氯化钙法进行质粒转化
利用冰冷的CaCl2 制备competent cells,以传统方法进行质体的转形。
仪器用具：37℃培养箱；42℃水浴；冰浴
药品试剂：
0.1 M CaCl2置冰浴中
2 M glucose：
取18 g glucose溶于水中，并调体积至50 mL，无菌过滤，分装后置-20℃贮存。
2 M Mg2+：
取20.3 g MgCl2·6H2O及24.65 g MgSO4·7H2O溶于水中，并调体积至100mL，无菌过滤的，分装小瓶置-20℃贮存。亦可以MgCl2完全取代MgSO4.
SOB 液体培养基：
32 Methods in Biotechnology Vol 1
2% Bacto tryptone, 0.5% yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl,高压灭菌，使用前加入2 M Mg2+，使最终浓度为10 mM.
SOB 固体培养基：
2% Bacto tryptone, 0.5% yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1. 5% Bactoagar,高压灭菌，倒plate前加入2 M Mg2+ 使最终浓度为10 mM.
SOC/Amp 固体培养基：
SOB 中另外添加20 mM glucose 及100 μg/mL ampicillin.
SOC 液体培养基：SOB 中加入20 mM glucose （使用前加入）。
大肠杆菌菌株：JM109
#1~#5 接合反应液
方法步骤：
1）进行转形实验前16~20 h,自-70℃取出贮存的菌种，以划单一菌落方式将菌株JM109 接种在SOB固体培养基上，在37℃培养。
2）取40 mL SOB培养基装入125 mL已灭过菌的三角瓶（请记得加入Mg 2+）。另取1 mL SOB加于微量离心管中。由SOB固体培养基上选4~6 个约2~3 mm大小的单一菌落接入1 mL SOB中，震荡将菌体打散后，加入40 mL S OB中，于37℃震荡培养约2~3 h,直至细胞数约为4~7×107/mL. 可于接菌2 h后每隔20~30 min测A600估计
3）收集菌液于离心管中，置冰浴中10~15 min.
4）以750~1,000 g 离心12~15 min （4℃）。
5）倒去上清，并尽量将液体倒干，或以微量移液器头吸干净。
6）沉淀加入1/3 菌液体积冰冷的0.1 M CaCl2,稍加震荡，混合均匀，置冰浴中10~15 min.
7）同上4），5）的操作。再重复6），4），5）的操作，以使反应更完全，增加成功率。
8）加入1/25 菌液体积冰冷的0.1 M CaCl2，稍加震荡使混合均匀。
◆Competent cells 制备完成！
9）DNA 样品（<10 μL）先装于微量离心管中，置冰浴中预冷，另取一微量离心管，标上#0,不加入任何DNA （作为negative control），亦置冰浴中预冷。
每个样品加入200 μL 菌液，震荡混合后，置冰浴中20~40 min.
10）42℃加热90 s （温度及时间均需很准确，请事先检查水浴锅的温度，不可超过42℃）。
◆Heat shock!
11）置冰浴中2 min。
12）加入800 μL SOC，混合后，于37℃震荡培养30~60 min.
13）将各管转形液上下摇动混合均匀后。#5 取20 μL 至另一离心管中，加入180μL SOC （稀释10 倍），混合均匀后，涂布于SOC/Amp plate. #0, #1~ #4 各取200 μL 涂抹在SOC/Amp plate. 剩余菌液以6,000 rpm 离心1 min,倒去上清，沉淀加入200 μL SOC，均匀打散后涂抹在另一个SOC/Amp plate 上。
14）待培养基表面的菌液完全被吸收后，倒置培养皿于37℃培养16~20 h 后，观察各个plate 上菌落的形状并计算菌落数。
实验九质粒 DNA 的转化
【原理】
转化是将外源 DNA 分子导入到受体细胞，使之获得新的遗传特性的一种方法。转化所用的受体细胞一般是限制 - 修饰系统缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶（ R- ， M- ）。将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后，细胞膜、的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源 DNA 分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的 DNA 分子通过复制和表达实现信息的转移，使受体细胞具有了新的遗传性状。将经过转化的细胞在筛选培养基上培养，即可筛选出转化子（带有异源 DNA 分子的细胞）。
本实验采用 CaCl 2 法制备感受态细胞。其原理是细胞处于 0 ～ 4 ℃， CaCl 2 低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的 DNA 形成抗 DNA 酶的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42 ℃ 90 秒热激处理，促进细胞吸收 DNA 得合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如氨苄青霉素耐药（ Amp r ）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含 Amp 的选择性培养基上，倒置培养过夜，即可获得细菌菌落。
本实验是将人 Bcl-2 重组质粒转化 DH5 α扩增菌，转化后在含 Amp 的培养基上进行筛选，生长的菌落即为含重组质粒的工程菌。
含人 Bcl-2 重组质粒的 DH5 α菌用于质粒 DNA 的扩增，获得的质粒将作为限制性内切酶的酶切底物 DNA 。
【试剂与器材】
1 ． LB 液体培养基 10g 胰蛋白胨、 5g 酵母提取物、 10gNaCl 加水至 1L ，高压灭菌消毒。
2 ． LB 固体培养基 LB 液体培养基中加 1.5% 琼脂粉，高压灭菌消毒，待泠却至不烫手背时铺培养皿。
3 ． 0.1mol/L CaCl 2 高压灭菌消毒或过滤除菌。
4 ．氨苄青霉素用无菌水或生理盐水配制成 100mg/ml 溶液，置 -20 ℃保存。
5 ．人 Bcl-2 重组质粒它是Eco R Ⅰ单酶切的 p Bluescript Ⅱ KS(-) 载体与EcoR Ⅰ单酶切的人 Bcl-2 cDNA 重组而成的，大小为 4 861bp ，前者是一种由pUC19 质粒衍生而来的具有 2 961bp 的质粒载体。因此用Eco R Ⅰ酶切则应到空载pBluescript Ⅱ KS(-) 载体 (2.96kb) 和人 Bcl-2 cDNA 片段 (1.9kb) 。配制成 2g/1 μ l 。
6 ．大肠杆菌 DH5 α此为 DNA 扩增菌
7 ．恒温水浴箱
8 ．超净工作台
9 ．高速冷冻离心机
10 ．恒温摇床
11 ．恒温箱
12 ．消毒离心管
13 ．消毒 tips
14 ．玻璃培养皿直径 90mm
15 ．玻璃涂布器
16 ． 95% 乙醇
17 ．标记笔
【操作步骤】
1 ．细菌感受态细胞的制备
将 DH5 α菌种划线于 LB 琼脂板上，37 ℃培养过夜。挑取单菌落接种于 5ml LB 培养基中，37 ℃振荡培养培养过夜。次日取菌液 1ml 接种至含有 100ml LB 培养
基的烧瓶中，37 ℃剧烈振荡培养至约 2 ～ 3h ，待 A 600 值达到 0.3 ～ 0.4 时将烧瓶置于冰浴 10 ～ 15min 。将细菌转移到一个灭菌处理过的冰预冷的 50ml 离心管中。 4 000 × g ， 4 ℃离心 10min ，弃培养基，将管倒置于滤纸使最后的残留液体流尽。加预冷的已过滤除菌的 0.1mol/L CaCl 2 重悬菌体，置冰浴 30min 。
4 000 × g ， 4 ℃离心 10min ，弃培养基。再加 4ml 预冷的 0.1mol/L CaCl 2 ，轻轻重悬菌体，置4 ℃冰箱 12 ～ 16h 。
2 ． DNA 重组子的转化大肠杆菌 DH5 α
本实验中的 DNA 重组子为人 Bcl-2 重组质粒。在无菌条件下按每管取 200 μl 新鲜感受态 DH5 α细菌置于无菌的 5ml 塑料离心管中，共 2 管，分别加入人 Bcl-2 重组质粒 (10ng) 和消毒水 ( 作阴性对照 ) 各 5 μl ，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置 30min 。42 ℃，热休克 90s ，中途不要摇动离心管，每管加 800 μl 无抗生素的 LB 培养基，于37 ℃空气摇床中以 150 r/min 速度振摇 45min ，使细菌复苏。每管取 200 μl 加至含氨苄青霉素（ Amp ）的 LB 琼脂平板上，用玻璃涂布器涂布均匀，室温放置 20min ，使液体吸收，然后37 ℃倒置培养 12 ～16h 至单菌落形成。
【注意事项】
1 ．含人Bcl-
2 重组质粒的DH5 α菌落平板倒置置于4 ℃保存，于下周进行质粒DNA 的制备。
生物技术通报 BIOTECHNOLOGY BULLETIN ·研究报告· 2009年增刊 收稿日期:2009-04-29 基金项目:西安市科技局科技攻关项目(GG06078) 作者简介:陈洪栋(1986-),女,硕士研究生,研究方向:西北大学生命科学学院细胞生物学方向;E-mail:huijie1022110@https://www.doczj.com/doc/0518378357.html, 通讯作者:李红民,E-mail :lihm2006@https://www.doczj.com/doc/0518378357.html, 引言 质粒DNA 成功转化大肠杆菌(Escherichia coli, E.coli )由Cohen 等首次报道[1].此后,多位研究者对 影响质粒转化E.coli 的条件如温度、离子强度和种类、质粒分子质量大小等进行了优化和改进[2] ,最 终形成一致认可的转化程序:. 细胞与DNA 在 氯化钙存在下于0~4℃作用一定时间后于42℃短暂热激2~3min,冰浴2~3min ,随后在不含抗生素 的液体培养基中于37℃恢复培养30~60min 后涂 布选择性平板[3]。该方法被称为是E.coli 细胞的标准转化方法,在世界范围内的分子生物学实验室中 广泛应用并不断被完善,最高转化效率可达107~ 109克隆/μg 质粒DNA [4]。然而,利用该方法完成质粒DNA 对大肠杆菌的转化,至少需要约2.5h ,对于一般的质粒转化实验而言,比较费时费力。文章作者尝试对这一标准转化程序进行简化,获得一种用质粒DNA 转化大肠杆菌感受态细胞的 实用操作技巧 陈洪栋董文博李红民 （西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室植物生物技术研究室西北大学生命科学学院，西安710069） 摘要:目的是建立一种简化、实用的用质粒DNA 转化大肠杆菌的操作方法。采用氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞。 以质粒pUC18,pCSN44,pAN52-1Not,pETts,pANth 和植物双元表达载体pCAMBIA1301分别转化用于质粒扩增与保存的常用大肠杆菌菌株Top10和DH5α以及用于原核表达的常用大肠杆菌菌株BL21(DE3)和TB1。质粒与感受态细胞的混合液置冰上作用一定时间后，直接涂布含有筛选抗生素的LB 平板，于37℃培养12~16h 。结果表明，用不同大小的质粒DNA 转化不同的大肠杆菌菌株，都可以获得满足实验要求，转化效率可高达103~4阳性克隆/μg 。该方法较标准的转化流程更加简便、省时、实用。 关键词：Escherichia coli 转化方法质粒 Doohickey for the Standard Transformation Protocol of Plasmids DNA Transfer into Competent Chen Hongdong Dong Wenbo Li Hongmin (Plant Biotechnology Research Unit,Key Laboratory of Resource Biology Biotechnology in Western China,Ministry of Education School of Life Science Northwest University,Xi ’an 710069) Abstract: The aim of this study was to introduce a doohickey for the transformation of competent cells with plasmid DNA. The competent cells of Escherichia coli strains were previously made using the calcium chloride method.The plasmids,pUC18,pCSN44,pAN52-1Not,pETts,pANth and pCAMBIA1301,were employed to transform the different E.coli strains Top10,DH5α,BL21(DE3)and TB1.The mixture of plasmid and competent cell was laid on ice for definite time before being cultured at 37℃degree on selected LB plate with relevant antibiotic for 12~16h.Perfect transformation rate up to 103~4colonies/μg plasmid DNA was obtained. Key words:Escherichia coli Transformation method Plasmid
CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞 原理： 转化(Transformation)：将外源DNA分子引入受体细菌，使之获得新的遗传性状。 受体细菌一般是限制修饰系统缺陷的变异株，不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R-,M-)，可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法，如电击或CaCl2、RbCl/KCl等化学试剂的处理后,细胞膜的通透性增高，成为感受态细胞(Compenent cells)，使外源DNA分子得以进入。 目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl/KCl法，RbCl/KCl法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入无菌甘油至总体积15％，于-70℃保存半年之久，因此CaCl2法为使用更广泛。 准备： 1、配制0.05mol/L CaCl2-15%甘油(可用0.1mol/L CaCl2和30％甘油等体积混合) 混合溶液，高温高压灭菌； 注：CaCl2必须为分析纯以上。 2、实验中所需的所有试管、培养瓶、离心管等均要用去离子水彻底清洗干净， 高温高压灭菌； 注：最好有制备感受态细菌专用的一套实验器材。 3、受体菌的培养：从非选择性LB平板上挑取E.coli单菌落,接种于3-5ml LB液 体培养基 （ ）中，37℃振荡培养过 夜至对数生长中后期。将该菌悬液以1:100的比例接种于50~100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2.5小时至OD600=0.5。注：培养时间不宜超过2.5小时，否则不能达到最高转化效率。 实验步骤： 1、细菌的收获：培养液冰浴5分钟后，4℃5000g离心5分钟。 注：（1）冰浴时间不要超过10分钟；（2）或者4℃8000g离心2分钟，速度太快或时间太长对细菌状态不利，并且不利于下步洗涤。（3）若出现很多黑色沉淀（细菌碎片），说明有多量细菌死亡，此时细菌状态并不好，但若只有少量黑色沉淀，或对转化效率要求不高，亦可继续进行。 2、用预冷的去离子水洗涤沉淀，4℃5000g离心5分钟。 注：（1）洗去细菌碎片和残留的培养液；（2）洗涤时间宜短不宜长。 3、沉淀加入2ml预冷的0.05mol/L CaCl2-15%甘油混合溶液，轻吹散，冰浴5分 钟，4℃5000g离心5分钟。 注：此时可见细菌沉淀为白色，体积也胀大为最初沉淀体积的数倍。 4、沉淀加入2ml预冷的0.05mol/L CaCl2-15%甘油混合溶液，轻吹散，即成为感 受态细胞悬液。分装成50~100μl的小份，贮存于-70℃可保存半年。
氯化钙法进行质粒转化 利用冰冷的CaCl2 制备competent cells,以传统方法进行质体的转形。 仪器用具：37℃培养箱；42℃水浴；冰浴 药品试剂： 0.1 M CaCl2置冰浴中 2 M glucose： 取18 g glucose溶于水中，并调体积至50 mL，无菌过滤，分装后置-20℃贮存。 2 M Mg2+： 取20.3 g MgCl2·6H2O及24.65 g MgSO4·7H2O溶于水中，并调体积至100mL，无菌过滤的，分装小瓶置-20℃贮存。亦可以MgCl2完全取代MgSO4. SOB 液体培养基： 32 Methods in Biotechnology Vol 1 2% Bacto tryptone, 0.5% yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl,高压灭菌，使用前加入2 M Mg2+，使最终浓度为10 mM. SOB 固体培养基：
2% Bacto tryptone, 0.5% yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1. 5% Bactoagar,高压灭菌，倒plate前加入2 M Mg2+ 使最终浓度为10 mM. SOC/Amp 固体培养基： SOB 中另外添加20 mM glucose 及100 μg/mL ampicillin. SOC 液体培养基：SOB 中加入20 mM glucose （使用前加入）。 大肠杆菌菌株：JM109 #1~#5 接合反应液 方法步骤： 1）进行转形实验前16~20 h,自-70℃取出贮存的菌种，以划单一菌落方式将菌株JM109 接种在SOB固体培养基上，在37℃培养。 2）取40 mL SOB培养基装入125 mL已灭过菌的三角瓶（请记得加入Mg 2+）。另取1 mL SOB加于微量离心管中。由SOB固体培养基上选4~6 个约2~3 mm大小的单一菌落接入1 mL SOB中，震荡将菌体打散后，加入40 mL S OB中，于37℃震荡培养约2~3 h,直至细胞数约为4~7×107/mL. 可于接菌2 h后每隔20~30 min测A600估计 3）收集菌液于离心管中，置冰浴中10~15 min. 4）以750~1,000 g 离心12~15 min （4℃）。
转染步骤及经验（精华） 一、基础理论 转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。 二、转染操作流程（以常用的6孔板为例） (1) 细胞培养： 取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37℃5%CO2培养箱中培养至70%～90%汇合。(不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞)。 (2) 转染液制备： 在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量) A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL， B液：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100μL； 轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。 (3) 转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL不含血清及PS的培养液。 (4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，37℃温箱置6～8小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。 三、转染注意事项 1. 血清 A. DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。 B．一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。 C. 对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用一种营养丰富的无血清培养基OPTI-MEMⅠ培养基， 或者在转染培养基中使用血清。对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用LIPOFECTAMINE 2000。无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)很好用，有条件的话，就用它代替PBS洗细胞两遍，注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。 2.抗生素（PS） 抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样，在转染前也不必润洗细胞。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血
质粒抽提 一、溶液及培养基配制： 1、LB液体培养基 （1）配方: 酵母提取物（Yeast extract）5g/L 胰蛋白胨（Tryptone）10g/L （2）配制： A、称量：称取培养基各成分所需量，置于烧杯中。 B、溶化：加入所需水量2/3的蒸馏水于锥形瓶中，搅拌使药品全部溶化。 C、定容。 D、加塞、包扎。 F、高压灭菌121 C, 30min ,灭菌后室温保存备用。若要分装需要在超净台内。 G、培养基完全溶解，降至室温后，加氨苄霉素（AMP ）。先将AMP用三蒸水配制为 100mg/ml母液，而后每1ml母液加至1000ml培养基。（可以多配制一些，分装为1ml/管）2、LB固体培养基 （1）配方: 酵母提取物(Yeast extract)5g/L 氯化钠（NaCl）5g/L 胰蛋白胨（Tryptone）10g/L 氨苄青霉素溶液100^g/ml （终浓度）（即100mg溶于1ml超纯水或生理 盐水或PBS，再加入1000ml培养基） 琼脂粉15g/L （2）配制： A、称量：称取培养基各成分所需量，置于烧杯中。 B、溶化：加入所需水量2/3的蒸馏水于烧杯中，搅拌使药品全部溶化。 C、5mol/L NaOH 溶液调pH 到7.4。 D、定容。 E、分装、加塞、包扎。 F、高压灭菌121 C, 30min。 G、火菌后，将融化的LB固体培养基置与55 C的水浴中（或室温），待培养基温度降到55 C时（手可触摸）加入抗生素，（免温度过高导致抗生素失效），并充分摇匀。 （3）倒板： 一般20ml倒1块板，培养基倒入培养皿后，打开盖子，水分晾干后盖上盖子并用封口膜封口，4 C保存备用，使用前提前拿出，防止水蒸气滴入板中。 首要检查是否有足够的固体和液体LB培养基，基本上每个质粒需要一块固体培养基，小摇 的2ml和大摇的250ml LB培养基。小摇的可以在一个50ml离心管中预备着，每次直接取 用。转化所需L形玻璃棒需确认已灭菌摇菌器申请，张评浒老师，王雪师姐； 注意：考虑到多种东西需要灭菌，可以在转化之前或者小摇大摇那天一起灭菌。所有需要提前灭菌的东西有：足量液体LB培养基灭菌后加入AMP蓝黄白枪头至少个一盒，备用； 1.5ml doff 管；Beckman离心机专用离心管；锡箔纸；250ml锥形瓶，500或者1000ml锥形瓶；电动移液器所用移液管（可以考虑用5ml移液枪，则先灭菌5ml枪头）；超纯水和TE
准备： 1，1L或0.5L大三角瓶（氧气充分，利于细菌生长），装入100mlLB液体培养基培养基中加100ul 4MNaOH 2，50ml干净（最好较新）塑料离心管 3，1ml枪头和200ul枪头足够数量 4，足够数量的分装用1.5mlEp管 5，80mMMgCl2+20mMCaCl2 以上灭菌，1室温放置，2-5冷冻储藏 制备： 1，活化菌种，5mlLB不加抗生素，1：100接菌，37度振荡培养过夜，同时接一管加抗生素的看是否长菌（让菌复苏，进入对数期的早中期。此时更容易制得感受态细胞） 1：500-1000转接入100ml培养基中，培养2-3h（减少达到所需亮的均所需繁殖的世代数，以减少菌的变异。） 2，无菌台中将菌液转移到冰预冷的50ml离心管中，冰浴10’，4度4000rpm 10’，超净台中弃上清，（使细菌的生长停止，代谢减慢。因为这时已经没有培养基了，如果细菌仍有很高的代谢效率，则有大量细菌死亡） 3，用10ml冰预冷的5液体重悬100ml菌液所得菌体（一定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱），冰浴10’（细菌处于00C，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，外源DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面（羟基来源于细胞壁上的糖，磷酸来源于DNA，经短时间420C热激处理，促进细胞吸收DNA 复合物。） 4，4度4000rpm 10’收菌 每100ml菌体用4ml冰预冷的0.1MCaCl2+10%甘油重悬（除去所有的LB以及细胞破损后释放出来的细胞内含物。防止细胞分裂，以致大量细胞死亡。（一定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱） 5，） 6，4度放置5hr 7，分装100ul/冰预冷的1.5EP，-80度保存 8，取两支分别转质粒和不转验证
第一章 第一节 物质的转化 班级 姓名 编号 03 一、选择题 1．铁、稀盐酸、澄清石灰水、氯化铜溶液是初中化学中常见的物质，四种物质间的反应关系如图所示。图中两圆相交部分(A 、B 、C 、D)表示物质间的反应，其中对应四个反应类型的说法正确的是 A ．复分解反应、复分解反应、化合反应、置换反应 B ．中和反应、置换反应、复分解反应、置换反应 C ．复分解反应、复分解反应、置换反应、置换反应 D ．分解反应、复分解反应、置换反应、置换反应 【答案】C 【解析】酸碱中和反应属于两种化合物相互交换成分生成另外两种化合物的反应，为复分解反应，氢氧化钙和稀盐酸反应生成氯化钙和水，所以A 为复分解反应、中和反应；B 的反应属于两种化合物相互交换成分生成另外两种化合物的反应，为复分解反应，氢氧化钙和氯化铜反应生成氢氧化铜沉淀和氯化钙，所以B 为复分解反应；C 的反应为一种单质和一种化合物反应生成另外的单质和化合物的反应，属于置换反应，Fe 和氯化铜反应生成Cu 和氯化亚铁，所以C 属于置换反应；D 的反应为一种单质和一种化合物反应生成另外的单质和化合物的反应，属于置换反应，铁和稀盐酸反应生成氯化亚铁和氢气，所以D 属于置换反应；故答案为C 。 2．下列物质的转化能实现的是 A ．242+Ba O H Cl H S Cl B ．23+NaOH CO Na CO C ．()2 +NaCl Cu OH NaOH D ．()3332+BaCO N O a N B a NO 【答案】A 【解析】 A 、发生反应2424=H SO +BaCl BaSO +2HCl ↓ ，过滤除去硫酸钡可得HCl ，符合题意； B 、一氧化碳和氢氧化钠不发生反应，不符合题意； C 、 氢氧化铜和氯化钠不发生反应，不符合题意； D 、 硝酸钠和碳酸钡不发生反应，不符合题意。 故选A 。 3．下图是有关物质的转化，下列说法不正确的是
20170803 热激法转化质粒 武汉大学Angelo 实验原理： 质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。将连接产物转化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖，便于后续分子操作。热激法：大肠杆菌在0℃、CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，与转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子 实验步骤： （1）从-80 ℃冰箱内取一管冻存的感受态大肠杆菌DH-5α于冰浴上融化复苏10min； （2）加入待转化的质粒0.5μL-1.5μL，轻轻吹打混匀，冰浴30 min； （3）在42 ℃恒温水浴锅中严格操作热激90 s，然后立即冰浴静置2 min； （4）在无菌操作台内，向感受态大肠杆菌中加入600 μL-1000μLLB液体培养基，在200 r/min 、37 ℃恒温摇床内摇30min-1 h 进行活化；
（5）在活化的时候，从4℃拿出含抗生素的固体细菌培养板放到37℃恒温培养箱中回温十分钟。 （6）活化结束后，在无菌操作台内，吸取菌液20μL-40μL涂板到含抗生素（50 mg/ml）的固体细菌培养板上； （7）置于37 ℃恒温培养箱内过夜培养（12h-16h）。 要点： 1，固体培养板的抗生素抗性（Amp，Kana） 2，转化质粒的量根据质粒浓度进行添加 3，涂板菌液的量根据活化加培养基的量进行选择 4，注意每项工作前都要进行充分准备，比如涂板棒进行灭菌，移液枪进行消毒等。 5，对刚连接的质粒进行转化，不同之处在于活化时间为1-2h。 活化后，将菌液2500 -3500rpm离心3 min，留下沉淀和200 μL菌液，充分混匀，涂板到含抗生素的固体培养基上。
质粒DNA的转化实验原理、仪器试剂和操作步骤 【原理】 转化是将外源DNA 分子导入到受体细胞，使之获得新的遗传特性的一种方法。转化所用的受体细胞一般是限制- 修饰系统缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶（R- ，M- ）。将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后，细胞膜、的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源DNA 分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的DNA 分子通过复制和表达实现信息的转移，使受体细胞具有了新的遗传性状。将经过转化的细胞在筛选培养基上培养，即可筛选出转化子（带有异源DNA 分子的细胞）。 本实验采用CaCl2 法制备感受态细胞。其原理是细胞处于0 ～4 ℃，CaCl2 低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的DNA 形成抗DNA 酶的羟基- 钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42 ℃90 秒热激处理，促进细胞吸收DNA 得合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如氨苄青霉素耐药（Amp r ）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含Amp 的选择性培养基上，倒置培养过夜，即可获得细菌菌落。 本实验是将人Bcl-2 重组质粒转化DH5 α扩增菌，转化后在含Amp 的培养基上进行筛选，生长的菌落即为含重组质粒的工程菌。 含人Bcl-2 重组质粒的DH5 α菌用于质粒DNA 的扩增，获得的质粒将作为限制性内切酶的酶切底物DNA 。 【试剂与器材】 1 ．LB 液体培养基10g 胰蛋白胨、5g 酵母提取物、10gNaCl 加水至1L ，高压灭菌消毒。 2 ．LB 固体培养基LB 液体培养基中加1.5% 琼脂粉，高压灭菌消毒，待泠却至不烫手背时铺培养皿。 3 ．0.1mol/L CaCl2 高压灭菌消毒或过滤除菌。 4 ．氨苄青霉素用无菌水或生理盐水配制成100mg/ml 溶液，置-20 ℃保存。 5 ．人Bcl-2 重组质粒它是Eco R Ⅰ单酶切的pBluescript ⅡKS(-) 载体与EcoR Ⅰ单酶切的人Bcl-2 cDNA 重组而成的，大小为4 861bp ，前者是一种由pUC19 质粒衍生而来的具有 2 961bp 的质粒载体。因此用Eco R Ⅰ酶切则应到空载pBluescript ⅡKS(-) 载体(2.96kb) 和人Bcl-2 cDNA 片段(1.9kb) 。配制成2g/1 μl 。 6 ．大肠杆菌DH5 α此为DNA 扩增菌 7 ．恒温水浴箱
氯化钙法（Calcium Chloride） 本方法适用于批量制备大肠杆菌感受态细胞，所得感受态细胞可以获得5 x 106 到2x 107 转化克隆/微克超螺旋质粒DNA 材料（MA TERIALS） 缓冲液和溶液（Buffers and Solutions） （冰冷的）CaCl2?2H2O (1 M) 冰冷的MgCl2-CaCl2 s溶液(solution, ice cold) 培养基（Media） 用于初始培养物培养的LB肉汤（L-broth for initial growth of culture） LB agar plates containing appropriate antibiotic 核酸（Nucleic Acids） 质粒DNA （Plasmid DNA） 或经过重组的质粒（recombinant plasmid） 方法 1.从37°C过夜(16-20 hours)培养平皿内挑取一个直径约为2到3毫米的单菌落。把这样的单菌落接种于一只装有5毫升LB肉汤的30毫升灭菌试管中，于37°C下振荡培养过夜。 2. 转移0.2毫升过夜培养物于一只装有15或20毫升LB的50毫升灭菌三角瓶中. 于37°C下振荡培养2到2.5小时（此时细菌处于对数生长期）。 3. 室温下，4000 rpm离心5分钟收集对数期细胞。弃培养基，保留细胞沉淀。 5. 加入10毫升冰冷的MgCl2-CaCl2 溶液，并轻微打匀。 6. 4°C下，4000 rpm离心10分钟收集细胞。 7. 弃MgCl2-CaCl2 溶液，保留细胞沉淀。 8. 加入0.8毫升(每25毫升初始培养物加入1毫升)冰冷的0.1M的CaCl2 溶液，并轻微打匀。冰浴放置若干小时为最好。 9. 此时的感受态细胞可以依照下面的步骤10到16直接进行转化操作，也可以分装,加入甘油后于-70°C冰冻保藏。 10. 向事先灭菌，并经冷处理的1.5ml 聚丙烯管中转移100微升感受态细胞悬浮液。向每个转化管中加入DNA(一般含量是10微升或更低的体积中所含量应不超过50纳克)。细心混匀管中成份。于冰浴放置30到40分钟。 11. 把转化管转移至放于42°C循环水浴锅中预热的试管架上，准确计时90秒。（此时不能摇动转化管） 12. 把试管迅速转移至冰浴2到3分钟。 13. 向每只试管中加入500微升LB肉汤。37°C放置45到90分钟，以使细菌复原，并容许质粒所编码的抗生素抗性的表达。 14. 转移适量体积（如果使用90毫米平板，一半涂布量不应超过100微升）的经转化处理的感受态细胞涂布于含有相应抗生素的LB-琼脂平板上。 15. 室温放置平板直到其上液体被吸收。 16. 于37°C倒置平板培养。转化克隆应该于12-16 小时区间出现
一、目的 1.了解感受态细胞生理特性及制备条件，掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。 2.掌握质粒DNA 转化大肠杆菌的方法，了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 的原理。 二、原理 （一）大肠杆菌感受态细胞制备的原理 所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。本实验为了把外源DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子 的感受态细胞。在细菌中，能发生感受态细胞是占极少数。而且，细菌的感受态是在短暂时间内发生。 目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子的本质看法不一。主要有两种假说： 1、局部原生质体化假说――细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。证据有： （1）发芽的芽孢杆菌容易转化； （2）大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体DNA 转化； （3）适量的溶菌酶能提高转化率。 2、酶受体假说――感受态细胞的表面形成一种能接受DNA 的酶位点，使DNA分子能进入细胞。证据是：（1）蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用；
（2）细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现；（3）分离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。 目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室一直进行探索，试图从实验中获得明确回答。有人根据pBR322 质粒DNA对E?coli K――12X1776菌株的转化结果，认为： 近来，在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理，可提高转化效率几十倍，通常把细胞悬浮在pH6.0 的100mmol/L CaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，转化率转高，但一过24小时，转化率测恢复为原来的水平。 （二）重组DNA 的转化原理 我们已经制备好大肠杆菌感受态细胞，接下的实验是把重组的DNA 引入受体细胞，使受体菌具有新的遗传特性，并从中选出转化子。作为受体的大肠杆菌C600 或DH5α，必须不同外来DNA分子发生遗传重组，通常是rec基因缺陷型的突变体，同时它们必须是限制系统缺陷或限制与修饰系统均缺陷的菌株。这样外来的DNA分子不会受其限制酶的降解。保持外来DNA 分子在受体细胞中的稳定性。制备的大肠杆菌细胞就具有这三种缺陷（rk- mk- rec-）同时此受体细胞还是氨苄青霉素敏感（Ap）。 在体外构建好的重组分子上具有分解氨苄青霉素（Ap）基因存在，当它导入受体细胞后，就赋于这些受体细胞新的特性，即Ap 抗性。同时载体质粒上具有乳糖操纵的β一半乳糖苷酶基因(lacZ，我们可以利用外源基因插入载体β一半乳糖苷酶基因(lacZ，使其失去β一半乳糖苷酶活性的原理来选择新构建的重组子。
实验七感受态细胞的制备和重组质粒的转化 【实验目的】 1.掌握用CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。 2.学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。 【实验原理】 质粒在不同的细菌之间转移是微生物世界中一种普遍的现象，一个细菌品系通过吸收另一个细菌品系的质粒DNA而发生了遗传性状的改变，这种现象叫做转化，获得了外源DNA的细胞称为转化子。 在基因克隆技术中，所谓转化是指质粒或重组质粒被导入受体细胞，表达相应的选择标记基因，并在一定的培养条件下，在选择性培养基上长出转化子的过程。质粒必须通过转化进入细菌细胞内，才能进行扩增和表达，从而获得大量的克隆基因,使我们能够进行进一步的DNA操作，如亚克隆等；或者获得其表达产物。转化效率的高低与受体菌的生理状态有关。细菌吸收外源DNA的能力最高时的状态被称为感受态细胞（competent cell）。有些种类的细菌在其生长的任一阶段都处于感受态，而另一些细菌只有处于某个生长时期时（一般为对数生长早、中期），才会处于感受态,如本实验所用的大肠杆菌。用一定浓度的CaCl2 处理对数生长早中期的细菌可以大大提高细菌吸收周围环境中的DNA分子的能力。对这种现象的一种解释是CaCl2能使细菌细胞壁的通透性增强，从而提高转化率。这种转化方法称为“化学法”。目前还可以使用电激的方法，通过瞬间的高压电流，在细胞上形成孔洞，使外源DNA进入胞内，从而实现细胞的转化。电激转化的效率往往比化学法高出1到2个数量级，达到1 x 108转化子/μg DNA，甚至1 x 109转化子/μg DNA，所以常用于文库构建时的转化或遗传筛选。 微生物转化是基因工程的常用技术，大肠杆菌是基因工程中最常用的受体菌，本实验即是用前面实验获得的重组质粒转化大肠杆菌细胞。 【试剂与器材】 〈一〉试剂 1．LB液体培养基: 参见附录 每组配200mL, 其中100mL分装于500mL三角瓶中，另各取3mL装于2只大试管中，其余装于装于500mL三角瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20分钟。 2．LB/Amp/IPTG/X-Gal平板（1）: 配1L LB液体培养基，加入20g琼脂粉和1支搅拌棒，同上高压灭菌，趁热取出置搅拌器上冷却，待冷至55℃左右, 加氨苄青霉素(Ampicillin)至终浓度100μg/ml (Amp储存液一般为100mg/mL), 倒平板，每皿倒约15 mL，室温放置过夜至冷凝水挥发干净。使用前半小时在培养基表面加20μL 50mg/mL X-gal 和100μL 0.1mol/L IPTG，涂匀，待这两种化合物渗入琼脂后，即可用于转化菌的涂布。 每组制备LB平板2个，LB/Amp 平板5个，LB/Amp/IPTG/X-Gal平板6个。 3．IPTG储存液(0.1mol/L)：1.2g IPTG加水至50ml，过滤除菌，4℃储存。 4．X-gal储存液：50mg/ml溶于二甲基甲酰胺溶剂中，过滤除菌，4℃储存。 5．1 mol/L CaCl2储存液，使用浓度为0.1mol/L，CaCl2应使用分析纯，配100mL，高压灭菌，全班用。6．甘油(灭菌)，全班50mL，同上高压灭菌。 7．酸洗无菌玻璃珠，涂布平板用，用50mL三角瓶分装，同上高压灭菌，烘干备用。 〈二〉器材 1. 37℃温箱、水浴锅、恒温振荡器等 2. 高速冷冻离心机 3. 微量移液器等
大肠杆菌感受态细胞的CaCl2法制备及质粒转化 实验原理 处于对数生长期的细菌经CaCl2 处理后接受外源DNA的能力显著增加。细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。 在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态，以摄取外源DNA。 转化（Transformation）是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体（R-,M-），它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl2 ，RbCl(KCl)等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（Compenent cells）。进入受体细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant，即带有异源DNA 分子的受体细胞）。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存（半年），因此CaCl2法使用更广泛。 主要试剂 (1)0.1mol/L CaCl2溶液 (2)LB液体培养基 (3)30%甘油：30mL甘油溶于100mL蒸馏水，高压灭菌。 主要设备 (1)超净工作台 (2)冷冻离心机 (3)恒温摇床 (4)－70℃冰箱 (5)10mL移液管 (6)吸耳球 (7)1mL、200μL移液枪（配套枪头） (8)50mL 离心管 (9)1.5mL离心管 实验材料 (1)大肠杆菌DH5α（R-，M-，Amp-）
C a C l2法制备感受态 细胞
大肠杆菌感受态细胞的CaCl2法制备及质粒转化 实验原理 处于对数生长期的细菌经CaCl2 处理后接受外源DNA的能力显著增加。细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。 在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态，以摄取外源DNA。 转化（Transformation）是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体（R-,M-），它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl2 ，RbCl(KCl)等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（Compenent cells）。进入受体细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant，即带有异源DNA 分子的受体细胞）。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备
出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存（半年），因此CaCl2法使用更广泛。 主要试剂 (1)0.1mol/L CaCl2溶液 (2)LB液体培养基 (3)30%甘油：30mL甘油溶于100mL蒸馏水，高压灭菌。 主要设备 (1)超净工作台 (2)冷冻离心机 (3)恒温摇床 (4)－70℃冰箱 (5)10mL移液管 (6)吸耳球 (7)1mL、200μL移液枪（配套枪头） (8)50mL 离心管 (9)1.5mL离心管 实验材料 (1)大肠杆菌DH5α（R-，M-，Amp-） 实验步骤 （一）受体菌的培养
一、大肠杆菌质粒DNA的提取 质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法： 碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。方法如下： 1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。 2、37℃振荡培养过夜。 3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。 4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。 5、加入0.2ml溶液II(0.2 mM/L NaOH，1％SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。 6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。 7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管 8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置10min。 9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。 10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有液体。 11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中 煮沸法 1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000ｇ离心30秒。 2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。 3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。 4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。 5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。 6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。 7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。 8、取20ml进行电泳检查。 [注意] 1. 对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒DNA。 2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,浓度高时,细菌裂解效果反而不好。有时不同溶菌酶也能溶菌。 3. 提取的质粒DNA中会含有RNA,但RNA并不干扰进一步实验,如限制性内切酶消化,亚克隆及连接反应等。 质粒DNA的大量提取和纯化 在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量提取质粒DNA。大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。 （一）、碱法 1、取培养至对数生长后期的含pBS质粒的细菌培养液250ml，4℃下5000g离心15分钟,弃上清,将离心管倒置使上清液全部流尽。 2、将细菌沉淀重新悬浮于50ml用冰预冷的STE中（此步可省略）。 3、同步骤1方法离心以收集细菌细胞。
从细菌中分离质粒 DNA 的具体操作 材料、设备及试剂 一、材料 含PBS的E.coliDH5α或JM系列菌株，1.5ml塑料离心管（又称eppendorf管），离心管架。 二、设备 微量取液器（20μl，200μl，1000μl），台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒器（灭菌锅），涡旋振荡器，电泳仪，琼脂糖平板电泳装置和恒温水浴锅等。 三、试剂 1、LB液体培养基（Luria-Bertani）：称取蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeastextract）5g，NaCl10g，溶于800ml去离子水中，用NaOH 调pH至7.5，加去离子水至总体积1升，高压下蒸气灭菌20分钟。 2、LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉，高压灭菌。 3、氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）母液：配成50mg/ml水溶液，-20℃保存备用。 4、溶菌酶溶液：用10mmol/LTris?Cl（pH8.0）溶液配制成10mg/ml，并分装成小份（如1.5ml）保存于-20℃，每一小份一经使用后便予丢弃。 5、3mol/lNaAc（pH5.2）：50ml水中溶解40.81gNaAc?3H2O，用冰醋酸调pH至5.2，加水定容至100ml，分装后高压灭菌，储存于4℃冰箱。 6、溶液1:50mmol/L葡萄糖，25mmol/ L T r i s. Cl（pH8.0）， 10mmol/LEDTA（pH8.0）。溶液Ⅰ可成批配制，每瓶100ml，高压灭菌15分钟，储存于4℃冰箱。 7、溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH（临用前用10mol/LNaOH母液稀释），1％SDS。 8、溶液Ⅲ：5mol/LKAc60ml，冰醋酸11.5ml，H2O28.5ml，定容至100ml，并高压灭菌。溶液终浓度为：K+3mol/L，A cˉ5mol/L。 9、RNA酶A母液：将RNA酶A溶于10mmol/LTris?Cl（pH7.5）， 15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml 的溶液，于100℃加热15分钟，使混有的DNA酶失活。冷却后用 1.5mleppendorf管分装成小份保存于-20℃。 10、饱和酚：市售酚中含有醌等氧化物，这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联，应在160℃用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加入0.1％的8-羟基喹啉（作为抗氧化剂），并用等体积的0.5mol/LTris?Cl （pH8.0）和0.1mol/LTris?Cl（pH8.0）缓冲液反复抽提使之饱和并使其pH值达到7.6以上，因为酸性条件下DNA会分配于有机相。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化（原理） 感受态细胞的概念重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。 1、感受态细胞的概念 所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。 制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效期6个月）。 2、转化的概念及原理 在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA 导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。 等化学试剂法）处理受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl 2 后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。 法），该法最先是由Cohen于1972大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl 2 的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球年发现的。其原理是细菌处于0℃，CaCl 2