EDTA纸片法检测肠杆菌科细菌高产AmpC酶
[摘要]目的寻找一种快速，简便，灵敏，准确的方法检测肠杆菌细菌高产AmpC酶的方法。方法用从临床菌株中筛选出头孢西丁耐药的肠杆菌科细菌，应用EDTA纸片法和头孢西丁三维试验和多重PCR方法分别对头孢西丁耐药肠杆菌科细菌是否高产AmpC 酶进行检测,并进行方法学比较。结果 40株头孢西丁耐药的细菌中，头孢西丁三维试验、EDTA纸片法阳性菌株分别为36、37株，EDTA法与三维试验的符合率为97.3%，阴性符合率100%，统计结果显示EDTA纸片法与三维试验法检测AmpC酶无差异。结论 EDTA 纸片法用于这2种临床菌株中持续高产AmpC酶的检测，方法简便，结果可靠，无需特殊仪器支持，可在临床实验室推广使用。[关键词] AmpC酶；三维试验； EDTA纸片法
随着广谱?-内酰胺类抗生素广泛应用与临床，越来越多的耐药菌株的产生给临床治疗带来极大挑战。尤其是AmpC酶，因其能产生对第三代头孢、单环类、头霉素类等?-内酰胺类抗生素的耐药性，且不受临床常见的?-内酰胺酶抑制剂抑制而受到重视。近年来质粒介导的AmpC酶相继在世界各地被发现，这使得耐药菌株在世界范围内广泛传播和对该类细菌感染的治疗困难，已引起临床的高度重视[1、2、3]。因此，AmpC酶的早期检测越来越重要，本研究在于寻求一种快速，简便，灵敏的方法检测AmpC酶，以便在临床实验室展开。
1 材料和方法
1.1实验菌株
用FOX纸片(30μg ,OXOID公司) 筛选耐药(< 6mm)的菌株40株，其中肺炎克雷伯菌22株，大肠埃希菌10株，产气肠杆菌3株，弗氏柠檬酸杆菌2株，阴沟肠杆菌4株，产气肠杆菌3株。实验前重新复核鉴定。
1.2 标准菌株
药物全敏感标准大肠埃希菌E.coli ATCC25922为阴性对照株，产ACT-1型质粒AmpC 酶的大肠埃希菌E.coliDH5a20919为阳性对照株。
1.3 EDTA纸片法检测AmpC酶[4]
将pH值8.0的100 ×三羟甲基氨基甲烷( Tris) 2EDTA 与生理盐水作1∶2混匀，取20μl加于无菌空白纸片上，烘干。将大肠埃希菌ATCC 25922制成0.5麦氏单位的菌悬液，用棉棒均匀涂布于M - H平板上，取已制备好的100xTris - EDTA纸片加20 μl生理盐水使之湿润，并将其紧贴于FOX一侧(每一FOX纸片两侧可各贴一张EDTA纸片)，蘸取若干菌落抹于EDTA 纸片上， 37℃培养过夜。在邻近检测纸片一边的抑制圈出现扁平或者凹陷则
为AmpC酶阳性，若抑菌环边缘光滑圆润，判为阴性。每一平板分别作阴性和阳性对照。1.4 头孢西丁三维实验检测[5]
酶粗提物的制备:普通37℃过夜培养的琼脂平板上挑取单个受试菌菌落制成0.5麦氏菌液浓度，取1ml该菌液接种在含16ug/ml的头孢西丁的50ml的胰蛋白大豆肉汤中，37℃水浴震荡孵育24小时后，于4℃条件下，5000r/min离心30分钟，弃去上清液，PBS磷酸盐缓冲液洗沉淀两次，并重新混旋菌体细胞，超声细胞破碎仪破菌（冰浴上进行），离心60分钟，收集上清，即为待检菌的初提酶液。用头孢硝噻吩纸片鉴定酶呈阳性反应后，用无菌滤膜过滤，-20℃保存备用。将大肠埃希菌ATCC 25922制成0.5麦氏单位的菌悬液,用棉棒均匀涂布于MH 平板上,在平板中央贴30μg的FOX纸片,在距离纸片5 mm处向外分三个方向打一长15mm,宽
1mm的矢状槽,用微量加样器向槽内分别加入40ul试验菌株，阳性对照株和阴性对照株的酶粗提物，大肠埃希菌在切缝与抑菌圈交界处向内扩大生长则为阳性。
2 结果
2.1 EDTA纸片法结果
40株对头孢西丁耐药的实验菌株中，有37株EDTA实验阳性。阳性率为92.5%，其中一株弗氏柠檬酸杆菌，一株大肠埃希菌，一株肺炎克雷伯菌表现为阴性，其余菌株表现为强弱不等的阳性。
2.2 头孢西丁三维试验结果
40株实验菌株中，其中阳性菌株共36株，阳性率为90%。两株肺炎克雷伯菌，1株大肠埃希菌和一株弗氏柠檬酸杆菌为阴性。
2.3 EDTA纸片法与三维试验结果比较
40株实验菌种中，3株EDTA纸片法和三维试验均阴性，一株三维试验阴性而EDTA纸片法阳性，两种检测方法的阳性符合率为97.3%，阴性符合率为100%，使用SAS 9.1统计软件进行McNemar检验，结果 2 = 0，P > 0.05，两种检测方法无差异，见表1。
表1.EDTA纸片法与三维试验结果比较
三维试验
EDTA纸片法＋－
＋36 1
－0 3
3讨论