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犬自体骨髓间充质干细胞介导HA_TCP修复牙槽骨缺损的实验研究_牛玉梅

犬自体骨髓间充质干细胞介导HA-TCP修复牙槽骨缺损的实验研究

牛玉梅1* 陈野2 李艳萍1 赵尔杨3 曹涛1 刘会梅1 王爽1 姜凌云1

(1.哈尔滨医科大学口腔医学院牙体牙髓病科 黑龙江哈尔滨 150001;

2.哈尔滨工程大学;3.哈尔滨医科大学口腔医学院口腔病理科)

[摘要] 目的:研究成年犬骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)介导羟基磷灰石磷酸三钙(hydroxyapatite-tricalcium phosphate,HA-TCP)修复犬牙槽骨缺损。方法:用密度梯度离心贴壁培养法分离纯化成年犬的MSCs,将MSCs矿化诱导为成骨样细胞后与HA-TCP支架复合。选取3只成年犬,在876︱678根分歧处分别制备长宽高均为3mm的骨缺损。左侧作为实验组,牙槽骨缺损处植入MSCs-HA-TCP复合物;右侧作为对照组,将HA-TCP植入牙槽骨缺损部位。移植后8周处死实验动物,进行组织学观察,并进行图像分析。

结果:实验组新生骨组织占缺损的百分比明显高于对照组,剩余材料占缺损的百分比低于对照组,具有统计学意义(P<0.01)。结论:MSCs介导HA-TCP修复成年犬牙槽骨缺损效果优于单纯的HA-TCP修复犬牙槽骨缺损。

[关键词] 骨髓间充质干细胞 牙槽骨缺损 HA-TCP 骨组织工程

[中图分类号] R782.13 [文献标识码] A [文章编号] 1671—7651(2012)01—0009—03

Repairing of Alveolar Bone Defect with Autoallergic Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Compounded HA-TCP inDogs.NIU Yu-mei,Chen Ye,LI Yan-ping,et al.Department of Operative Dentistry and Endodontics,School of Stomatology,Harbin Medical University,Harbin150001

[Abstract] Objectives:To study the efficacy of repairing the alveolar bone defects with autoallergic bone marrowmesenchymal stem cells(MSCs)compounded HA-TCP(hydroxyapatite-tricalcium phosphate)in dogs.Meth-ods:MSCs of adult dogs were isolated,purified,cultured and induced to osteoblasts.The osteoblasts were implan-ted into the HA-TCP,and then implanted the composite into the defects of mandible in left side of the dogs.TheHA-TCP without MSCs were implanted into right side of the dogs as control.The animals were sacrificed 8weekslater.HE staining and image measurement were performed on implantation section.Results:HE staining and imageanalysis demonstrated that the amount of new alveolar bone formation of experimental group was obviously morethan that of control group.The difference was statistically significant(P<0.01).The residue material of the exper-imental group was fewer than that of the control group.Conclusion:MSCs compounded HA-TCP deployed to re-pair alveolar bone defects in dogs is better than only HA-TCP.

[Key words] MSCs Alveolar bone defect HA-TCP Bone tissue engineering

因外伤、肿瘤等原因所导致的牙槽骨损伤临床发病率较高,组织工程学的发展为牙槽骨损伤的修复开辟了一条新的途径。本实验应用组织工程学原理,研究骨髓间充质干细胞介导羟基磷灰石磷酸三钙(hydroxyapatite-tricalcium phosphate,HA-TCP)修复犬牙槽骨缺损,旨在为牙槽骨缺损的细胞学治疗及骨髓间充质干细胞构建组织工程化骨提供一定的实验支持。

基金项目 黑龙江省教育厅项目(编号:11521109)

作者简介 牛玉梅(1963~),女,黑龙江人,博士,教授,主要从事牙体牙髓病临床及基础的研究工作。

*通讯作者 牛玉梅,电话:(0451)536455541 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要仪器 MILLI_Q超纯水纯化系统,O-LYMPUS IX70倒置相差显微镜,ECKMAN Al-legr21R恒温离心机,JEOL JEM-1220扫描电子显微镜。

1.1.2 主要材料及试剂 HA-TCP(四川大学材料系提供),LG-DMEM培养液(Hyclone公司),胎牛血清(FBS,匈牙利公司),胰酶(Sigma),地塞米松(Sigma),维生素C(Sigma),β-甘油磷酸钠(Sig-ma),胰岛素(Sigma),3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(

 口腔医学研究2012年1月第28卷第1期

犬自体骨髓间充质干细胞介导HA_TCP修复牙槽骨缺损的实验研究_牛玉梅

图1 MSC成骨诱导10d,ALP

染色呈阳性(×200

)图2 MSC成骨诱导14d

,茜素红染色阳性(×100

)图3 实验组见大量新生骨组织

从边缘与中心两个方向长入(×100

)图4 对照组仅有少量新骨生

成,由周边长入(×100

)Fig.1 ALP staining was posi-tive in MSCs after 10days of mineralizationinduction

Fig.2 Alizarin red staining forMSCs showed positiveafter 14days of osteo-g

enic inductionFig.3 New bone formation e-merged from both themargin and the center ofthe defects in experi-mental group

ig.4 Only a little coralliformnew bone was depositedfrom the margin of thedefects in control group

IBMX,Sigma),吲哚美辛(Sigma),茜素红(Sig-ma),苏丹Ⅳ(Sigma),淋巴细胞分离液(1.073g/ml,TBD)

,碱性磷酸酶试剂盒(南京建成公司)。1.1.3 实验动物 雄性成年犬,体重12~15kg,由哈尔滨医科大学第一临床医院实验动物中心提供。

1.2 实验方法

1.2.1 犬MSCs的分离培养和诱导 对成年犬行

髂后上棘骨穿,无菌条件下采集犬的骨髓3mL(肝素100U/mL抗凝);在骨髓中加等量PBS稀释,将稀释后液体置于淋巴细胞分离液的液面上;离心机1500r/min离心20min,

取离心后中层云雾状有核细胞层,加入PBS中,1800r/min离心10min,洗2次去除分离液;最后一次倒掉上清,用10%FBS+

1%双抗的培养液重悬,

以1.0×106

/mL的密度接种于瓶底面积为25cm2的培养瓶内,

加5mL培养液;置37℃、5%CO2孵箱培养,培养3d后首次换液,后每3d换1次。当细胞融合至80%时进行消化传代。取第3代细胞,当细胞融合至50%~60%时加入矿化诱导液(10nmol/L地塞米松,10

mmol/Lβ-甘油磷酸钠,50mg/L维生素C),诱导MSCs向成骨样细胞分化,进行碱性磷酸酶(ALP)染色,并对形成的矿化结节进行检测。1.2.2 牙槽骨损伤的修复

1.2.2.1 MSCs与支架的联合培养 取矿化诱导5

d的MSCs,胰酶消化,1500r/min离心5min收集

细胞,将细胞浓度调整至2×106

/mL制成细胞悬

液,将无菌的支架材料放入培养液中浸泡2h,吸取

大部分培养液,每个支架加50μL细胞悬液,37℃孵育2h,再加另一面,37℃孵育2h,加培养液,以后每3d换液,培养6d

。1.2.2.2 牙槽骨缺损动物模型的建立及支架材料

的植入 选健康的成年杂种犬3只(雄性,体重12~15kg),5%戊巴比妥(0.5ml/kg)静脉注射麻醉,侧卧位,消毒犬口腔,用外科手术刀沿876︱678龈缘作一角型切口,用剥离子进行剥离,暴露牙槽骨骨面,在876︱678根分歧处制备长、宽、深均为3mm的牙槽骨缺损模型。实验分为2组。左侧为实验组,缺损处植入HA-TCP-MSCs复合物;右侧为对照组,缺损处植入无细胞HA-TCP。1.2.2.3 组织学观察 术后8周处死成年犬,取出整个下颌骨,4%多聚甲醛固定,EDTA脱钙,浸蜡、透明、石蜡包埋、切片,进行HE染色,光镜下观察。用C-Imaging System software进行图像分析,测定新生骨占缺损的百分比和剩余支架材料占缺损的百分比。统计学分析采用Pooled的t检验和秩和检验。

2 实验结果

2.1 ALP染色 MSCs用矿化诱导液培养10d,ALP表达阳性,

见图1。2.2 钙化结节的检测 MSCs用矿化诱导液培养

11~14d,可见细胞复层生长,局部增厚,细胞集落中心出现不透光的沉积物,随培养时间增加出现肉眼可见的结节,茜素红染色见沉积物被染成深红色斑块,苏木素将核染成紫色,为钙盐特征性染色,见图2。

2.3 组织学观察 实验组见新生骨组织从边缘与

中心两个方向长入,新生组织边缘不齐,周围纤维结缔组织与新生骨骨髓腔相通,新生骨与原牙槽骨之间界线非常明显,局部有未降解的HA-TCP,骨细胞体积较大,骨板排列规则,形成同心圆状的哈弗系统,有大量血管生成,见图3。对照组新生骨组织量

01Journal of Oral Science 

Research,Jan.2012,Vol.28,No.1 

少,骨板排列不规则,未形成哈弗系统,见图4。2.4 统计学分析 2组新生骨占缺损的百分比比较运用Pooled的t检验方法,P<0.01,差异有统计学意义,可以认为2组的新生骨占缺损的百分比不同,实验组大于对照组。2组剩余支架材料占缺损的百分比,运用Wilcoxon秩和检验,P<0.05,差异有统计学意义,可以认为2组剩余材料占缺损的百分比不同,实验组小于对照组。

表1 实验组与对照组新生骨及材料占缺损的百分比比较

Table 1 The percentage of new bone and residual material of testgroup compared with these of control group

分析指标DF t值∶Z值P值

新生骨百分比14 5.09*0.0002

材料百分比 14-2.3630#0.0181

3 讨论

骨组织工程的基本方法是将体外培养的高浓度的成骨细胞扩增后吸附于一种生物相容性好、并可被人体逐渐降解吸收的细胞外基质上,使细胞在预成形的三维支架中生长,然后将这种细胞生物材料复合体移植入体内病损部位,在生物支架降解的过程中,种植的成骨细胞继续增殖并分泌骨基质,最终形成新的具有原来特殊形态和一定功能的骨组织。骨组织工程3个关键因素是种子细胞、支架材料以及有助于细胞生长、分化的培养条件。

3.1 种子细胞 骨组织工程应用的成体干细胞主要是MSCs,它具有强的增殖能力和多向分化潜能,可以分化为成骨细胞、软骨细胞及脂肪细胞等[1,2],是组织工程中理想的种子细胞。本实验采用Per-coll密度梯度离心法和反复贴壁筛选法相结合[3],所获得的MSCs形态均一,增殖速度快,生长性状稳定,且操作简便,成本低。本实验组织学结果显示实验组新生骨组织骨细胞体积较大,骨板排列规则,形成同心圆状的哈弗系统。同对照组比较可见,经MSCs介导的HA-TCP修复牙槽骨缺损生成的新生骨组织在组织学形态上更接近正常骨。另外,本实验应用图像分析系统对样本新生骨组织进行图像分析,实验组新生骨占缺损面积的百分比大于对照组(P<0.01),说明2组新生骨的生成速率不同,实验组新骨形成速度快,且新生骨量大于HA-TCP组。

3.2 支架材料 理想的支架材料应具有三维立体多孔结构、良好的生物相容性、表面活性、可塑性及骨传导性;且材料的降解速率应与骨组织的修复速率相适应[4]。HA是骨骼的主要成份,多孔HA具有均匀的孔径分布和较大的表面积,为细胞生长、组织再生及血管化提供条件,但其力学性能差,脆性大,抗弯强度低,生理环境中的抗疲劳与抗破坏强度不高[5,6],且在体内的降解速率较慢。HA-TCP是HA和TCP复合构建的双相陶瓷,它既保留了HA的优点,同时TCP提高了材料在体内的降解速率,增强了引导骨组织长入的能力,是较为理想的骨替代材料。本实验显示实验组的剩余材料量小于对照组,说明HA-TCP-MSCs和HA-TCP的降解速率不同,HA-TCP-MSCs降解速率与牙槽骨组织形成的速率更相适应。由此可见,本实验证实以MSCs为种子细胞,将其与支架材料复合,有助于提高牙槽骨修复的效果[7],并为寻找理想的骨组织修复方法提供了新的途径。

参考文献

[1] Delome B,Chateauvieux S,Charbord P.The concept of mes-enchymal stem cells[J].Regen Med,2006,1(4)∶497-509[2] Jackson L,Jones DR,Scotting P,et al.Adult mesenchymalstem cells:differentiation potential and therapeutic applica-

tions[J].J Postgrad Med,2007,53(2)∶121-127

[3] 王爽,姜凌云,李艳萍,牛玉梅.犬骨髓间充质干细胞分离培养及鉴定[J].解剖科学进展,2009,15(1)∶37-39

[4] Kim BS,Mooney DJ.Development of biocompatible syntheticextracellular matrices for tissure engineering[J].Trends Bio-

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[5] 李世普,编著.生物医用材料导论[M].武汉:武汉工业大学出版社,2000,214-221

[6] Villacampa AI,Garci a-Ruiz JM.Synthesis of a newhydroxyapatite Silicacomposite material[J].Journal of Crys-

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[7] 谭丽思,林晓萍,刘尧,魏巍.组织工程骨促进犬牙槽骨再生的体内研究[J].口腔医学研究,2010,26(2)∶183-186

[收稿日期:2011-03-17](本文编辑 汪喻忠)

 口腔医学研究2012年1月第28卷第1期