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微生物常规鉴定技术

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微生物常规鉴定技术

微生物常规鉴定技术

一、形态结构和培养特性观察

1、微生物的形态结构观察主要是通过染色,在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构(包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等)及染色特性进行观察,直观地了解细菌在形态结构上特性,根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。

2、细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫菌落(colony)。不同微生物在某种培养基中生长繁殖,所形成的菌落特征有很大差异,而同一种的细菌在一定条件下,培养特征却有一定稳定性。,以此可以对不同微生物加以区别鉴定。因此,微生物培养特性的观察也是微生物检验鉴别中的一项重要内容。

1)细菌的培养特征包括以下内容:在固体培养基上,观察菌落大小、形态、颜色(色素是水溶性还是脂溶性)、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。在液体培养中的表面生长情况(菌膜、环)混浊度及沉淀等。半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况。

2)霉菌酵母菌的培养特征:大多数酵母菌没有丝状体,在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相似,只是比细菌菌落大且厚。液体培养也和细菌相似,有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。霉菌有分支的丝状体,菌丝粗长,在条件适宜的培养基里,菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色,因而菌落边缘和中心,正面和背面颜色常常不同,如青霉菌:孢子青绿色,气生菌丝无色,基内菌丝褐色。霉菌在固体培养表面形成絮状、绒毛状和蜘蛛网状菌落。

二、生理生化试验

微生物生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物,生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。因此微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一。

微生物检验中常用的生化反应有:

1、糖酵解试验

不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异,或能利用或不能利用,能利用者,或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。

试验方法:以无菌操作,用接种针或环移取纯培养物少许,接种于发酵液体培养基管,若为半固体培养基,则用接种针作穿刺接种。接种后,置36±1.0°C培养,每天观察结果,检视培养基颜色有无改变(产酸),小倒管中有无气泡,微小气泡亦为产气阳性,若为半固体培养基,则检视沿穿刺线和管壁及管底有无微小气泡,有时还可看出接种菌有无动力,若有动力、培养物可呈弥散生长。

本试验主要是检查细菌对各种糖、醇和糖苷等的发酵能力,从而进行各种细菌的鉴别,因而每次试验,常需同时接种多管。一般常用的指示剂为酚红、溴甲酚紫,溴百里蓝和An-drade指示剂。

2、淀粉水解试验

某些细菌可以产生分解淀粉的酶,把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后,遇碘不再变蓝色。

试验方法:以18~24h的纯培养物,涂布接种于淀粉琼脂斜面或平板(一个平板可分区接种,试验数种培养物)或直接移种于淀粉肉汤中,于36±1°C培养24~48h,或于20°培养5天。然后将碘试剂直接滴浸于培养表面,若为液体培养物,则加数滴碘试剂于试管中。立即检视结果,阳性反应(淀粉被分解)为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色透明环、或肉汤颜色无变化。阴性反应则无透明环或肉汤呈深蓝色。

淀粉水解系逐步进行的过程,因而试验结果与菌种产生淀粉酶的能力、培养时间,培养基含有淀粉量和pH等均有一定关系。培养基pH必须为中性或微酸性,以pH7.2最适。淀粉琼脂平板不宜保存于冰箱,因而以临用时制备为妥。

某些细菌能够分泌淀粉酶(胞外酶),将淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖,再被细菌吸收利用。淀粉被水解后遇碘不再变蓝色。

(1)将装有淀粉培养基的锥形瓶置于沸水浴中融化,然后取出冷却至50℃左右,即倾入培养皿中,待凝固后制成平板。

(2)翻转平板使底皿背面向上,用记号笔在其背面玻璃上划成两半,一半用于接种枯草芽孢杆菌作为阳性对照菌,另一半用于接种试验菌大肠杆菌或产气肠杆菌。接种时用接种环取少量菌在平板两边各划“+”字。如图7-1-1。

(3)将接完种的平板倒置于37℃恒温箱中,培养24h。

(4)观察结果时,可打开皿盖,滴加少量碘液于平板上,轻轻旋转,使碘液均匀铺满整个平板。如菌体周围出现无色透明圈,则说明淀粉已被水解。透明圈的大小,说明该菌水解淀粉能力的强弱。

3、V-P试验

某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸,丙酮酸缩合,脱羧成乙酰甲基甲醇,后者在强碱环境下,被空气中氧氧化为二乙酰,二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物,称V-P(+)反应。

试验方法:

1)O’Meara氏法:将试验菌接种于通用培养基,于36±1°C培养48h,培养液1ml加O’Meara试剂(加有0.3%肌酸Creatine或肌酸酐Creatinine的40%氢氧化钠水溶液)1ml,摇动试管1~2min,静置于室温或36±1°C恒温箱,若4h内不呈现伊红、即判定为阴性。亦有主张在48~50°C水浴放置2h后判定结果者。

2)Barritt氏法:将试验菌接种于通用培养基,于36±1°C培养4天、培养液2.5ml先加入5°Cα萘酚(2-na-phthol)纯酒精溶液0.6ml,再加40%氢氧化钾水溶液0.2ml,摇动2~5min,阳性菌常立即呈现红色,若无红色出现,静置于室温或36±1°C恒温箱,如2h内仍不显现红色、可判定为阴性。

3)快速法:将0.5%肌酸溶液2滴放于小试管中、挑取产酸反应的三糖铁琼脂斜面培养物一接种环,乳化接种于其中,加入5%α-萘酚3滴,40%氢氧化

钠水溶液2滴,振动后放置5min,判定结果。不产酸的培养物不能使用。

本试验一般用于肠杆菌科各菌属的鉴别。在用于芽胞杆菌和葡萄球菌等其它细菌时,通用培养基中的磷酸盐可阻碍乙酰甲基醇的产生,故应省去或以氯化钠代替。

4、甲基红(Methyl Red)试验

肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖,在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸,进一步分解中,由于糖代谢的途径不同,可产生乳酸,琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物,可使培养基PH值下降至pH4.5以下,使甲基红指示剂变红。

试验方法:挑取新的待试纯培养物少许,接种于通用培养基,培养于

36±1°C或30°C(以30°C较好)3~5天,从第二天起,每日取培养液1ml,加甲基红指示剂1~2滴,阳性呈鲜红色,弱阳性呈淡红色,阴性为黄色。迄至发现阳性或至第5天仍为阴性、即可判定结果。

甲基红为酸性指示剂,pH范围为4.4~6.0,其pK值为5.0。故在pH5.0以下,随酸度而增强黄色,在pH5.0以上,则随碱度而增强黄色,在pH5.0或上下接近时,可能变色不够明显,此时应延长培养时间,重复试验。

5、靛基质(Imdole)试验

某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸,生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合,形成玫瑰吲哚,为红色化合物。

试验方法:将待试纯培养物小量接种于试验培养基管,于36±1C培养24h 时后,取约2ml培养液,加入Kovacs氏试剂2~3滴,轻摇试管,呈红色为阳性,或先加少量乙醚或二甲苯,摇动试管以提取和浓缩靛基质,待其浮于培养液表面后,再沿试管壁徐缓加入Kovacs氏试剂数滴,在接触面呈红色,即为阳性。

实验证明靛基质试剂可与17种不的靛基质化合物作用而产生阳性反应,若先用二甲苯或乙醚等进行提取,再加试剂,则只有靛基质或5-甲基靛基质在溶剂中呈现红色,因而结果更为可靠。

6、硝酸盐(Nitrate)还原试验

有些细菌具有还原硝酸盐的能力,可将硝酸盐还原为亚硝酸盐、氨或氮气等。亚硝酸盐的存在可用硝酸试剂检验。

试验方法:临试前将试剂的A(磺胺酸冰醋酸溶液)和B(α-萘胺乙醇溶液)试液各0.2ml等量混合、取混合试剂约0.1ml、加于液体培养物或琼脂斜面培养物表面,立即或于10min内呈现红色即为试验阳性,若无红色出现则为阴性。

用α-萘胺进行试验时,阳性红色消退很快、故加入后应立即判定结果。进行试验时必须有未接种的培养基管作为阴性对照。α-萘胺具有致癌性、故使用时应加注意。

7、明胶(Gelatin)液化试验

有些细菌具有明胶酶(亦称类蛋白水解酶),能将明胶先水解为多肽,又进一步水解为氨基酸,失去凝胶性质而液化。

试验方法:挑取18~24h待试菌培养物,以较大量穿刺接种于明胶高层约2/3深度或点种于平板培养基。于20~22℃培养7~14天。明胶高层亦可培养于

36±1℃。每天观察结果,若因培养温度高而使明胶本身液化时应不加摇动、静置冰箱中待其凝固后、再观察其是否被细菌液化,如确被液化,即为试验阳性。平板试验结果的观察为在培养基平板点种的菌落上滴加试剂,若为阳性,

10~20min后,菌落周围应出现清晰带环。否则为阴性。

8、尿素酶(Urease)试验

有些细菌能产生尿素酶,将尿素分解、产生2个分子的氨,使培养基变为碱性,酚红呈粉红色。尿素酶不是诱导酶,因为不论底物尿素是否存在,细菌均能合成此酶。其活性最适pH为7.0。

试验方法:挑取18~24h待试菌培养物大量接种于液体培养基管中,摇均,于36±1℃培养10,60和120min,分别观察结果。或涂布并穿刺接种于琼脂斜面,不要到达底部,留底部作变色对照。培养2,4和24h分别观察结果,如阴性应继续培养至4天,作最终判定,变为粉红色为阳性。

9、氧化酶(Oxidase)试验

氧化酶亦即细胞色素氧化酶,为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶,氧化酶先使细胞色素C氧化,然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化,产生颜色反应。

试验方法:在琼脂斜面培养物上或血琼脂平板菌落上滴加试剂1~2滴,阳性者Kovacs氏试剂呈粉红色~深紫色,Ewing氏改进试剂呈蓝色。阴性者无颜色改变。应在数分钟内判定试验结果。

10、硫化氢(H2S)试验

有些细菌可分解培养基中含硫氨基酸或含硫化合物,而产生硫化氢气体,硫化氢遇铅盐或低铁盐可生成黑色沉淀物。

试验方法:在含有硫代硫酸钠等指示剂的培养基中,沿管壁穿刺接种,于36±1℃培养24~28h,培养基呈黑色为阳性。阴性应继续培养至6天。也可用醋

酸铅纸条法:将待试菌接种于一般营养肉汤,再将醋酸铅纸条悬挂于培养基上空,以不会被溅湿为适度;用管塞压住置36±1℃培养1~6天。纸条变黑为阳性。

11、三糖铁(TSI)琼脂试验

试验方法:以接种针挑取待试菌可疑菌落或纯培养物,穿刺接种并涂布于斜面,置36±1℃培养18~24h,观察结果。

本试验可同时观察乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气(变黄);产生硫化氢(变黑)。葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄,但因量少,生成的少量酸,因接触空气而氧化,加之细菌利用培养基中含氮物质,生成碱性产物,故使斜面后来又变红,底部由于是在厌氧状态下,酸类不被氧化,所以仍保持黄色。

12、硫化氢-靛基质-动力(SIM)琼脂试验

试验方法:以接种针挑取菌落或纯养物穿刺接种约1/2深度,置36±1℃培养18~24h,观察结果。培养物呈现黑色为硫化氢阳性,混浊或沿穿刺线向外生长为有动力,然后加Kovacs氏试剂数滴于培养表面,静置10min,若试剂呈红色为靛基质阳性。培养基未接种的下部,可作为对照。

本试验用于肠杆菌科细菌初步生化筛选,与三糖铁琼脂等联合使用可显著提高筛选功效。

油脂水解试验

某些细菌能够分泌脂肪酶(胞外酶),能将培养基中的脂肪水解为甘油和脂肪酸。所产生的脂肪酸,可通过预先加入油脂培养基中的中性红加以指示[指示范围

pH6.8(红)~pH8.0(黄)]。当细菌分解脂肪产生脂肪酸时,培养基中出现红色斑点。

(1)将装有油脂培养基的锥形瓶置于沸水浴中融化,取出并充分振荡(使油脂均匀分布),再倾入培养皿中,待凝固后制成平板。

(2)翻转平板使底皿背面向上,用记号笔在其背面玻璃上划成两半。一半用于接种金黄色葡萄球菌作为阳性对照菌,另一半用于接种实验菌大肠杆菌或产气肠杆菌。接种时用接种环取少量菌在平板两边各划线接种。

(3)将接种完的平板倒置于37℃恒温箱中,培养24h。

(4)观察结果时,注意观察平板上长菌的地方,如出现红色斑点,即说明脂肪已被水解,此为阳性反应。

三、血清学试验

血清学反应是指:相应的抗原与抗体在体外一定条件下作用,可出现肉眼可见的沉淀、凝集现象。在食品微生物检验中,常用血清学反应来鉴定分离到的细菌,以最终确认检测结果。

血清学反应的一般特点:

1)抗原体的结合具有特异性,当有共同抗原体存在时,会出现交叉反应。

2)抗原体的结合是分子表面的结合,这种结合虽相当稳定,但是可逆的。

3)抗原体的结合是按一定比例进行的,只有比例适当时,才能出现可见反应。

4)血清学反应大体分为两个阶段进行,但其间无严格界限。第一阶段为抗原体特异性结合阶段,反应速度很快,只需几秒至几分钟反应即可完毕,但不出现肉眼可见现象。第二阶段为抗原体反应的可见阶段,表现为凝集、沉淀、补体结合反应等。反应速度慢,需几分、几十分以至更长时间。而且,在第二阶段反应中,电解质、PH、温度等环境因素的变化,都直接影响血清学反应的结果。

习惯上将经典的血清学反应分三种类别:凝集反应、沉淀反应和补体结合反应。

1、凝集反应

颗粒性抗原(细菌、红细胞等)与相应抗体结合,在电解质参与下所形成的肉眼可见的凝集现象,称为凝集反应(Agglutination reaction)。其中的抗原称为凝集原,抗体称为凝集素。在该反应中,因为单位体积抗体量大,做定量实验时,应稀释抗体。

1)直接凝集反应

颗粒性抗原与相应抗体直接结合所出现的反应,称为直接凝集反应

(Direct agglution reaction)。

a.玻片凝集法。是一种常规的定性试验方法。原理是用已知抗体来检测未知抗原。常用于鉴定菌种、血型。如将含有痢疾杆菌抗体的血清与待检菌液各一滴,在玻片上混匀,数分种后若出现肉眼可见的凝集块,即阳性反应,证明该菌是痢疾杆菌。此法快速、简便,但不能进行定量测定。

b.试管凝集法。是一种定量试验方法。多用已知抗原来检测血清中有无相应抗体及其含量。常用于协助诊断某些传染病及进行流行病学调查。如肥达氏反应就是诊断伤寒、付伤寒的试管凝集试验。因为要测定抗体的含量,故将待检查的血清用等渗盐水倍比稀释成不同浓度,然后加入等量抗原,37℃或56℃,2~4小时观察,血清最高稀释度仍有明显凝集现象的,为该抗血清的凝集效价。

2)间接凝集反应

将可溶性抗原(抗体)先吸附在一种与免疫无关的,颗粒状微球表面,然后与相应抗体(抗原)作用,在有电解质存在的条件下,即可发生凝集,称为间接凝集反应(Indirect agglutination)。由于载体增大了可溶性抗原的反应面积。当载体上有少量抗原与抗体结合。就出现肉眼可见的反应,敏感性很高。

2、沉淀反应

可溶性抗原与相应抗体结合,在有适量电解质存在下,经过一定时间,形成肉眼可见的沉淀物,称为沉淀反应(Precipitation)。反应中的抗原称为沉淀原,抗体为沉淀素。由于在单位体积内抗原量大,为了不使抗原过剩,故应稀释抗原,并以抗原的稀释度作为沉淀反应的效价。

1)环状沉淀反应:是一种定性试验方法,可用已知抗体检测未知抗原。将已知抗体注入特制小试管中,然后沿管壁徐徐加入等量抗原,如抗原与抗体对应,则在两液界面出现白色的沉淀圆环。

2)絮状沉淀反应:将已知抗原与抗体在试管(如凹玻片)内混匀,如抗原抗体对应,而又二者比例适当时,会出现肉眼可见的絮状沉淀,此为阳性反应。

3)琼脂扩散试验:利用可溶性抗原抗体在半固体琼脂内扩散,若抗原抗体对应,且二者比例合适,在其扩散的某一部分就会出现白色的沉淀线。每对抗原抗体可形成一条沉淀线。有几对抗原抗体,就可分别形成几条沉淀线。琼脂扩散可分为单向扩散和双向扩散两种类型。单向扩散是一种定量试验。可用于免疫蛋白含量的测定。而双向扩散多用于定性试验。由于方法简便易行,常用于测定分析和鉴定复杂的抗原成分。

3、补体结合反应

补体结合反应(Complement fixation reaction)是在补体参与下,以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统的抗原抗体反应。补体无特异性,能与任何一组抗原抗体复合物结合而引起反应。

如果补体与绵羊红细胞、溶血素的复合物结合,就会出现溶血现象,如果与细菌及相应抗体复合物结合,就会出现溶菌现象。因此,整个试验需要有补体、待检系统(已知抗体或抗原、未知抗原或抗体)及指示系统(绵羊细胞和溶血素)五种成份参加。其试验原理是补体不单独和抗原或抗体结合。如果出现溶菌,是补体与待检系统结合的结果,说明抗原抗体是相对应的,如果出现溶血,说明抗原抗体不相对应。此反应操作复杂,敏感性高,特异性强,能测出少量抗原和抗体,所以应用范围较广。

常见的微生物检测方法

常见的微生物检测 方法

摘要:微生物的检测,无论在理论研究还是在生产实践中都具有重要的意义,本文分生长量测定法,微生物计数法,生理指标法和商业化快速微生物检测简要介绍了利用微生物重量,体积,大小,生理代谢物等指标的二十余种常见的检测方法,简要介绍了这些方法的原理,应用范围和优缺点。 概述: 一个微生物细胞在合适的外界条件下,不断的吸收营养物质,并按自己的代谢方式进行新陈代谢。如果同化作用的速度超过了异化作用,则其原生质的总量(重量,体积,大小)就不断增加,于是出现了个体的生长现象。如果这是一种平衡生长,即各细胞组分是按恰当的比例增长时,则达到一定程度后就会发生繁殖,从而引起个体数目的增加,这时,原有的个体已经发展成一个群体。随着群体中各个个体的进一步生长,就引起了这一群体的生长,这可从其体积、重量、密度或浓度作指标来衡量。微生物的生长不同于其它生物的生长,微生物的个体生长在科研上有一定困难,一般情况下也没有实际意义。微生物是以量取胜的,因此,微生物的生长一般指群体的扩增。微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映。因此生长繁殖情况就可作为研究各种生理生化和遗传等问题的重要指标,同

时,微生物在生产实践上的各种应用或是对致病,霉腐微生物的防治都和她们的生长抑制紧密相关。因此有必要介绍一下微生物生长情况的检测方法。既然生长意味着原生质含量的增加,因此测定的方法也都直接或间接的以次为根据,而测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。微生物生长的衡量,能够从其重量,体积,密度,浓度,做指标来进行衡量。 生长量测定法 体积测量法:又称测菌丝浓度法。 经过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。方法是,取一定量的待测培养液(如10毫升)放在有刻度的离心管中,设定一定的离心时间(如5分钟)和转速(如5000 rpm),离心后,倒出上清夜,测出上清夜体积为v,则菌丝浓度为(10-v)/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。这种方法比较粗放,简便,快速,但需要设定一致的处理条件,否则偏差很大,由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物,结果会有一定偏差。 称干重法:

什么是微生物检验

什么是食品微生物检验 吴崇食质12级1班学号:20122629 微生物是个体难以用肉眼观察的一切微小生物之统称。微生物包括细菌、病毒、真菌、和少数藻类等。(但有些微生物是肉眼可以看见的,像属于真菌的蘑菇、灵芝等。)病毒是一类由核酸和蛋白质等少数几种成分组成的“非细胞生物”,但是它的生存必须依赖于活细胞。根据存在的不同环境分为空间微生物、海洋微生物等,按照细胞机构分类分为原核微生物和真核微生物。 微生物对人类最重要的影响之一是导致传染病的流行。在人类疾病中有50%是由病毒引起。微生物导致人类疾病的历史,也就是人类与之不断斗争的历史。在疾病的预防和治疗方面,人类取得了长足的进展,但是新现和再现的微生物感染还是不断发生,像大量的病毒性疾病一直缺乏有效的治疗药物。一些疾病的致病机制并不清楚。大量的广谱抗生素的滥用造成了强大的选择压力,使许多菌株发生变异,导致耐药性的产生,人类健康受到新的威胁。一些分节段的病毒之间可以通过重组或重配发生变异,最典型的例子就是流行性感冒病毒。每次流感大流行流感病毒都与前次导致感染的株型发生了变异,这种快速的变异给疫苗的设计和治疗造成了很大的障碍。而耐药性结核杆菌的出现使原本已近控制住的结核感染又在世界范围内猖獗起来。 微生物千姿百态,有些是腐败性的,即引起食品气味和组织结构发生不良变化。当然有些微生物是有益的,它们可用来生产如奶酪,面包,泡菜,啤酒和葡萄酒。微生物非常小,必须通过显微镜放大约1000 倍才能看到。比如中等大小的细菌,1000个叠加在一起只有句号那么大。想像一下一滴牛奶,每毫升腐败的牛奶中约有5千万个细菌,或者讲每夸脱牛奶中细菌总数约为50亿。也就是一滴牛奶中可能含有50 亿个细菌。 微生物能够致病,能够造成食品、布匹、皮革等发霉腐烂,但微生物也有有益的一面。最早是弗莱明从青霉菌抑制其它细菌的生长中发现了青霉素,这对医药界来讲是一个划时代的发现。后来大量的抗生素从放线菌等的代谢产物中筛选出来。抗生素的使用在第二次世界大战中挽救了无数人的生命。一些微生物被广

微生物常规鉴定技术

微生物常规鉴定技术 一、形态结构和培养特性观察 1、微生物的形态结构观察主要是通过染色,在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构(包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等)及染色特性进行观察,直观地了解细菌在形态结构上特性,根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。 2、细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫菌落(colony)。不同微生物在某种培养基中生长繁殖,所形成的菌落特征有很大差异,而同一种的细菌在一定条件下,培养特征却有一定稳定性。,以此可以对不同微生物加以区别鉴定。因此,微生物培养特性的观察也是微生物检验鉴别中的一项重要内容。 1)细菌的培养特征包括以下内容:在固体培养基上,观察菌落大小、形态、颜色(色素是水溶性还是脂溶性)、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。在液体培养中的表面生长情况(菌膜、环)混浊度及沉淀等。半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况。 2)霉菌酵母菌的培养特征:大多数酵母菌没有丝状体,在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相似,只是比细菌菌落大且厚。液体培养也和细菌相似,有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。霉菌有分支的丝状体,菌丝粗长,在条件适宜的培养基里,菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色,因而菌落边缘和中心,正面和背面颜色常常不同,如青霉菌:孢子青绿色,气生菌丝无色,基内菌丝褐色。霉菌在固体培养表面形成絮状、绒毛状和蜘蛛网状菌落。

革兰氏染色: 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G—)两大类,是细菌学上最常用的鉴别染色法。 该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌,是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质,而且肽聚糖层较薄、交联度低,故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质,增加了细胞壁的通透性,使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出,结果细菌就被脱色,再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高,类脂质含量少,经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小,通透性降低,因此细菌仍保留初染时的颜色步骤: (1)涂片:涂片方法与简单染色涂片相同。 (2)晾干:与简单染色法相同。 (3)固定,与简单染色法相同 (4)结晶紫色染色:将玻片置于废液缸玻片搁架上,加适量(以盖满细菌涂面)的结晶紫染色液染色1分钟。 (5)水洗:倾去染色液,用水小心地冲洗。 (6)媒染:滴加卢哥氏碘液,媒染1min。 (7)水洗:用水洗去碘液。 (8)脱色:将玻片倾斜,连续滴加95%乙醇脱色20—25s至流出液无色,立即水洗。 (9)复染:滴加蕃红复染5min。 (10)水洗:用水洗去涂片上的蕃红染色液。 (11)晾干:将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。 (12)镜检:镜检时先用低倍,再用高倍,最后用油镜观察,并判断菌体的革兰氏染色反应性。 (13)实验完毕后的处理: ①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净,a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦 去。b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2—3次。c.再用干净的擦镜纸将 镜头擦2—3次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。 ②看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干

新版GMP与快速微生物检测鉴定技术

A B C D 高鹃 新版GMP 与快速微生物检测鉴定技术新版GMP 与 快速微生物检测鉴定技术 3.快速鉴定技术 4.法规与药典要求 第一部分引言无菌药品生产要求的大幅度提高 新版GMP 无菌药品附录 以上各级别空气悬浮粒子的标准规定如下表: 洁净度级别 悬浮粒子最大允许数静态 ≥0.5μm ≥5.0μm A 级(1) 352020B 级352029C 级3520002900D 级 3520000 29000 洁净级别 浮游菌cfu/m 3 沉降菌(φ90mm )cfu /4小时 表面微生物 接触cfu /碟(φ55m m ) 5指手套cfu /手套A 级<1<1<1<1B 级10555C 级1005025 - D 级 200 100 50- 洁净区微生物监测的动态标准 工业工程技术要求隔离装置隔离器Rabs RTP 公用工程 水系统空调系统氮气压缩 空气真空传送系统动态环境监测系统粒子监测沉降菌浮游菌

动态环境监测带来的新课题 1、大量数据的管理和分析 2、面对细菌培养阳性结果发生争执 是生产管理方面的问题? 是QC 的OOS ?3、细菌培养阳性结果的后续处理明确what where who how 革兰氏染色无法判定 无菌药品生产要求的大幅度提高 未污染 ? 无菌药品生产要求的大幅度提高 无菌药品附录: 产品的无菌或其它质量特性绝不能只依赖 于任何形式的最终处理或成品检验(包括无菌检查)。 微生物检测技术的飞跃发展 快速检测技术(不需进行培养PAT )快速鉴定技术(属种株)为无菌药品生产和质量管理提供了先进技术手段及时发现污染,追溯污染源 案例: 爱吃桔子的员工 一直难以去除的革兰氏阳性短棒状菌燃烧麦秸杆与无菌药品生产车间

食品中有害微生物快速检测方法概述

(一)、概述 食用被微生物污染的食品而导致的疾病,称作食源性疾病。导致这类疾病的微生物叫食源性致病菌。随着人们居住和卫生条件的不断改善,以及抗生素的滥用,人类对病菌的抵抗能力却在不断下降,食源性疾病一直呈上升的趋势。因此,对食品中致病菌的监测和检验也就越显示其重要性,常规的检验大多依靠培养目标微生物的方法来确定食品是否受到此微生物的污染,这些方法需要一定的培养时间,少则2~3天,多至数周,才能确定。而现行有效的一些快速检测方法不仅可以大大缩短检测时间提高微生物检出率并可用于微生物计数、早期诊断、鉴定等方面,以做到快速、简便、准确。快速方法包括了微生物学、分子化学、生物化学、生物物理学、免疫学和血清学等领域。 (二)、常见、常用的快速、简便的检测微生物数量的方法如下: 1、活细胞计数的改进方法 (1)、旋转平皿计数方法 (2)、疏水性栅格滤膜法(HGMF)或等格法(isogrid method) (3)、血膜系统(Pertrifilm) (4)、酶底物技术(ColiComplete) (5)、直接外荧光滤过技术(DEFT) (6)、“即用胶”系统(SimPlate) 2、用于估计微生物数量的新方法 (1)、阻抗法 (2)、A TP生物发光技术 3、其他方法 (1)、微量量热法 (2)、接触酶测定仪 (3)、放射测定法 (三)、食品中沙门氏菌的快速筛检方法 1、沙门氏菌显色培养基法 2、免疫学方法 3、分子生物学方法 4、自动传导法 (四)、大肠杆菌O157:H7快速检测方法 大肠杆菌O157:H7肠出血性大肠杆菌的主要血清型,自1982年在美国被分离并命名以来,陆续发现本菌与轻度腹泻、溶血性尿毒综合症、出血性肠炎、婴儿猝死综合症等多种人类病症密切相关,是食源性疾病的一种重要致病菌。E.coli O157:H7属于肠杆菌科埃希氏菌属,为革兰氏阴性杆菌,有鞭毛。近年来作为食品卫生及流行病学的研究热点,E.coli O157:H7的分离和鉴定方法已取得了较大进展。利用其生化特征、免疫原性建立的方法以及现代分子生物学技术的应用,可以从多方面对E.coli O157:H7进行检测。 1、E.coli O157:H7鉴别培养基及显色培养基 2、免疫学检测方法 3、分子生物学方法 (五)、金黄色葡萄球菌的快速检测方法 金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌,呈普通串状排列无芽孢,无鞭毛,不能运动。该菌在自然界中分布广泛,如空气、水、土壤、饲料和一些物品上,是最常见的化脓性球菌之一,食品受其污染的机会很多。金黄色葡萄球菌食物中毒是其肠毒引起的,目前已确认的肠毒素至少有A,B,C1,C2,C3,D,E和F8个型。由金黄色葡萄球菌肠毒素引发的中毒爆发事件,近年来

微生物检验常规鉴定技术

第一章微生物检验常规鉴定技术 课堂教学计划(1学时) 第一章微生物检验基本知识 包括显微镜、染色技术、培养基制备技术、接种、分离纯化和培养技术等。 接种、分离纯化和培养技术

一、接种 将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。 1、接种工具和方法 接种和分离工具 1.接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀 常用的接种方法有以下几种: 1)划线接种这是最常用的接种方法。即在固体培养基表面作来回直线形的移动,就可达到接种的作用。常用的接种工具有接种环,接种针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。 2)三点接种在研究霉菌形态时常用此法。此法即把少量的微生物接种在平板表面上,成等边三角形的三点,让它各自独立形成菌落后,来观察、研究它们的形态。除三点外,也有一点或多点进行接种的。 3)穿刺接种在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。做穿刺接种时,用的接种工具是接种针。用的培养基一般是半固体培养基。它的做法是:用接种针蘸取少量的菌种,沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺,如某细菌具有鞭毛而能运动,则在穿刺线周围能够生长。 4)浇混接种该法是将待接的微生物先放入培养皿中,然后再倒入冷却至45°C 左右的固体培养基,迅速轻轻摇匀,这样菌液就达到稀释的目的。待平板凝固之后,置合适温度下培养,就可长出单个的微生物菌落。 5)涂布接种与浇混接种略有不同,就是先倒好平板,让其凝固,然后再将菌液倒入平板上面,迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布,让菌液均匀分布,就可长出单个的微生物的菌落。 6)液体接种从固体培养基中将菌洗下,倒入液体培养基中,或者从液体培养物中,用移液管将菌液接至液体培养基中,或从液体培养物中将菌液移至

食品微生物检验的内容及检测技术

食品微生物检验的内容及检测技术 食品安全检验过程的主要内容 食品微生物的检验。食物在生产过程中以及放置过程中会受到环境中微生物的损坏或影响,在部分研究中,将食品中细菌数量对食品的损坏程度作为食品安全检测的首 要内容。在食品微生物的检验过程中,我们主要对人体有害微生物进行检验,其中在食品安全检验过程中,因为食品中有多种微生物共存现象,所以在检验前,微生物检验员要把不同的菌体进行分离,这样才能更加清楚的了解各种微生物的数量及菌体的分布情况,包括生产型食品微生物,如醋酸杆菌,酵母菌等和使食物变质的微生物,如霉菌、细菌等和食源性病原微生物如溶血性大肠杆菌,肉毒杆菌等。对食品原辅料微生物的控制和产成品微生物的检验是保证食品安 全的重要途径。 针对食品致病菌的相关检验。不同的致病菌会对人们的身体健康有不同程度的危害,像我们在生活中经常吃到的大米,有些不法商家将发霉的大米加工后再次放入市场进行二次销售,虽然经加工后,在外表上和普通大米没啥两样,但这种大米中含有黄曲霉这一致病菌,据可靠信息表明,黄曲霉的危害性十分巨大,如果人们长时间吃这样的大米,出

现癌症的风险要比常人高出很多倍,由此可见,食品中致病菌的检验是保证我们能吃到放心食品十分关键的微生物检 测技术,所以我们在致病菌的检验上对不同种类的致病菌进行定量严格检验。如乳制品和肉制品的致病菌主要是黄曲霉菌和大肠杆菌,而蛋制品中则容易出现染沙门菌、大肠菌群、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌,罐头食品容易出现肉毒梭菌、产气荚膜梭菌、蜡样芽胞杆菌。 食品微生物检验中的主要特点 对食品检测要求相对较高。在食品微生物的一系列检验中,由于食品中涉及的微生物种类较多,因此加大了食品微生物检验的难度。国家标准或行业标准对不同食品中微生物的含量特别是致病菌的含量有明确的要求。在食品的运输过程中,食品致病菌以及其他微生物对相应的食品有一定的污染,随着微生物种类的增多,检测人员需要对食品受致病菌影响的程度、食品保质期以及其他相关的标准进行测量,难度会随着微生物种类的增多而复杂。所以在微生物检验上我们对每一阶段的食品安全检测都要重视,在各个微生物的测量上,相关的检测技术要求就有所提高。 食品微生物检验效率。随着食品市场的商品流通提高,人们对食品需求不断增加,而食品安全问题却在日益严重,为了保障人们在能够及时满足食品种类和数量要求的同时,进一步促进食品安全的保障措施落实,必须加强食品安

梅里埃全自动微生物鉴定仪参数

设备名称:全自动微生物鉴定及药敏分析系统 一、具体用途:对食品,环境中的微生物进行快速,全自动的鉴定及药物敏感性测试。 二、技术参数与性能要求: 1. 系统可同时处理》30个标本,系统具有扩容功能,至少可以两台联机; 2. 分析组件可对环境中和食品中的细菌进行全自动鉴定,种类包括革兰阴性菌、革兰阳性 球菌、革兰氏阳性杆菌、酵母样真菌、假丝酵母类真菌、苛养菌、厌氧菌及棒状杆菌等的 鉴定; 3. ★分析组件可对芽孢杆菌进行全自动鉴定; 4. ★大于500种可鉴定细菌,鉴定结果通过美国FDA认证,细菌鉴定采用GB推荐生化鉴定 显色法,药敏检测采用比浊法,并且鉴定方法原理可在GB4789中查询(提供具体细菌库); 5. ^分析组件可自动进行革兰阴性菌、革兰阳性菌、酵母样真菌、肺炎链球菌等药敏试验, 以上所有药敏试验均得到美国FDA批准用于临床应用(提供FDA证明资料); 6. ★在对标本的鉴定及药敏试验过程中,无需添加任何额外附加试剂; 7. 快速全自动对细菌进行鉴定和药敏试验,采用实时检测系统,系统每隔15分钟对试剂卡 进行一次扫描读数,一旦确认结果,可马上出报告; & ★细菌最快鉴定时间V 4个小时,平均鉴定时间不超过5小时; 9?最快药敏实验时间5小时,平均药敏实验时间不大于6小时; 10. ★系统可同时进行鉴定和药敏实验,并且可同时上机的鉴定试剂卡种类不少于4种,可 同时上机的药敏试剂卡的种类不少于6种; 11. ★系统自动填充悬浮液至试剂卡,自动密封拭卡,并自动将拭卡装载于设备内置读数系 统/孵育系统,测试结束时可自动丢弃拭卡,操作都在仪器内部自动进行,不需要额外设 备; 12. 卡片填充菌液后为封闭式卡片,不会造成污染; 13. ★鉴定卡和药敏卡必须独立包装; 14. 鉴定卡应至少提供3种不同试剂的SFDA注册证; 15. 药敏卡应至少提供5种不同试剂的SFDA注册证; 16. 测试完成后,经分析软件分析后得出结果并可自动打印报告,并保存结果; 17. 具备中文报告软件系统; 18?双向联网软件,可传输报告结果;

2020年(生物科技行业)微生物常规鉴定技术

(生物科技行业)微生物常 规鉴定技术

微生物常规鉴定技术 壹、形态结构和培养特性观察 1、微生物的形态结构观察主要是通过染色,在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构(包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等)及染色特性进行观察,直观地了解细菌在形态结构上特性,根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。 2、细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫菌落(colony)。不同微生物在某种培养基中生长繁殖,所形成的菌落特征有很大差异,而同壹种的细菌在壹定条件下,培养特征却有壹定稳定性。,以此能够对不同微生物加以区别鉴定。因此,微生物培养特性的观察也是微生物检验鉴别中的壹项重要内容。 1)细菌的培养特征包括以下内容:在固体培养基上,观察菌落大小、形态、颜色(色素是水溶性仍是脂溶性)、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。在液体培养中的表面生长情况(菌膜、环)混浊度及沉淀等。半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况。 2)霉菌酵母菌的培养特征:大多数酵母菌没有丝状体,在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相似,只是比细菌菌落大且厚。液体培养也和细菌相似,有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。霉菌有分支的丝状体,菌丝粗长,在条件适宜的培养基里,菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色,因而菌落边缘和中心,正面和背面颜色常常不同,如

青霉菌:孢子青绿色,气生菌丝无色,基内菌丝褐色。霉菌在固体培养表面形成絮状、绒毛状和蜘蛛网状菌落。 革兰氏染色: 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G—)俩大类,是细菌学上最常用的鉴别染色法。 该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌,是由这俩类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质,而且肽聚糖层较薄、交联度低,故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质,增加了细胞壁的通透性,使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出,结果细菌就被脱色,再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高,类脂质含量少,经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小,通透性降低,因此细菌仍保留初染时的颜色步骤: (1)涂片:涂片方法和简单染色涂片相同。 (2)晾干:和简单染色法相同。 (3)固定,和简单染色法相同 (4)结晶紫色染色:将玻片置于废液缸玻片搁架上,加适量(以盖满细菌涂面)的结晶紫染色液染色1分钟。 (5)水洗:倾去染色液,用水小心地冲洗。 (6)媒染:滴加卢哥氏碘液,媒染1min。 (7)水洗:用水洗去碘液。

微生物自动化鉴定系统的工作原理

微生物自动化鉴定系统的工作原理 微生物鉴定的自动化技术近十几年得到了快速发展。数码分类技术集数学、计算机、信息及自动化分析为一体,采用商品化和标准化的配 套鉴定和抗菌药物敏感试验卡或条板,可快速准确地对临床数百种常见分离菌进行自动分析鉴定和药敏试验。目前自动化微生物鉴定和药 敏分析系统已在世界范围内临床实验室中广泛应用。 一、微生物数码鉴定法 早在七十年代中期,一些国外公司就研究出借助生物信息编码鉴定细菌的新方法。这些技术的应用,为医学微生物检验工作 提供了一个简便、科学的细菌鉴定程序,大大提高了细菌鉴定的准确性。目前,微生物编码鉴定技术已经得到普遍应用,并早已商品化和 形成独特的不同细菌鉴定系统。如、、、和等系统。这种鉴定系统是自动化鉴定系统的基础。 ( 一)数码鉴定法基本原理 数码鉴定是指通过数学的编码技术将细菌的生化反应模式转换成数学模式,给每种细菌的反应模式赋予一组数码,建立数据库或编成检索 本。通过对未知菌进行有关生化试验并将生化反应结果转换成数字(编码),查阅检索本或数据库,得到细菌名称。其基本原理是计算并 比较数据库内每个细菌条目对系统中每个生化反应出现的频率总和。随着电脑技术的进步,这一过程已变得非常容易。 1.简要介绍计算步骤: (1)出现频率(概率)的计算:将记录成阳性或阴性结果转换成出现频率:①对阳性特征,则除以100即得。②对阴性特征,除以1

00的商被1减去即可。③说明:对“0”和“100”,因这2个数太超量,为了使结果不出现过小或过大,而用相似值0.01或0 .99值代替。 (2)在每一个分类单位中,将所有测定项目的出现频率相乘,得出总出现频率。 (3)在每个分类菌群中的所有菌的总出现频率相加,除以一个分类单位的总出现频率,乘100,即得鉴定%() (4)在每个菌群中,再按值大小顺序重新排列。将未知菌单次总发生频率除以最典型反应模式单次总发生频率,得到模式频率T 值,代表个体与总体的近似值。T值越接近1,个体与总体越接近,鉴定价值越大。按大小排序,将相邻两项的之比为R, 代表着首选条目与次选条目的差距,差距越大,价值越大。如果≥80,参考T及R值可作出鉴定。 2.在编码检索本中检索数据谱得出的结果有以下几种形式(以鉴定系统为例)。 (1)有此数码谱:①有一个或几个菌名条目及相应的鉴定值(和T值)。②对鉴定结果好坏的评价,最佳……等。 ③用小括号列出关键的生化结果及阳性百分率。④有时,鉴定结果不佳或有多条菌名条目,需进一步补充试验项目才能得出良好的鉴定结 果。⑤指出某些注意要点,需用“推测性鉴定”,并将此菌送至参考实验室;需用“血清学鉴定”,作进一步的证实等。 (2)无此数码谱:可能有以下原因:①此生化谱太不典型。②不能接受,鉴定值低(<80.0)。③可疑。需进一步确认是否 纯培养,重新鉴定,可与供应商技术服务部联系。 3. 结果解释

微生物检测手段及注意事项

微生物检测手段及注意事项

微生物检测手段及注意事项 微生物的检测,无论在理论研究还是在生产实践中都具有重要的意义,本文对生长量测定法、微生物计数法、生理指标法和商业化快速微生物检测简要介绍了利用微生物重量,体积,大小,生理代谢物等指标的二十余种常用的检测方法,简要介绍了这些方法的原理,应用范围和优缺点。 一个微生物细胞在合适的外界条件下,不断的吸收营养物质,并按自己的代谢方式进行新陈代谢。如果同化作用的速度超过了异化作用,则其原生质的总量(重量,体积,大小)就不断增加,于是出现了个体的生长现象。如果这是一种平衡生长,即各细胞组分是按恰当的比例增长时,则达到一定程度后就会发生繁殖,从而引起个体数目的增加,这时,原有的个体已经发展成一个群体。随着群体中各个个体的进一步生长,就引起了这一群体的生长,这可从其体积、重量、密度或浓度作指标来衡量。微生物的生长不同于其他生物的生长,微生物的个体生长在科研上有一定困难,通常情况下也没有实际意义。微生物是以量取胜的,因此,微生物的生长通常指群体的扩增。微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映。因此生长繁殖情况就可作为研究各种生理生化和遗传等问题的重要指标,同时,微生物在生产实践上的各种应用或是对致病,霉腐微生物的防治都和他们的生长抑制紧密相关。所以有必要介绍一下微生物生长情况的检测方法。既然生长意味着原生质含量的增加,所以测定的方法也都直接或间接的以次为根据,而

测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。微生物生长的衡量,可以从其重量,体积,密度,浓度,做指标来进行衡量。 1. 微生物计量法 1.1 体积测量法 又称测菌丝浓度法,通过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。方法是,取一定量的待测培养液(如10 mL)放在有刻度的离心管中,设定一定的离心时间(如5 min)和转速(如5000 rpm),离心后,倒出上清夜,测出上清夜体积为v,则菌丝浓度为(10-v)/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。这种方法比较粗放,简便,快速,但需要设定一致的处理条件,否则偏差很大,由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物,结果会有一定偏差。 称干重法 可用离心或过滤法测定。一般干重为湿重的10~20%。在离心法中,将一定体积待测培养液倒入离心管中,设定一定的离心时间和转速,进行离心,并用清水离心洗涤1~5次,进行干燥。干燥可用烘箱在105 ℃或100 ℃下烘干,或采用红外线烘干,也可在80 ℃或40 ℃下真空干燥,干燥后称重。如用过滤法,丝状真菌可用滤纸过滤,细菌可用醋酸纤维膜等滤膜过滤,过滤后用少量水洗涤,在40 ℃下进行真空干燥。称干重发法较为烦琐,通常获取的微生物产品为菌体时,常采用这种方法,如活性干酵母(Activity Dry Yeast, ADY),一些以微生物菌体为活性物质的饲料和肥料。

微生物的鉴定方法总结2020

微生物的鉴定方法总结2020 微生物鉴定技术新技术新方法 32、1 细胞壁组分分析 32、2 红外光谱IR 32、3 气相色谱GC 42、4 高效液相色谱HPLC 42、5 质谱分析MS43 微生物鉴别方法传统方法在传统的分类鉴定中,微生物分类鉴定的主要依据是形态学特征、生理生化反应特征、生态学特征以及血清学反应、对噬菌体的敏感性等。在鉴定时,我们把这些依据作为鉴定项目,进行一系列的观察和鉴定工作。 1、1 细菌微菌落技术细菌的形态、大小、颜色及其它特征与细菌的基本生物学特性如代谢类型、分裂方式、繁殖速度等有密切关系。肉眼所见菌落,即大菌落是由大量的菌体紧密堆积而成,有不少生物学特性不能辨别;微菌落则是指细菌生长繁殖早期在固相载体上形成的只能借助显微镜进行观察的细菌集落。与大菌落相比,微菌落边缘及中央有明显不同的表形特征。可据此对微生物的种类进行鉴定。缺点:受操作人员主观性影响大。(1)细胞形态在显微镜下观察细胞外形大小、形状、排列等,细胞构造,革兰氏染色反应,能否运动、鞭毛着生部位和数目,有无芽孢和荚膜、芽孢的大小和位置,放线菌和真菌的繁殖器官

的形状、构造,孢子的数目、形状、大小、颜色和表面特征等。(2)群体形态群体形态通常是指以下情况的特征:在一定的固体培养基上生长的菌落特征,包括外形、大小、光泽、黏稠度、透明度、边缘、隆起情况、正反面颜色、质地、气味、是否分泌水溶性色素等;在一定的斜面培养基上生长的菌苔特征,包括生长程度、形状、边缘、隆起、颜色等;在半固体培养基上经穿刺接种后的生长情况;在液体培养基中生长情况,包括是否产生菌膜,均匀浑浊还是发生沉淀,有无气泡,培养基的颜色等。如是酵母菌,还要注意是成醭状、环状还是岛状。 1、2 生理生化反应特征(1)利用物质的能力包括对各种碳源利用的能力(能否以CO2为唯一碳源、各种糖类的利用情况等)、对各种氮源的利用能力(能否固氮、硝酸盐和铵盐利用情况等)、能源的要求(光能还是化能、氧化无机物还是氧化有机物等)、对生长因子的要求(是否需要生长因子以及需要什么生长因子等)。(2)代谢产物的特殊性这方面的鉴定项目非常多,如是否产生H2S、吲哚、CO 2、醇、有机酸,能否还原硝酸盐,能否使牛奶凝固、冻化等。(3)与温度和氧气的关系测出适合某种微生物生长的温度范围以及它的最适生长温度、最低生长温度和最高生长温度。对氧气的关系,看它是好氧、微量好氧、兼性好氧、耐氧还是专性厌氧。

9204 微生物鉴定指导原则

9204
微生物鉴定指导原则
本指导原则为非无菌产品微生物限度控制菌检查中疑似菌的鉴定, 以及药物 原料、辅料、制药用水、生产环境、中间体和终产品中检出微生物的鉴定提供指 导。当微生物的鉴定结果有争议时,以《伯杰氏系统细菌学手册》 (《Bergey, s Manual of Systematic Bacteriology》)现行版的鉴定结果为准。 微生物鉴定是指借助现有的分类系统,通过对未知微生物的特征测定,对其 进行细菌、酵母菌和霉菌大类的区分,或属、种及菌株水平确定的过程,它是药 品微生物检验中的重要环节, 药典附录相应章节中对检出微生物的鉴定做了明确 规定,如“非无菌产品的微生物检查:控制菌检查” (通则 1106)中选择培养 基或指示培养基上发现的疑似菌落需进行鉴定; 对“无菌检查法” (通则 1101) 的阳性实验结果中分离的微生物进行鉴定,以判定试验是否重试;药品洁净实验 室微生物监测和控制指导原则(通则 9203)建议对洁净室和其他受控环境分离 到的微生物进行鉴定,以掌握环境微生物污染情况,有助于污染调查。此外,在 药品生产中,有时亦需对药物原料、辅料、制药用水、生产环境、中间产物和终 产品中检出的微生物进行适当水平的鉴定。 微生物鉴定需达到的水平视情况而定,包括种、属鉴定和菌株分型。大多数 非无菌药品生产过程和部分无菌生产环境的风险评估中, 对所检出微生物的常规 特征包括菌落形态学、细胞形态学(杆状、球状、细胞群、孢子形成模式等)、革 兰染色或其它染色法,某些能够给出鉴定结论的关键生化反应(如氧化酶、过氧 化氢酶和凝固酶反应)进行分析,一般即可满足需要;非无菌药品产品的控制菌 检查应达到种的水平;无菌试验结果阳性和无菌生产模拟工艺(如培养基灌装) 失败时,对检出的微生物鉴定一般需达到菌株水平。 一、微生物的鉴定程序 微生物鉴定的基本程序包括分离纯化和鉴定,鉴定时,一般先将待检菌进行 初步的分类。鉴定的方法有表型微生物鉴定和基因型微生物鉴定,根据所需达到 的鉴定水平选择鉴定方法。微生物鉴定系统是基于不同的分析方法,其局限性与 方法和数据库的局限性息息相关, 未知菌鉴定时通过与微生物鉴定系统中的标准 微生物(模式菌株)的特征(基因型和/或表型)相匹配来完成。如果数据库中没 有此模式菌株,就无法获得正确的鉴定结果。在日常的微生物鉴定试验中,用户
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VITEK全自动微生物检测系统原理及其应用

VITEK全自动微生物检测系统原理及其应用 近年来,微生物的检测鉴定技术已逐步由手工检测走向仪器化和电脑化,并力求简便、快速、准确。由生物梅里埃公司出品的全自动微生物鉴定/药敏分析系统VITEK是目前世界上最先进、自动化程度最高的细菌鉴定仪器之一。 近年来,微生物的检测鉴定技术已逐步由手工检测走向仪器化和电脑化,并力求简便、快速、准确。由生物梅里埃公司出品的全自动微生物鉴定/药敏分析系统VITEK是目前世界上最先进、自动化程度最高的细菌鉴定仪器之一。VITEK已被许多国家定为细菌最终鉴定设备,并获美国药品食品管理局(FDA)认可。该系统有高度的特异性、敏感性和重复性,还具有操作简便、检测速度快的特点,绝大多数细菌的鉴定在2~18 h内可得出结果。现将该系统的工作原理、主要结构、功能并结合我们使用后的一些体会介绍如下。 1工作原理 VITEK对细菌的鉴定是以每种细菌的微量生化反应为基础,不同种类的VITEK试卡(检测卡)含有多种的生化反应孔,可达30种。将手工分离的待检菌的纯菌落制成符合一定浊度要求的菌悬液,经充填机将菌悬液注入试卡内,封口后放入读数器/恒温培养箱,根据试卡各生化反应孔中的生长变化情况,由读数器按光学扫描原理,定时测定各生化介质中指示剂的显色(或浊度反应,然后把读出信息输入电脑储存并进行分析,再和预定的阈值进行比较,判定反应,再通过数值编码技术与数据库中反应文件进行比较,最后鉴定报告将在显示器上自动显示)并在打印机上自动打印。 2VITEK系统的结构组成 2.1检测卡 目前VITEK系统的检测卡有14种,微生物常用的有7种,即:革兰氏阳性菌鉴定卡(GPI)、革兰氏阴性菌卡(GNI+)、非发酵菌卡(NFC)、酵母菌卡(YBC)、厌氧菌卡(ANI)、芽胞杆菌卡(BAC)、奈瑟氏菌嗜血杆菌卡(NHI),以及药敏检测卡等。每张检测卡对应接种1份标本,检测卡为一次性消耗品。 2.2充填机将待测菌的菌悬液注入试卡内。 2.3读数器/恒温箱可在培养过程中定时读出细菌在试卡内培养基中的生长变化值。 2.4电脑主机/显示器/键盘/打印机用于储存和分析资料、系统的操作和结果分析鉴定,实验结果的自动显示报告和打印。 2.5电源稳压器和UPS在外围断电的情况下提供电脑主机约10 min持续电源。 3VITEK系统的功能

微生物快速检测方法及应用进展

微生物快速检测方法及应用进展【关键词】微生物快速检测 随着人们生活水平不断提高,各种安全问题越来越受到人们的重视,微生物的污染问题也相应地备受关注。在食品和环境等各个方面都有微生物污染的可能,一旦污染,微生物将大量繁殖而导致食源性疾病或环境污染甚至医院内感染。特别是近年来随着环境污染的加剧和生态平衡的不断破坏,导致感染的致病菌的种类越来越多,病原微生物对人类的威胁越来越大。传统的检验方法,主要包括形态检查和生化方法,其准确性、灵敏性均较高,但涉及的实验较多、操作烦琐、需要时间较长、准备和收尾工作繁重,而且要有大量人员参与[1,2]。所以,迫切需要准确、省时、省力和省成本的快速检验方法。本文对微生物快速检测方法的进展情况及实际应用进行综述,以利于预防食源性疾病及公共卫生突发事件的发生。 1 即用型纸片法 3M公司的perrifilmTMPlate系列微生物测试片,可分别检测菌落总数、大肠菌群计数、霉菌和酵母计数[3]。由RCP Scientific Inc 公司开发上市的Regdigel系列,除上述项目外还有检测乳杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌的产品[4],这两个系列的产品与传统检测方法之间的相关性非常好。如用大肠菌群快检纸片检测餐具的表面,操作简便、快速、省料,特异性和敏感性与发酵法符合率高,已经被列为国标方法。使用时应正确掌握操作技术和判断标准,从而达到理想的检测效果[5]。美国3M公司生产的PF(Petrifilm)试纸还加入了染色

剂、显色剂,增强了菌落的目视效果,而且避免了热琼脂法不适宜受损细菌恢复的缺陷。霉菌快速检验纸片,应用于食品检验中的霉菌具有操作简便,仅需36℃培养,不需要低温设备;快速,仅需2 d就可观察结果,比现在的国家标准检验方法缩短3~5 d,大大提高了工作效率。纸片法与国标法在霉菌检出率上差异无统计学意义,且菌落典型,易判定。纸片荧光法利用细菌产生某些代谢酶或代谢产物的特点而建立的一种酶—底物反应法。只需检测食品中大肠菌群、大肠杆菌的有关酶的活性,将荧光产物在365 nm紫外光下观察即可。同时纸片可高压灭菌处理,4℃保存,简化了实验准备、操作和判断[6]。但由于它们价格昂贵,限制了在基层单位的实际应用。 2 生物化学技术 2.1 PCR技术 PCR技术采用体外酶促反应合成特异性DNA片段,再通过扩增产物来识别细菌。由于PCR灵敏度高,理论上可以检出一个细菌的拷贝基因,因此在细菌的检测中只需短时间增菌甚至不增菌,即可通过PCR进行筛选,节约了大量时间,但PCR技术也存在一些缺点:食物成分、增菌培养基成分和其他微生物DNA对Taq酶具有抑制作用,可能导致检验结果假阴性;操作过程要求严格,微量的外源性DNA进入PCR后可以引起无限放大产生假阳性结果,扩增过程中有一定的装配误差,会对结果产生影响。由于以上原因,PCR技术对操作者的自身素质要求很高,对于基层单位而言难以做到。短时间内也不会有经济效益和社会效益,因此影响了这项技术在基层的应用。 2.2 基因探针技术基因探针技术利用具有同源性序列的核酸单

微生物检测技术实验资料

海南大学 实验教学自编教材微生物检测技术实验 农学院生物技术系编

实验一细菌学鉴定中常用的生化反应实验 一、目的要求 了解细菌鉴定中常用的生化反应及其原理。 二、基本原理 微生物生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物。生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。因此微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一。 IMVIC是吲哚(indol test)、甲基红(methyl red test)、伏-普(V oges-Prokauer test)和柠檬酸盐(citrate test)四个试验的缩写,i是在英文中为了发音方便而加上去的。这四个试验主要是用来快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes),多用于水的细菌学检查。大肠杆菌虽非致病菌,但在饮用水中若超过一定数量,则表示受粪便污染。产气肠杆菌也广泛存在于自然界中,因此检查水时要将两者分开。 硫化氢试验也是检查肠道杆菌的生化试验。 吲哚试验是用来检测吲哚的产生。有些细菌能产生色氨酸酶,分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸。吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合,形成红色的玫瑰吲哚。但并非所有微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力,因此吲哚试验可以作为一个生物化学检测的指标。 色氨酸水解反应:

吲哚与对二甲基苯甲醛反应: 大肠杆菌吲哚反应阳性,产气肠杆菌为阴性。 甲基红试验是用来检测由葡萄糖产生的有机酸,如甲酸、乙酸、乳酸等。当细菌代谢糖产生酸时,培养基就会变酸,使加入培养基的甲基红指示剂由橘黄色(pH6.3)变为红色(pH4.2),即甲基红反应。尽管所有的肠道微生物都能发酵葡萄糖产生有机酸,但这个试验在区分大肠杆菌和产气肠杆菌上仍然是有价值的。这两个细菌在培养的早期均产生有机酸、但大肠杆菌在培养后期仍能维持酸性pH4,而产气肠杆菌则转化有机酸为非酸性末端产物,如乙醇、丙酮酸等,使pH升至大约6。因此大肠杆菌为阳性反应,产气肠杆菌为阴性反应。 伏-普试验是用来测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性未端产物的能力,如丙酮酸。丙酮酸进行缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇,此化合物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙酰。二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基作用,生成红色化合物,即伏-普反应阳性;不产生红色化合物者为阴性反应。有时为了使反应更为明显,可加入少量含胍基的化合物,如肌酸等。 其化学反应过程如下:

微生物分类鉴定

第三节微生物的分类鉴定方法 一、微生物鉴定的依据 获得纯化的微生物分离菌株后,首先判定是原核微生物还是真核微生物,这实际上在分离过程中所使用的方法和选择性培养基已经决定了分离菌株的大类的归属,从平板菌落的特征和液体培养的性状都可加以判定。然后,如是原核微生物,便可根据表14-3 所示的经典分类鉴定指标进行鉴定,如条件允许,可做碳源利用的BIOLOG-GN 分析和16S rDNA 序列分析。多项结果结合起来确定分离菌株的属和种。 表14-3 微生物经典分类鉴定方法的指标依据 二、微生物鉴定的技术与方法 根据目前微生物分类学中使用的技术和方法,可把它们分成四个不同的水平:①细胞形态和行为水平,②细胞组分水平,③蛋白质水平,④基因组水平; 在微生物分类学发展的早期,主要的分类鉴定指标是以在细胞形态和习性为主,可称为经典的分类鉴定法。其他三种实验技术主要是60 年代以后采用的,称为化学分类和遗传学分类法,这些方法再加上数值分类鉴定法,可称为现代的分类鉴定方法。 (一)、经典分类鉴定法 经典分类法是一百多年来进行微生物分类的传统方法。其特点是人为地选择几种形态生理生化特征进行分类,并在分类中将表型特征分为主、次。一般在科以上分类单位以形态特征、科以下分类单位以形态结合生理生化特征加以区分。最后,采用双歧法整理实验结果,排列一个个的分类单元,形成双歧检索表(图14-4 )。 A. 能在60 o C 以上生长 B. 细胞大,宽度1.3~1.8mm ……………………………………… 1. 热微菌属 ( Thermomicrobium )

BB. 细胞小,宽度0.4~0.8mm C. 能以葡萄糖为碳源生长 D. 能在pH4.5 生长…………………………………………… 2. 热酸菌属 ( Acidothermus ) DD. 不能在pH4.5 生长………………………………………………… 3. 栖热菌属 ( Thermus ) CC. 不能以葡萄糖为唯一碳源……………………… 4. 栖热嗜油菌属( 栖热嗜狮菌属Thermoleophilum ) AA. 不能在60 o C 以上生长 图14-4 双歧法检索表例样 应用BIOLOG-GN 仪检测分离菌株对众多碳源的利用情况判断分离菌株的分类地位,近年来也时有应用。在BIOLOG-GN 仪上有96 个小孔,其中95 孔内分装有95 种不同碳源的缓冲液,1 孔为无碳源的缓冲液对照,各孔接入适宜菌浓度和液量的分离菌株培养物,定温培养,每日定时读取BIOLOG-GN 仪计算机上各碳源利用情况,一般为时1 周,BIOLOG-GN 仪可显示出该鉴定菌株的最可能归属。 (二)、数值分类法 又称阿德逊氏分类法() 。它的特点是根据较多的特征进行分类,一般为50 ~60 个,多者可达100 个以上,在分类上,每一个特性的地位都是均等重要。通常是以形态、生理生化特征,对环境的反应和忍受性以及生态特性为依据。最后,将所测菌株两两进行比较,并借用电子计算机计算出菌株间的总相似值,列出相似值矩阵( 图14-5) 。为便于观察,应将矩阵重新安排,使相似度高的菌株列在一起,然后将矩阵图转换成树状谱(dendrogram)( 图14-6) ,再结合主观上的判断( 如划分类似程度大于85 %者为同种,大于65 %者为同属等) ,排列出—个个分类群。 图14-5 显示6 个细菌菌株的遗传相似矩阵图

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