中国农业科学 2010,43(11):2340-2346 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2010.11.018
收稿日期：2010-01-22；接受日期：2010-03-26
基金项目：现代甘薯农业产业技术体系建设专项（nycytx-16-B-16）、国家“863”计划项目（2006AA10Z332） 作者简介：郭 庆，硕士研究生。通信作者木泰华，研究员。Tel ：010-********；E-mail ：mutaihuacaas@https://www.doczj.com/doc/10594249.html,
氯化钙对甘薯蛋白乳化特性的影响
郭 庆，木泰华
（中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193）
摘要：【目的】研究不同氯化钙浓度（0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mol ·L -1，pH 7.0）对甘薯蛋白乳化特性的影响。【方法】分别对甘薯蛋白乳化液的乳化颗粒平均粒径（d 4,3）、乳化活性指数、乳析指数、界面性质（界面吸附蛋白浓度及组成）和流变性质进行测定。【结果】添加0.05 mol ·L -1氯化钙后甘薯蛋白乳化活性指数由未添加氯化钙的30.3 m 2·g -1显著降低为27.6 m 2·g -1，d 4,3从4.2 μm 增大至4.42 μm（P ＜0.05）。然而，随着氯化钙浓度进一步升高（0.10—0.25 mol ·L -1），d 4,3显著增大（P ＜0.05）而甘薯蛋白乳化活性指数变化不显著（P ＞0.05）。此外，添加较高浓度的氯化钙能显著地增加乳化液的乳析指数和初始表观黏度，且界面吸附蛋白的浓度也显著提高（P ＜0.05）。SDS-PAGE 分析发现，Sporamin A 不易被甘薯蛋白乳化界面吸附，且乳化界面和乳化液中均存在＞66 kD 的S-S 键高分子聚合物。【结论】 钙离子与甘薯蛋白结合能改变其结构，进而影响甘薯蛋白的乳化特性。
关键词：氯化钙；甘薯蛋白；乳化活性；乳化稳定性；机理
Effect of Calcium Chloride on Emulsifying Properties
of Sweetpotato Soluble Protein
GUO Qing, MU Tai-hua
(Institute of Agro-Food Science and Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193)
Abstract : 【Objective 】 The effect of different concentrations of calcium chloride (0.05, 0.10, 0.15, 0.20, 0.25 mol·L -1, pH 7.0) on emulsifying properties of sweetpotato protein (SPP) was investigated. 【Method 】 Droplet average size (d 4,3), emulsifying activity index (EAI), creaming index (CI), interfacial properties and rheological properties were respectively determined. 【Result 】 The EAI of SPP emulsions decreased significantly from 30.3 m 2·g -1 to 27.6 m 2·g -1 after the addition of 0.05 mol·L -1 calcium chloride, while the d 4,3 increased from 4.2 μm to 4.42 μm (P ＜0.05). Nevertheless, with the further increase in concentrations of calcium chloride (0.10-0.25 mol·L -1), the EAI had no obvious difference (P ＞0.05), but the d 4,3 had a marked increase (P ＜0.05). In addition, the CI, interfacial adsorbed protein concentration and initial apparent viscosity were increased markedly by adding higher concentrations of calcium chloride (P ＜0.05). Furthermore, SDS-PAGE showed that Sporamin A was not easy to be adsorbed at oil/water interface, and that the high molecular polymers (＞66 kD) formed by S-S bonding existed both in oil/water interface and continuous phase of emulsions. 【Conclusion 】 The binding of calcium ions to SPP could change its structure thereby affecting the emulsifying properties of SPP.
Key words : calcium chloride; sweetpotato protein; emulsifying activity; emulsifying stability; mechanism
0 引言
【研究意义】由于植物蛋白良好的功能特性和广泛的来源，它被越来越多的应用于食品和非食品工业中。在食品工业中，水包油型食品乳化液通常是通过
蛋白质来稳定的。植物蛋白是一个非常大的优质蛋白质资源库，至今人们对植物蛋白的研究还相对较 少[1]。
甘薯是中国第四大产量的粮食作物[2]，而对甘薯蛋白的研究目前还处于初始阶段。研究甘薯蛋白的物化性质可为在食品工业中开发和利用该资源提供理论
11期郭庆等：氯化钙对甘薯蛋白乳化特性的影响 2341
依据。【前人研究进展】许多学者致力于研究不同物化条件对蛋白质乳化特性的影响，在这些研究中乳化颗粒大小、颗粒表面电势，流变学特性和颗粒界面性质常作为分析的参数[3-6]，这些参数是决定乳化液品质的重要因子。钙离子能够改变蛋白质分子的电荷分布与分子构象并能与蛋白质分子结合，这些改变能显著地影响乳化过程中蛋白质分子的吸附行为和乳化液的稳定性。钙离子对很多蛋白的乳化特性均有显著的影响[7-9]，其中对酪蛋白和乳清蛋白乳化特性影响的研究已经比较深入。Ye和Singh发现酪蛋白能与钙离子结合造成酪蛋白聚集，均质前加入钙离子后界面吸附蛋白浓度和乳化微粒平均粒径均显著提高[8]。Dickinson 和Golding发现均质前加入低浓度的氯化钙能增强酪酸钠油水乳化液的稳定性，这是因为钙离子能诱导产生大的酪蛋白束使界面吸附蛋白增多，未吸附的在乳化液中游离的蛋白减少，故直接导致了排斥絮凝程度下降[10]。Agboola和Dalgleish发现β-乳球蛋白与钙离子的结合物吸附到油滴上能引起乳化颗粒的聚集[11]。Baumy和Brule发现结合到乳清蛋白上的钙离子降低了蛋白质分子之间的静电斥力作用并促进了其疏水基团的相互作用，最终影响了乳清蛋白的吸附行为和乳清蛋白乳化液的稳定性[12]。【本研究切入点】目前关于钙离子对甘薯蛋白乳化特性的研究非常少[13]。特别是钙离子对甘薯蛋白界面性质（吸附蛋白浓度和组成），流变性质和乳析稳定性的影响均未见报道。【拟解决的关键问题】本研究的目标是考察不同浓度氯化钙对甘薯蛋白乳化活性和稳定性的影响，并通过分析乳化颗粒粒度、乳化颗粒界面性质（界面吸附蛋白组成与浓度）和乳化液流变性质来探索中性pH条件下钙离子对甘薯蛋白乳化特性的影响机制。
1 材料与方法
1.1 试验材料
甘薯的品种为密选1号，购于北京市密云区。玉米油购于当地超市。
1.2 主要仪器和试剂
1.2.1 主要仪器 管式分离机：GQLB-Z，辽宁阳光制药机械有限公司；高速离心机：TGL-16M型，湖南湘仪仪器厂；电泳系统：AE-6450型，日本ATTO株式会社；凯氏定氮仪：KIELTEC，瑞典ANALYSISER Foss公司；紫外可见分光光度计：U-3010，日本HITACHI；冷冻干燥机：LGJ-10型，北京四环科学仪器厂；高速分散均质机：FJ-200型，上海标本模型厂；流变仪：Physica MCR 301，奥地利安东帕有限公司；激光粒度分析仪：BT9300H，丹东百特仪器有限公司。
1.2.2 主要试剂牛血清蛋白、电泳分子量Marker，福林酚、N,N,N',N'-四甲基二乙胺、β-巯基乙醇、十二烷基硫酸钠、三氯乙酸、去氧胆酸钠、冰醋酸、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、溴酚蓝、考马斯亮蓝R-250均购于Sigma公司。所有试剂均为分析纯。
1.3 试验方法
1.3.1 甘薯蛋白的制备 新鲜甘薯清洗，去皮，切块浸泡于含0.1% NaHSO3的0.1 mol·L-1Tris-HCl缓冲液（pH 7.5）中（1 L溶液/1 kg鲜薯），然后打浆，取浆液用管式分离机（16 000 r/min）除去淀粉等杂质得上清液，将该液用10 000分子量的膜超滤装置超滤后用高速离心机在10 000×g条件下离心1 h，取上清液浓缩脱盐后冻干得蛋白粉，测得该蛋白粉纯度为85.86%。
1.3.2 乳化液的制备 均质前向预先准备好的不同浓度（0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mol·L-1）氯化钙溶液（pH 7）中加入一定量的甘薯蛋白粉，磁力搅拌2 h，甘薯蛋白粉溶液的最终浓度为1.0%（w/v）。分别取不同氯化钙浓度的该蛋白粉溶液3 mL与1 mL 玉米油混合，用漩涡混合仪混匀，混合液立刻用装配有12 mm工作头的高速机械均质机在室温下23 000 r/min均质60 s得新鲜乳化液立即用于以下的分析。
1.3.3 乳化颗粒粒径测定新鲜乳化液和室温下静止2 h后的乳化液分别溶解在1.0%（w/v）SDS溶液和蒸馏水后，再用激光粒度分析仪测定乳化液的表面积等效平均粒径（d3,2）和体积等效平均粒径（d4,3）。乳化颗粒的比表面积（S v）由Walstra的方法[14]计算得到：S v=6Φ/d3,2（m2·mL-1），Φ为油相体积分数（0.25），d3,2为表面积等效平均粒径。
1.3.4乳化活性指数的测定 依照Pearce和Kinsella[15]的浊度法测定甘薯蛋白的乳化活性指数（EAI）。均质结束后立刻取20 μL不同蛋白浓度的乳化液稀释到5 mL 0.1%（w/v）SDS溶液中，用漩涡混合仪混匀后在500 nm处分别测定不同溶液吸光值。乳化活性指数（m2·g-1）被定义为每克蛋白质能形成的乳化颗粒的表面积。EAI=2×
2.303A/（1-φ）lC，A表示500 nm处吸光值，C表示甘薯蛋白粉溶液的蛋白浓度（0.0086 g·L-1），φ表示油相的组分数（0.25）, l表示光程（0.01 m）。
1.3.5 乳析指数的测定 将新鲜乳化液置于 1.0 cm×15 cm的玻璃试管中，在常温下放置后乳化液分成两层，上层为乳析层，下层为清液层。分别记录24
2342 中国农业科学43卷
h内每隔 2 h可视的乳析界面高度的变化。根据Keowmaneechai和McClements的方法[16]，乳析指数（CI）被定义为下层清液的高度（H s）除以整个乳化液的高度（H t）即：
CI（%）= 100×H s / H t。
1.3.6流变性质的测定 使用装配有椎体和平板模头的剪切型流变仪测定乳化液的黏度。椎体的直径是50 mm，椎角是1°。所有的测定均在25℃下进行。1.3.7界面吸附蛋白浓度的测定参考Patton和Huston的方法[17]，取一定量2 mL新鲜甘薯蛋白乳化液与同体积50%（w/v）蔗糖溶液用漩涡混合仪混匀，然后取2 mL该混合液置入盛有7 mL 5%（w/v）蔗糖溶液的塑料离心管底部，离心管在3 500×g条件下离心20 min后取出再放在-40 ℃下冷冻24 h后取出，离心管中溶液被分为3层。其中上层为析出的乳化颗粒，中层为蔗糖，下层为未被油滴吸附的蛋白。用剃须刀将上层和下层分别切下并将上层立刻溶解到 1.0%（w/v）SDS溶液中充分振荡后得到界面吸附蛋白液；将下层溶于蒸馏水中得到未被界面吸附蛋白液。依照Peterson和Markwell等的方法[18-19]测定并计算出1 mL 乳化液中的界面吸附蛋白含量C ad（mg·mL-1）。界面吸附蛋白浓度Г被定义为：Г=C ad/S v（mg·m-2），S v 为乳化颗粒的比表面积。
1.3.8SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）用SDS-PAGE分析甘薯蛋白乳化液界面吸附蛋白和未被界面吸附蛋白的组成。SDS-PAGE依照Laemmli法[20]进行。采用1.3.7的方法将未添加氯化钙的蛋白乳化液和添加0.15 mol·L-1浓度氯化钙蛋白乳化液分离出界面吸附蛋白溶液和未被界面吸附蛋白，并分别溶解在添加和不添加5% β-巯基乙醇的样品溶解液中。用甘薯蛋白作对照，采用不连续的缓冲液系统，浓缩胶和分离胶的浓度分别是5%和15%，用含50%甲醇、10%乙酸和0.25%考马斯亮蓝R-250的混合液对蛋白进行染色，用含40%甲醇和7%乙酸的混合液作为脱色液,摇床振荡8 h脱色后用凝胶成像系统拍照记录。
1.3.9 统计分析 每个试验3次重复，数据用SRS 8.1进行方差分析和均值比较，以P＜0.05为显著性检验标准。
2 结果
2.1 氯化钙对甘薯蛋白乳化颗粒粒径的影响
乳化颗粒d4,3是一个表征乳化液品质的重要参数。氯化钙浓度对甘薯蛋白乳化颗粒d4,3的影响如图1所示。新鲜乳化液的d4,3为4.20 μm。均质前向蛋白溶液中加入0.05 mol·L-1的氯化钙使乳化液的d4,3略有增加为 4.42 μm，且随着氯化钙浓度的升高（0.1—0.25 mol·L-1），乳化液d4,3呈逐渐增大的趋势（P＜0.05）。此外，与未静置的新鲜乳化液相比，不加氯化钙的乳化液静置后d4,3未显著增大，而加入不同浓度氯化钙的乳化液静置后d4,3均显著增大（P＜0.05），且这种趋势随着加入氯化钙浓度的增大变得越来越明显。
同一组内不同字母表示存在显著性差异（P＜0.05）
Different letters indicate significant difference at 5% level within the group
图1 氯化钙浓度对乳化颗粒平均粒径的影响
Fig. 1 Effect of different concentrations of calcium chloride on emulsion droplet average size
2.2 氯化钙对甘薯蛋白乳化活性的影响
图2表示氯化钙浓度对甘薯蛋白乳化活性指数的影响。不加氯化钙的甘薯蛋白的乳化活性指数为30.3 m2·g-1，当加入0.05 mol·L-1氯化钙后甘薯蛋白乳化活性指数显著地降低为27.6 m2·g-1（P＜0.05）。然而，随着氯化钙浓度的上升，氯化钙对甘薯蛋白的乳化活性指数影响的差异并不显著（P＞0.05）。
2.3 氯化钙对甘薯蛋白乳化液稳定性的影响
乳析指数是衡量乳化液稳定性的一个关键参数。如图3所示，添加和未添加氯化钙乳化液随着乳化液放置时间的延长，乳析指数均逐渐增大。但加入氯化钙能显著加快乳化液的乳析速率。在相同时间条件下，与未加入钙离子乳化液的乳析指数相比，加入不同浓度的氯化钙均能显著增加乳化液的乳析指数（P＜0.05）。在相同时间条件下氯化钙浓度越高其乳化液的乳析指数越大（P＜0.05）。
11期郭庆等：氯化钙对甘薯蛋白乳化特性的影响
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不同字母表示存在显著性差异（P＜0.05）
Different letters indicate significant difference at 5% level
图2 氯化钙浓度对甘薯蛋白乳化活性指数的影响
Fig. 2 Effect of different concentrations of calcium chloride on the emulsifying activity index of sweetpotato protein
图3 氯化钙浓度对甘薯蛋白乳化液乳析指数的影响
Fig. 3 Effect of different concentration of calcium chloride on the creaming index of sweetpotato protein emulsion
2.4 氯化钙对甘薯蛋白乳化液流变性质的影响
如图4所示，随剪切速率的增大所有乳化液的表观黏度都逐渐下降，这表明所有乳化液均为非牛顿流体即存在剪切变稀行为。与未加氯化钙的乳化液相比，加入0.05 mol·L-1的氯化钙，乳化液的初始表观黏度从3.19 Pa·s显著地增加到6.05 Pa·s（P＜0.05），且随着加入氯化钙浓度的增高（0.05—0.25 mol·L-1）乳化液的初始剪切黏度直线上升（P＜0.05），氯化钙浓度为0.25 mol·L-1时乳化液的初始剪切黏度最大为772 Pa·s。在相同剪切速率条件下，随着加入氯化钙浓度
图4 氯化钙浓度对甘薯蛋白乳化液流变性质的影响
Fig. 4 Effect of different concentrations of calcium chloride on the rheological property of sweetpotato protein
emulsion
的提高乳化液的表观黏度逐渐增大。随着剪切速率的增大，未加氯化钙的乳化液（0 mol·L-1）在高剪切速率区（10—100 1/s）的表观黏度逐渐趋于稳定达到一个常数，表现出一定的牛顿流体特征，而加入不同浓度氯化钙的乳化液均未发现有此现象。
2.5 氯化钙对甘薯蛋白乳化液界面吸附蛋白浓度的
影响
氯化钙浓度对界面吸附蛋白浓度的影响如图5所示，添加氯化钙后乳化液界面吸附蛋白浓度呈显著上升（P＜0.05），且随着氯化钙浓度的升高（0.05—0.20 mol·L-1），乳化液的界面吸附蛋白的浓度显著增大（P＜0.05）。当氯化钙浓度达到0.2 mol·L-1后，继续
不同字母表示存在显著性差异（P＜0.05）
Different letters indicate significant difference at 5% level
图5 氯化钙浓度对界面吸附蛋白浓度的影响
Fig. 5 Effect of different concentrations of calcium chloride on the interfacial adsorbed protein concentration
2344 中国农业科学43卷
增加其浓度界面吸附蛋白的浓度不再显著增加（P＞0.05）。未加氯化钙乳化液界面吸附蛋白浓度仅为1.73 mg·m-2，当添加0.25 mol·L-1浓度的氯化钙后，乳化液界面吸附蛋白浓度增加至9.38 mg·m-2，增加了约5倍。
2.6 氯化钙对甘薯蛋白乳化液界面吸附蛋白组成的
影响
在非还原条件下，甘薯蛋白主要有22、31 和50 kD 3条染色带，分别相当于Sporamin B、SporaminA 和Sporamin二聚体（图6-b 泳道1）[21-22]。甘薯蛋白不含钙离子乳化液的未被界面吸附蛋白也存在与甘薯蛋白相类似的三条染色带（图6-b 泳道3），而被界面吸附的蛋白质只显示出22和31 kD两条染色带，说明Sporamin二聚体未被油滴界面吸附。甘薯蛋白含钙离子的乳化液未被界面吸附的蛋白除显示出与甘薯蛋白类似的3条染色带之外，还在泳道顶端发现有＞66 kD更高分子量染色条带出现（图6-b 泳道5）。而甘薯蛋白含钙离子乳化液的界面吸附蛋白除了有22、31 kD两条染色带外，也在泳道顶端存在＞66 kD高分子量染色带。然而，31 kD染色带显色很淡，说明当加入钙离子后Sporamin A较难被乳化液油滴界面吸附（图6-b 泳道4）。
在还原条件下，Sporamin A和Sporamin B两条染色带消失并主要生成了约25 kD的1条染色带；上述高分子量的染色带均消失，表明高分子量的物质是由S-S键连接而成（图6-a）[22]。
1：甘薯蛋白；2：未加氯化钙乳化液界面吸附的甘薯蛋白；3：未加氯化钙乳化液未被界面吸附的甘薯蛋白；4：添加氯化钙乳化液界面吸附甘薯蛋白；5：添加氯化钙乳化液界面未被吸附甘薯蛋白
1: Sweetpotato protein; 2: Interfacial adsorbed protein without CaCl2; 3: Interfacial unadsorbed protein without CaCl2; 4: Interfacial adsorbed protein with CaCl2;5: Interfacial unadsorbed protein with CaCl2
图6 还原（a）与非还原（b）条件下的SDS-PAGE图谱
Fig. 6 SDS-PAGE patterns in the presence (a) and absence (b) of β-mercaptoethanol
3 讨论
EAI表示乳化剂的乳化效率[23]，乳化活性指数越高说明乳化剂的乳化活性越好。蛋白质的乳化活性可能决定于蛋白质分子吸附到乳化颗粒界面动力学过程的早期。蛋白质分子吸附的速率与其在溶液中的扩散系数有关，其扩散系数越大吸附速率也越高，故乳化活性指数也越大[24]。加入不同浓度氯化钙甘薯蛋白乳化液的EAI均显著下降，但是加入不同浓度氯化钙后的甘薯蛋白乳化液的EAI无显著差异（图2）。这可能是因为加入0.05 mol·L-1的氯化钙能显著地降低甘薯蛋白分子的扩散系数（溶解度下降导致），导致其自由扩散活化能增大使EAI降低，然而进一步增大氯化钙浓度（0.05—0.25 mol·L-1）对甘薯蛋白溶解度的影响并不显著[13]，故对扩散系数影响也较小，所以EAI 没有显著变化。
在中性pH条件下，加入氯化钙以后新鲜乳化颗粒d4,3显著增大，这可能是因为甘薯蛋白在溶液中与钙离子结合使其构象发生变化，蛋白质分子不能立即覆盖匀质过程中新形成的油滴界面和获得低自由能状
11期郭庆等：氯化钙对甘薯蛋白乳化特性的影响 2345
态[25]，一些具有高表面自由能的小乳化颗粒会聚结形成更大的乳化颗粒，导致了乳化颗粒d4,3增大且这种趋势随着钙离子浓度的增大越来越明显。加入不同浓度氯化钙乳化液静置2 h后d4,3变得越来越大（图1），其原因可能是由于放置后乳化颗粒形成了絮凝体。这种絮凝体在乳清蛋白添加钙离子后也会产生[8]。乳析指数可间接地表示乳化液中乳化颗粒的絮凝程度，絮凝程度越高，乳析指数越大[26]。在中性pH 条件下加入不同浓度氯化钙的乳化液静置2 h后乳析指数均明显升高（图3），这与粒径测定的结果是一致的。
乳化液初始表观黏度与其絮凝程度有较大的关系，高黏度表示乳化液絮凝明显[27]。因此，甘薯蛋白乳化液初始剪切黏度随氯化钙浓度的增加而增大（图4），说明钙离子能促进甘薯蛋白乳化液絮凝。此外，未添加氯化钙乳化液的界面吸附蛋白浓度为 1.73 mg·m-2（图5），这已接近已报道的单层球蛋白饱和吸附浓度2—3 mg·m-2[28]。随着氯化钙浓度的增加，甘薯蛋白乳化液界面吸附蛋白的浓度显著增加，这可能是由于添加高浓度的钙离子导致甘薯蛋白结构变化，因此可能会促进其疏水相互作用并在油滴表面形成不规则的多吸附层，但是界面吸附蛋白增加却没有促进乳化液的稳定。这与Home和Leaver对酪蛋白的研究结果是类似的[29]。其原因可能是钙离子的加入导致乳化颗粒之间相互作用增强。
在中性pH条件下添加氯化钙后，Sporamin A不容易被乳化界面吸附，可能是由于Sporamin A参与形成了＞66 kD的高分子聚合物（图6-b），当加入β-巯基乙醇后该高分子聚合物被分解（图6-a），表明在乳化液中和乳化颗粒界面上存在的高分子聚合物是由Sporamin A蛋白与钙离子通过S-S键连接而成。这种连接也存在于乳化颗粒之间，并造成乳化液通过架桥产生絮凝。
4 结论
在中性pH条件下，加入氯化钙能显著降低甘薯蛋白的乳化活性和乳化稳定性。钙离子与甘薯蛋白结合能引起其结构变化并改变甘薯蛋白乳化液界面吸附蛋白的组成并显著提高界面吸附蛋白浓度。此外，在甘薯蛋白乳化液和乳化颗粒界面上存在的高分子聚合物是由Sporamin A蛋白与Ca2+间通过S-S键连接而成，这种架桥也存在于乳化颗粒之间并造成了乳化液稳定性的降低。References
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（责任编辑曲来娥）