分类号密级公开
国际十进分类号（UDC）
第四军医大学
学位论文
NF-κB信号通路对RNA结合蛋白QKI的
转录调控及其在骨骼肌中的功能研究
（题名和副题名）
张杰
（作者姓名）
指导教师姓名卢兹凡教授
指导教师单位第四军医大学生物化学与分子生物学教研室申请学位级别硕士专业名称生物化学与分子生物学论文提交日期2009.05 答辩日期2009.05
论文起止时间2007年4月至2009年5月
第四军医大学
学位授予单位
独创性声明
秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，不包含本人或他人已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。
申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。
论文作者签名：日期：
保护知识产权声明
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论文作者签名：导师签名：日期：
NF-κB信号通路对RNA结合蛋白QKI的转录调控及
其在骨骼肌中的功能研究
研究生：张杰
学科专业：生物化学与分子生物学
所在单位：第四军医大学基础部
生物化学与分子生物学教研室
导师：卢兹凡教授
资助基金项目：国家自然科学基金 NSF: 30470387
国家自然科学基金 NSF: 30570396
海外杰出青年基金 NSF: C030200303
关键词： NF-κB, QKI, 转录调控，骨骼肌
中国人民解放军第四军医大学
2009年5月
目录
缩略语表 (1)
中文摘要 (3)
ABSTRACT (6)
前言 (10)
文献回顾 (11)
正文 (24)
实验一NF-ΚB信号通路对RNA结合蛋白QKI的转录调控 (25)
1 材料、试剂与仪器 (25)
1.1 实验材料 (25)
1.2 主要试剂 (25)
2 方法 (26)
3 结果 (34)
实验二 NF-κB信号通路对RNA结合蛋白QKI的转录下调在骨骼肌中的功能研究 (41)
1．材料、试剂与仪器 (41)
2．方法 (41)
3．结果 (42)
小结 (49)
参考文献 (50)
个人简历和研究成果 (60)
致谢 (61)
缩略语表
缩略词英文全称中文全称
pair 碱基对
bp Base
albumin 牛血清白蛋白
serum
BSA Bovine
Immunoprecipitation 染色体免疫共沉淀ChIP Chromatin
cDNA Complimentary deoxyribonucleic acid 互补DNA
2 环氧合酶2
Cox2 Cyclooxygenase
medium 改良的Eagle培养基
eagle
DMEM Dulbecco’s
modified
sulfoxide 二甲基亚砜
DMSO Dimethyl
triphosphate 脱氧核糖核苷三磷酸dNTP Deoxyribonucleoside
coli 大肠杆菌
E.Coli Escherichia
FBS Fetal bovine serum 胎牛血清
Kbp Kilo base pair 千碱基对
Dalton 千道尔顿
KD Kilo
HDAC Histone deacetylase 组蛋白去乙酰化酶
κB ακB抑制子α
IκBα Inhibitor
κB kinase κB抑制子激酶
IKK Inhibitor
Luc Luciferase 荧光素酶
chain 肌球蛋白重链
MHC Myosin
heavy
mRNA Message
RNA 信使RNA
NF-κB Nuclear
factor
κB 核因子κB
OD Optical
density 光密度
PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis 聚丙稀酰胺凝胶电泳PBS Phosphate-buffered
saline 磷酸缓冲液
PCNA Proliferating cell nuclear antigen 增殖细胞核抗原PCR Polymerase chain reaction 聚合酶链反应
QKI quaking 震颤
QRE Quaking
response
element Quaking应答元件rpm Revolutions
per
minute 每分钟转速
RT-PCR Reverse transcription-Polymerase chain
reaction
反转录聚合酶链反应
SDS Sodium dodecyl sulfate 十二烷基磺酸钠
siRNA Small interference RNA 小干涉RNA
STAR Signal transduction and activation of RNA RNA信号转导和活化Taq Thermos aquaticus DNA polymerase 栖热水生菌DNA聚合酶
TBST Tris-buffered saline with tween-20 含tween-20 的Tris盐缓冲液
TNF-αTumor necrosis factor α肿瘤坏死因子αTSA Trichostatin
A 曲古抑菌素A 3’UTR 3’untranslated
region 3’非翻译区
NF-κB信号通路对RNA结合蛋白QKI的转录调控及
其在骨骼肌中的功能研究
硕士研究生：张杰
导师：卢兹凡教授
第四军医大学生物化学与分子生物学教研室，西安 710032
中文摘要
NF-κB 作为B细胞中κB 轻链表达的调控元件，其家族的功能和调控是20 年来研究的热点。免疫系统识别抗原并通过NF-κB传递信息，由NF-κB 失调引发的疾病等相关研究进展，使得这个可诱导转录因子受到了越来越广泛的关注。大量的研究工作使得NF-κB 途径成为了解的较为透彻的信号通路，并被广泛应用于其他研究系统；而NF-κB 本身也成为不同领域研究思想的融合点。可诱导的基因表达调控是正常生理的核心元素，也是多细胞有机体适应环境及机械、化学和微生物胁迫能力的关键。由于其可研究性和对疾病的重要性，NF-κB 途径成为可诱导转录因子协调产生的细胞、组织及有机体水平应答的模型。
QKI是一种RNA结合蛋白，对其功能认识尚不深入。组织特异性表达降低QKI导致神经髓鞘发育障碍，ENU诱导QKI纯合突变的小鼠出现胚胎致死。目前对QKI的研究大多集中在神经系统中，它参与少突胶质细胞的分
化而影响神经髓鞘的形成。深入的机制探讨发现QKI结合MBP、MAG等髓鞘发育重要分子的3’UTR，改变mRNA的定位和稳定性，从而改变其蛋白表达水平参与髓鞘的形成。
从分子生物学的角度更深入地了解一个蛋白质的功能，首先可以从其受到的调节机制入手。通过生物信息学分析，我们发现在QKI的启动子区域，ATG上游的710bp处存在一个非常保守的NF-κB的结合位点，推测NF-κB 信号通路对QKI具有调控作用。为了证实这一调控作用的存在，我们首先构建了包含QKI基因启动子区域，atg上游2056个碱基的荧光素酶载体。通过荧光素酶报告系统的分析，发现NF-κB信号通路的活性亚基P65和外源活化因子TNF-α可以下调QKI启动子的转录活性，提示我们NF-κB下调QKI 的转录。通过半定量RT-PCR检测TNF-α刺激C2C12和原代培养的新生大鼠的骨骼肌细胞后QKI的mRNA的表达变化，得到TNF-α的刺激可以在转录水平下调QKI的表达。为了进一步说明TNF-α的刺激是通过NF-κB信号通路发挥转录下调QKI的功能以及确认NF-κB信号通路对QKI的转录下调，我们采用TNF-α活化NF-κB通路特异性的抑制剂BAY11-7082以及干预NF-κB通路中重要分子的方式，证明了NF-κB确实对QKI具有转录下调的功能。之后，通过CHIP试验证明了NF-κB信号通路中的活化亚基P65可以与QKI的启动子区域直接的结合，而其发挥转录抑制的机制可能与HDACs 的相互作用有关。
为了研究NF-κB对QKI下调在骨骼肌中的功能，我们首先探讨了QKI 在C2C12细胞中的功能。通过干预QKI的表达，我们发现QKI既有抑制C2C12细胞增殖的功能又有抑制C2C12细胞分化的功能。由于在C2C12细胞中过表达QKI后reserve细胞的marker分子P130的明显上升，说明上述QKI对肌肉细胞产生的影响是通过促进reserve细胞的形成实现的。在我们
诱导C2C12分化后，我们通过分步消化法得到reserve细胞，发现其中QKI 的表达丰度高于分化成熟的myotube。由于reserve细胞与成体肌肉干细胞的特性非常相似，所以我们认为NF-κB信号通路对RNA结合蛋白QKI的转录下调的机制可能参与了肌肉的再生过程。外源细胞因子，例如TNF-α，激活卫星细胞中的NF-κB信号通路，通过转录水平下调QKI而促使卫星细胞进入细胞周期，完成肌肉损伤后的修复过程。
关键词：NF-κB, QKI, 转录调控，骨骼肌
Transcriptional regulation of RNA binding protein QKI by NF-κB and elucidation of its function in
skeletal muscle
Candidate for master: Zhang Jie
Supervisor: Prof. Lu Zifan
Department of biochemistry and molecular biology,
Fourth Military Medical University,
Xi’an 710032, China
Abstract
Twenty years following the identification of nuclear factor-κB (NF-κB) as a regulator of expression of the κB light chain in B cells, research into the function and regulation of the NF-κB family continues at a blistering pace. Advances in understanding how the immune system senses pathogens and processes this information through the activation of NF-κB, as well as an ever-expanding list of diseases in which dysregulation of NF-κB has been implicated, have continued to invite broad interest into the regulation of this inducible transcription factor. Part of the answer lies in these numbers themselves. The sheer volume of work in this area has allowed the field of NF-κB research to be both a source of signaling paradigms that have been broadly applied to other systems, as well as a melting pot in which ideas from disparate fields have merged, been modified, and matured into new concepts. The inducible regulation of gene expression is a
central element of normal physiology and is the key to the ability of multicellular organisms to adapt to environmental, mechanical, chemical, and microbiological stresses. Owing to its amenability to experimentation and its importance in disease, NF-κB has served as a model of cell, tissue, and organism level responses that are orchestrated through inducible transcription factors.
RNA binding protein QKI encoded by the quaking gene locus was designated from the quaking viable mice. Quaking viable (qk v) is an autosomal recessive mutation due to a deletion of the 5’ flanking region of the QKI gene, leading to diminished expression of the selective RNA-binding protein QKI in myelin producing cells and subsequently dysmyelination in the CNS. QKI harbors amino acid domains characteristic of RNA-binding and interaction with Src homology 3 (SH3)-containing signaling molecules, therefore belongs to a fast-growing family denoted as signal transduction activators of RNA (STAR). Currently, all the findings related with QKI are mainly focused on CNS, esp. related with MBP and MAG mRNA stability, splicing, translocation and translational repression during oligodentrocytes differentiation. As RNA-binding protein, its interaction with target mRNA is mainly through binding with
cis-element in target mRNA 3’UTR (Quaking Response Element, QRE).
Characterization of the expression and the underlying mechanism would shed light on the function of a protein or gene. To this end, we would like to explore the transcription of QKI. By bioinformatics analysis, we found a putative NF-κB binding site at 710bp upstream of atg in QKI gene promoter region, rasising the possibility that NF-κB signal pathway would regulate QKI expression. To confirm the regulation, firstly we constructed the QKI promoter luciferase reportor system. From the reportor assay, both ectopic expression of the constitutively activative subunit of NF-κB (P65) and extracelluar treatment of
TNFα could blunt the transcriptional activity of QKI promoter. These results suggested that the NF-κB signal pathway may transcriptionally down-regulate QKI. Then we found that endogenous QKI mRNA decreased in C2C12 cell line when treated with TNF-α, and similar results were also observed in the primary culture of neonate rat skeletal muscle cells. To validate the decrease of QKI by TNF-α is mediated by NF-κB signal pathway, BAY11-7082, a specific inhibitor to block TNFα activated NF-κB was included in the following study. We found that this inhibitor rescued the expression of QKI, suggesting that NF-κB signal pathway is involved in the TNFα induced repression of QKI expression. Similar results were also found when we shut down the NF-κB signal pathway by overexpression of dominat negative IκBα or IKKα. Furthermore, the chromatin immunoprecipation result showed that P65, the activated subunit of NF-κB signal pathway, could interact with QKI promotor directly. We assumed that corepressors, such as histone deacetylases, might colocalize with the P65 at the promoter, which cordinatedly inhibit the QKI expression.
To uncover the function of the down-regualtion of QKI by NF-κB signal pathway in skeletal muscle, further studies were done. Through overexpression and knock down of QKI in myocyte C2C12, we found that QKI could inhibit myoblast proliferation and differentiation. Because of the up-regulation of P130, a reserve cell marker, after QKI overexpression, we propose that QKI could enhance the self-renewaland mainta intenance of these reserve cell group. Moreover, we separated the reserve cells from differentiated C2C12 cell culture, and found a higher expression level of QKI in reserve cells. Because reserve cells are similar to satellite cells in skeletal muscle, we claimed that the transcriptioanal down-regulation of QKI by NF-κB signal pathway may functioned in skeletal muscle regeneration. Extracellular cytokine stimulation, such as TNF-α, activated NF-κB signal pathway in satellite cells, then
promoted satellite cells to enter cell cycle from resting stage, and finally repair the injured muscle.
Key words：NF-κB, QKI, transcriptional regulation, skeletal muscle
前言
QKI是我们实验室一直关注的一个STAR蛋白家的成员。该家族成员通过与靶基因3’UTR的保守结合元件结合发挥对靶基因转录后调控的功能。NF-κB信号通路是近20年来热点的研究领域，通过预测我们发现QKI可能受到NF-κB的转录调控。通过验证，我们首次证实了NF-κB在转录水平抑制QKI的表达。
NF-κB信号通路在骨骼肌的再生过程中的活化，促进了静息期的肌肉干细胞的活化并进入细胞周期，最终进入分化程序，融合入肌纤维完成肌肉损伤后的修复过程。通过研究我们发现QKI可以促进C2C12细胞进入reserve 状态，并在reserve细胞中较高表达，提示我们QKI可能促进了肌肉干细胞的维持。
所以我们认为NF-κB信号通路对RNA结合蛋白QKI的转录下调的机制可能参与了肌肉的再生过程。外源细胞因子，例如TNF-α，激活卫星细胞中的NF-κB 信号通路，通过转录水平下调QKI而促使卫星细胞进入细胞周期，完成肌肉损伤后的修复过程。
文献回顾
RNA结合蛋白QKI
一、 QKI的结构及分布
QKI是一种RNA结合蛋白，因其上游调节区的缺失引起组织特异性的QKI表达降低而导致神经髓鞘发育障碍，小鼠出现颤抖表型，故命名为QKI （quaking）[1]。QKI是STAR( signal transduction and activation of RNA)蛋白家族中的一员。STAR即信号转导与RNA活化蛋白，是一类集信号转导特性与RNA激活功能于一身的蛋白质[2]。1997年Vernet的研究发现STAR蛋白家族的成员都含有一个标志性的STAR功能区，它由三部分组成，分别是RNA结合区域、KH结构域及其两侧的QUA1和QUA2结构域。目前已鉴定出30多种STAR蛋白，根据氨基酸序列的差异分为三个亚家族，分别是SAM68、QKI 和SF1家族[3]。功能研究证实它们可以直接作用于mRNA前体, 通过不同的剪接方式调节mRNA和蛋白质的合成[4]；还可以在转运、定位以及维持稳定性等转录后的各个方面影响着mRNA和蛋白质的表达[5,6]。在STAR家族中，对SAM68、GLD21、SF1和QKI研究得比较深入。其中QKI蛋白在不同生物体内高度保守，对神经髓鞘形成和胚胎发育有至关重要的作用，QKI敲除的小鼠胚胎致死[7]
1964年，Sidman 首先报道了一种发生在小鼠神经系统的髓鞘形成障碍突变-quaking,也称为quakingviable (qkv),这是一种常染色体隐性突变,纯合子小鼠在出生1天后发生严重的震颤和强直性惊厥。由于研究手段的限制,1992 年才发现qkv 小鼠的基因缺陷是由于17 号染色体发生了缺失,但是已知的与髓鞘形成有关的基因都不在缺失区域内。直到1996 年终于由Ebersole 等克隆出相应的quaking 基因QKI。
QKI基因编码RNA结合蛋白QKI，在鼠定位于17号染色体，全长大约为
65kb，含有9个外显子，通过不同的剪接可以产生至少4个转录本，第1到第4个外显子在不同的转录本中是通用的，而6、7、8外显子的剪接和非翻译区则各有不同（图6）[8]。QKI在人定位于6号染色体，主要编码4种转录本QKI-5kb, QKI-6kb, QKI-7kb,和QKI-7kb-B分别编码产生QKI-5、QKI-6和QKI-7三种亚型[9]。它们拥有共同的KH （heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K-type homology）结构域及其两侧的QUA1 和QUA2 结构域,但羧基端和3’非翻译区各不相同（图7）。进一步研究发现, KH 结构域及QUA1 和QUA2 结构域都是高度保守的序列,与其它STAR 蛋白具有很高的同源性,特别是Xqua(存在于爪蟾中) 和gld21 。KH结构域是一个RNA结合结构域，与RNA结合参与RNA的代谢。QUA1主要介导它与自身或其他分子相互作用[10]。此外,QKI 蛋白还有两个RG序列,也与RNA 结合功能有关。在羧基端有富含脯氨酸的区域、五个酪氨酸以及七个SH3 结合位点,提示QKI 具有信号转导功能[11,12]。
图1：QKI转录本结构示意图
图2：QKI蛋白结构示意图
由于转录产物的不同剪接，QKI各亚型间的差别主要集中在它们C末端和3’非翻译区的不同。这一差别决定了各自的亚细胞定位和功能有所不同[13,14]。其中QKI-5包含了一段核定位信号肽，因此主要定位于胞核中，但也可在胞核与胞浆中穿梭[15]；而QKI-6和QKI-7则定位于胞浆中，QKI-7羧基端的14个氨基酸命名为杀伤序列，功能可能为凋亡诱导剂。QKI-5作为穿梭蛋白它最重要的功能是运送RNA。它将特异的RNA运至胞浆后，位于胞浆中的QKI-6, 7继续与这些RNA相互作用。而QKI-5则被再循环进入核。与hnRNP A1这类RNA结合蛋白类似，QKI-5的再进入核是转录依赖的，其目的是携带胞浆的信号传送入核。
QKI在胚胎时期主要表达于神经管和心脏；在成体表达与脑、心脏、肺、睾丸和骨骼肌等多种组织中。对小鼠胚胎进行原位杂交检测发现,QKI 转录本最早出现于胚胎第7.5 天的神经上皮,此时只有QKI-5一种亚型表达,以后其表达量逐渐增加,到出生时达最高水平。出生后两周内一直维持在最高水平，之后立即降低。Hardy (1998) 经小鼠胚胎致死性突变研究证实,QKI-5是胚胎早期唯一一种大量表达的QKI蛋白。与QKI-5不同, QKI-6和QKI-7在初生小鼠脑中的含量很低,但以后迅速增加,到第二周时达到最高,与神经髓鞘的发育同步。
QKI的同系物在许多其他物种中也相继被克隆，在人、小鼠和非洲蟾蜍中高度保守[16-18]。在线虫中虽然没有QKI蛋白同系物，但是却有一个高度相关的蛋白GLD-1 (germ-line defective)。其序列与QKI的GSG domain高度同源。GLD-1是胚胎细胞分化必需的，同时也有肿瘤抑制和翻译抑制的功能。GLD-1可能具有识别与QKI一致的RNA靶基因的功能。
二、 QKI的功能研究
1、QKI在神经系统中的功能
qk v(quaking viable)小鼠是一种因17号染色体约1Mb区域的自发性、隐性
缺失致使出现神经系统髓鞘形成障碍，机体严重震颤和雄性不育表型的突变小鼠（图8）[19]。qk v小鼠的髓鞘形成障碍程度与髓鞘发育过程恰好相反，呈现从头到尾严重度逐渐降低的方式。受损以中枢神经系统最为严重，主要表现为髓层数目降低，髓鞘缺乏致密性。此外，qk v小鼠出生后10天出现的快速震颤和发育成熟后出现癫痫也与髓鞘层的不成熟和髓鞘形成障碍有关。对17号染色体缺失的区域进行分析发现此区域包含了部分QKI上游调控区，缺失导致QKI的部分启动子和增强子丢失，使得QKI表达水平降低。但这种降低是由组织和细胞特异性的。在心脏、肝脏和肌肉中QKI的表达无明显变化。在神经系统中，QKI的变化很大，髓鞘形成细胞中的QKI-6, QKI-7表达明显降低，QKI-5的降低与受损严重度呈正相关，受损严重区域的髓鞘形成细胞中QKI-5表达明显降低甚至不表达，受损轻微的则无明显变化。但在星形胶质细胞中，QKI的表达也无明显变化。此外，在N-乙基-N-亚硝基(ENU)诱导的QKI等位基因点突变qk e5小鼠因影响了QKI的调控活性，小鼠出生后也出现中枢神经系统脱髓鞘和机体震颤表型，且较qk v更为严重。由此高度提示QKI 参与髓鞘的形成[20]。
图3：QKI在染色体上的定位及其qk v小鼠染色体1Mb区域的缺失。
髓鞘是髓鞘形成细胞重叠包裹神经纤维所构成的结构。在中枢神经系统，髓鞘形成细胞以少突胶质细胞为主，髓磷脂碱性蛋白(MBP)、蛋白脂类蛋白(PLP)、髓鞘相关糖蛋白(MAG)、少突胶质蛋白(MOP)和2’,3’-环核苷酸3’-磷酸二酯酶(CNP)等都是重要分子。在外周神经系统，则以血旺氏细胞为主，除MBP外，P0和P2蛋白为重要分子，此外，也有PLP和MAG的参与。研究证实，在野生型的成年小鼠中，QKI在少突胶质细胞和血旺氏细胞中都大量表达。发育过程中，QKI-5大量表达于少突胶质细胞的前体细胞中，而QKI-6、
QKI-7则在发育成熟停止了增殖的少突胶质细胞中高表达，参与调控不同分化阶段髓鞘形成相关分子的表达；QKI-6、QKI-7还通过上调P27使细胞出现G0/G1期阻滞，参与髓鞘形成细胞的分化，促进髓鞘形成[21]。在qk v和qk e5小鼠中， QKI在少突胶质细胞中表达水平的剧降抑制了MBP、PLP、MAG和CNP的正常表达，使少突胶质细胞的分化和成熟提前中断，抑制了髓鞘的形成。
QKI还参与胚胎期神经前体细胞的分化。在胚胎期神经前体细胞分化过程中，QKI表达量逐渐降低的前体细胞分化为神经元，而QKI持续高表达的细胞则分化为神经胶质细胞或作为有潜在分化功能的前体细胞储备起来，提示QKI蛋白与神经细胞的分化取向有相关性,并可作为一个指标预测细胞分化的终点[22-25]。临床研究发现神经脱髓鞘疾病、老年痴呆和精神分裂症均与QKI表达降低有关[26]。
2、QKI与心血管发育：
在小鼠体内，QKI蛋白对于胚胎发育起到了至关重要的作用。在QKI 编码区的一些隐性等位基因的突变可引起小鼠的胚胎致死。
QKI缺失的纯合子小鼠和四种ENU诱导的QKI等位基因突变型小鼠(qk kt1,qk k2,qk kt3/4, qk l-1)均胚胎致死。最早研究认为是神经系统发育障碍所导致。后来发现在神经系统发育之前，QKI蛋白在卵黄囊的内胚层即有表达,它与位于中胚层的正在发育的血岛相毗邻,而后者是血液细胞和内皮细胞分化最先发生的地方。因此目前认为QKI基因突变引起卵黄囊血管重塑障碍以及胚胎中期血管发育异常是导致胚胎死亡的直接原因[27]。且在这一过程中，QKI-5发挥着最为重要的作用。因为仅单独QKI-5异常的qk l-1小鼠与三种异构体功能均异常的qk kt1,qk k2,qk kt3/4小鼠出现同样的致死表型。
目前已知，在内胚层中，QKI-5可调节血清蛋白，代谢酶类及一些可溶性因子；此外，QKI还通过对维甲酸合成必需的酶Raldh2的调节控制维甲酸的产量参与邻近胚外中胚层的发育过程[28]。