东北农业大学
硕士学位论文
甜菜谷氨酸合成酶（GOGAT）酶学特性及氮素对其酶活性的调控
姓名：滕祥勇
申请学位级别：硕士
专业：作物学；作物栽培学与耕作学
指导教师：李彩凤
2012-06-02
酶工程复习提纲 第一章绪论 1.酶及酶工程的概念。 酶：是生物体内一类具有催化活性和特殊空间构象的生物大分子物质。 酶工程：利用酶的催化作用，在一定的生物反应器中，将相应的原料转化成所需产品的一门工程技术。(名词解释) 2.了解酶学的发展历史，尤其是一些关键事件。 1833年，Payen和Persoz发现了淀粉酶。1878年，Kuhne首次将酵母中进行乙醇发酵的物质称为酶。给酶一个统一的名词，叫Enzyme，这个词来自希腊文，其意思“在酵母中”。 1902年，Henri提出中间产物学说。1913年，Michaelis and Menton推导出酶催化反应的基本动力学方程，米氏方程：V=VmS/（Km+S）。1926年，Summer分离纯化得到脲酶结晶。人们开始接受“酶是具有生物催化功能的蛋白质”。Cech and Altman于1982和1983年发现具有催化活性的RNA即核酸类酶，1989年获诺贝尔化学奖。现已鉴定出5000多种酶，上千种酶已得到结晶，而且每年都有新酶被发现。 3.了解酶在医药、食品、轻工业方面的应用。 医药：（1）用酶进行疾病的诊断：通过酶活力变化进行疾病诊断，谷丙转氨酶/谷草转氨酶用于诊断肝病、心肌梗塞等，酶活力升高；葡萄糖氧化酶用于测定血糖含量，诊断糖尿病。 （2）用酶进行疾病的治疗：来源于蛋清、细菌的溶菌酶用于治疗各种细菌性和病毒性疾病；来源于动物、蛇、细菌、酵母等的凝血酶用于治疗各种出血病；来源于蚯蚓、尿液、微生物的纤溶酶用于溶血栓。 （3）用酶制造各种药物：来源于微生物的青霉素酰化酶用于制造半合成青霉素和头孢菌素；来源于动物、植物、微生物的蛋白酶用于生产L-氨基酸。 食品：生产低聚果糖，原料为蔗糖，所需酶为果糖基转移酶、蔗糖酶α（黑曲霉、担子菌）；生产低聚异麦芽糖，原料为淀粉，所需酶为α-淀粉酶、β-淀粉酶、真菌α-淀粉酶（米曲霉）、α-葡萄糖苷酶（黑曲霉）、普鲁兰酶、糖化型α-淀粉酶（枯草杆菌）。 轻工业：用酶进行原料处理；用酶生产各种轻工、化工产品；用酶增强产品的使用效果。
３结 论 植物乳杆菌素Ｌ－１经硫酸铵沉淀，透析除盐后效价达１２８０ＡＵ／ｍｌ，作用方式为杀菌。在７、１５、３０、３７℃下，添加植物乳杆菌素Ｌ－１对单增李斯特菌都有一定的抑制作用。７℃下该细菌素在１４４ｈ内控制住初始菌数，温度较高的情况下则可以在短时间内迅速降低活菌数。在选用的六种ｐＨ下，ｐＨ７．０时植物乳杆菌素Ｌ－１的抑菌效果最好。不论在培养基中还是ｐＨ７．０，５ｍｍｏｌ／Ｌ的磷酸缓冲液中，盐对该细菌素具有一定的拮抗作用，各盐分之间和同种盐不同浓度之间差异不显著。有关吸附作用的研究发现：低ｐＨ（５．０～５．５）下，植物乳杆菌素Ｌ－１不能吸附在单核细胞增生李斯特氏菌上，而ｐＨ６．０～７．５下有５０％吸附在指示菌上。盐对该细菌素吸附单核细胞增生李斯特氏菌没有显著影响。 参考文献： ［１］ 吕燕妮， 李平兰， 江志杰． 乳酸菌３１－１菌株产细菌素的初步研究［Ｊ］． 中国食品学报， ２００３， 增刊： １３０－１３３． ［２］郁庆福， 蔡宏道， 何晓青， 等． 现代卫生微生物学［Ｍ］． 北京： 人民卫生出版社， １９９５． １１６－１１７． ［３］ Ｓｏｐｈｉｅ Ｍ Ｐ， Ｅｍｉｌｉａ Ｆ， Ｒｉｃｈａｒｄ Ｊ． Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｐａｒｔｉａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄ ｍｏｄｅ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉｎ ＥＦＳ２， ａｎ ａｎｔｉｌｉｓｔｅｒｉａｌ ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ａ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ａ ｃｈｅｅｓｅ［Ｊ］．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １９９６， ３０： ２５５－２７０． ［４］ Ａｔｒｉｈ Ａ， Ｒｅｋｈｉｆ Ｎ， Ｍｏｉｒ Ａ Ｊ Ｇ， ｅｔ ａｌ． Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｃ１９［Ｊ］． ＣａｎａｄａｎＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １９９３， ３９： １１７３－１１７９． ［５］ Ａｔｒｉｈ Ａ， Ｒｅｋｈｉｆ Ｎ， Ｍｏｉｒ Ａ Ｊ Ｇ， ｅｔ ａｌ． Ｍｏｄｅ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｌａｎｔａｒｉｃｉｎ Ｃ１９， ａｎ ａｎｔｉ－Ｌｉｓｔｅｒａ ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ ｐｒｏ－ｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｃ１９［Ｊ］． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＦｏｏｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２００１， ６８： ９３－１０４． ［６］ Ｒｏｎｇｇｕａｎｇ Ｙ， Ｍｏｎｔｙ Ｃ Ｊ， Ｂｉｂｅｋ Ｒ． Ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ｌａｒｇｅａｍｏｕｎｔｓ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎｓ ｆｒｏｍ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ［Ｊ］． Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉ－ｒｏｎｍｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １９９２， ５８： ３３５５－３３５９． ［７］还连栋， 贾士芳， 庄增辉， 等． 乳链菌肽（ＮＩＳＩＮ）的杀菌作用机制［Ｊ］．中国食品添加剂， １９９７， （４）： ２０－２３． ［８］ Ｓ Ｔｏｄｏｒｏｖ， Ｂ Ｏｎｎｏ， Ｏ Ｓｏｒｏｋｉｎｅ， ｅｔ ａｌ． Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆａ ｎｏｖｅｌ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍＳＴ ３１ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｓｏｕｒｄｏｕｇｈ［Ｊ］． Ｉｎｔ Ｊ Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， １９９９， ４８： １６７－１７７． 收稿日期：２００５－０１－２１ 作者简介：毕金峰（１９７０－），男，副教授，博士后，主要从事食品化学与生物技术研究。 耐高温α－淀粉酶的酶学性质研究 毕金峰１，董福奎２ （１．中国农业科学院农产品加工研究所 农业部农业核技术与农产品加工重点实验室，北京 １０００９４； ２．内蒙古呼和浩特市赛罕区蔬菜技术推广站，内蒙古 呼和浩特 ０１００２０） 摘 要：耐高温α－淀粉酶是淀粉生产麦芽糖的关键酶。本文对两种耐高温α－淀粉酶的酶学性质进行了对比研究。结果表明：两种酶的耐高温能力差别较大，酶活差别明显；最适ｐＨ值均为７．０，耐酸性较差；当Ｃａ２＋浓度在７～９ｍｍｏｌ／Ｌ时，酶活提高明显。关键词：耐高温α－淀粉酶；性质 Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｈｅａｔ－ｒｅｓｉｓｔｉｎｇ α－ａｍｙｌａｓｅ ＢＩ Ｊｉｎ－ｆｅｎｇ１，ＤＯＮＧ Ｆｕ－ｋｕｉ２ （１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｇｒｏ－Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｇｒｏ－Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ， ＭＯＡ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００９４， Ｃｈｉｎａ；２．Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｏｐｕｌａｒｉｚｅ Ｓｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｉｈａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ ｉｎ Ｈｕｈｅｈａｏｔｅ Ｃｉｔｙ， Ｈｕｈｅｈａｏｔｅ ０１００２０， Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ ：Ｈｅａｔ－ｒｅｓｉｓｔｉｎｇ α－ａｍｙｌａｓｅ ｉｓ ａ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｅｎｚｙｍｅ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｍａｌｔｏｓｅ． Ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｈｅａｔ－ｒｅｓｉｓｔｉｎｇα－ａｍｙｌａｓｅｓ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ： ｔｈｅ ｈｅａｔ－ｒｅｓｉｓｔｉｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ ｆｏｒ ｔｗｏ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅｓ ｗａｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ，ａｎｄ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ａｎ ｅｖｉｄｅｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｐＨ ｗａｓ ７．０， ａｎｄ ｔｈｅ ａｃｉｄ－ｒｅｓｉｓｔｉｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ ｗａｓ ｐｏｏｒ． Ｔｈｅ
Lecture1 酶学与酶工程 1、酶的概念，命名、酶的活性中心 1）酶是由活细胞产生的，具有催化活性和高度转移性的特殊蛋白质，是一类生物催化剂。 酶工程：将酶学理论与化工技术相结合，研究酶的产生和应用的一门新的技术性学科，包括了酶制剂的制备、酶的固定化、酶的修饰与改造及酶反应器等方面。 主要:酶的生产、酶的分离纯化、酶的固定化和酶生物反应器。 化学酶工程：用化学手段修饰、改造、模拟天然酶，使其更适合人们的需要，主要包括天然酶、化学修饰酶、固定化酶以及化学人工合成酶的研究与应用。 生物酶工程：用生物学的方法，特别是基因工程、蛋白质工程和组合库筛选法改造天然酶，创造性能优异的新酶，主要是抗体酶、杂合酶、进化酶和核酸酶的研究与应用。 2）命名：系统命名法！！ 催化下列反应酶的命名：ATP+D—葡萄糖→ADP+D—葡萄糖-6-磷酸 该酶的正式系统命名是：ATP：葡萄糖磷酸转移酶，表示该酶催化从ATP中转移一个磷酸到葡萄糖分子上的反应。 它的分类数字是：E.C.2.7.1.1 E.C代表按国际酶学委员会规定的命名 第1个数字(2)代表酶的分类名称(转移酶类) 第2个数字(7)代表亚类(磷酸转移酶类) 第3个数字(1)代表亚亚类(以羟基作为受体的磷酸转移酶类) 第4个数字(1)代表该酶在亚-亚类中的排号(D葡萄糖作为磷酸基的受体） 3）活性中心 必需基团：酶分子中氨基酸残基侧链的化学基团中，一些与酶活性密切相关的基因 酶的活性中心：必需基团在空间结构上彼此靠近，组成具有特定空间结构的区域，能与底物特异结合并将底物转化为产物。 2、酶的分类、组成、结构特点和作用机制 分类：按酶促反应的性质分类（六大类）：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶类、异构酶类、合成酶类 全酶=酶蛋白+辅因子 辅因子包括：有机辅因子（辅酶非共价结合/辅基非共价结合或共价结合）和金属辅因子（金属酶/金属激活酶） 3、酶作为催化剂的显著特点 强大的催化能力：可以加快至1017倍； 没有副反应，酶在较温和的条件下催化反应的进行； 高度的专一性，各种酶都有专一性但是专一程度的严格性上有所差别； 可调节性，包括了抑制剂和激活剂的调节、反馈抑制调节、共价修饰调节和变构调节等；
1.6 酶学性质研究 （1）pH 的影响：分别测定粗酶液在pH3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0下的酶活力，确定其最适反应pH 值；将粗酶液用上述pH 缓冲液稀释后，45℃水浴保温4小时后，测定其剩余酶活力。 （2）温度的影响：分别在40~95℃下测定酶活力，确定其最适反应温度；将酶液在40～90℃范围内的不同温度下保温60 min 后，测定其剩余酶活力。 （3）金属离子的影响：在酶液中分别添加各种金属离子，使其浓度为4 mmol ／L ，然后测定酶活力。 2.5 纤维素酶粗酶液酶学性质 2.5.1酶反应的最适pH 值和酶的pH 稳定性 粗酶液在不同pH 值下测得的酶活及在不同pH 值下处理4小时后测得的相对酶活示于图11。结果表明，CMCase 在pH 3.5～4.5有较高的酶活力，最适反应pH 值为4.0；β-Gluase 在pH 4.5～5.5酶活力较高，最适反应pH 值为5.0，同样方法测得FPA 最适反应pH 为5.0。可见，该菌株所产的各组分纤维素酶是酸性酶。 图11表明，该菌产CMCase 在pH3.0～6.0的范围内，β-Gluase 在pH3.5～5.5的范围内，酶活力均可保持在80％以上，说明该菌株所产酸性纤维素酶可在较宽的pH 值范围内保持其酶活力的稳定性。2.5.2 酶反应的最适温度和酶的热稳定性 在不同温度下直接进行酶促反应测得的酶活及在不同温度下热处理60 min 后于最适反应温度和最适pH 下测得的相对酶活(以4℃保存的酶液活力为100%)示于图12。结果表明，CMCase 、β-Gluase 及FPA 最适反应温度均为65℃。 c e l l u l a s e a c t i v i t y ( U .m l -1) pH r e l a t i v e y a c t i v i t y （%） c e l l u l a s e a c t i v i t y ( U .m l -1) temperature ( o C ) r e l a t i v e y a c t i v i t y （%） 图11 pH 值对酶活力及酶稳定性的影响 Fig.10 Effects of pH value on Cellulase activity and stability 图12 温度对酶活力及酶稳定性的影响 Fig.11 Effects of temperature on activity and stability of cellulase
实验四酶学性质研究 一、实验目的 1、了解pH、温度、金属离子对酶的活性的影响机理； 2、掌握如何选择酶催化反应的最适pH、温度和获得最适pH条件的确定、以及Km常数的测定。 二、实验原理 酶促反应速度受介质pH的影响，一种酶在几种pH介质中测其活力，可看到在某一pH时酶促效率最高，这个pH称为该酶的最适pH。pH影响酶分子的活性部位的解离，另外，也影响底物的解离状态，从而影响酶活性中心的结合与底物或催化。其次，有关基团解离状态的改变影响酶的空间构象，甚至会使酶变性。酶的最适pH不是酶的特征性常数，如缓冲液的种类与浓度，底物浓度等均可改变酶作用的最适pH。 在一定温度范围内，酶促反应速率随温度的升高而加快；但当温度高到一定限度时，酶促反应速率不仅不再加快反而随着温度的升高而下降，最终，酶因高温变性失去活性，失去了催化能力。在一定条件下，每一种酶在某一温度时活力最大，这个温度称为这种酶的最适温度 在进行酶学研究时一般都要制作一条pH与酶活性的关系曲线，即保持其他条件恒定，在不同pH条件下测定酶促反应速度，以pH值为横坐标，反应速度为纵坐标作图。由此曲线，不仅可以了解反应速度随pH值变化的情况，而且可以求得酶的最适pH。最适温度的实验方法和pH类似。 酶促动力学研究酶促反应的速度及影响速度的各种因素，而米氏常数K m值等于酶促反应速度为最大速度一般时所对应的底物浓度，其值大小与酶的浓度无关，是酶促反应的特征常数。不同酶的K m值不同，同一种酶与不同的底物反应
时，其Km值也不同，Km值反映了酶和底物亲和力的强弱程度，Km值越大，表明酶和底物的亲和力越弱；Km值越小，表明酶与底物的亲和力越强。 酶的活力就是酶所催活的反应速度，通常用单位时间内底物的减少或产物的增加来表示。酶反应过程中产物的生成和时间的关系可以用进程曲线来说明，曲线的斜率就是酶反应过程中的反应速度。从进程曲线来看，在一定时间内反应速度维持恒定，但随着时间的延长，反应速度逐渐降低，这是由多种因素造成的。所以，为了准确表示酶的反应速度必须采用初速度，即保持恒定时的速度。同样，不同酶浓度下的反应进程曲线也可以说明这个问题。V=Vmax[S]/Km+[S]，Vmax 指该酶促反应的最大速度，[S]为底物浓度，Km是米氏常数，V是在某一底物浓度时相应的反应速度。双倒数作图（将米氏方程两边取倒数，可转化为下列形式：1／V=Km／Vmax.1／[S]+1／Vmax，可知，1/V对1/[S]的作图得一直线，其斜率是Km/V，在纵轴上的截距为1/Vmax，横轴上的截距为-1/Km。此作图除用来求Km和Vmax值外，在研究酶的抑制作用方面还有重要价值 三、实验器材与试剂 1、试剂：磷酸二氢钠、柠檬酸、ABTS、酸性靛蓝。 2、器材：可见分光光度计、恒温水浴锅、试管、酸度计 四、操作步骤 1、配置缓冲溶液 按下表配置缓冲溶液，其溶液pH值以酸度计测定值为准。
酶工程复习题 一、选择题： 1.下面关于酶的描述，哪一项不正确( ) （A）（答案）所有的蛋白质都是酶 （B）酶是在细胞内合成的，但也可以在细胞外发挥催化功能 （C）酶具有专一性 （D）酶是生物催化剂 2.下列哪一项不是辅酶的功能( ) （A）转移基团 （B）传递氢 （C）传递电子 （D）（答案）决定酶的专一性 3.下列对酶活力的测定的描述哪项是错误的( ) （A）酶的反应速度可通过测定产物的生成量或测定底物的减少量来完成 （B）需在最适pH条件下进行 （C）（答案）按国际酶学会统一标准温度都采用25℃ （D）要求[S]远远小于[E] 4.下列关于酶活性部位的描述，哪一项是错误的 （A）活性部位是酶分子中直接与底物结合，并发挥催化功能的部位 （B）活性部位的基因按功能可分为两大类：一类是结合基团，一类是催化基团（C）酶活性部位的集团可以是同一条肽链但在一级结构上相距很远的集团（D）（答案）不同肽链上的有关基团不能构成该酶的活性部位 5.酶的高效率在于 （A）增加活化能 （B）降低反应物的能量水平 （C）增加反应物的能量水平 （D）（答案）降低活化能
6.作为催化剂的酶分子，具有下列哪一种能量效应 （A）增高反应活化能 （B）（答案）降低反应活化能 （C）增高产物能量水平 （D）降低产物能量水平 二、填空题 1.酶和菌体固定化的方法很多。主要可分为吸附法、结合法、交联法和热处理法 2.系统命名法根据酶所催化的反应类型，将酶分为6大类。即1、氧化还原酶；2、转移酶； 3、水解酶； 4、裂合酶； 5、异构酶； 6、合成酶（或称连接酶）。 3.酶分子修饰中，经过修饰的酶的特性会改变，即可提高酶活力，增加稳定性或降低抗原性。 4.决定酶催化活性的因素有两个方面，一是酶分子结构，二是反应条件。 5.酶的特点酶是生物催化剂；其反应条件温和、催化效率高；酶具有高的作用专一性；其化学本质具有蛋白质性质。 6.常用产酶菌有细菌（大肠杆菌）；霉菌（黑曲酶；青酶；木酶；根酶）；放线菌（链酶菌）；酵母等。 7.通常酶的固定化方法有吸附法共价键结合法交联法包埋法 8.对生产酶的菌种来说，我们必须要考虑的条件有，一是看它是不是致病菌，二是能够利用廉价原料，发酵周期短，产酶量高，三是菌种不易退化，四是最好选用能产生胞外酶的菌种，有利于酶的分离纯化，回收率高。 9. 酶的生产方法有提取法，发酵法和化学合成法。 10. 借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。 11. 酶的分离纯化方法中，根据目的酶与杂质分子大小差别有凝胶过滤法，超滤法和超离心法三种。 12.酶的特点酶是生物催化剂；其反应条件温和、催化效率高；酶具有高的作用专一性；其化学本质具有蛋白质性质。 13.在酶的发酵生产中，培养基要从营养的角度考虑碳源、氮源、无机盐、生长因素的调
实验四多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质 This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020
实验四、马铃薯块茎多酚氧化酶（PPO）活性测定及酶学性质一、实验目的 1掌握分光光度法测定多酚氧化酶活性的一般原理及操作技术方法。 2了解酶的活性与植物组织褐变以及生理活动之间的关系。 二、实验原理 马铃薯不耐储藏，在加工过程中去皮切分后非常容易发生酶促褐变，使外观品质和营养价值大为降低，制约着马铃薯的开发利用。酶促褐变是马铃薯加工产业必须解决的难题。其中多酚氧化酶是导致马铃薯等果蔬发生酶促褐变的重要酶类。多酚氧化酶活性大小直接影响酶促褐变程度。 多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)又称酪氨酸酶、儿茶酚酶、酚酶等．是自然界中分布极广的一种含铜氧化酶．普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中。植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成醌，使组织形成褐变．以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。研究多酚氧化酶的特性对食品的加工与保藏工艺有非常重要的意义。因此，检测食品中多酚氧化酶具有重要意义。 多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在一定的温度、pH条件下，有氧存在时，能使催化邻苯二酚氧化生成有色物质，单位时间内有色物质在410nm处的吸光度与酶活性强弱成正相关，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD值的变化确定PPO的酶活大小。 多酚氧化酶 邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2O 2——————→邻醌＋H 2 O
三、试验材料、试剂及试验用品 1．材料：马铃薯块茎。 2．仪器：分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵；试管；移液管；容量瓶 3．试剂：L 磷酸缓冲液（pH=）；L邻苯二酚；L磷酸氢二钠；L磷酸二氢钠；10mmol/L 柠檬酸；10mmol/L抗坏血酸；10mmol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA）；10mmol/L亚硫酸钠 四、实验方法： 1.多酚氧化酶的提取 取马铃薯块茎样品，加入预冷的磷酸缓冲液（）3ml，研磨匀浆，转移到离心管中，再用7mL磷酸缓冲液冲洗研钵，合并提取液，在４℃下离心（8000r/min）5min，取上清液为多酚氧化酶提取液，并量取粗酶液体积。 2.多酚氧化酶活性测定 采用比色法测定。将ｍl邻苯二酚加入2ｍl磷酸缓冲液（ｐＨ）中，加入ｍl酶提取液，立即于波长410nm下测定吸光值，2min后再计吸光值，以不加酶提取液的反应液做对照(注意空白为： ml缓冲液和 mL邻苯二酚溶液)。以每分钟吸光度变化为1个多酚氧化酶活性单位。 表1 多酚氧化酶活性测定
酶学与酶工程复习资料 上一届考试试题 一、名字解释 1、酶的活性中性：酶分子中直接与底物结合，并和酶催化作用直接有关的区域叫酶的活性中心，参与构成酶的活性中心和维持酶的特定构象所必需的基团为酶的必需基团。 2、米式方程及各字母的意义：米氏方程表示一个酶促反应的起始速度v与底物浓度S关系的速度方程，v＝V max·S/（K m+S）。其中 K m值称为米氏常数，V max是酶被底物饱和时的反应速度，[S]为底物浓度。由此可见K m值的物理意义为反应速度（v）达到1/2V max时的底物浓度（即K m=[S]），单位一般为mol/L，只由酶的性质决定，而与酶的浓度无关。 3、别构效应：一个蛋白质与其配体（或其他蛋白质）结合后，蛋白质的空间结构发生改变，使它适用于功能的需要，这一类变化称为别构效应或变构效应。 4、遗传密码：遗传密码决定蛋白质中氨基酸顺序的核苷酸顺序，由3个连续的核苷酸组成的密码子所构成。 5、盐析：增加中性盐浓度使蛋白质、气体、未带电分子溶解度降低的现象。是蛋白质分离纯化中经常使用的方法，最常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠和氯化钠等。 6、内囊性包埋法：系利用天然的或合成的高分子材料（统称为囊材）作为囊膜壁壳，将固态或液态药物包裹成为的药库型微型胶囊。 7、固定化酶：水溶性酶经物理或化学方法处理后，成为不溶于水的但仍具有酶活性的一种酶的衍生物。在催化反应中以固相状态作用于底物。 8、必需水：维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水量。 二、问答题 1、温度对酶促反应的影响及原因。 答：温度对酶促反应的影响包括两方面：一方面是当温度升高时，反应速度也加快，这与一般化学反应相同。另一方面，随温度升高而使酶逐步变性，即通过减少有活性的酶而降低酶的反应速度。在低于最适温度时，前一种效应为主，在高于最适温度时，则后一种效应为主，因而酶活性丧失，反应速度下降。 2、操纵子的定义及组成。 答：操纵子：指启动基因、操纵基因和一系列紧密连锁的结构基因的总称，基因表达的协同单位，转录的功能单位。很多功能上相关的基因前后相连成串，由一个共同的控制区进行转录的控制，包括结构基因以及调节基因的整个DNA 序列。操纵子通常由2个以上的编码序列与启动序列、操纵序列以及其他调节序列在基因组中成簇串联组成。 3、蛋白质合成过程当中的主要物质。 答：主要为mRNA、tRNA、氨基酸、核糖核蛋白体以及有关的酶和辅助因子。蛋白质合成是以mRNA为模板，以氨基酸为底物，在核糖体上通过各种tRNA、酶和辅助因子的作用，合成多肽链的过程。 4、酶生物合成模式有哪几种及其特点?简述其接近理想模式的方法？ 答：1、同步合成型：酶的生物合成与细胞生长同步进行的一种酶生物合成模式。该类型酶的 生物合成速度与细胞生长速度紧密联系，又称为生长偶联型。2、延续合成型：酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成一段较长时间。3、中期合成型：酶在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的生物合成也随着停止。4、滞后合成型：酶是在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生物合成并大量积累，又称为非生长偶联型，许多水解酶的生物合成都属于这一类型。 在酶的发酵生产中，为了提高产酶率和缩短发酵周期，最理想的合成模式应是延续合成型。属于延续合成型的酶，在发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞一开始生长就有酶产生，直至细胞生长进入平衡期以后，酶还可以继续合成一段较长的时间。对于其他合成模式的酶，可以通过基因工程\细胞工程等先进技术,选育得到优良的菌株, 并通过工艺条件的优化控制, 使他们的生物合成模式更加接近于延续合成型。其中对于同步合成型的酶，要尽量提高其对应的mRNA的稳定性，为此适当降低发酵温度是可取的措施；对于滞后合成型的酶，要设法降低培养基中阻遏物的浓度，尽量减少甚至解除产物阻遏或分解代谢物阻遏作用，使酶的生物合成提早开始；而对于中期合成型的酶，则要在提高mRNA的稳定性以及解除阻遏两方面考虑，使其生物合成的开始时间提前，并尽量延迟其生物合成停止的时间。 5、举例说明生物酶制剂生产工艺流程。 答：一、植物细胞培养的工艺流程：外植体→细胞的获取→细胞培养→分离纯化→产物。植物细胞培养产酶的工艺过程——大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（SOD）：1、大蒜愈伤组织的诱导：打破休眠的大蒜蒜瓣，去除外皮消毒在无菌条件下，将蒜瓣切成0.5cm3左右的小块，植入培养基中，25℃、600lux、12h/d光照的条件下培养18d，诱导得到愈
萌发小麦种子中淀粉酶酶学性质研究（东北农业大学，生命科学学院，黑龙江省哈尔滨市150030） 摘要： 酶是酶是一种生物催化剂，它具有催化剂属性，同是也具有一些无机催化剂所不具有的特性。催化特定化学反应的蛋白质、RNA或其复合体。是生物催化剂，能通过降低反应的活化能加快反应速度，但不改变反应的平衡点。本实验通过利用淀粉酶水解还原糖，还原糖能使3，5-二硝基水杨酸还原，生成棕色的3-氨基-5硝基水杨酸。淀粉酶活力与还原糖的量成正比，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位质量样品在一定时间内生成还原糖的量表示酶活力。以淀粉在碘液中显蓝色性质，探究酶活性影响因素，常见的影响因素有：温度 pH 活性剂和抑制剂等。 Abstract:Enzyme is a biological catalyst is an enzyme, the catalyst having the property, the same also has some inorganic catalysts do not have the characteristics. Proteins catalyze specific chemical reactions,RNA or a composite thereof. Are biological catalysts,by reducing the activation energy of the reaction to accelerate the reaction rate, but does not change the equilibrium reaction. In this study, the use of enzymatic hydrolysis of starch sugar, sugar makes 3,5-dinitrosalicylic acid reduction ,a brown 3-amino-nitro-salicylic acid.Proportional to the amount of amylase activity and reducing sugars,measuring the amount of amylase in starch sugar produced by colorimetry ,a unit mass of the sample at the certain time. 关键词： 淀粉酶活性温度 PH 激活剂和抑制剂 引言： 新陈代谢是生命活动的基础，是生命活动最重要的特征。而构成新陈代谢的许多复杂而有规律的物质变化与能量变化，都是在酶催化下进行的。生物的生长发育、繁殖、遗传、运动、神经传导等生命活动都与酶的催化过程紧密相关，可以说，没有酶的参与，生命活动一刻也不能进行。酶是细胞产生的，受多种因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂，与一般催化剂比较有以下不同点：酶易失活、酶具有很高的催化效率、酶具有高度专一性、酶活性受到调节和控制。而调节和控制又包括调节酶浓度、抑制剂和激活剂的调节等。[1] 按照淀粉酶水解淀粉的作用方式，可以分为α-淀粉酶、β-淀粉酶、异淀粉酶和麦芽糖酶四种类型。实验证明，当谷类种子萌发时，两类淀粉酶（α，β型）都存在，淀粉酶总酶
食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY 食品开发· 62 ·2012年 第37卷 第10期过氧化物酶(peroxidase，POD，EC1.11.1.7)收稿日期：2012-03-30 *通讯作者 基金项目：国家自然科学基金项目(31071625)。 作者简介：丁薪源(1989—)，女，吉林德惠人，硕士研究生，研究方向为食品质量与安全。 是广泛存在于各种动物、植物和微生物体内的一丁薪源，曹建康* (中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083) 摘要：综述了过氧化物酶在植物抗性方面的作用及研究意义，并对抗性相关酶POD 的分离纯化、同工酶谱、酶结构及分布等酶学特性进行了综述。分析得到，果蔬中过氧化物酶的最适pH 范围大部分集中在5.0~7.0之间，最适温度集中在30~60 ℃，对于大部分果蔬的过氧化物酶，Fe 2+、Fe 3+、Ca 2+、Mg 2+等金属离子有不同程度的激活作用，表面活性剂PEG 、SDS 和DETA 的激活作用不明显，甲醇、乙醇、丙酮、抗坏血酸、柠檬酸、L-半胱氨酸也有不同程度的抑制作用。研究表明，大多数植物的过氧化物酶分子量在30~60 ku 范围内，不同品种、不同发育期、不同器官之间的同工酶种类有所差异。同时，对过氧化物酶的发展前景进行了展望。关键词：植物抗性；过氧化物酶；酶学特性；同工酶；果蔬 中图分类号：TS 201.2+5 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2012)10-0062-05 Characteristics of peroxidase from fruit and vegetable research progress DING Xin-yuan, CAO Jian-kang * (College of Food Science & Nutritional Engineering, Chinese Agricultural University,Beijing 100083) Abstract: This paper described the peroxidase’s role in plant resistance and research significance, and summarized the characteristic of peroxidase, such as purification, isozymes, structure and distribution of POD. The result showed that, the optimum pH of the peroxidase in many fruits and vegetables concentrated in 5.0~7.0, the optimum temperature concentrated in 30~60 ℃. For many fruits and vegetables, peroxidase activities were stimulated in different degrees by some metal ions like Fe 2+, Fe 3+, Ca 2+, Mg 2+, and almost weren’t stimulated by surfactant like PEG, SDS, DETA. Methanol, ethanol, acetone, ascorbic acid, citric acid, L-cysteine have different degrees of inhibition to the peroxidase. Molecular weights of most of the PODs vary from 30 ku to 60 ku, and isoenzyme types are different between the different varieties, different developmental stages and different organs. This paper gave an overview of peroxidase development prospects.Key words : plant resistance; peroxidase; enzymatic characteristics; isozymes; fruits and vegetables 果蔬过氧化物酶酶学特性研究进展
第一章 1、蛋白质工程的产生： 1，最早的蛋白工程是福什特（Forsht）等在1982-1985年间对酪氨酰-t-RNA合成酶的分子改造工作。2，佩里（Perry）1984年通过将溶菌酶中Ile(3)改成Cys(3)，并进一步氧化生成Cys(3)-Cys（97）二硫键，使酶热稳定性提高，显著改进了这种食品工业用酶的应用价值。3，1987年福什特通过将枯草杆菌蛋白酶分子表面的Asp（99）和Glu（156）改成Lys，而导致了活性中心His（64）质子pKa从7下降到6，使酶在pH＝6时的活力提高10倍。 二，蛋白质工程的内容 1、定义：广义上来说，蛋白质工程是通过物理、化学、生物和基因重组等技术改造蛋白质或设计合成具有特定功能的新蛋白质。 2、内容：确定蛋白质的化学组成、空间结构与生物功能之间的关系。根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质 三，蛋白质工程的程序 蛋白质分子设计基因改造方案基因成或突变 分离纯化蛋白质结构蛋白质分子基因克隆与表达 目的基因和功能测定 改造的蛋白质分子 四，酶工程的应用范围 （1）对生物宝库中存在天然酶的开发和生产； （2）自然酶的分离纯化及鉴定技术； （3）酶的固定化技术（酶和细胞固定化）； （4）酶反应器的研制和应用； （5）与其他生物技术领域的交叉和渗透。 其中固定化酶技术是酶工程的核心。实际上有了酶的固定化技术，酶在工业生产中的利用价值才真正得以体现。 五，医用药物酶应用的问题：1）异体蛋白引起免疫反应；2）酶不纯，引起各种副作 3）酶在体内降解，时间短； 4）药物无法定向分布。 解决办法： 1) 制成微胶囊； 2) 制成衍生物；3) 制成脂质体包埋与免疫系统隔开(酶蛋白)；4) 酶上引入一定基团，起导向作用。 五，分子酶学与酶工程 1、酶——由活细胞产生的具有催化功能的蛋白质（或其它类型的生物大分子），是生物体进行代谢、维持生命活动的必需物质，没有酶就没有生命，因此研究酶的结构与功能、性质与作用机理，对于阐明生命现象的本质具有重要意义。
Breeding of D (–)-Lactic Acid High Producing Strain by Low-energy Ion Implantation and Preliminary Analysis of Related Metabolism Ting-Ting Xu &Zhong-Zhong Bai &Li-Juan Wang &Bing-Fang He Received:21January 2008/Accepted:5May 2008/Published online:24June 2008#Humana Press 2008 Abstract The low-energy nitrogen ion beam implantation technique was used in the breeding of mutant D (–)-lactic-acid-producing strains.The wild strain Sporolactobacillus sp.DX12was mutated by an N +ion beam with energy of 10keV and doses ranging from 0.4×1015to 6.60×1015ions/cm https://www.doczj.com/doc/1767932.html,bined with an efficient screening method,an efficient mutant Y2-8was selected after two times N +ion beam implantation.By using the mutant Y2-8,121.6g/l of D -lactic acid was produced with the molar yields of 162.1%to the glucose.The yield of D -lactic acid by strain Y2-8was 198.8%higher than the wild strain.Determination of anaerobic metabolism by Biolog MT2was used to analyze the activities of the concerned enzymes in the lactic acid metabolic pathway.The results showed that the activities of the key enzymes responded on the substrates such as 6-phosphofructokinase,pyruvate kinase,and D -lactate dehydrogenase were considerably higher in the mutants than the wild strain.These might be affected by ion beam implantation. Keywords Nitrogen ion beam implantation .D (–)-Lactic-acid-producing strain .Mutation .Breeding .Metabolic influence Introduction For centuries,lactic acid has traditionally been used in the food,textile,chemical,and pharmaceutical industries.In recent years,poly-L -lactic acid (PLLA)has attracted much interest as a renewable alternative to conventional petroleum-based plastics.Its properties make it useful for many applications such as biodegradable packaging and agricultural mulch film [1].However,thermal stability of PLA is not sufficiently high to some Appl Biochem Biotechnol (2010)160:314–321DOI 10.1007/s12010-008-8274-4 T.-T.Xu :Z.-Z.Bai :L.-J.Wang :B.-F.He (*) College of Life Science and Pharmaceutical Engineering,Nanjing University of Technology,Xinmofan Road 5,Nanjing,210009Jiangsu,China e-mail:bingfanghe@https://www.doczj.com/doc/1767932.html,
?Lecture 1 酶学与酶工程 ?酶的概念:酶（enzyme）是一类由活细胞产生的，具有催化活性和高度专一性的特殊蛋白质，是一类生物催化剂。 ? ?酶的分类(6类)、组成、结构特点？和作用机制？ 组成：单体酶、寡聚酶、多酶复合体 Note:一个酶蛋白可有多种催化活性，相当于多个酶(关注原核和真核生物的差别) 除水解酶和连接酶外，其他酶在反应时都需要特定的辅酶。 金属在酶催化中的作用：稳定酶构象、参与酶的催化作用（如激活底物）、电子传递体 ?酶作为催化剂的显著特点: 强大的催化能力：加快反应速度可高达1017倍; 没有副反应; 高度的专一性：各种酶都有专一性，但专一程度的严格性上有所差别; 可调节性; ?同工酶的概念:同一种属中由不同基因或（复）等位基因编码的多肽链所组成的单体、纯聚体或杂交体，其理化及生物学性质不同而能催化相同反应的酶称同工酶。 同一基因生成的不同mRNA所翻译出来的酶蛋白也列入同工酶的范畴。 酶蛋白合成后经不同类型的共价修饰（如糖基化等）而造成的多种酶分子形式，严格来说不属于同工酶而称为synzyme，但也有人称其为次生性同工酶（secondary isozyme）。 不同种属中催化相同反应的酶称为xenozyme，也不属于同工酶。
?酶的活性中心 指必需基团在空间结构上彼此靠近，组成具有特定空间结构的区域，能与底物特异结合并将底物转化为产物 必需基团(essential group):酶分子中氨基酸残基侧链的化学基团中，一些与酶活性密切相关的基团。 活性中心内的必需基团:结合基团（与底物相结合）和催化基团（催化底物转变成产物） 活性中心外的必需基团：维持酶活性中心应有的空间构象所必需； 构成酶活性中心的常见基团：His的咪唑基、Ser的－OH、Cys的－SH、Glu的γ-COOH。 ?酶的作用机制 ?酶活力的调节 ?酶的应用 食品加工方面：生物技术在食品工业中应用的代表就是酶的应用，目前已经有几十种酶成功用于食品工业。如葡萄糖、饴糖、果葡糖浆的生产、蛋白质制品加工、果蔬加工、食品保鲜以及改善食品品质与风味等。 常用的酶制剂主要有：淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、葡萄糖异构酶、果胶酶、脂肪酶、纤维素酶葡萄糖氧化酶等。 酶在轻工业方面的应用：用酶进行原料处理（发酵原料、淀粉原料、纤维素原料、含戊聚糖的植物原料的处理、纺织原料、造纸原料的制浆、生丝的脱胶处理、羊毛的除垢），用酶生产各种产品（L-氨基酸、核苷酸、酱油或豆酱、制革），用酶增强产品的使用效果（加酶洗涤剂；加酶牙膏、牙粉和嗽口水） 酶在医学中的应用：主要的医药用酶、用酶进行疾病的诊断、用酶治疗各种疾病、用酶制造各种药物 ?酶与食品质量安全 酶制剂作为食品添加剂进入食品的潜在危害 酶催化有毒物质的产生 酶作用导致食品中营养组分的损失 潜在的产毒素性 潜在的致病性 对策：安全菌株，体外基因毒理学测试，酶制剂的安全评价，酶制剂来源安全性的评估标准 ?Lecture 2 基因工程的酶学基础 ?核酶（Ribozyme)：概念：具有生物催化功能的RNA。 看课件 ?基因工程的酶学基础 ?基因克隆表达的过程 基因克隆常用的酶，有什么应用，注意事项（补充后两者）