分混匀。4℃冰箱中保存备用。
（4）0.05 mol/L pH5.0的柠檬酸缓冲液
取上述A液20.5mL，B液29.5mL，充分混匀后移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至100mL，充分混匀。即为0.05M pH5.0的柠檬酸缓冲液。4℃冰箱中保存备用。用于测定C X酶活力。
（5）0.51％羧甲基纤维素钠（CMC）溶液
精确称取0.51gCMC于100ml小烧杯中，加入适量0.05 mol/L pH5.0的柠檬酸缓冲液，加热溶解后移入100mL容量瓶中并用0.05 mol/L pH5.0的柠檬酸缓冲液定容至100mL，用前充分摇匀。4℃冰箱中保存备用，用于测定C X酶活力。
四、操作方法和步骤
1.一级种子的制备
将黑曲霉接种到麸皮斜面（10%麸皮浸汁，2%琼脂，自然pH，121℃，灭菌20 min），28℃静置培养5-7天。
2.固体发酵
将活化的菌种接入300ml三角瓶（内含麸皮干重50g+2.5g(NH4)2SO4，水：麸皮＝1:1，自然pH，121℃，灭菌20min），28℃培养5-7 天。其间每隔两小时摇动瓶内培养物，使其蓬松（扣瓶），以利菌种生长均匀。
3.发酵液的预处理
浸提：固体发酵培养5-7 d后，以每10g干料加50ml pH7.0缓冲液，8层纱布过滤，浸提。浸提液以6000r/m离心30min，取上清液。
4.葡萄糖（G）标准曲线的制作
取8支洗净烘干的20mL具塞刻度试管，编号后按表1加入标准葡萄糖（G）溶液和蒸馏水，配制成一系列不同浓度的葡萄糖溶液。充分摇匀后，向各试管中加入1.5mL DNS溶液，摇匀后沸水浴5min，取出冷却后用蒸馏水定容至20ml，充分混匀。在540nm波长下，以1号试管溶液作为空白对照，调零点，测定其它各管溶液的光密度值并记录结果。以葡萄糖含量（mg）为横坐标，以对应的光密度值为纵坐标，在坐标纸上绘制出葡萄糖标准曲线。
表1 葡萄糖标准曲线制作
5.C X酶活力的测定
取4支洗净烘干的20mL具塞刻度试管，编号后各加入1.5mL 0.51％CMC柠檬酸缓冲液，并向1号试管中加入1.5mL DNS溶液以钝化酶活性，作为空白对照，比色时调零用。将4
支试管同时在50℃水浴中预热5～10min，再各加入预处理后的酶液0.5mL，50℃水浴中保温30min后取出，立即向2、3、4号试管中各加入1.5mL DNS溶液以终止酶反应，充分摇匀后沸水浴5min，取出冷却后用蒸馏水定容至20mL，充分混匀。以1号试管溶液为空白对照调零点，在540nm波长下测定2、3、4号试管液的光密度值并记录结果。
根据3个重复光密度的平均值，在标准曲线上查出对应的葡萄糖含量，按下式计算出
C X酶活力（U/ ml）。在上述条件下，每小时由底物生成1μmol葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位（U）。
葡萄糖含量（mg）× 酶液定容总体积（mL）×5.56
C X酶活力(U/ml)＝
反应液中酶液加入量（mL）×时间（h）
6．滤纸酶活力的测定
取4支洗净烘干的20mL具塞刻度试管，编号后各加入0.5mL酶液和1.5mL 0.05 mol/L pH4.5的柠檬酸缓冲液，向1号试管中加入1.5mL DNS溶液以钝化酶活性，作为空白对照，比色时调零用。将4支试管同时在50℃水浴中预热5～10min，再各加入滤纸条50mg（新华定量滤纸，约1cm × 6 cm），50℃水浴中保温1h后取出立即向2、3、4号试管中各加入1.5mL DNS溶液以终止酶反应，充分摇匀后沸水浴5min，取出冷却后用蒸馏水定容至20mL，充分混匀。以1号试管溶液为空白对照调零点，在540nm波长下测定2、3、4号试管液的光密度值并记录结果。
根据3个重复光密度的平均值，在标准曲线上查出对应的葡萄糖含量，按下式计算出滤纸酶活力（U/ml）。在上述条件下，每小时由底物生成1μmol葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位（U）。
葡萄糖含量（mg）× 酶液定容总体积（mL）× 5.56滤纸酶活力 (U/ml) ＝
反应液中酶液加入量（mL）× 时间（h）
式中：5.56为1mg葡萄糖的μmol数。（1 000/180=5.56）
7．C1酶活力的测定
将5mg/mL的原酶液稀释10～15倍后用于测定C1酶活力，以脱脂棉为底物。
取4支洗净烘干的20mL具塞刻度试管，编号后各加入50mg脱脂棉，加入1.5mL 0.05M pH5.0的柠檬酸缓冲液，并向1号试管中加入1.5mL DNS溶液以钝化酶活性，作为空白对照，比色时调零用。将4支试管同时在45℃水浴中预热5～10min，再各加入适当稀释后的酶液0.5mL，45℃水浴中保温24h。取出后立即向2、3、4号试管中各加入1.5mL DNS溶液以终止酶反应，充分摇匀后沸水浴5min，取出冷却后用蒸馏水定容至20mL，充分混匀。以1号试管溶液为空白对照调零点，在540nm波长下测定2、3、4号试管液的光密度值并记录结果。
根据3个重复光密度的平均值，在标准曲线上查出对应的葡萄糖含量，按下式计算出
C1酶活力（U/g）。在上述条件下反应24h，由底物生成1μmol葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位（U）。
C1酶活力 (U/g)＝
葡萄糖含量（mg）× 酶液定容总体积（mL）× 稀释倍数× 5.56 × 24
反应液中酶液加入量（mL）× 样品重（g）× 时间 (h)
式中：24为酶活力定义中的24h。
8．β-葡萄糖苷酶活力的测定
取4支洗净烘干的20mL具塞刻度试管，编号后各加入1.5mL 0.5％水杨酸苷柠檬酸缓冲液，并向1号试管中加入1.5mL DNS溶液以钝化酶活性，作为空白对照，比色时调零用。将4支试管同时在50℃水浴中预热5～10min，再各加入酶液0.5mL，50℃水浴中保温30min，取出后立即向2、3、4号试管中各加入1.5mL DNS溶液以终止酶反应，充分摇匀后沸水浴
5min，取出冷却后用蒸馏水定容至20mL，充分混匀。以1号试管溶液为空白对照调零点，在540nm波长下测定2、3、4号试管液的光密度值并记录结果。
根据3个重复光密度的平均值，在标准曲线上查出对应的葡萄糖含量，按下式计算出β-葡萄糖苷酶活力（U/g）。在上述条件下，每小时由底物生成1μmol葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位（U）。
β-葡萄糖苷酶活力 (U/g)＝
葡萄糖含量（mg）× 酶液定容总体积（mL）× 5.56
反应液中酶液加入量（mL）× 样品重（g）× 时间（h）
实验三利用发酵罐进行产品的分批发酵生物反应器是生物工程的重要组成部分，是生物技术转化为产品的关键设备，在生物工程中处于中心地位。机械搅拌式生物反应器，又称发酵罐，是进行液体发酵的特殊设备。实验室使用的小型发酵罐，其容积可从1 L至数百升。发酵罐配备有控制器和各种电极，可以自动地调控试验所需的培养条件，是微生物学、遗传工程、医药工业等科学研究所必需的设备。
一、目的和要求
1. 了解机械搅拌式生物反应器的基本结构、原理，掌握其操作方法。
2. 学习生物培养工艺过程实验技术。
二、基本原理
发酵罐的结构可分为罐体和控制器两部分。
罐体为一硬质玻璃圆筒，底和顶两端用不锈钢及橡胶垫圈密封构成，容积为5 L，顶盖上有8个孔口，分别是加料及接种口、补料口、溶氧电极口、放置温度电极口、放置pH电极口、放置消泡电极口、放置取样管口、进气口、放置搅拌器及冷凝管口。
图1 发酵罐顶盖，表示各孔口
1.加料及接种口；
2.补料口；
3.放置消泡电极口；
4.放置D.O（溶解氧）电极口；
5.放置
pH电极口；6.放置温度电极口；7.进气口；8.取样口；9.放置搅拌器及冷凝管口
发酵罐放置在罐座上，罐座除支持发酵罐外，还有搅拌器转动装置，升温和冷却装置等。控制器能够完成基本的控制功能，它由下列几部分构成：
(1) 参数输入及显示装置，用以输入控制发酵条件的各种参数及显示发酵过程中罐内培养液的温度，pH、DO（溶氧）的测定数值。
（2）电极校正装置用以校正pH电极和DO电极等。
（3）酸碱泵用以向发酵罐加入酸液、碱液以调节培养液中的pH。
（4）消泡剂加入泵用以向发酵罐加入消泡剂，以消除发酵过程中产生的过多的泡沫。
（5）电极电导连线分别连接控制发酵罐的DO、pH、温度、泡沫等。
（6）空气调节装置控制器的空气调节装置由进气口、出气口、空气减压阀、空气压力表、空气流量调节阀和空气流量计组成，用以调节进入发酵罐的空气流量及压力。进气管与空气压缩机或氧气瓶相连；出气管与发酵罐之间接有空气过滤器，以滤除空气中的微生物，避免染菌。
三、实验材料
菌种：放射状土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)
培养基：
(1)斜面培养基：
K2HPO4 0.1g，MgSO4·7H2O 0.05g，FeSO4·7H2O 0.001g，NaNO3 0.3g，KCl 0.05g，蔗糖3g，琼脂2g，蒸馏水100ml，pH6.6
(2)种子培养基（g/L）：
蔗糖 2%，酵母膏 0.05%, 尿素0.05%, NaCl 0.01%, K2HPO4 0.5%，(NH4)2SO4 0.02%，MgSO4?7H2O 0.02%, pH 7.0。
(3) 发酵培养基（g/L）：
蔗糖 2%，酵母膏 0.05%, 尿素0.05%, NaCl 0.01%, K2HPO4 0.5%，(NH4)2SO4 0.02%，MgSO4?7H2O 0.02%, pH 7.0。
四、仪器设备
5L发酵罐及附件
电热恒温水浴槽
立式灭菌锅
超净工作台
恒温振荡器
五、实验步骤
1. 菌种准备：配制斜面培养基100 ml，分装试管，灭菌后摆成斜面。将放射状土壤杆菌接种于斜面上，30℃培养48 h。上罐前一天，由斜面菌种转接种子瓶，振荡培养16 h。
2. 上罐前的准备：
（1）发酵罐的清洗
洗净发酵罐及各个部件，洗净各联接胶管。发酵罐内（可进行清洗的）任何部分都应认真清洗，否则都可能成为杂菌的滋生地。发酵前期引起染菌的主要原因是由于清洗不净。易被忽略而未能充分清洗的地方有轴封、罐顶、取样管和空气分布器等处。另外，还应充分注意发酵罐周围的附件设备，如加热电器、空气压缩机、电机的安全使用。
（2）上罐前的各项检查工作
检查空气源，排油；防油进空气过滤器造成堵塞。
检查管道阀门（加棉团吸油）校检空气减压阀,pH,DO,检查轴封。
（3）培养基灭菌
配制发酵培养基4000 ml，置发酵罐内，调pH 7.0，121℃20 min灭菌。
3.上罐时的操作步骤：
（1）把发酵罐置罐座上，连接各电极导线。
（2）接通控制器、参数输入及显示装置、电极校正装置及罐座电源。
（3）按控制器、参数输入与显示装置上的AUTO键，使发酵罐处在自动控制状态。（4）连接压缩空气管路，接通空气压缩机电源，调节贮气罐出气压力为0.5-1.0 Mpa，通入压缩空气，调节空气流量计旋钮，使浮子悬浮在5－7 L/min处。
（5）调节搅拌转速为300 r/min。
（6）连接冷却水管路，打开自来水龙头，通入冷却水。
（7）输入各控制参数，本机自动控制发酵过程中的温度、pH及显示DO值。控制参数的输入是通过参数输入及显示装置进行的。
（8）当发酵罐的温度达到28－30℃时，进行接种。
将酒精置接种口环内，点燃，进行无菌接种，接入种子。密封接种口。接种后立即进行第一次取样。
（9）在搅拌转速300 r/min和空气流量在7 ml/min下校正DO至100％。
发酵过程各指标的测定：
还原糖测定：发酵液离心，取上清液2ml加入试管，再向试管中加入1.5mL DNS溶液，以加入2ml水、1.5mL DNS溶液的试管溶液作为空白对照，摇匀后沸水浴5min，取出冷却后用蒸馏水定容至20ml，充分混匀。在540nm波长下，用空白对照调零点，测定样品光密度值并记录结果（葡萄糖标准曲线同实验二）。
生物量测定：将发酵液适当稀释，美兰染色，使用显微镜计数。
A、取发酵液稀释
B、镜检计数器
C、加样品取样要摇匀菌液，加样时计数室不可有气泡。
D、显微镜计数使用低倍镜、高倍镜。
E、清洗血细胞计数板
计算公式：
单位体积发酵液总菌数＝A/5×25×104×B＝50000A×B（25个中方格）
或者A/5×16×104×B＝32000A×B（16个中方格）
注：A是五个中方格的总菌数，B为发酵液稀释倍数，计数室体积是0.1mm3（万分之一毫升）。
4.放罐:
经过发酵48－60h后，菌体生长缓慢，产物也不再增加，便可放罐。发酵液经离心后，收集发酵液作进一步处理。
5.清洗:
（1）放罐后，向发酵罐内加入4000 ml 水。
（2）把取样管插入发酵罐内，固定。连同其它接触过微生物的容器和物品，置高压蒸汽灭菌锅中灭菌。
（3）灭菌后清洗干净，按要求存放。
实验四乳酸发酵和制作乳酸菌饮料
一、实验目的
学习乳酸发酵和制作乳酸菌饮料的方法，了解乳酸菌的生长特性。
从新鲜酸乳中进行乳酸菌的分离纯化。
乳酸菌饮料制作。
自制乳酸质量品尝。
二、实验材料和用具
嗜热乳酸链球菌(Streptococcus thermophilus)、保加利亚乳酸杆菌(Lactobacillus casei)，乳酸菌种也可以从市场销售的各种新鲜酸乳或酸乳饮料中分离。
BCG牛乳培养基、乳酸菌培养基、脱脂乳试管(见注)、脱脂乳粉或全脂乳粉、鲜牛奶、蔗糖、碳酸钙。
恒温水溶锅、酸度计、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、培养箱、酸乳瓶(200～280mL)、培养皿、试管、300ml三角瓶。
三、实验内容
1、操作步聚
(1). 乳酸菌的分离纯化
A. 分离取市售新鲜酸乳或泡制酸菜的酸液稀释至10-5，取其中的10-4、10-5 2个稀释度的稀释液各0.1—0.2ml，分别接入BCG牛乳培养基琼脂平板上，用无菌涂布器依次涂布；或者直接用接种环蘸取原液平板划线分离，置40℃培养48h，如出现圆形稍扁平的黄色菌落及其周围培养基变为黄色者初步定为乳酸菌。
B. 鉴别选取乳酸菌典型菌落转至脱脂乳试管中，40℃培养8～24h，若牛乳出现凝固，无气泡，呈酸性，涂片镜检细胞杆状或链球状(两种形状的菌种均分别选入)，革兰氏染色呈阳性，则可将其连续传代4～6次，最终选择出在3～6h能凝固的牛乳管，作菌种待用。(2). 乳酸菌饮料的制作
A．将脱脂乳和水以1:7～10(W／V)的比例，同时加入5％～6％蔗糖，充分混合，于80～85℃灭菌10～15min，然后冷却至35～40℃，作为制作饮料的培养基质。
B．将纯种嗜热乳酸链球菌、保加利亚乳酸杆菌及两种菌的等量混合菌液作为发酵剂，均以2％～5％的接种量分别接入以上培养基质中即为饮料发酵液，亦可以市售鲜酸乳为发酵剂。接种后摇匀，分装到已灭菌的酸乳瓶中，每一种菌的饮料发酵液重复分装3～5瓶，
随后将瓶盖拧紧密封。
C. 把接种后的酸乳瓶置于40～42℃恒温箱中培养3～4h。培养时注意观察，在出现凝乳后停止培养。然后转入4-～5℃的低温下冷藏24h以上。经此后熟阶段，达到酸乳酸度适中(pH 4～4.5)，凝块均匀致密，无乳清析出，无气泡，获得较好的口感和特有风味。
D．以品尝为标准评定酸乳质量采用乳酸球菌和乳酸杆菌等量混合发酵的酸乳与单菌株发酵的酸乳相比较，前者的香味和口感更佳。品尝时若出现异味，表明酸乳污染了杂菌。
2、注意事项
(1).采用BCG牛乳培养基琼脂平板筛选乳酸菌时，注意挑取典型特征的黄色菌落，结合镜检观察，有利高效分离筛选乳酸菌。
(2)．制作乳酸菌饮料，应选用优良的乳酸菌，采用乳酸球菌与乳酸杆菌等量混合发酵，使其具有独特风味和良好口感。
(3)．牛乳的消毒应掌握适宜温度和时间，防止长时间采用过高温度消毒而破坏酸乳风味。
(4)．作为卫生合格标准还应按卫生部规定进行检测，如大肠菌群检测等。经品尝和检验，合格的酸乳应在4℃条件下冷藏，可保持6-7d。
3、演示
1. 在BCG牛乳培养基琼脂平板上乳酸菌的黄色菌落典型特征和镜检细胞学特征。
2. 已发酵的乳酸菌饮料凝乳情况观察。
四、结果整理
1．乳酸发酵过程、检测结果及结果分析。
2．将发酵的酸乳品评结果记录。
五、问题和思考
1．发酵酸乳为什么能引起凝乳?
2．为什么采用乳酸菌混合发酵的酸乳比单菌发酵的酸乳口感和风味更佳?
3．试设计一个从市售鲜酸乳中分离纯化乳酸菌和制作乳酸菌饮料的程序。
注：
(1) 脱脂乳试管
直接选用脱脂乳液或按脱脂乳粉与5％蔗糖水为1:10的比例配制，装量以试管的1/3为宜，115℃灭菌15min。
实验五啤酒的简易酿制一、实验目的
学习啤酒的酿制方法
二、实验内容
（一）概述
啤酒的酿造原料
大麦、酒花、水和辅助原料
啤酒的酿造工艺
麦芽制备→麦芽汁制备→啤酒前酵和后酵→啤酒过虑与包装
啤酒的酿造原理：
糖的变化；②蛋白质的变化；③高级醇的形成；④酯类的形成⑤连二酮的形成
（二）啤酒的实验室酿制
1、麦芽汁的制备（珠江啤酒厂赠送）
2、麦芽汁的灭菌: 0.05MPa灭菌15～20分钟
3、啤酒发酵：
（1）啤酒酵母扩大培养：
（2）啤酒发酵
将活化完的酵母培养液，小心倾斜倒掉上清液，按0.5g/l的比例添加酵母于带有发酵栓的麦汁锥形瓶中，12℃发酵培养8天(前酵)，4℃发酵培养2天（后酵），0℃条件下放置5天停止发酵。
三、分析方法
1起泡期、高泡期、落泡期
2芽生率、细胞密度、VDK、酒精浓度
实验六葡萄酒酿造
一、目的要求
分离纯化葡萄表面上存在的野生葡萄酒酵母，将其富集并扩大培养，酿造葡萄酒
二、基本原理
葡萄酒型野生酵母在葡萄皮上附着得甚多，所以分离这类醇母比较容易，对于采用当地特产葡萄酿制具有独特风味的葡萄酒，分离本地的葡萄酒型醇母非常必要。本实验采用平板或斜面富集分离酵母，采用液体发酵进行扩大培养。
从微生物群体中经富集分离生长在平板上的单个菌落不保证是纯培养，因此纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。
葡萄酒酿造就是将葡萄转化为葡萄酒。它包括两个阶段：第一阶段为物理化学或物理学阶段，即在酿造红葡萄酒时，葡萄浆果中的固体成分通过浸渍进入葡萄汁，在酿造白葡萄酒时，通过压榨获得葡萄汁；第二阶段为生物学阶段，即酒精发酵和苹果酸-乳酸发酵阶段。葡萄原料中，20%为固体成分，包括果梗、果皮和种子，80%为液体部分，即葡萄汁。果梗主要含有水、矿物质、酸和丹宁；种子富含脂肪和涩味丹宁；果汁中则含有糖、酸、氨基酸等，即葡萄酒的非特有成分。而葡萄酒的特有成分则主要存在于果皮和果肉细胞的碎片中。从数量上讲，果汁和果皮之间也存在着很大的差异。果汁富含糖和有机酸，芳香物质含量很少，几乎不含丹宁。而对于果皮，由于富含葡萄酒的特殊成分，则被认为是葡萄浆果的“高贵”部分。葡萄酒酿造的目标就是，实现对葡萄酒感官平衡及其风格至关重要的这些口感物质和芳香物质之间的平衡，然后保证发酵的正常进行。
红葡萄酒是用带色果皮的葡萄制成。含有果皮或果肉中的有色物质，酒色深红，鲜红或红宝石色。干红葡萄酒含洒精9~13%。
葡萄酒发酵可以采用天然发酵和纯种发酵两种方法。
三、实验材料
1. 新鲜葡萄数公斤
2. 菌种分离培养基
（1）固体培养基取自新鲜葡萄的榨汁25ml, 稀释一倍，加2%琼脂。若pH小于4，宜调节至4~4.5后，然后121℃灭菌20min。
（2）液体培养基取自新鲜葡萄的榨汁50ml ，若pH小于4，宜调节至4~4.5
3. 实验仪器及设备试管、平皿，接种环，培养箱，漏斗，棉塞三角瓶（1L）大漏斗，蒸锅，纱布，牛皮纸，温度计，培养箱。
四、操作步骤
（一）野生葡萄酒酵母的富集纯化
1. 将4层洁净纱布铺平，放入几粒葡萄（挑选每枝内侧的）包起来，然后用力将葡萄汁挤出，漏斗过滤至试管中。30℃静置培养24h ~ 48h。
2. 将培养基倒入培养皿中，待其凝固，取接种环，沾取葡萄汁，分别划线分离，在30℃培养箱中培养。
3. 培养48h，将长出的菌落接入斜面，可随机挑取数10个菌落，注意应挑取单个的菌落。
（二）野生葡萄酒酵母的扩大培养
1. 取斜面或平板富集纯化培养的野生葡萄酒酵母
2. 取一接种环，沾取少量菌，接入50ml液体培养基中。
3. 摇床恒温培养，温度30℃，18h。
4. 显微镜观察培养结果
（三）葡萄酒酿造
流程：700g葡萄洗净除梗——压榨葡萄——注入1L三角瓶，（加入适量砂糖）——60℃-90℃湿热灭菌40 min ——冷却至室温——接种经放大培养的酵母——发酵——（一周后）过滤——再培养
注意事项：
1.红葡萄酒不除种子及果皮，对1L三角瓶，需备红葡萄700g。
2.将发酵液接入三角瓶达到容器高度的2/3处
3.塞上棉塞，外用牛皮纸或是保鲜膜包裹，不要过紧
4.管理：30℃恒温培养发酵，每天振一次，主发酵7天左右，发酵停止后过滤，再进
入后发酵温度15℃左右，其间过滤2~3次，可得澄清液。
实验1: 显微镜的使用及细菌形态的观察（2学时） 目的要求 (1) 熟悉普通光学显微镜的构造及各部分的功能。 (2) 学习并掌握油镜的原理和使用方法。 1.基本原理 显微镜由机械装置和光学系统两大部分组成。 油镜物镜的基本原理 微生物学研究用的显微镜的物镜通常有低倍物镜（16mm，10×）、高倍物镜（4mm，40—45×）和油镜（1．8 mm，95—100×）三种。油镜通常标有黑圈或红圈，也有的以“OI字样表示，它是三者中放大倍数最大的。根据使用不同放大倍数的目镜，可使被检物体放大1000—2 000多倍。油镜的焦距和工作距离（标本在焦点上看得最清晰时，物镜与样品之间的距离）最短，光圈则开得最大，因此，在使用油镜观察时，镜头离标本十分近，需特别小心。 使用时，油镜与其他物镜的不同是载玻片与物镜之间不是隔一层空气，而是隔一层油质，称为油浸系。这种油常选用香柏油，因香柏油的折射率n=1．52，与玻璃相同。当光线通过载玻片后，可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射。如果玻片与物镜之间的介质为空气，则称为干燥系，当光线通过玻片后，受到折射发生散射现象，进入物镜的光线显然减少，这样就减低了视野的照明度。
利用油镜不但能增加照明度，更主要的是能增加数值孔径，因为显微镜的放大效能是由其数值孔径决定的。所谓数值孔径，即光线投射到物镜上的最大角度（称为镜口角）的一半正弦，乘上玻片与物镜间介质的折射率所得的乘积，可用下列公式表示： NA＝n·sinα 式中 NA=数值孔径； n=介质折射率； α=最大入射角的半数，即镜口角的半数。 因此，光线投射到物镜的角度愈大，显微镜的效能就愈大（图Ⅲ-5），该角度的大小决定于物镜的直径和焦距。同时，α的理论限度为90°，sin90°=1，故以空气为介质时（n=1），数值孔径不能超过1，如以香柏油为介质时，则n增大，其数值孔径也随之增大。如光线入射角为120°，其半数的正弦为sin60°=0．87，则： 以空气为介质时： NA=1×0．87=0．87 以水为介质时： NA=1．33×0．87=1．15 以香柏油为介质时： NA=1．52×0．87=1．32 显微镜的分辨力是指显微镜能够辨别两点之间最小距离的能力。它与物镜的数值孔径成正比，与光波长度成反比。因此，物镜的数值孔径愈大，光波波长越短，则显微镜的分辨力愈大，被检物体的细微结构也愈能明晰地区别出来。因此，一个高的分辨力意味着一个小的可分辨距离，这两个因素是成反比关系的，通常有人把分辨力说成是多少微米或纳米，这实际上是把分辨力和最小分辨距离混淆起来了。显微镜的分辨力是用可分辨的最小距离来表示的。 式中λ=光波波长。 我们肉眼所能感受的光波平均长度为0．55μm，假如数值孔径为0．65的高倍物镜，它能辨别两点之间的距离为0．42μm。而在0．42μm以下的两点之间的距离就分辨不出，即使用倍数更大的目镜，使显微镜的总放大率增加，也仍然分辨不出。只有改用数值孔径更大的物镜，增加其分辨力才行。例如用数值孔径为1．25的油镜时，能辨别两点之间的 因此，我们可以看出，假如采用放大率为40倍的高倍物镜（NA=0．65），和放大率为24倍的目镜，虽然总放大率为960倍，但其分辨的最小距离只有0．42μm。假如采用放大率为90倍的油镜（NA=1．25），和放大率为9倍的目镜，虽然总的放大率为810倍，但却能分辨出0．22μm间的距离。 2.材料及器材 显微镜、擦镜纸、二甲苯、香柏油、各种细菌微生物制片标本、吸水纸、纱布、瓷盘、酒精灯、接种工具、打火机、试剂瓶、牙签等。
实验一光学显微镜的使用及微生物形态的观察、 大小的测定和计数 一、实验目的 １、掌握光学显微镜的结构、原理，学习显微镜的操作方法和保养 2、观察细菌、真菌、原生动物的标本装片,学会绘制生物图 3、掌握使用测微尺测量微生物大小的方法 ４、了解血球计数板的结构，掌握使用和计算方法 二、实验器材 １、显微镜 ２、微生物标本装片 ３、目、物镜测微尺 ４、血球计数板 ５、酵母菌液或霉菌孢子液 6、载波片、盖波片、烧杯、滴管、擦镜纸、香柏油、二甲苯等 三、显微镜的构造、原理及使用方法 1、构造 现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜,由机械装置和光学系统两大部分组成。机械装置包括镜筒、转换器、载物台、镜臂、镜座、调节器;光学系统包括目镜、物镜、聚光器、电光源。显微镜的总放大倍数为目镜和物镜的放大倍数的乘积。 ２、操作 在目镜保持不变的情况下,使用不同放大倍数的物镜所能达到的分辨率及放大率都是不同的。一般情况下,特别是初学者，进行显微观察时应遵循从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序,因为低倍数物镜视野相对大,易发现目标及确定检查的位置。 四、微生物大小的测量原理和方法 微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体很小,只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和物镜测微尺。 1、目镜测微尺(图1-1）是一块圆形玻片,在玻片中央把5ｍｍ长度刻成5０等分，或把1０mm长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上（此处正好与物镜放大的中 --
-- 间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同,目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用物镜测微尺校正，以求出在一定放大倍数下,目镜测微尺每小格所代表的相对长度。 2、物镜测微尺(图１-２）是中央部分刻有精确等分线的载 玻片,一般将lmm 等分为100格,每格长ｌ０μm （即0.0ｌmm), 是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将物镜测微尺放在载 物台上,由于物镜测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经 过物镜和目镜的两次放大成象进入视野,即物镜测微尺随着显 微镜总放大倍数的放大而放大，因此从物镜测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小,所以用物镜测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度,然后移去物镜测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。 3、目镜测微尺的校正 把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把物镜测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清物镜测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与物镜测微尺的刻度平行，移动推动器,使两尺重叠,再使两尺的“０”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度（图1－３)，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和物镜测微尺的格数。因为物镜测微尺的刻度每格长l0μｍ，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。 例如目镜测微尺５小格正好与物镜测微尺5小格重叠，已知物镜测微尺每小格为ｌ0μm ，则目镜测微尺上每小格长度为=5×10μm/５=1０μm 用同法分别校正在高倍镜下和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。 由于不同显微镜及附件的放大倍数不同,因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件(特定的物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在特定的情况下重复使用,当更换不同放大倍数的目镜或物镜时,必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。 4、细胞大小的测定 移去物镜测微尺,换上待测菌体的装片，先在低倍镜下找到目的物,然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量菌体的长，宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值,即等于该菌的长和宽。 结果计算： 长μm=平均格数×校正值 宽μｍ＝平均格数×校正值 大小表示: 宽μm ×长μｍ 五、微生物细胞数量的测定原理和方法 1、血球计数板是一块特制的厚型载玻片,载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半,每个半边上面各有一个计数区(图1-4），计数区 图1-1 目镜测微尺 图1-2 物镜测微尺 图1-3 目、物镜测微尺的校正 图1-4 血球计数板
第一章，绪论 一、填空： 微生物工程可分为发酵和提纯两部分，其中以发酵为主。 化学工程与发酵工程的本质区别在于化学工程利用非生物催化剂，发酵工程利用生物催化剂---酶。 二、判断： 发酵产品是经微生物厌氧生物氧化过程获得的。错 三、课后思考题： 1、发酵的定义：利用微生物的新陈代谢作用，把底物（有机物）转化成中间产物，从而获得某种工业产品。（工业上定义、广义、有氧无氧均可） 2、发酵流程： 3、比拟放大的基本过程：斜面菌种－摇瓶试验(培养基、温度、起始pH值、需氧量、发酵时间)－小型发酵罐－中试－大规模工业生产 4、发酵工程的发展经历了哪几个阶段？ 1.）自然发酵时期 2）纯培养技术建立(第一个转折期) 3）通气搅拌的好气性发酵工程技术建立(第二个转折期) 4）人工诱变育种与代谢控制发酵工程技术建立(第三个转折期) 5）发酵动力学、连续化、自动化工程技术的建立(第四个转折期) 6）生物合成和化学合成相结合工程技术建立(第五个转折期) 5、微生物工业发展趋势 1）、几个转变 分解代谢→合成代谢 自然发酵→人工控制的突变型发酵→代谢控制发酵→通过遗传因子的人工支配建立的发酵（如工程菌） 2）、化学合成与生物合成相结合 3）、大型、连续化、自动化发酵 发酵罐的容量可达500t，常用的也达20-30t。 4）、人工诱变育种和代谢控制发酵
微生物潜力进一步挖掘，新菌株、新产品层出不穷。 5）、原料范围不断扩大 石油、植物淀粉、天然气、空气、纤维素、木质素等 6、举例说明微生物工业的范围 酿酒工业（啤酒、葡萄酒、白酒） 食品工业（酱、酱油、食醋、腐乳、面包、酸乳） 有机溶剂发酵工业（酒精、丙酮、丁醇） 抗生素发酵工业（青霉素、链霉素、土霉素等） 有机酸发酵工业（柠檬酸、葡萄糖酸等） 酶制剂发酵工业（淀粉酶、蛋白酶等） 氨基酸发酵工业（谷氨酸、赖氨酸等） 核苷酸类物质发酵工业（肌苷酸、肌苷等） 维生素发酵工业（维生素B12、维生素B2等） 生理活性物质发酵工业（激素、赤霉素等） 名贵医药产品发酵工业（干扰素、白介素等） 微生物菌体蛋白发酵工业（酵母、单细胞蛋白） 微生物环境净化工业（利用微生物处理废水等） 生物能工业（沼气、纤维素等天然原料发酵生产酒精、乙烯等能源物质） 微生物治金工业（微生物探矿、治金、石油脱硫等） 第二章发酵基础知识 1、写出生产以下产品的主要菌种： 啤酒（啤酒酵母）、黄酒（霉菌（根霉、曲霉）、酵母菌、细菌）、味精（谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌）、柠檬酸（黑曲霉）、食醋（霉菌、酵母菌、醋酸菌）、酸奶（乳酸菌（保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、乳酸链球菌）） 2、发酵工艺控制中，主要应监控温度、pH值、溶解氧、 泡沫、氧化还原电位等。 3、概念：单菌发酵: 现代发酵工业中最常见，传统发酵工业中很难实现。 混合菌发酵: 自然发酵和人工接种发酵 液态发酵: 发酵基质呈流动状态，如啤酒发酵、柠檬酸发酵等。 固态发酵: 发酵基质呈不流动状态。如固态酱油发酵、米醋发酵、大曲酒（白酒）发酵等。半固态发酵: 发酵基质呈半流动状态，如黄酒发酵、传统稀醪酱油发酵等。 4、发酵产品主要类型 微生物菌体、代谢产物、酶 5、如何理解：传统工艺，原料决定菌种；现代工艺，菌种决定原料？ 传统工艺，原料决定菌种：传统工艺中，发酵原料是一种选择培养基。 传统工艺就是利用这种选择作用，把自然界带入的各种野生菌，在发酵基质上进行选择富集培养，这些微生物生长和代谢的结果可生产出有特殊风味的食品。 现代工艺，菌种决定原料：在使用纯种发酵剂前，我们必须对原料进行灭菌，以防止其他杂菌对发酵的干扰。 6、发酵产品主要有哪些附加值 1）发酵有利于食品保藏食品发酵后，改变了食品的渗透压、酸度、水的活性等，从而抑制了腐败微生物的生长，有利于食品保藏。 2）发酵产品有保健作用有些食品经过微生物发酵后，不仅能产生酸类和醇类等，还能产生某些抗菌素可抑制致病菌和肠内腐败菌。
生物发酵工程实验 实验一................................ 利用酵母富集培养基分离酵母菌 实验二... ......................... 分离纯化酵母菌 实验三... ......................... 酵母菌的保藏 实验四............................... 大肠杆菌生长曲线测定及pH对生长曲线 的影响 实验五.............................. 发酵罐的构造及操作 实验六.............................. 发酵罐实灌灭菌操作 实验七.............................. 利用7L发酵罐对地衣芽孢杆菌进行补 料分批发酵培养 实验八..............................淀粉酶生成曲线的测定
实验一、利用酵母富集培养基分离酵母菌 一实验目的 1、通过本实验加深理解酵母富集培养基的原理和应用； 2、掌握涂布分离技术； 3、熟悉从自然样品土壤中分离酵母菌的具体操作方法 二实验原理 酵母菌主要分布于含糖高和酸度较高的自然环境中，在果园表土和浆果、蔬菜、花蜜和蜜饯等的表面很容易找到它们。在土壤中，由于各种微生物混杂在一起且酵母菌的数量相对比较少，故可以利用酵母菌富集培养基进行富集培养，该培养基含有较高的葡萄糖（5%）和较酸（pH为4.5）的环境，以及能抑制多种杂菌（许多细菌、放线菌和快速生长霉菌）的孟加拉红（玫瑰红），故十分有利于酵母菌的增值。 三实验材料 土壤（标注采集地点） 培养基：酵母富集培养基（5%葡萄糖、0.1%尿素、0.1%硫化铵、0.25%磷酸二氢钾、0.05%磷酸氢二钠、0.1%七水合硫酸镁、0.01%七水合硫酸铁、0.05%酵母膏、0.003%孟加拉红、1.9%琼脂 pH4.5） 移液枪、培养皿、天平、涂布棒、棉绳、250ml三角瓶、75%酒精棉花、摇床等 四实验步骤 1、采集土样：采集葡萄园或其他果园、菜地等的土壤若干（要求：先铲去2~3cm 的表土，再采集土样）适当研碎。 2、称取1g土样装入准备好的30/250ml蒸馏水中震荡均匀。 3、准备平板：将酵母菌富集培养基加热融化，待冷却至50℃左右后，倒2个平板，冷却待用。 4、用移液枪吸取200ul样品，用涂布法分离菌种。 5、恒温培养：将培养皿倒置后防于37℃恒温培养箱中培养2d。 五结果记录 将土壤来源，平板上得到的菌落特征和菌落数做表记录 六思考题 酵母菌富集培养基中为什么要加孟加拉红
发酵工程复习资料重 点
发酵工程（Fermentation Engineering）的定义 应用微生物学等相关的自然科学以及工程学原理，利用微生物等生物细胞进行酶促转化，将原料转化成产品或提供社会服务的一门科学。 淀粉质原料进行蒸煮的目的是使植物组织和细胞膜彻底破裂，淀粉成为溶解状态进行液化；同时对进料进行灭菌；排除原料中的一些不良成分及气味。 为了实现这些目的，蒸煮设备必须达到下列要求： (1)能使淀粉细胞完全破裂，淀粉溶解成均匀的糊状物； (2)尽量减少淀粉和糖分的损耗，避免产生其它不必要的有害的化学变 化； (3)节省蒸汽，减少热损失； (4)设备能承受较高的压力，具有耐磨性，能使物料在锅内充分翻动，受 热均匀； (5)结构简单，操作方便，投资少。 连续蒸煮有低温长时间的罐式连续蒸煮，中温的柱式连续蒸煮和高温短时间的管式连续蒸煮 后熟器 在连续蒸煮中，后熟器是利用经加热器或蒸煮锅(罐)加热后的料液余热，在一定压力和温度下维持一定时间的继续蒸煮，因此，后熟器又称维持器。对后熟器的要求是，料液在后熟器中的整个截面上均匀地由下向上推动，力求做到先进先出。
真空冷却指的是醪液在一定的真空度下（即醪液进入负压状态）醪液本身产生大量蒸气（二次蒸气），并被抽出，这样便消耗了醪液大量的热量，因而醪液很快冷到与真空度相应的温度，这种醪液冷却法就称为真空冷却 糖化设备主要是糖化罐，其容积按1m3的糖化醪需要的1.3m3容积来计算。其旋转方向与冷却水在蛇管中水流的方向相反 ?连续糖化罐的作用是连续地把糊化醪与水稀释，并与液体曲或麸曲乳混 合，在一定温度下维持一定时间，保持流动状态，以利于酶的活动。二级真空冷却的连续糖化法。对蒸煮醪的前冷却和后冷却均采用真空冷却的糖化工艺，叫二级真空冷却糖化法 发酵罐的定义：是为一个特定生物化学过程的操作提供良好而满意的环境的容器。 ?1．按微生物生长代谢需要分类： ?好气：抗生素、酶制剂、酵母、氨基酸，维生素等产品是在好气发酵罐 中进行的；需要强烈的通风搅拌，目的是提高氧在发酵液中的传质系 数； ?厌气：丙酮丁醇、酒精、啤酒、乳酸等采用厌气发酵罐。不需要通气。 ? 2. 按照发酵罐设备特点分类： ?机械搅拌通风发酵罐：包括循环式，如伍式发酵罐，文氏管发酵罐，以 及非循环式的通风式发酵罐和自吸式发酵罐等。
实验二实验器具的灭菌 一、实验目的 1.学习并初步掌握和各种实验器具的包扎及高压蒸汽灭菌的方法。 2.了解其他灭菌方法。 二、基本原理 高压蒸汽灭菌法可杀灭包括芽胞在内的所有微生物，是灭菌效果最好、应用最广的灭菌方法。其基本原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加，在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃，在此温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。 三、器材 1、高压蒸汽灭菌锅 2、牛皮纸 3、棉绳 4、仪器和其他用具 四、操作步骤 1、包扎 将各种实验器具进行合理规范包扎后，要用牛皮纸覆盖，最后用棉绳系紧。 2、加热烧开 待高压锅内的水烧开，将包扎好的器具放入锅内的桶内，最后放入高压锅。 3、升压 完全排除锅内空气后，关闭放弃阀，待压力上升到0.1MPa时，开始计时，维持压力0.1~0.15MPa 20分钟。 4、减压，取出器具 到达保压时间后，即可切断电源，压力降到0.5MPa时，可缓慢放出蒸汽，注意不要使压力降低太快，以致引起激烈的减压沸腾，使容器中的液体四溢。当压力降到零后，才能开盖。 五、思考题 （1）、你认为那些环节会影响高压灭菌的效果？如果影响，请简述其中最关节的环节是什麽？
实验三牛肉膏蛋白胨培养基的配制 —、目的要求 1、明确培养基的配制原理 2、通过对基础培养基的配制，掌握培植基的一般方法和步骤。 二、基本原理 牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下： 牛肉膏 3.0g 蛋白胨10.0g NaCI 5.0g 水1000mI pH 7.4～7.6 三、器材 1、溶液和试剂牛肉膏，蛋白胨，NaCI,琼脂，1 moI/L NaOH, 1 moI/L HCI。 2、仪器和其他用品试管，三角瓶，烧杯，量筒，破棒，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸气灭菌锅，pH试纸（pH5.5～9.0），棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。 四、操作步骤 1、称量 按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨，NaCI放入烧杯中。牛肉膏常用破棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水融化后倒入烧杯。也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时，如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。 （蛋白质很易吸湿，在称取时动作要迅速，另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。瓶盖也不要盖错。） 2、溶化 在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，或在磁力搅拌器上加热溶解。将药品完全溶解后，补充水到所需的总体积，如果配制固体培养基时，将称好的琼脂放入已溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。在制备用三角瓶盛固体培养基时，一般也可先将一定量的液体培养基分装于三角瓶中，然后按1.5％~2.0％的量将琼脂直接分别加入各三角瓶中，不必加热溶化，而是灭菌和加热溶化同步进行，节省时间。 3、调pH 在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LnaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，直至pH达7.6。反之，用1mol/LHCl进行调节。 4、分装 按照实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角瓶内。 5、加塞 培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶口上塞上棉塞（或泡沫塑料塞），以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。 6、包扎 加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。
环境工程微生物学考试复习资料
精品文档 收集于网络，如有侵权请联系管理员删除 6、微生物有哪些特点？1.个体极小 2.分布广，种类繁多。3.繁殖快4.易变异 7、革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细胞壁结构有什么异同？各有哪些化学组成？ 1.革兰氏阳性菌含大量的肽聚糖，独含磷壁酸，不含脂多糖。革兰氏阴性菌含极少的聚糖，独含脂多糖，不含磷壁酸。 2.革兰氏阳性菌的细胞壁厚，结构较简单，含肽聚糖、磷壁酸、少量蛋白质和脂肪。革兰氏阴性菌的细胞壁较薄，结构较复杂，分外壁层和内壁层，外壁层分为三层：最外层脂多糖，中间层磷脂层，内层脂蛋白；内壁层含肽聚糖，不含磷壁酸。 8叙述革兰氏染色的机制和步骤 革兰氏染色的机制有以下两点：(1) 革兰氏染色与等电点的关系G+菌的等电点低于G-菌，所带负电荷更多，因此，它与结晶紫的结合力较大，不易被乙醇脱色。(2) 革兰氏染色与细胞壁的关系G+的细胞壁脂类少，肽聚糖多，G-则相反，故乙醇容易进入G-细胞，进行脱色。 8、藻类的分类依据是什么？它分为几门？ 根据藻类光合色素的种类、个体形态、细胞结构、生殖方式和生活史等，将藻类分为10门：蓝藻门、裸藻门、绿藻门、轮藻门、金藻门、黄藻门、硅藻门、甲藻门、红藻门和褐藻门。 9、真菌包括那些微生物？它们在废水生物处理中各起什么作用？ 真菌包括酵母菌、霉菌及各种伞菌。酵母菌既处理了废水，又可得到酵母菌体蛋白，用作饲料。还可以用酵母菌监测重金属。美军在对废水中氰化物的去除率达90%以上，有的霉菌还可以处理含硝基化合物的废水。真菌在处理有机废水可以用于培养食用菌的菌丝体，这样既处理了废水和固体废物，还获得了食用菌。 10、酵母菌有哪些细胞结构？有几种类型的酵母菌？ 酵母菌的细胞结构有细胞壁、细胞质膜、细胞核、细胞质及内含物。酵母菌有发酵型和氧化型两种。 11、霉菌有几种菌丝？如何区别霉菌和放线菌的菌落？ 整个菌丝体分为两部分：即营养菌丝和气生菌丝 放线菌菌落：是由一个孢子或一段营养菌丝生长繁殖出许多菌丝，并相互缠绕而成的，有的呈戎状或密实干燥多皱，整个菌落像嵌入培养基中，不易被挑取。霉菌菌落：呈圆形、绒毛状、絮状或蜘蛛网状，比其他微生物的菌落都大，菌落疏松，与培养基结合不紧，用接种环很容易挑取。 12、什么叫定向培育和驯化？ 定向培养是人为用某一特定环境条件长期处理某一微生物群体，同时不断将它们进行移种传代，以达到累积和选择合适的自发突变体的一种古老的育种方法。驯化是经过长时间地定向培养后，微生物改变了原来对营养、温度、PH 等要求，产生了适应酶，利用各营养，改变了代谢途径。 13、什么叫水体自净？可根据那些指标判断水体自净程度？ 河流接纳了一定量的有机污染物后，在物理的、化学的和水生生物等因素的综合作用后得到净化，水质恢复到污染前的水平和状态，这叫水体自净。1、P\H 指数，2、氧浓度昼夜变化幅度和氧垂曲线。 14、水体污染指标有哪几种？污化系统分为那几“带”？各“带”有什么特征？1.BIP 指数2.细菌菌落总数3.总大肠菌群 多污带：位于排污口之后的区段，水呈暗灰色，很浑浊，含有大量有机物，BOD 高，溶解氧极低，为厌氧状态。 α-中污带：在多污带下游，水为灰色，溶解氧少，为半厌氧状态，有机物减少，BOD 下降，水面上有泡沫和浮泥，有氨、氨基酸及H2S ，生物种类比多污带稍多。 β-中污带：在α-中污带之后，有机物较少，BOD 和悬浮物含量低，溶解氧浓度升高，NH3和H2S 分别氧化为NO3-和SO42-，两者含量均减少。 寡污带：在β-中污带之后，标志着河流自净作用完成，有机物全部无机化，BOD 和悬浮物含量极低，H2S 消失细菌极少，水的浑浊度低，溶解氧恢复到正常含量。 15、什么叫水体富营养化？评价水体富营养化的方法有几种？ 人类将富含氮、磷的城市生活污水和工业废水排放入湖泊、河流和海洋，使水体中的氮、磷营养过剩，促使水体中的藻类过量生长，使淡水中发生水华，使海洋中发生赤潮，叫富营养化。观察蓝细菌和藻类等指示生物、测定生物的现存量、测定原初生产力、测定透明度和测定氮和磷等导致富营养化的物质。 16、什么叫活性污泥？它有哪些组成和性质？ 活性污泥(activesludge)是由各种微生微、真菌、原生动物、微型后生动物和各种有机无机的固体物质混凝交织在一起的一种绒粒.即生物群体及它们所依附的有机物质和无机物质的总称．微生物群体主要包括细菌，原生动物和藻类等．由外到内水解细菌、发酵细菌、氢细菌和乙酸菌、甲烷菌、硫酸盐还原菌、厌氧原生动物其中产甲烷丝菌是厌氧活性污泥的中心骨架。 17、叙述好氧活性污泥净化污水的机理？1.在氧化的条件下，活性污泥绒粒中的絮凝性微生物吸附污水中的有机物。2.活性污泥绒粒中的水解性细菌水解大分子有机物为小分子有机物，同时，微生物合成自身细胞。污水中的溶解性有机物直接被细菌吸收，在细菌体内氧化分解，其中间代谢产物被另一群细菌吸收，进而无机化。3.原生动物和微型后生动物吸收和吞食未分解彻底的有机物及游离细菌。 42、叙述氧化塘和氧化沟处理污水的机制 氧化塘和氧化沟一般用于三级深度处理，用以处理生活污水和富含氮、磷的工业废水。有机污水流入氧化塘，其中的细菌吸收水中的溶解氧，将有机物氧化分解为H2O 、CO2、NH3、NO3-、PO43、SO42-。细 菌利用自身分解含氮有机物产生的NH3和环境中的营养物合成细胞物质。在光照条件下，藻类利用H2O 和CO2进行光合作用合成糖类，再吸收NH3和SO42-合成蛋白质，吸收PO43-合成核酸，并繁殖新藻体。 43、菌胶团、原生动物和微型后生动物在水处理过程中有哪些作用。菌胶团的作用： 1、有很强的生物絮凝、吸附能力和氧化分解有机物的能力 2、菌胶团对有机物的吸附和分解，为原生动物和微型后生动物提供了良好的生存环境 3、为原生动物、微型后生动物提供附着栖息场所 4、具有指示作用 原生动物和微型后生动物的作用 1、指示作用 2、净化作用 3、促进絮凝作用和沉淀作用 44、叙述生物膜法净化污水的作用机制 生物膜在滤池中是分层的，上层生物膜中的生物膜生物和生物膜面生物及微型后生动物吸附污水中的大分子有机物，将其水解为小分子有机物。同时生物膜生物吸收溶解性有机物和经水解的小分子有机物进入体内，并进行氧化分解，利用吸收的营养构建自身细胞。上层生物膜的代谢产物流向下层，被下层生物膜生物吸收，进一步被氧化分解为CO2和H2O 。老化的生物膜和游离细菌被滤池扫除生物吞食。通过以上微生物化学和吞食作用，污水得到净化。 45、什么叫活性污泥丝状膨胀？引起活性污泥丝状膨胀的微生物有哪些？ 由于丝状细菌极度生长引起的活性污泥膨胀称为活性污泥丝状膨胀。经常出现的有诺卡氏菌属、浮游球衣菌、微丝菌属、发硫菌属、贝日阿托氏菌属等 46、促使活性污泥丝状膨胀的环境因素有哪些？ 1、温度 2、溶解氧 3、可溶性有机物及其种类 4、有机物浓度 47、为什么丝状细菌在污水生物处理中能优势生长？ 因为几乎所有的丝状细菌都能吸收可溶性有机物，尤其是低分子的糖类和有机酸。在运行过程中，有机物因缺氧不能降解彻底，积累大量有机酸，为丝状细菌创造营养条件，使丝状细菌优势生长。 48、如何控制活性污泥丝状膨胀？ 1、控制溶解氧 2、控制有机负荷 3、改革工艺 49、污水为什么要脱氮除磷？ 在水体中氮、磷量过多，危害极大，最大的危害是引起水体富营养化，在富营养化水体中，蓝细菌、绿藻等大量繁殖，有的蓝细菌产生毒素，毒死鱼、虾等水生生物和危害人体健康，由于它们的死亡、腐败，引起水体缺氧，使水源水质恶化。不但影响人类生活，还严重影响工、农业生产。 50、微生物脱氮工艺有哪些？ A|O 、A2\O 、A2\O2、SBR 等 51、叙述污水脱氮原理？ 脱氮是先利用好氧段经硝化作用，由亚硝化细菌和硝化细菌的协同作用，将NH3转化为NO2--N 和NO3--N 。再利用缺氧段经反硝化细菌将NO2--N （经反亚硝化）和NO3--N （将反硝化）还原为氮气，溢出水面释放到大气，参与自然界氮的循环。水中含氮物质大量减少，降低出水的潜在危险性。 52、什么叫捷径反硝化？何谓短程硝化-反硝化？在生产中它有何意义？ 捷径反硝化：即通过限制充氧量和缩短曝气时间等条件，抑制硝化细菌生长，促使亚硝化细菌优势生长，迅速将氨氧化为HNO2 后，随即利用有机物将HNO2 还原为N2的过程。捷径反硝化不仅可缩短曝气时间，减少能耗，还节省碳源，从总体上节省运行费用。 Q10：温度每升高10度酶促反应速率相应升高的因数。
发酵工程实验 目录 发酵罐的结构系统及使用方法实验一 实验二微生物的诱变育种乳酸菌的分离及乳酸饮料制作实验三 实验四大肠杆菌生长曲线的测定摇床培养枯草芽孢杆菌发酵条件的优化实验五
实验一发酵罐的结构系统及使用方法 一、实验目的： 1．了解发酵罐（气升式、搅拌式）的几大系统组成，即空气系统、 蒸汽系统、补料系统、进出料系统、温度系统、在线控制系统。 2．掌握发酵罐空消的具体方法及步骤 3．掌握发酵罐进料及实消的具体方法及步骤 4．掌握发酵罐各系统的控制操作方法 二、实验原理： 1．蒸汽系统： 三路进汽——空气管路、补料管路、罐体 2．温度系统： (1) 夹套升温：蒸汽通入夹套。 (2) 夹套降温：冷水通入夹套，下进水，上出水。 3．空气系统： 取气口→空压机：往复式油泵获得高脉冲的压缩空气 粗过滤器：由沙布包裹棉花压实成块状叠加制得，作用是去除部分细菌及大部分灰尘 （贮气罐）：空压机压缩使气体温度升高，经贮气使气体保温杀菌；压缩空气中有油污、水滴，且压力不稳，有一定的脉冲作用，会冲翻后面的过滤介质，贮气后可使油滴重力沉降，减小脉冲。（冷却塔）：有降温并稳定作用，同时经旋风分离器进行气液分离 (丝网分离器)：通过附着作用，逐步累积沉降而分离5微米以上的微粒 其作用介质为铜丝网 (加温器)：对压缩空气升温，除湿，使湿度达50%-60% 总过滤器：纱布包裹棉花加活性炭颗粒，逐层压紧而成。 分过滤器：平板式纤维，中间为玻璃纤维或丝棉，下面放水阀应适时打开放出油、水，再用压缩空气控干。 种子罐或发酵罐 4．补料系统：补培养基、消泡剂、酸碱等。 5．在线控制系统：热电偶（温度探关）、溶氧探头、pH探头（后二者实消时才安装，为不可再生探头，有限定使用次数，pH探头使用前要先校准）、控制柜、数据采集系统。 。)取样口(、出料口)接种口(、进出料系统：进料口6．
实验一水中细菌的分离、培养、鉴定及菌落总数的测定 1 培养基的配制及灭菌 【目的要求】 1．了解培养基的概念、种类及用途 2．了解培养基的配制原理及其常规配制程序 3．学习和掌握细菌培养基的配制方法。 【基本原理】 培养基是指利用人工方法将适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的各种营养物质混合配制而成的营养基质，主要用于微生物的分离、培养、鉴定、菌种保藏等方面。自然界中微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究的目的不同，所以培养基种类很多。不同培养基一般都应含有微生物生长繁殖所需的碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水等营养成分。此外，为了满足微生物生长繁殖的要求，还必须控制培养基的pH值。 牛肉膏蛋白胨培养基是一种用于培养细菌的培养基，属于半合成培养基。 【材料与用品】 1．材料与试剂 牛肉膏、蛋白胨、琼脂、NaCl、NaOH溶液（1mol/L）、pH试纸。 一、肉膏蛋白胨培养基的配制 1．培养基成分 牛肉膏0. 3g 蛋白胨1g NaCl 0.5g 琼脂 1.5g 水100mL pH 7.2~7.4 2．配制方法 （1）称量及溶化：分别称取蛋白胨和NaCl的所需量，置于烧杯中，加入所需水量的2／3左右的蒸馏水；用玻璃棒挑取牛肉膏置于另一小烧杯中，进行称量。然后加入少量蒸馏水于小烧杯中，加热融化，倒入上述烧杯中。 （2）定容：将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。 （3）加琼脂：将所需量的琼脂先放到三角瓶中，再将定容后的培养基倒入三角瓶中。 （4）调pH：待溶液冷至室温时，用1mol/L NaOH溶液调pH至7.2~7.4。 （5）分装、加塞、包扎。 （6）高压蒸汽灭菌20分钟。 待培养基冷却至60℃左右时，倒入已灭菌的培养皿中，等到培养基完全凝固后，放入冰箱中保存。 【思考题】 1.制作平板培养基的注意事项是什么？ 2.培养基配好后，为什么必须马上进行高压蒸汽灭菌？如不能及时灭菌时，应将培养基暂时放置何处？ 3.如何检查灭菌后的培养基是否无菌？ 2 细菌的分离和培养 【目的要求】 1．掌握细菌稀释分离技术。
第一章发酵工程概述 一、发酵工程：是利用微生物特定的形状和功能，通过现代化工程技术生产有用物质或直接应用与工业化生产的技术体系，是将传统发酵与现代的DNA重组、细胞融合、分子修饰和改造等新技术结合并发展起来的发酵技术。 二、发酵工程简史： 1590 荷兰人詹生制作了显微镜 1665 英国人胡克制作的显微镜观察到了霉菌近代发酵工程建立初期 1864 巴斯德灭菌法 1856 psateur 酵母导致酒精发酵 19世纪末 Koch 纯种分离和培养技术 三、发酵工程技术的特点 （1）主体微生物的特点 ①微生物种类繁多，繁殖速度快、代谢能力强，容易通过人工诱变获得有益的突变株； ②微生物酶的种类很多，能催化各种生化反应 ③微生物能够利用有机物、无机物等各种营养源 ④可以用简易的设备来生产多种多样的产品 ⑤不受气候、季节等自然条件的限制等优点 （2）发酵工程技术的特点 ①发酵工程以生命体的自动调节方式进行，数十个反应能够在发酵设备中一次完成 ②反应通常在常温下进行，条件温和，耗能少，设备简单
③原料通常以糖蜜，淀粉等碳水化合物为主 ④容易生产复杂的高分子化合物 ⑤发酵过程中需要防止杂菌污染 (3)发酵工程反应过程的特点 ①在温和条件下进行的 ②原料来源广泛，通常以糖、淀粉等碳水化合物为主 ③反映以生命体的自动调节形式进行（同（2）①） ④发酵分子通常为小分子产品，但也很容易生产出复杂的高分子化合物 四、发酵工程的一般特征 ①与化学工程相比，发酵工程中微生物反应具有以下特点： 作为生物化学反应，通常在常温常压下进行，没有爆炸之类的危险，不必考虑防爆问题，还有可能使一种设备具有多种用途 ②原料通常以糖蜜、淀粉等碳水化合物为主，加入少量的各种有机或无机氮源，只要不含毒，一般无精制的必要，微生物本身就有选择的摄取所需物质 ③反应以生命体的自动调节方式进行因此数十个反应过程能够像单一反应一样，在称为发酵罐的设备内很容易进行 ④能够容易的生产复杂的高分子化合物，是发酵工业最有特色的领域 ⑤由于生命体特有的反应机制，能高度选择性的进行复杂化合物在特定部位的氧化还原官能团导入等反应 ⑥生产发酵产物的生物物质菌体本身也是发酵产物，富含维生素、蛋白质、酶等有用物质，因此除特殊情况外，发酵液等一般对生物体无害。 ⑦发酵生产在操作上最需要注意的是防止杂菌污染。进行设备的冲洗、灭菌，空气过滤
微生物学实验讲义 Document serial number【KKGB-LBS98YT-BS8CB-BSUT-BST108】
《生物学实验Ⅰ——微生物》 （2008级基地班） 任课教师：熊芳 教学时数： 15学时 实验周数： 4周 生物学实验教学中心 微生物实验目录（15学时） 微生物实验基础知识介绍 实验一：培养基的配制与灭菌（4学时） 实验二：土壤自生固氮菌的分离纯化（5学时） 实验三：显微镜的使用和简单染色（3学时） 实验四：革兰氏染色和荚膜染色（3学时） 第一次实验： 微生物学实验基础知识 一、实验目的 1.熟悉实验室规则和安全守则，正确应对实验中出现的意外事故； 2.认识微生物学实验室常用仪器和有关试剂的基本知识； 3.掌握实验报告的正确书写。 二、实验内容 1.实验室规则； 2.实验室安全守则； 3.实验室中意外事故处理； 4.常用器皿及用具； 5.显微镜及有关知识；
6.实验预习、实验记录和实验报告。 实验一培养基的配制和高压蒸汽灭菌 配置培养基的基本流程如下： 原料称量→溶解→调节pH值→过滤澄清→分装→塞硅胶塞和包扎→灭菌 培养基的配制原则 一、营养成分 1. 根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基，如自养型微生物的培养基完全可以（或应该）由简单的无机物质组成。异养微生物的培养基至少需要含有一种有机物质。 碳源物质的功能：构成细胞物质；为机体提供整个生理活动所需要的能量（异养微生物）。 氮源(nitrogen source) 凡是提供微生物营养所需的氮元素的营养源，称为氮源。氮源物质的主要作用是合成细胞物质中含氮物质，少数自养细菌能利用铵盐、硝酸盐作为机体生长的氮源与能源，某些厌氧细菌在厌氧与糖类物质缺乏的条件下，也可以利用氨基酸作为能源物质。 能源指能为微生物的生命活动提供最初能量来源的营养物或辐射能。 2. 注意各种营养物质的浓度与配比 营养物的浓度：在一般情况下，浓度合适的营养物质才对微生物表现出良好作用，浓度大时对微生物生长起抑制作用，浓度小时不能满足微生物生长的需要。 各营养物质之间的浓度比：培养基中各营养物质之间的浓度比直接影响微生物的生长与繁殖和（或）代谢产物的形成与积累，尤其是碳氮比（C／N）（碳氮比一般指培养基中元素碳与元素氮的比值，有时也指培养基中还原糖与粗蛋白两种成分含量之比）的影响更为明显。 二、控制培养基的PH值 各类微生物生长的最适pH各不相同，细菌与放线菌生长的pH在之间，酵母菌与霉菌生长的pH值在4-5之间。 在微生物的生长和代谢过程中，由于营养物质的利用和代谢产物的形成与积累，常会改变培养基的pH值，为了维持培养基pH值的相对恒定，通常采用下列两种方式： 内源调节：在培养基里加一些缓冲剂或不溶性的碳酸盐；调节培养基的碳氮比。 外源调节：按实际需要流加酸或碱液 三、渗透压
实验 1 K L a 的测定方法 氧是难溶气体，在25℃和1个大气压下，纯水中溶解度为0.25 mol/m 3左右。在好氧发酵过程中，氧气由气相传递到液相，为微生物消耗。氧的传递过程限速阻力位液膜阶段，此时K l a 是描述氧的传递性能的重要参数。 1.目的 掌握利用亚硫酸盐测定容积氧体积传递系数的方法，了解氧传递在好氧发酵过程中的重要作用。 2原理 以Cu 离子为催化剂，溶解于水中的O 2能立即将水中的SO 32-氧化为SO 42-，其氧化反应的速度几乎与SO 32-浓度无关。实际上是O 2一经溶入液相，立即就被还原掉。这种反应特性使溶氧速率成为控制氧化反应的因素。其反应式如下： 2Na 2SO 3 2 2SO 4 剩余的Na 2SO 3与过量的碘作用 Na 2SO 3 + I 2 + H 2O Na 2SO 4 + 2HI 剩余的I 2用标准Na 2S 2O 3溶液滴定。 I 2+ 2Na 2S 2O 3 Na 2S 4O 6+2NaI ?O 2 ~ ?Na 2SO 3 ~ ?I 2 ~ ?Na 2S 2O 3 1 2 2 4 可见，每溶解1mol O 2，将消耗2mol Na 2SO 3，将少消耗2mol I 2，将多消耗4mol Na 2S 2O 3。因此可根据两次取样滴定消耗Na 2S 2O 3的摩尔数之差，计算体积溶氧速率。公式如下： 090036004tV VM tV VM N V ??=???= 式中 N V ：两次取样滴定消耗Na 2S 2O 3体积之差， M ：Na 2S 2O 3浓度， ?t ：两次取样时间间隔，h V 0：取样分析液体积。 将上述N V 值代入公式C C N a k V L -= * 即可计算出k L a
口腔微生物学实验指导 （2005年） 前言 口腔微生物学实验课是本课程学习过程中的重要环节。其目的在于加深和巩固对理论知识的理解和体会；掌握和熟悉口腔微生物学研究技术和方法，培养学生对口腔医学基础研究的兴趣，为今后工作打下良好基础。 一、标本的采集与运送 口腔是人体与外界相通的器官，存在多种微生物群。从口腔中可分离培养到各种需氧、微需氧或厌氧、兼性厌氧的细菌。口腔微生物的分离培养是确定各种细菌最常用的方法。（一）口腔标本取材与运送原则 口腔微生物培养检查的临床标本主要有唾液、龈沟液、龈上菌斑、龈下菌斑，感染根管组织，牙槽脓肿的脓液，颌面间隙感染的脓液或分泌物等。 以上标本的采集应根据其培养目的来确定采集方法及注意事项。需氧菌采用棉拭子法，厌氧菌采用厌氧采集技术，尽量减少标本与空气的接触及培养物的放置时间，以提高厌氧菌的检出率。在采取标本中必须无菌操作。 口腔临床标本的微生物学检查，大多数与厌氧菌有关，在标本采集后，要求立即用厌氧方式运送到培养箱中孵育。脓液或唾液标本可直接用注射器针筒运送，大多数标本均应加入具厌氧条件的还原转送液运送到实验室。减少氧敏感细菌在运送过程中死亡，保证厌氧菌的检出。 （二）几种常见标本的采集方法 1.唾液： 最佳采集时间为晨间起床后，刷牙洗漱前或两餐之间。（10：00 am或4：00pm）。在采集标本前令受检者用温开水清漱口中的食物残渣，然后自然排出唾液于无菌容器中，至少采集0.5—1ml。然后塞好管口，立即送检。 2.牙菌斑： 按菌斑的位置可分为龈上菌斑和龈下菌斑两大类。龈上菌斑指牙颈部龈缘以上牙面的牙菌斑，龈下菌斑指牙龈缘内侧被牙龈所覆盖牙面上的菌斑。 （1）龈上菌斑的采集： 适用于牙龈炎和早期牙周炎的细菌分离。受检者用温开水漱口后，用菌斑指示剂显示出龈上菌斑，然后在无菌纱球局部隔湿的情况下，用无菌匙形器采集，转至有还原转移液的无菌试管中送检。 （2）龈下菌斑的采集： ①取菌器采集：有带充气导管的采集器（见图1）及Moore 00取菌器。受检者经温开水漱 口后，用取菌器采集，放入有还原转送液的无菌试管中送检。 ②灭菌纸尖采集法：温开水漱口，刮除龈上菌斑，采集部位用纱球隔湿，用无菌镊子将灭 菌滤纸尖直接插入龈沟或牙周袋内（见图2），放置数秒后取出放入还原转送液，加盖后尽快送检。该法较简便，但易被唾液污染。 ③匙形洁牙器采集：温开水漱口后，用菌斑指示剂显示菌斑，并除去龈上菌斑。在隔湿条 件下，将无菌匙形洁牙器伸入龈沟或牙周袋内，刮取龈下菌斑，然后将菌斑置入盛有小玻璃珠和还原转送液的无菌管中，加盖液体石蜡后立即送检。该方法简捷方便，但不易
发酵工程讲义 长江大学生科院生物技术系《发酵工程》讲义第一章绪论教学目的：了解发酵工程的意义及组成，我国发酵工程的发展现状；掌握微生物发酵的纯培养技术和深层培养技术的相关内容及发酵工程发展历史上的五个转折点；掌握发酵工程的产业化及其发展前景。教学重点、难点：微生物发酵的纯培养技术和深层培养技术；发酵工程的产业化及其发展前景。发酵工程的意义及组成传统生物技术：抗生素、生物制药、氨基酸、核苷酸、有机酸、饲料添加剂、微生态制剂、生物农药、生物肥料等。现代生物技术：基因工程菌发酵，基因工程药物、疫苗及抗体生产。发酵工业范围：了解发酵工程与现代生物技术的关系发酵工程是生物技术的重要组成部分，是生物技术产业化的重要环
节。它是应用微生物学等相关的自然科学以及工程学原理，利用微生物等生物细胞进行酶促转化，将原料转化成产品或提供社会性服务的一门科学。于它以培养微生物为主，故又称为微生物工程。发酵工程的组成：从广义上讲，三部分组成，上游工程、发酵工程、下游工程上游工程：- genetics, cell ? - inoculum development -media formulation -sterilization - inoculation 下游工程：- product extraction, purification & assay - waste treatment - by product recovery 发酵的定义： 1.传统发酵发酵最初是来自于拉丁语“发泡”这个词，是指酵母作用于果汁或发芽的谷物时产生二氧化碳的现象。 2.生化和生理学意义的发酵指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量的一种方式，如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出CO2。 3.工业上的发酵泛指利用生物细胞制造某些产品或净化环境的