水稻愈伤组织转化
一、实验目的
1.掌握植物组织培养的基本原理；
2.学习水稻愈伤组织的诱导方法；
3.学习农杆菌转化法的原理，掌握农杆菌转化水稻愈伤组织的方法；
4.学习转基因植株的各种鉴定方法（包括PCR检测、GUS染色、Southern-blot、Western-blot、FISH
等），同时能够操作PCR与GUS染色鉴定的方法。
二、实验原理
1.植物组织培养
植物组织培养（plant tissue culture）是指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体和花药等，在人工控制的培养基上培养，使其生长、分化以及形成完整植株的技
术。自1902年Haberlandt 首先用紫鸭跖草( Tradescantia )的叶片栅栏组织进行培养来，植物组织培养已有100余年历史。用于离体培养的各种植物材料称为外植体（explant）。根据外植体的类
型，又可将组织培养分为：器官培养、组织培养、胚胎培养、细胞培养以及原生质体培养等。（从这个角度讲，本学期的实验属于胚胎培养。）植物组织培养的理论基础是植物细胞全能性。
2.基因工程
基因工程技术是在离体条件下对不同生物的遗传物质(DNA)进行人为“加工”，并按照人们的意愿重新组合，以改变生物的性状和功能，然后再通过适当的载体将重组DNA转入生物体或细胞
内，并使其在生物体内或细胞中表达，从而获得新的生物机能。这种利用基因工程技术获得的植
物一般称为“基因工程植物”。自1983年首次获得转基因植物以来，转基因技术发展十分迅速，
成功进行转基因的植物已达60多种，在世界上批准进入田间试验的转基因植物已超过500例，有些转基因产品已进入市场。通过基因工程改良作物品种在未来的农业生产中日益显示出巨大潜力。
3.农杆菌转化法
转基因的方法有很多，对于植物而言，最常用的是农杆菌转化法和基因枪法。农杆菌转化法使用的是根癌农杆菌，其内含Ti质粒：
T-DNA（Transferre DNA）区：农杆菌Ti 质粒中向植物中转移并整合进植物基因组中的部分。
T-DNA区大小为10-30Kb，左右边界高度保守，为25bp正向重复序列。根癌农杆菌进行转化时，只识别左右边界（尤其是右边界在转化时最为重要），而T-DNA区内为什么基因则不影响转化。因此我们可以通过基因工程改造T-DNA区，转化目的基因。
毒性蛋白（Virulence）区：越20Kb，包括A、B、C、D、E、F、G等基因区，有些基因区含多个基因，形成操纵子结构。毒性蛋白区在侵染植物细胞的过程中起重要作用。
4.农杆菌转化过程：
1)植物受伤部位酚类化合物的分泌；
2)附着（染色体毒性基因ChvA、ChvB）；
3)VirA/G的双元系统感受受伤信号；
4)其他 Vir基因的表达；
5)T-DNA链的切出（VirD1+VirD2）；
6)T-complex（T复合体）的形成；
7)运输（从细菌中输出、进入植物细胞、入核）；
8)整合。
植物受伤后的分泌物中含有酚类物质，这些酚类物质可以被农杆菌感知，借助于趋化性迁移至植物受伤部位，在ChvA、ChvB的帮助下，附着到受伤部位。【因此在人工进行农杆菌侵染时，需要加入乙酰丁香酮（AS）吸引农杆菌，乙酰丁香酮即起到和植物受伤后分泌的酚类物质相同的作用。】VirA识别植物受伤后分泌的酚类物质信号，进行自磷酸化，进而将磷酸化信号传VirG——这是典型的细菌双元信号传导系统。VirG磷酸化后被活化，作为转录因子启动或增强各毒性蛋
白的表达。VirD2在 D1的帮助下识别T-DNA区25bp的边界序列，利用核酸外切酶的在第3、4碱基之间形成缺刻；VirD2的Tyr29与缺刻的5 ’端共价结合，DNA新链合成时便生成一条T-DNA单链，这条单链与VirD2和VirE2 结合形成T-complex。T-complex通过细菌细胞壁上由11个VirB 蛋白和VirD4组成的通道从农杆菌进入植物细胞。此外，VirD2含有NLS（核定位序列），能够引
导T-complex进入细胞核，并帮助T-DNA插入植物染色体中。VirE2是非特异DNA结合蛋白，包裹T-DNA单链，使DNA由随机卷曲状态转变为规则螺旋，这种形状使T-complex 容易穿过核孔。此
外，VirE2将T-DNA包裹，还可避免T-DNA从细菌向植物转移过程中被降解。VirE2可在植物细胞膜上形成通道，使T-complex进入植物细胞；VirE2虽不含NLS序列，但亦可促进T-complex向核定向转运。
5.Ti质粒的改造：
Ti质粒只有被解甲之后才能被应用于转基因实验中。所谓解甲，是指去除对转基因有不良影响的基因，如生长素、细胞分裂素合成基因等。现使用的工程菌株均使用双元载体。双元载体由
存在于工程菌株中的大质粒和方便体外操作的小质粒组成。大质粒包含Vir区，负责侵染植物细胞、帮助T-complex转运等；小质粒约十几Kb，方便体外操作，包含T-DNA区、筛选标记等。实际应
用时，将目的基因插入T-DNA区即可。
三、实验用品
1、实验仪器：镊子、灭菌滤纸、移液器、平皿、离心管、离心机、三角瓶、EP管、摇床、分光光度
计、超净工作台等；
2、实验材料：日本晴水稻种子、 EHA105农杆菌；
3、实验试剂
1)0.1% 升汞，无菌水等
2)抗生素：利福平（Rif）、卡那霉素（Kan）、头孢霉素（Cef）、潮霉素（Hyg）
3)培养基：
①N6培养基：
大量元素母液（50×）g/L
KNO3141.5
MgSO4·7H2O 9.25
KH2PO420
（NH4）2SO423.15
微量元素母液（1000×） Mg/250mL KI 200 H 3BO 3 400 MnSO 4·4H 2O （MnSO 4·H 2O ） 1100 （834） ZnSO 4·7H 2O
0.375
钙盐母液（200×） g/250mL CaCl 2·2H 2O （无水CaCl 2）
8.3 （6.27）
铁盐母液（200×） g/250mL EDTA 加热溶解，FeSO 4常温溶解后倒入EDTA 中混匀，加热至60-70度，冷却备用。
FeSO 4·7H 2O 1.39 Na 2EDTA·H 2O
1.865
维生素母液（1000×） Mg/250mL 烟酸
125 盐酸吡哆醇（VB 6） 125 盐酸硫胺素（VB 1） 250 甘氨酸
250
肌醇
5g 定容至250mL ，浓度为200×（终浓度100mg/L ）
附加有机成分 mg/L
水解酪蛋白 500 配培养基之前加入
谷氨酰胺 500 脯氨酸 500 蔗糖
30g/L
激素（根据不同培养基区别添加）mg/L
2,4-D母液 2 70%终体积的酒精溶解，水定容NAA 0.5 无水乙醇溶解，水定容
6BA 3 1M KOH溶解，水定容
②YEP培养基
蛋白胨酵母粉NaCl
10g/L 10g/L 5g/L
③侵染培养基：N6D2（N6加2mg/L 2,4-D）液体培养基+AS（100μM）
④共培养培养基：N6D2+AS（100μM）固体培养基
⑤筛选培养基1（初次筛选）：N6D2+Cef（600mg/L）+Hyg（25mg/L）固体培养基
⑥筛选培养基2（二次筛选）：N6D2+Cef（300mg/L）+Hyg（50mg/L）固体培养基
⑦分化培养基：N6+6-BA+NAA+Cef（300mg/L）+Hyg（50mg/L）固体培养基
四、实验步骤
（一）水稻愈伤组织的诱导：
，无菌水冲洗3-5次，每次
1.水稻种子去壳，0.1%升汞消毒15-20min（或4%次氯酸钠30min）
10min，不断摇晃；
2.滤纸吸干水分，将种子置于N6D2固体培养基上25℃暗培养诱导愈伤组织；一周时去除长
出的芽；
3.愈伤组织长至较大时（约2周）继代，培养至7天用于转化。
（二）农杆菌活化
4.早上取甘油保存的农杆菌，加至3-5 ml YEP液体培养基中（含利福平R if25mg/l 和卡
那霉素K an 50mg/l），28℃培养至晚上；
5.农杆菌培养物，按200至500倍左右稀释，加入不含抗生素的Y EP 液体中，28℃过夜培养；
6.测量O D600，培养至0.5左右；
（三）农杆菌浸染及共培养
7.将农杆菌培养物转移至灭菌离心管中，管壁标记液面位置，离心收集菌体；
8.弃上清，倒置离心管，流尽剩余的Y EP；
9.加入含100μM乙酰丁香酮（AS）的N6D2 液体培养基至标记位置，彻底重悬菌体（可先
加入少量N6D2，重悬后将剩余的加入）；
10.静置2h，期间收集待转化愈伤组织；
11.将愈伤组织加入农杆菌悬液中，晃匀，静置30 min；
12.倒掉多余液体，愈伤组织转到灭菌滤纸上，超净台吹15～20 min；
13.将愈伤组织转到含100μM乙酰丁香酮N6D2固体培养基上，培养基上垫一层灭菌滤纸；
14.黑暗中25℃度共培养3天；
（四）筛选
15.用含300mg/L 头孢霉素的无菌水冲洗愈伤组织3-5 次，每次10min，不断摇晃；洗至液
体澄清（约需4-5次）；
愈伤组织转到含600 mg/l 头孢霉素C ef 和25 mg/l潮霉素
16.用灭菌滤纸吸干多余水份，
Hyg 的N6D2 固体培养基（筛选培养基Ⅰ）上，筛选2周（可缩短至10天），期间注意
去除有农杆菌增殖的愈伤组织块；
17.愈伤组织转到含300 mg/l头孢霉素（Cef）和50 mg/l 潮霉素（Hyg）的N6D2固体培养基
（筛选培养基Ⅱ）上，筛选2周；
（五）植株再生
18.将筛选获得的H yg 抗性愈伤组织转移到含3mg/l 6-BA 和0.5 mg/l NAA 的N6 培养基
（不含2,4-D）,25°C 光照培养，诱导植株再生。经2-3 周后，愈伤组织可出现绿点或小
植株（小植株只是s hoot）；
（以下步骤未进行）
19.将含绿点或小植株的愈伤组织转移到生根培养基（1/2 MS大量元素和微量元素，1/2 N6
维生素，10 g/l蔗糖），培养植株长大并诱导生根；
20.2-4 周后，将茁壮的再生植株移出，室内水培壮苗2-3 天后，移栽至土中，苗期水刚
好没过土即可。
（六）鉴定
21.GUS染色：在生长状态良好的克隆上夹取少量愈伤组织，放入EP管中，加入少量X-Gluc染
液至没过材料，37℃过夜染色；
（以下步骤未进行）
22.PCR检测：过程略。
五、实验结果
1.愈伤组织诱导
2.二次筛选平板（色泽浅而鲜艳的愈伤为阳性）。从二次筛选的结果看，转化率在60%左右。这
些克隆在后续实验中大多可以继续生长愈伤，但随机选取4个克隆进行GUS染色均为阴性。
实际的转化率，应小于二次筛选的统计。
3.愈伤组织的再分化（已可见绿点，是再分化的标志，会长成芽）
4.GUS染色鉴定（有愈伤组织被染成蓝色，证明是阳性克隆）
六、结果分析及总结
总体来说，整个实验下来，我们基本掌握了水稻组织培养、转基因及鉴定的方法。整个过程是曲折的，我们走了很多弯路。或许一学期刚刚做到再生植株是挺慢的，但整个实验在徐老师的指导下，都是由我们自己独立完成的，得与失都是我们实验的经历——这些远比最后的结果更有价值。
首先，无菌意识是我在整个试验中时刻不敢松懈的。组培的前提是无菌操作，它保证了整个实验的顺利进行。在第一次诱导愈伤的时候，大家的污染情况十分严重，有的组甚至是全军覆没。但是到了实验后期，材料染菌的情况就只是零星出现了，这使我们大家都十分欣喜。
第二是培养基的问题。培养基也是组培的基础，但是它的问题有时是不容易确定的。在1L培养基中多加或是少加了1g蔗糖，究竟有没有影响？是好还是坏的影响？我也无法回答。但是我们不能存有侥幸心理，而必须严格每一步的操作。不仅是试剂的称量，也包括试剂的溶解、添加的顺序、pH的调节等问题。当一批材料出现普遍性的问题时，我们就需要考虑培养基的问题，是需要改良培养基还是培养基在配置中出现问题。这个实验中的N6培养基是早已被验证过的，我们第一批材料愈伤诱导率低，应该是培养基配的不够好。在更换商业化的N6粉末后，问题得到了显著改善。
第三点，我认为应该重视实验材料。只有对实验材料的认识足够清晰，才能有针对性的做好每一步实验。一开始种子的选择，要选取饱满的种子，剥壳时注意不要损伤到胚。在之后多次培养中，要清楚是光下培养还是暗培养。培养温度也是重要的条件，温度的小幅度变化可能不会决定实验的成败，但会
影响实验的时间及材料的生长状况。在几次筛选时，要能够判断材料的状态，认清哪些是生长状态良好
的、哪些是阳性，当然这需要大量的经验积累。
实验技术和清楚实验目的当然是实验成功的关键，但我认为更重要的还在于实验的态度。就态度而言，我想我们每个人都在改善，但也都还做得不够。最简单的，大家频繁地到实验室观察材料的状态，就能够随时发现情况，及时解决。有染菌的可以及时处理，有长好的可以及时继代或转移，整个实验进度变会大大加快，实验结果也会更加理想。在活化农杆菌的一步中，我也深自责于没有赶去及提醒同学摇菌时间，导致菌浓度超过了最佳值，幸无碍于实验。
最后一步，植株再生我们做的并不理想，两周的时间，只有1块克隆（全班共2块）出现了绿色，由于时间关系惜已不能再次继代，无法判断是否是培养基的问题。在稍早一点的GUS染色检测中也出现了难以解释的戏剧性情况：37℃过夜染色后全班抽选的十几个克隆均未染色。大家对此结果很失望，我把所有装有染色材料的EP管都捧回宿舍，丢进抽屉里，以备不时之用。然而就在几天前，我无意间拉开抽屉，惊奇地发现竟然有几个EP管中的材料被染成了蓝色！染色的结果，或许可以说明是阳性克隆，但如此长时间后才出现结果，却是难以解释的。分析可能的原因，一是染液的问题导致染色时间大大延长；二是选取的愈伤组织较致密，染色时没有抽真空，导致染液在几天后才进入内部，而恰恰是内部的较成熟的愈伤才表达了GUS基因。
最后的最后，要感谢徐老师一学期来耐心的指导和精彩的讲解。徐老师为我们讲解了许多有用的实验知识，使我们受益匪浅。除了专业知识，徐老师还在方方面面帮助我们，相信每个同学都已把徐老师当做好朋友看待。还要感谢冯老师一学期来为我们所做的帮助和指导。冯老师不辞辛劳，为我们的实验做的充分的准备，是我们实验成功的保障。以及感谢同组的吕菲、王依婷、王明星和班里的每一位同学，一学期来我们共同完成实验，互相学习，互相进步。行文于斯，所感千言，不得尽述！
绿色水稻种植技术操作规程 为确保生产出绿色食品优质大米，特制定此技术规程。对水稻生产基地的规管理和技术指导，严格控制各种污染。 一、水稻栽培管理 （一）育秧 1、品种选择 选择适宜地区的优质高产新品种，不带病菌、虫源、无破粒、无秕粒、优质高产新品种。 经两年实验示，选出绥粳4，龙洋16，180，旱香74，旱香52等优质品种。这些品种抗病性强、生产性好、米质优良（一级米）、适口性好。 2、种子处理 晒种 3月25日——3月30日，室外晒种1—2天，增加种子活力。 盐水浸种，浸种4—5天后捞出控干进行催芽，有50%种子露白后方可播种。
3、营养床土配制 根据当地条件选用疏松、肥沃、富含有机质、偏酸、无草籽的腐殖土或旱田土，风干过筛，最好加15-20%草碳土，按照每平方米苗床需要20kg原土，加入适量75%浓硫酸使PH值达到5-6.0，制成营养土。 4、秧床整理 选取无盐碱、土地肥沃、平坦的壤土为育秧地块， 田要泡透使土质松软。秧床设置宽1.5米、长15米，秧沟宽30厘米，将秧床精细整理，达到平整一致，无作物根茬、杂草。 5、播种 4月5日——4月12日，首先在浇透水的置床上铺有孔地膜或软盘，然后铺撒3cm厚的营养土，刮平，浇透水，盘育苗每盘播70克左右，合理密植，稀播育壮秧。 6、秧田管理 温度管理 出苗前密封保温，棚温控制在30℃左右，苗出齐后及时撤去地膜。2叶1心时，温度控制在20—25℃左右，低温大床苗，严防高温烧苗和徒长。降温主要靠通风大小来调节。 水分管理
6、整地 11月上旬，水稻机收后，秸秆全部还田深翻，亩秸秆还田量在600公斤以上。 按照绿色食品优质米要求，四月下旬在耙地时施用em 菌发酵好的农家肥2吨/亩，施底肥磷酸二胺5公斤/亩，农家肥要施均匀，可以增加土壤有机质含量，改进土壤理化性状。 一次性深施，这样不仅节省施肥次数，而且有利于提高有效分蘖率和有效穗数及穗大粒饱，减少垩白率，提高稻米品质。 4月25日——5月1日泡田。 耙地 春季耙地以旱耙为主，泡田后水耙找平为辅，水耙地以寸水不露泥为准。 （二）插秧 5月9日——5月28日，当气温稳定在13℃时，就可开始插秧，插前3—5天整好地耙细耙平，寸水不露泥，沉淀适宜时，就可以插秧，插秧时要保证插秧质量，浅插，插秧
野外试验方案-CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN
试验方案 一、试验目的 近年来，有关利用合理的水稻种植模式，尤其是水稻品种间栽或混作来增加稻田的生物多样性，从而控制水稻病虫害的研究报道不断增多，这方面的研究已成为国内外的一个热点，本次实验就是为了探究增加稻田生物多样性对害虫飞虱的影响，通过观察稻田生物多样性对飞虱繁殖力、抗药性、致害型、天敌数量、对水稻病虫害的等影响，从而去研究其中的相关影响机制。以期能减少化学农药的施用，减少环境污染，更好地去发展生态农业。 二、试验材料 由广东田联种业有限公司提供水稻种子，选取以下两种： 植优523：感温型三系杂交稻组合。早造平均全生育期130～132天。科高～106.3厘米，株型中散，分蘖力中强，穗大粒多。中抗稻瘟病，全群抗性频率%～%，对中B群、中C群的抗性频率分别为%～75%和85%～%；中抗白叶枯病（IV型菌3级、V型菌7级）。丰产性较好，中抗稻瘟病和白叶枯病，耐寒性中弱。 特优816：感温型三系杂交稻组合。早造平均全生育期131～132天。科高～115.6厘米，植株较高，株型中集，分蘖力和抗倒力中弱，剑叶较宽、长，穗大粒多，后期熟色好。高抗稻瘟病，全群抗性频率%，对中C群、中B群的抗性频率分别为%和%，田间监测结果表现抗叶瘟、高抗穗瘟；感白叶枯病，对C4菌群、C5菌群分别表现感和中感。 田间均无抗飞虱抗性表现。 三、试验设计 试验设三个处理，分别为A：单作植优523、B：单作特优816、混作植优523和特优816，其比例A：B=5：1设三次重复，每小区面积200 m2，总面积大概3亩左右。如下图所示
水稻转基因实验操作方法步骤 一、水稻愈伤组织的诱导 （一）以水稻幼胚为试材诱导愈伤组织 1．消毒： 取水稻未成熟种子（灌浆期），按以下步骤消毒： 1）用自来水冲洗种子，去掉浮起的瘪谷； 2）将种子放入250ml无菌烧杯中(种子数量约占1/3体积)，用200ml 70%酒精消毒2分钟；（在操净工作台上进行无菌操作） 3）加入250ml 25%次氯酸钠（NaClO）溶液，同时加数滴吐温-20，浸泡90分钟； 4）倒去NaClO溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍。 2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作） 1）用镊子夹住种子，在无菌滤纸上用钢钩挤出幼胚，置入诱导培养基中； 2）操作完毕后封好培养皿(一般保鲜膜)，在暗处适温下（25-28℃）培养5天； 3）继代培养。用镊子剥下胚性愈伤组织（去掉芽及膜状物），置入继代培养基中（凸起面向上），暗处适温下（25-28℃）培养3天。 （二）以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织 1．消毒： 取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒：1）将适量种子放入10ml离心管中（100颗左右），倒入75%酒精消毒2分钟； 2）倒去酒精，加入一定量的0.1%升汞溶液，浸泡10分钟； 3) 倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子5-6遍，最后一遍浸泡30分钟。 2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作） 1）种子放在无菌滤纸上吸干，置入成就胚诱导培养基中，每皿12－14颗； 2）操作完毕用封口膜（Micropore TM Surgical Tape）封好培养皿，在28℃光照培养箱，暗培养培养3周； 3）在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然分裂的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状，去除种子和芽），置入继代培养基中，在28℃光照培养箱，继代培养1周 （2周愈伤组织更为松散）。（如不马上用，需转移至暗处，于22℃继续培养1周）
溶液配制 1、纤维素酶解液：
2、PEG4000溶液（一次配置可以保存五天，但是最好现用现配，每个样品需100μl PEG4000溶液，可根据实验样品量调整溶液配置总量）
3、W5 溶液 4、MM G溶液
5、WI溶液 拟南芥原生质体制备转化方法整理 一、土培室播种种植的拟南芥。 二、生长良好情况下在未开花前用于取材叶片制备原生质体。 三、剪取中部生长良好的叶片用刀片切成0.5 -1 mm宽的叶条。 四、将切好叶条掷入预先配置好的酶解液中（每5-10 ml酶解液大约需10-20片叶子）。并用镊子帮助使叶子完全浸入酶解液。
五、用真空泵于黑暗中抽30分钟。（此时可配制PEG4000溶液，200和1000 ul 枪头去尖使操作时吸打缓和。） 六、在室温中无须摇动继续黑暗条件下酶解至少3个小时。当酶解液变绿时轻轻摇晃培养皿促使原生质体释放出来。（此时预冷一定量W5溶液） 七、显微镜下检查溶液中的原生质体，拟南芥叶肉原生质体大小大约30-50 um。 八、在过滤除去未溶解的叶片前用等量的W5溶液稀释含有原生质体的酶液。 九、先用W5溶液润湿35-75 um的尼龙膜或60-100目筛子，然后用它过滤含有原生质体的酶解液。 十、用30毫升的圆底离心管100g，1-2分钟离心沉淀原生质体。尽量去除上清然后用10ml 冰上预冷的W5溶液轻柔重悬原生质体。 十一、在冰上静至原生质体30分钟。 以下操作在室温23℃下进行
十二、100g离心八至十分钟使原生质体沉淀在管底。在不碰触原生质体沉淀的情况下尽量去除W5溶液。然后用适量MMG溶液（1m）重悬原生质体，使之最终浓度在2X105个/ml。 十三、加入10 ul DNA（10-20微克约5-10kb的质粒DNA）至2ml离心管中。 十四、加入100 ul原生质体（2x104个），轻柔混合。 十五、加入110 ul PEG溶液，轻柔拍打离心管完全混合（每次大约可以转化6-10个样品）。 十六、诱导转化混合物5-15分钟（转化时间视实验情况而定，要表达量更高也许需要更高转化时间）。 十七、室温下用400-440 ul W5溶液稀释转化混合液，然后轻柔颠倒摇动离心管使之混合完好以终止转化反应。 十八、室温下用台式离心机100g离心2分钟然后去除上清。再加入1ml W5溶液悬浮清洗一次，100g离心两分钟去上清。
水稻种植管理技术方法介绍 一、节水灌溉技术 水稻遇到阶段性低温，又遇绵绵细雨。花粉吸水容易破裂，空壳增加，9月上旬若出现早霜，使水稻不能正常灌浆、乳熟。风速过大时，造成水稻器官直接损害而增加了空秕粒，直接影响了水稻的结实率，造成减产。 1.选择优良抗逆性强的品种，培育壮秧，增施硅肥，增加叶片韧度，促进根系发育，防止叶片下垂，减轻遮敝，创造良好的受光环境。提高抗逆性。 2.在水稻抽穗期，注意天气变化。当气温低于17℃时，要加深水层15～17厘米，以水保温，气温回升后恢复原水层，以利水稻正常成熟。 3.在不影响产量的情况下，适当减少氮肥的施用量，增施钾肥，从促花肥开始，每一个叶龄同期施一次，可以增强稻株吸收钾肥的能力，减少副作用，穗大增粒重。提高水稻产量。 三、适期收获 收获时期的早晚，将直接影响稻米外观品质，食味品质和产量。收获过早，籽粒尚未充分成熟，秕粒、青粒多，出米率低，米质差;收获过晚。籽粒养分倒流，产量降低，易受早霜危害，茎秆倒伏，稻壳厚，米质发暗无光泽等，造成直接经济损失。因此不能适时收获对产量的影响是很大的。当穗轴上下干黄，穗上部三分之二的枝梗变黄.穗下部的谷粒定型变硬时是最佳的收获期。 防治稻曲病，一般应在水稻破口前1周左右施药。据江苏省农科院等单位多年前的试验研究，用井冈霉素防治稻曲病，在水稻破口前1周左右用药效果最好，到破口期再施药，几乎没有防治效果。从近年试验示范和大面积生产用药情况看，适用于防治稻曲病的苯
甲·丙环唑、戊唑醇等唑类杀菌剂，铜高尚碱式硫酸铜、琥胶肥酸铜等铜制剂以及咪鲜胺等药剂，在水稻抽穗期使用，对稻曲病也有一定的防效。水稻破口前1周没有用药防治稻曲病的田块，可以考虑在抽穗期因地制宜地选用上述药剂防治稻曲病。 避开高温对水稻结实的影响，要适期播种，避开炎热高温。将一季中稻的最佳抽穗扬花期安排在8月中旬，有效地避开7月下旬~8月上旬存在的常发性高温伏旱天气。合理筛选应用抗高温力较强的品种，调整水稻后期追肥，提高施肥中磷钾比例。当水稻处于抽穗扬花等高温敏感时期，如35℃以上高温天气有可能形成热害时，可以在田间灌深水，根外喷施3%的过磷酸钙或0.2%磷酸二氢钾溶液，增加稻株对高温的抗性，减轻高温伤害。如已遇高温，则加强受灾田块的后期管理，首先坚持浅水湿润灌溉。防止夹秋旱使灾害进一步加剧，后期切忌断水过早，以收获前7~10天断水为宜，其次加强病虫害的防治。另外，还可蓄养再生稻。根据不同的受灾程度，因地制宜蓄养再生稻是一种有效的补救措施。 看了“水稻种植管理技术方法介绍”的人还看了：
年广西水稻品种实验实施方案 广西区种子管理局 广西农科院水稻研究所 一、实验目的 为了鉴定评价新选育的水稻品种(组合，下同)在我区的丰产性、稳产性、适应性、抗逆性、品质及其它重要特征特性表现，为我区品种审定、推荐参加全国南方区试等提供科学依据，根据《广西壮族自治区农作物品种管理实施办法》有关规定，特制定年广西水稻品种区域实验、生产实验和预备实验实施方案。 二、参试品种 （一）区域实验和生产实验 年开展早稻桂中、桂北早熟组(以金优和株两优为对照)、中熟组(以优和五丰优为对照)、桂南迟熟组(以特优为对照)、常规优质稻组(以柳沙油占为对照)；晚稻设桂中、桂北中熟组(以优和五丰优为对照)、桂中中迟熟组(以天优华占为对照)、桂南感光组(以博优为对照)；高寒山区一季中稻组(以中浙优号为对照)； （二）预备(筛选)实验 开展早稻桂中、桂北早熟组(以株两优为对照)、中熟组(以五丰优为对照)、桂南迟熟组(以特优为对照)；晚稻设桂中、桂北中迟熟组(以天优华占为对照)、桂南感光组(以博优为对照)、常规优质稻组(以柳沙油占为对照)； 各熟组参试品种安排详见附件表～、表～。附件上没有参试品种安排的，请不要寄种子，否则当废种处理。 实验方案在“广西种业信息网()”上公布，不再印发。 三、供试种子要求 年所有参试品种(包括对照品种)在实验过程中实行实验编号管理，要求供种单位统一把参试品种的种子提供给广西农科院水稻所，进行编号后再分发到各承试点(包括抗性鉴定点)。分组编号情况报广西区种子管理局备案，对实验点和供种单位一概保密。各实验点不需再重新编号，以免发生错误。 (一)供种量 区域实验公斤个，生产实验早稻中熟组、晚稻中熟组和中迟熟组公斤个，其它熟组公斤个，预备(筛选)实验公斤个。
水稻愈伤组织转化 一、实验目的 1.掌握植物组织培养的基本原理； 2.学习水稻愈伤组织的诱导方法； 3.学习农杆菌转化法的原理，掌握农杆菌转化水稻愈伤组织的方法； 4.学习转基因植株的各种鉴定方法（包括PCR检测、GUS染色、Southern-blot、Western-blot、FISH 等），同时能够操作PCR与GUS染色鉴定的方法。 二、实验原理 1.植物组织培养 植物组织培养（plant tissue culture）是指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体和花药等，在人工控制的培养基上培养，使其生长、分化以及形成完整植株的技 术。自1902年Haberlandt 首先用紫鸭跖草( Tradescantia )的叶片栅栏组织进行培养来，植物组织培养已有100余年历史。用于离体培养的各种植物材料称为外植体（explant）。根据外植体的类 型，又可将组织培养分为：器官培养、组织培养、胚胎培养、细胞培养以及原生质体培养等。（从这个角度讲，本学期的实验属于胚胎培养。）植物组织培养的理论基础是植物细胞全能性。 2.基因工程 基因工程技术是在离体条件下对不同生物的遗传物质(DNA)进行人为“加工”，并按照人们的意愿重新组合，以改变生物的性状和功能，然后再通过适当的载体将重组DNA转入生物体或细胞 内，并使其在生物体内或细胞中表达，从而获得新的生物机能。这种利用基因工程技术获得的植 物一般称为“基因工程植物”。自1983年首次获得转基因植物以来，转基因技术发展十分迅速， 成功进行转基因的植物已达60多种，在世界上批准进入田间试验的转基因植物已超过500例，有些转基因产品已进入市场。通过基因工程改良作物品种在未来的农业生产中日益显示出巨大潜力。 3.农杆菌转化法 转基因的方法有很多，对于植物而言，最常用的是农杆菌转化法和基因枪法。农杆菌转化法使用的是根癌农杆菌，其内含Ti质粒：
1.影响原生质体数量和活力的因素 （1）细胞壁降解酶的种类和组合 不同植物种类或同一植物种的不同器官以及它们的培养细胞，由于它们的细胞壁结构组成不同，分解细胞壁所需的酶类也不同。例如，叶片及其培养细胞用纤维素酶和果胶酶，根尖细胞以果胶酶为主附加纤维素酶或粗制纤维素酶（Driselase酶），花粉母细胞和四分体期小孢子用蜗牛酶和胼胝质酶，成熟花粉用果胶酶和纤维素醇。 （2）渗造压稳定剂 用酶法降解细胞壁前，为防止原生质体的破坏，一般需先用高渗液处理细胞，使细胞处于微弱的质壁分离状态，有利于完整原生质体的释放。这种高渗液称为渗透压稳定剂。常用的滲透压稳定剂有甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、盐类（KCI、MgSO4.7H2O）等。在降解细胞壁时，渗透压稳定剂往往和酶制剂混合使用。滲透压稳定剂中，用得最多的是甘露醇，常用于烟草、胡萝ト、柑橘、蚕豆原生质体制备；蔗糖常用于烟草、月季等；山梨醇常用于油菜原生质体制备。滲透压稳定剂种类及浓度的选择应根据植物种类而异，例如胡萝ト用0.56mol ／L甘露醇，月季用14％蔗糖，柑橘用0.8mol／L甘露醇，蚕豆用0.7mol／L甘露醇，烟草的四分体用7％熊糖，烟草的成熟花粉用13％甘露醇。 （3）质膜稳定剂 质膜稳定剂可以增加完整原生质体数量、防止质膜破坏，促进原生质体胞壁再生和细胞分裂形成细胞团。如在分离烟草原生质体时，在酶液中加人入葡聚糖硫酸钾，一旦洗净确液进行培养，原生质体很快长壁并持续细胞分裂形成细胞团。而未加葡聚糖硫酸钾的对照，原生质体经一周培养即解体。常用的原生质膜稳定剂有葡聚糖硫酸钾、MES、氯化钙、磷酸二氢钾等。 （4）pH的影响 分离原生质体时，酶液的pH是值得注意的问题。因为降解酶的活力和细胞活力最适pH是不一致的低pH时（＜4.5），酶的活力强，原生质体分离速度快，但细胞活力差，破坏的细胞较多；pH偏高时，酶活力差，原生质体分离速度慢，完整的原生质体数目较多。分离原生质体时，酶液的pH因植物种类不同而有差异，如胡萝ト为5.5、月季为5.5～6.0、烟草为5.4～5.8、柑橘为5.6、蚕豆为5.6～5.7。 （5）温度影响 制备生质体时，一般在26土1℃条件下酶解。 （6）植物材料的生理状态 一般应选择植物体细胞分裂旺盛的部分进行取材。采用那些颗粒细小、疏松易碎的胚性愈伤组织和由其建立的胚性悬浮细胞系，更容易获得高质量的原生质体。要得到良好的供体材料，必要时应对材料进行预处理及预培养。 2.植物原生质体的纯化 材料经过一段时间的酶解后，需要将酶解混合物中破碎的原生质体、未去壁的细胞、细胞器及其他碎片去除出去。纯化原生质体的常用方法有过滤、离心、飘浮法，在实际操作中一般联合运用这三种方法。 1）过滤法用滤网过滤酶解混合物，滤去未被酶解的细胞、细胞团及组织块 2）离心法利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液中，先进行过滤然后低速离心，使纯净完整的原生质体沉积于离心管底部。 3）飘浮法采用比原生质体比重大的高渗溶液（如蔗糖、Ficoll溶液），使原生质体漂浮在溶液表面。
目录 第一章水稻生长特性及对环境的要求 (2) 水稻生产发育期对环境的要求 (2) 影响水稻根系生长的因素 (3) 第二章水稻种子处理及苗期管理 (4) 水稻种子处理技术 (4) 水稻苗期管理技术建议 (5) 水稻苗床管理的主要技术措施 (6) 怎样加强水稻苗期分蘖率 (6) 第三章水稻移栽、插秧管理 (7) 水稻插秧技术要求 (7) 水稻移栽标准 (9) 加强秧田中后期管理 (9) 水稻插秧后管理技术要点 (10) 第四章水稻施肥技术 (10) 水稻需肥规律与施肥技术 (11) 水稻各时期施肥量和施肥方法 (12) 水稻如何进行标准化施肥 (13) 水稻施肥四注意 (13) 第五章水稻水分管理 (14) 水稻全生育期如何管水 (14) 水稻生育期高产水管理 (15) “四期”控水巧灌杂交晚稻高产 (15) 对灌溉技术的要求 (16) 水稻涝灾的补救措施 (16) 晚稻后期重管水 (17) 第六章水稻高产管理 (17) 水稻栽后加强田管 (17) 怎样缩短稻秧移栽后的返青期 (18) 水稻中后期优质高产管理五措施 (18) 水稻生长后期高产栽培要点 (19) 水稻后期的田间管理 (20) 水稻抽穗结实期的田间管理 (21) 水稻倒伏防治 (22) 第七章水稻常见病害防治 (23)
第一章水稻生长特性及对环境的要求水稻生产发育期对环境的要求 在水稻上通常把种子萌发到水稻新的种子产生为水稻的一个生育周期，即生育期。生育期可分为幼苗期，返青期、分蘖期、长穗期（穗分化期），结实期。一般幼苗期在秧田已完成，移栽后缓苗成活的这段时间叫返青期，返青后就开始分蘖（有的在秧田已开始分蘖），就开始穗分化（拔节），在幼穗分化以前，是长根、茎、叶为主的为营养生长期，穗分化到成熟是长穗，花、籽粒等为主的生殖生长期。 一、幼苗期： 是种子萌发到三叶期这个阶段，一般又分为种子萌发阶段和幼苗生长阶段。 浸种发芽、发芽的需要温度是秈稻为12℃，梗稻为10℃，适温30℃—32℃，最高温度可达40℃—42℃，但是在育秧期间最低不能低于5℃，或0℃，在低温下会出现烂种、烂芽和烂秧。首先秧田要选择向阳、避风、水灌、排放等的田地块，如遇低温还可加盖薄膜等措施，避免少烂或不烂。 出苗及幼苗生长的温度比发芽高2℃，即秈稻14℃，梗稻12℃，16℃以上秈，梗都可顺利出苗。 二、返青期与分蘖对环境的要求： 返青期是移栽后，从秧田到本田成活的缓冲阶段太约在4天左右，要求即是浅水，因水太深，淹没了生长点（心叶），透气性不好，也会烂秧，或成活缓慢，返青后接着以分蘖为中心，生长根和叶片的营养生长期。 1、温度的要求：水稻分蘖最高适温为30~32℃，最适水温为32℃~34℃。最高气温38℃~40℃，最高水温为40℃~42℃，最低气温为15℃~16℃，最低水温16℃~17℃。水温在22℃以下分蘖就较缓慢。低温使分蘖延迟，且影响总分蘖的有效穗数，因此要求在15℃以上时开始插秧。 2、光照的要求：在分蘖期需要充足的阳光，以提高叶片的光合强度，制造有机物，促进增加分蘖数。在自然光照下，返青后3天就开始分蘖，若只50%自然光照时，返青13天才开始分蘖，若只有5%的自然光照，不但不产生分蘖，连秧苗也会死去。 3、水份的要求：分蘖期是对水最敏感的时期，但是只要求水田水饱和状态，或浅水最有利于分蘖，在高温条件下（26℃~36℃），土壤持水量在80%时会产生分蘖最多。如深水灌溉，水层超过田8厘米时，使分蘖节光照弱，氧气不足，温度又低的情况下，抑制分蘖。但是田过份干，持水量在70%以下时，也会停止分蘖。 4、营养要求：在分蘖需要营养多，有效分蘖也多。营养多可促分蘖和生长快而多。如果营养少、分蘖也少或停止。所需的营养中是以氮、磷、钾为主，特别是氮肥最需要。最好氮、磷、钾配合追肥最有利。 三、拔节孕穗期对外界条件的要求 拔节孕穗期是营养生长和生殖生长同时并进的时期，在这个时期水稻生长发育迅速增大，根群最大、稻株叶面积达到最大，同时稻穗开始分化，拔节孕穗是决定每穗粒数的关键时期，也是每亩有效穗数的巩固时期，及粒重的决定时期，主要因素在于外界条件影响。 1、养分要求：幼穗分化过程中，水根的根群不断增加，最后3片叶相继长出，营养生长和生殖生长都需要养份的时期，如果在这时期缺乏营养，对幼穗分化会产生不利的影响。所以在生产上要进行中耕追肥，约在抽穗前30~40天的时期，以促进颖花分化，2次枝梗数增加，这次肥也可称“促花肥”；在抽穗前10~20天可喷施肥一次，即是雌雄花芯形成期与
水稻愈伤组织的诱导 李希 北京科技大学化学与生物工程学院生物科学与技术系，北京，100083 摘要：以水稻种子为外植体，研究了外植体的消毒方法和接种技术，了解了水稻愈伤组织诱导的过 程。结果表明水稻种子接种在诱导培养基上两天已产生愈伤组织发芽2mm，四天愈伤组织呈现浅黄色发芽5-10mm，6天愈伤组织颜色加深发芽1-2cm，8天愈伤组织为橙黄色发芽2-3cm，无杂菌污染。 关键词：水稻种子外植体诱导愈伤组织 引言 自Niizeki和Oono1968年首次获得水稻花粉植株以来，水稻组织培养取得了很大的进展，如各种水稻品种愈伤组织的诱导、继代、植株再生培养基的筛选，遗传特性，基因工程转化体系的建立等等。水稻种子愈伤组织的诱导是这些研究的基础，因此掌握外植体的消毒方法和接种技术，了解了水稻愈伤组织诱导的过程至关重要。以植物器官、组织、细胞等作外植体进行离体培养时，在一定的诱导培养条件下都能诱导形成愈伤组织。外植体源自自然环境均为带菌状态，在接种前都必须进行消毒。对于难消毒的材料，有时要几种消毒剂配合使用。本次试验使用的诱导剂为2,4-D，诱导率为100%。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1实验材料 水稻成熟种子（用于诱导愈伤组织）； 1.1.2仪器设备及用具 超净工作台培养室、培养皿：￠9cm×2 枪形镊量筒：100mL×2 三角瓶：50mL×2(无菌)；废液缸；保鲜膜；标签纸 1.1.3试剂及培养基 试剂：75%酒精，2% NaCLO，无菌水(每组1瓶400mL) 培养基：诱导培养基：MS+2,4-D 2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L（pH5.8） 1.2 实验方法 1.2.1 MS固体培养基配制： 由于实验室中的MS培养基已含有蔗糖和琼脂，所以直接按照41.5g/L的浓度配置。实验中配置50ml培养基，需依次加入2.075gMS，0.1mg2,4-D； 用NaOH或HCl调节PH=5.8； 高压蒸汽锅121℃灭菌20min。 1.2.2接种室、培养基及用具表面消毒 用75%酒精棉球试擦超净工作、镊子，将培养基及用具放工作台，打开紫外灯，20分钟以表面消毒。之后关紫外灯，打开工作台风机，通风30分钟后可进行无菌操作。 1.2.3种子去壳 选取饱满、无霉变成熟水稻种子，用手工脱去谷壳（注意保持胚完整），准备20粒去壳种子，
方法1 NB基本培养基(右边的为N6,大量相同,加glycine甘氨酸2 mg/L) KNO3 2830 mg/L (NH4)2SO4 463 mg/L KH2PO4 400 mg/L MgSO4.7H2O 185 mg/L CaCl2.2H2O166 mg/L FeSO4.7H2O 27.8mg/L 5.6 Na2EDTA 37. 5 mg/L 7.5 MnSO4.4H2O 10 mg/L 27.8 H3BO3 3 mg/L 1.6 ZnSO4.7H2O 2 mg/L 1.5 Na2MoO4.2H2O 0.25 mg/L 0.25 CuSO4.5H2O 0.025 mg/L 0.025 CoCl2.6H2O 0.025 mg/L 0.025 KI 0.75 mg/L 0.8 盐酸硫胺素thiamine CHL VB1 10 mg/L 0.1 盐酸吡哆醇pyridoxine-CHL VB6 1 mg/L 0.5 烟酸nicotinic acid 1 mg/L 0.5 肌醇myo-inositol 100 mg/L 100 水解酪蛋白300 mg/L 谷氨酰胺500 mg/L 脯氨酸500 mg/L 蔗糖30,000 mg/L PHytagel 2.6 mg/L pH 5.8 Basic培养基 B N6（大量）50ml （20倍） A Ms-Fe盐10-20ml（100倍）CH 0.3g/L S B5 macro 10ml （100倍）phytogel 4g/L或agar 8g/L I B5 vita 10ml （100倍）sucrose 30g/L C proline 0.5g/L glutamine 0.5g/L N6 (大量梗稻种子) 终浓度母液(20倍) 终浓度母液(20倍)培KNO32830mg/L56.6g/L Mg SO4.7H2O185 mg/L 3.7 g/L 养(NH4)2SO4463 mg/L9.26 g/L CaCl2.2H2O 166 mg/L 3.32 g/L 基KH2PO4400 mg/L8.00 g/L 制备1 KNO3, (NH4)2SO4, KH2PO4同时倒入烧杯,加水搅拌, 使之完全溶解.
一个水培还有就是土培 水培就是放在水里让他们发芽的土培就是种在土里保持土层湿润就好了 种子播在准备好的秧田上，当苗龄为20～25天时移植到周围有堤的水深为5～10公分(2～4吋)的稻田内，在生长季节一直浸在水中。 耕种方式 稻米的种植技术，包括稻田和插秧，是在中国发明的。传说中是神农氏教导人们如何种稻。 目前稻的耕种除传统的人工耕种方式，亦有高度机械化的耕种方式。但仍不失下列步骤： 整地： 种稻之前，必须先将稻田的土壤翻过，使其松软，这个过程分为粗耕、细耕和盖平三个期间。过去使用兽力和犁具，主要是水牛来整地犁田，但现在多用机器整地了。 育苗： 农民先在某块田中培育秧苗，此田往往会被称为秧田，在撒下稻种后，农人多半会在土上洒一层稻壳灰；现代则多由专门的育苗中心使用育苗箱来使稻苗成长，好的稻苗是稻作成功的关键。在秧苗长高约八公分时，就可以进行插秧了。 插秧： 将秧苗仔细的插进稻田中，间格有序。传统的插秧法会使用秧绳、秧标或插秧轮，来在稻田中做记号。手工插秧时，会在左手的大拇指上戴分秧器，帮助农人将秧苗分出，并插进土里。插秧的气候相当重要，如大雨则会将秧苗打坏。现代多有插秧机插秧，但在土地起伏大，形状不是方型的稻田中，还是需要人工插秧。秧苗一般会呈南北走向。还有更为便利的抛秧。 除草除虫： 秧苗成长的时候，得时时照顾，并拔除杂草、有时也需用农药来除掉害虫（如福寿螺）。 施肥： 秧苗在抽高，长出第一节稻茎的时候称为分蘖期，这段期间往往需要施肥，让稻苗成长的健壮，并促进日后结穗米质的饱满和数量。 灌排水： 水稻比较倚赖这个程序，旱稻的话是旱田，灌排水的过程较不一样，但是一般都需在插秧后，幼穗形成时，还有抽穗开花期加强水份灌溉。 收成： 当稻穗垂下，金黄饱满时，就可以开始收成，过去是农民一束一束，用镰刀割下，再扎起，利用打谷机使稻穗分离，现代则有收割机，将稻穗卷入后，直接将稻穗与稻茎分离出来，一粒一粒的稻穗就成为稻谷。 干燥、删选： 收成的稻谷需要干燥，过去多在三合院的前院晒谷，需时时翻动，让稻谷干燥。删选则是将瘪谷等杂质删掉，用电动分谷机、风车或手工抖动分谷，利用风力将饱满有重量的稻谷自动筛选出来。
水稻愈伤组织的诱导 一、实验目的 1、掌握外植体的消毒方法和接种技术； 2、了解愈伤组织诱导的过程。 二、实验原理 以植物器官、组织、细胞等作外植体进行离体培养时，在一定的诱导培养条件下都能诱导形成愈伤组织。愈伤再经分化培养，通过器官发生途径或体细胞胚胎发生途径可再生成植株。 外植体源自自然环境均为带菌状态，在接种前都必须进行消毒。对于难消毒的材料，有时要几种消毒剂配合使用；对于多茸毛表面粗糙不平的材料，要加展著剂（吐温20）以增强消毒效果。 三、实验材料与用具 1、材料：水稻成熟种子（用于诱导愈伤组织）； 2、试剂：75%酒精，2% NaCLO，无菌水(每组1瓶400mL)； 3、培养基：诱导培养基：NB+2,4-D 2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L（pH5.8）； 4、仪器设备：培养室、超净工作台、培养皿（￠9cm）2个、枪形镊、量筒（100mL）2个、三角瓶（50mL、无菌）2个、废液缸、保鲜膜、标签纸。 四、实验步骤 1、接种室、培养基及用具表面消毒 用75%酒精棉球试擦超净工作台、镊子，将培养基及用具放工作台，打开紫外灯，照射20分钟以表面消毒。之后关紫外灯，打开工作台风机，通风30分钟后可进行无菌操作。 2、种子去壳 选取饱满、无霉变、成熟的水稻种子，手工脱去谷壳（注意保持胚完整），每人准备30粒去壳种子，并按照分组放到三角瓶中。 3、操作者双手的清洗与消毒
在进入无菌室之前，各操作者先用自来水清洗干净双手并晾干，然后进入无菌室，坐在超净台前位子上后，用含75%酒精的酒精喷壶喷洒双手对双手进行消毒，在超净台风口待双手酒精风干后进入超净工作台。（注意：酒精喷壶喷洒双手时切记不要把酒精喷到超净台的有机玻璃板上！） 4、超净台面的表面消毒（以下工作在超净工作台内进行） 用枪形镊子从含75%酒精棉球的容器中取一团棉球，仔细把整个超净台面擦试一遍，尽量降低超净台面的带菌量，并将废棉球丢到废液缸中，然后点亮超净台里面放置的酒精灯。 5、外植体消毒（分组操作，每组由一位代表操作完成外植体的消毒工作） 将脱谷壳米粒转到一50mL 无菌三角瓶→加适量无菌水洗一次（以没过种子为准，下同）→弃水，倒入75%酒精适量，摇动搅拌，放置30秒（过程中适当轻摇动混匀）→弃酒精→加适量无菌水洗一次→弃水→倒入适量2% NaCLO ，不时摇动搅拌，共处理30分钟→弃NaCLO →用无菌水洗3次，每次停留1分钟→倒去无菌水，将种子从三角瓶转到带无菌滤纸的无菌培养皿中吸干。 6、接种与观察 将吸干的消毒种子用无菌的镊子接入培养基并均匀放置，每皿接10粒，每人共接种2皿。接种完成后，将培养皿盖上并用保鲜膜封口，然后将接种有材料的培养皿移出超净台，贴上标签写明日期、接种人，按照班级统一放入一篮子，再将篮子放入培养室进行25℃暗培养。注意每隔2-3天前来观察一次实验现象，1周后调查计算污染率，14天后调查计算愈伤组织诱导率。 五、实验结果 本次实验我组未出现被污染的种子，污染率均为0 。说明实验过程中，我组成员操作规范，保证所接种的种子均不受到污染。 最后，我组的2个培养皿分别可以诱导出7和8株水稻苗，诱导率分别为70% ×100% 形成愈伤组织的种子数 污染率(%)= ×100% 污染的种子数 接种的总种子数 诱导率 (%)= 接种的总种子数
水稻转化方法 1．愈伤组织的诱导 选取成熟良好、饱满、无霉变的籼稻种子，用糙米机或人工方法去掉种子的内外粰，保留胚的完整性。先用75%酒精消毒1 min，再浸泡于40% NaClO+0.1% Tween 20 溶液，并置于100 rpm的摇床上消毒30 min。在超净工作台上，消毒后的去粰种子用无菌水洗涤5次以上，洗净后转移至装有无菌吸水纸的培养皿中吸干水分，再将去粰种子接种于诱导培养基中。培养条件为32℃，持续光照（100 mole m-2s-1）。30天后即可得到较好的愈伤组织用于转化。 2．农杆菌的准备 农杆菌选用水稻转化中常用的菌株Ag10。将含有目的基因的表达载体通过电激转化法转入农杆菌Ag10，选取阳性菌株，再将阳性菌株划线于含合适抗生素的YEB固体平板培养基中，于28 ℃暗培养3天。3天后，用接种针挑取米粒大小的农杆菌震荡悬浮于装有100 mL AA浸染培养基的150 mL灭菌三角瓶中，以此作为愈伤组织的农杆菌浸染液。特别值得注意的是，农杆菌应充分分散，而且浓度不能太大（OD600=0.1），否则后续的脱菌效果不好。 3．愈伤组织和农杆菌的共培养 挑取诱导30天并且生长良好的愈伤组织（长出的水稻芽与种子去掉）浸泡于装有100 mL 农杆菌浸染液的150 mL灭菌三角瓶中（在加入愈伤前，先加入150ml的AS,使AA液中AS的浓度为30mg/L），摇动5min。同时，在共培养基平板上预先垫1张无菌滤纸，用1 mL 的AAM浸染培养基打湿，并除去气泡。然后将浸染5 min后的愈伤组织用无菌滤纸吸干，置于垫了滤纸的共培养基上于25℃黑暗培养3天。 4．农杆菌的洗脱 将共培养3天后的愈伤组织置于250 mL锥形瓶中，先用无菌水洗涤4-5次，直至洗液清澈透明为止。加入过滤灭菌的400 mg/L羧苄青霉素溶液适量，于摇床上100 rpm 震荡洗涤25 min。然后倒掉洗液，继续用羧苄青霉素溶液洗愈伤3-5次，再加入适量羧苄青霉素溶液，于摇床上100 rpm 震荡洗涤25 min，然后倒掉洗液，继续用羧苄青霉素溶液洗愈伤3-5次，最后用无菌滤纸将愈伤组织吸干。 5．抗性愈伤组织的筛选 首先将农杆菌洗脱后的愈伤组织置于筛选剂浓度为100mg/L的 G418或50mg/L的HPT筛选培养基上, 于32℃和持续光照条件下筛选培养30天左右，将新长的愈伤继代一次。
水稻原生质体分离及转化 作者：植物逆境与光合实验室|发表日期：2014-04-11 实验目的：用于做荧光定位、BIFC、Co-IP实验 实验材料和试剂： 生长8-10 d的水稻组培幼苗、酶解液、mmg溶液、PEG-CaCl2溶液、W5溶液、5 mL移液枪、5 mL枪头、12 mL BD管、1.5 mL EP管、100 mL锥形瓶、圆形培养皿、滤网（20 mm×20 mm）、离心机、摇床等。 溶液的配制： 母液的配制： 1、0.2 M MES(pH 5.7) 2、0.8 M Mannitol(甘露醇) 3、1 M CaCl2 4、2 M KCl 5、2 M MgCl2 6、10% BSA [Fluka PEG 4000 81240] 以下如有上述母液，则都是使用的母液 酶解液：20 mL ×2 MES 0.5
mL 1 mL Mannitol 7.5 mL 15 mL Cellucose（纤维素酶）0.15 g 0.3 g Macerozyme（离析酶）0.075 g 0.15 g ddH2O 1.8 mL 3.6 mL 55℃10 min 冷却至RT后加入200 uL CaCl2 加入200 uL 10% BSA Mmg: 20 mL ×2 MES 0.2 mL 0.4 mL Mannitol 5 mL 10 mL MgCl2 0.075 mL 0.15 mL ddH2O 4.725 mL 9.45 mL
PEG-CaCl2: 20 mL ×2 Mannitol 2.5 mL 5 mL CaCl2 1 mL 2 mL PEG4000 4 g 8 g ddH2O 3 mL 6 mL W5: 200 mL MES 2 mL NaCl 1.8 g CaCl2?2H2O 3.67525 g KCl 0.5 mL ddH2O 197.5 mL 具体实验步骤： 1、从培养基上切取培养8-10 d的水稻幼苗，去除幼苗外层包裹的叶子。 2、用干净的刀片将幼苗切成很细的粉末状碎片（越细越好，有利于酶解），大概切到水稻幼苗茎秆的中间段即可（剩余未切割的部分可以扔掉）。
水稻 水稻属于禾本科一年生草本，稻属。它是由普通野生稻经长期的自然选择和人工选择共同作用下演变而来的。我国是世界栽培稻的发源地之一,并且栽培历史悠久(约有5-6千年的栽培历史)。稻分为籼稻和粳稻两个亚种，在籼稻和粳稻中按其对光照长短的反映和生育期长短分为晚稻和早、中稻,在晚稻和早、中稻类型中按耐湿性和耐旱性分为水稻和陆稻。稻米营养价值较高，与其它谷物相较，它含粗纤维最少，各种营养成分容易消化和吸收，适宜人体需要。 水稻的生物学基础如下： （一）水稻的生长发育 1、水稻的一生 水稻从种子萌发开始，经过发根、长叶、分蘖、拔节、长穗、开花、结实等一系列生长发育过程，最后形成新的种子，称为水稻的一生。从播种到种子成熟所经历的日数，叫水稻全生育期。 水稻一生共分为四个时期： （1）秧苗期。播种——移栽 （2）返青分蘖期。移栽——幼穗分化前 （3）拔节孕穗期。幼穗分化——抽穗前 （4）抽穗结实期。抽穗——成熟 营养生长与生殖生长划分： （1）营养生长期。根、茎、叶、分蘖（营养器官） （2）生殖生长期。穗、花、籽粒（生殖器官） 2、种子发芽 （1）种子构造：谷粒由谷壳和糙米两部分构成。 （2）种子生活力：一是种子成熟度。开花授粉后7—10天的种子具有发芽能力，20天后发芽力正常。二是种子休眠期。籼稻的休眠期很短，特别是早稻种子休眠期更短。三是种子寿命。种子贮存的时间越长，寿命越短。种子在一般条件下贮存，生活力可保持2年，但发芽率
只有50%左右。 （3）种子发芽过程：一是吸胀；二是萌发（破胸）；三是发芽三个阶段。露出白色的胚称为破胸，胚芽达到谷粒长度的一半时称为发芽。 3、根的生长 水稻的根系：水稻属须根系，分为种子根和不定根，不定根又分为普通根和浮根，浮根除吸收水分和养分外，还能吸收氧气，输送到下部的根系，以提高下部根的活力，这是水稻适应淹水环境的一种特殊表现。 4、叶的生长 水稻叶有完全叶和不完全叶两类。完全叶和不完全叶在胚中已分化形成。水稻一生叶主茎的叶片数已定。主茎第1—3片叶是在幼苗期生长的，最后3片叶则是在幼穗分化期生长的，其余各叶都在分蘖期生长。 5、叶片功能 叶片功能期是指叶片保持光合能力时间长短。叶片功能期随着叶位上升，由短变长，水稻1—3片叶只有10多天，而剑叶功能期可达50—60天。 6、水稻分蘖 水稻茎基部节上腋芽长成的分枝称为分蘖。分蘖期是决定每亩穗数的关键时期。掌握分蘖规律，可以促进分蘖的发生和成穗，保证足穗，达到高产稳产。 7、水稻分蘖规律 （1）分蘖发生的节位：无论主茎或分蘖茎，都有很多节，每个节上都有一个腋芽。茎基部的腋芽长成分蘖。分蘖发生的节位，叫分蘖位。在低节位上长出的分蘖，叫低位蘖，反之则叫高位蘖。 （2）凡是由主茎上直接发生的分蘖叫一次分蘖，从一次分蘖上再发生的分蘖叫二次分蘖。依次类推……。在大田栽培条件下，一次分蘖最多，大多数有效；二次分蘖较少，部分有效；三次分蘖极少，大都无效。 （3）有效分蘖和无效分蘖。凡能抽穗结实5粒以上的，称为有效分蘖，否则就是无效分
2019年鉴别水稻种子优劣的方法有何些篇一：水稻种子的正确选种方法 水稻种子的选种方法 种子质量是决定水稻质量的重要因素，关系到农业生产的安全。 在选种时，了解需要掌握的事项，能为水稻安全生产提供保障。 1.坚持品种选定原则 根据《中华人民共和国种子法》第十七条规定，未经审定的品种 任何单位和个人不得宣传、销售和推广。凡政府允许大面积推广的品种，必须是由国家或省级农作物品种审定委员会审定通过的水稻品种。不要购买未经审定而先行推广的品种，而且最好不要选择那些没有大面积普及的品种。谨慎购买新品种，遇到从来没有种植过的新品种，要向经营者询问该品种是否通过引种测试，其结果如何，最好不要盲目购买。 2.选择具有合法资格的种子供应商 不要在无证经营的门店、街头巷尾摆摊及走街串巷叫卖的种子商 贩手里购买种子，避免买到假冒、伪劣和陈年的种子。应该选择经营
证照齐全、具有合法资格的种子供应商。购种时注意要供应商开具有效发票（或种子质量信用卡），并妥善保管购种发票和种子包装袋，以备种子出问题时有据可查。 3.确保其品种特性和所种植区域自然条件相吻合 选择的品种要和自身的用种目的、栽培条件相匹配。不同品种的抗逆性、丰产性、成熟期、商品性等各不相同；不同使用者的用种目的、栽培条件、肥力条件、上下茬口安排、管理水平等也不尽相同。所以，在选种时，要根据自身条件和用种目的，结合品种的特征属性，有目的地选择品种。 4.善于分析种子的标签等信息 购种时要选择正规包装正规生产单位生产的原包装种子，包装物上印有醒目图案及文字说明，有的还有防伪标志。要注意查看稻种说明书或品种简介，内容包含适宜种植地域、特征特性、栽培措施等。还要注意查看包装是否规范，如所装数量、质量指标、生产商、经营许可证号码、产地及联系电话等明确标识。同时要注意查看种子包装袋上标注的种子生产日期，隔年生产的陈年种子不要买，没有注明生产日期的种子也不要买。诚邻粮食选用优质种子公司提供的高品质品种，比如稻花香2号选用的是稻花香之父“田永太”培育的种子，确
水稻愈伤组织的诱导 、实验目的 1、掌握外植体的消毒方法和接种技术； 2、了解愈伤组织诱导的过程。 二、实验原理 以植物器官、组织、细胞等作外植体进行离体培养时，在一定的诱导培养条件下都能诱导形成愈伤组织。愈伤再经分化培养，通过器官发生途径或体细胞胚胎发生途径可再生成植株。 外植体源自自然环境均为带菌状态，在接种前都必须进行消毒。对于难消毒的材料，有时要几种消毒剂配合使用；对于多茸毛表面粗糙不平的材料，要加展着剂（吐温20）以增强消毒效果。 三、实验材料与用具 1、材料：水稻成熟种子（用于诱导愈伤组织）； 2、试剂：75%酉精，2% NaCLO无菌水（每组1瓶400mL）; 3、培养基：诱导培养基：NB+2,4-D 2mg/L+蔗糖30g/L+ 琼脂8g/L （pH5.8）; 4、仪器设备：培养室、超净工作台、培养皿（C 9cm）2个、枪形镊、量筒（100mL 2 个、三角瓶（50mL无菌）2个、废液缸、保鲜膜、标签纸。 四、实验步骤
1、接种室、培养基及用具表面消毒 用75%酒精棉球试擦超净工作台、镊子，将培养基及用具放工作台，打开紫外灯，照 射20分钟以表面消毒。之后关紫外灯，打开工作台风机，通风30 分钟后可进行无菌操作。 2、种子去壳 选取饱满、无霉变、成熟的水稻种子，手工脱去谷壳（注意保持胚完整），每人准备 30 粒去壳种子，并按照分组放到三角瓶中。 3、操作者双手的清洗与消毒 在进入无菌室之前，各操作者先用自来水清洗干净双手并晾干，然后进入无菌室，坐在超净台前位子上后，用含75%酒精的酒精喷壶喷洒双手对双手进行消毒，在超净台风口待双手酒精风干后进入超净工作台。（注意：酒精喷壶喷洒双手时切记不要把酒精喷到超净台的有机玻璃板上！） 4、超净台面的表面消毒（以下工作在超净工作台内进行） 用枪形镊子从含75%酒精棉球的容器中取一团棉球，仔细把整个超净台面擦试一遍，尽量降低超净台面的带菌量，并将废棉球丢到废液缸中，然后点亮超净台里面放置的酒精灯。 5、外植体消毒（分组操作，每组由一位代表操作完成外植体的消毒工作） 将脱谷壳米粒转到一50mL无菌三角瓶一加适量无菌水洗一次（以没过种子为准，下同）一弃水，倒入75%酉精适量，摇动搅拌，放置30秒（过程中适当轻摇动混匀）一弃酒精f加适量无菌水洗一次f弃水f倒入适量2% NaCL O不时摇动搅拌，共处理30分钟一弃NaCL f用无菌水洗3次，每次停留1分钟f倒去无菌水，将种子从三角瓶转到带无 菌滤纸的无菌培养皿中吸干。 6、接种与观察