姓名：郭沈杰年级专业：2012级生物科学同组者：蔡萍萍
学号：
实验七酵母RNA的提取及鉴定
一、实验目的
掌握稀碱法提取酵母RNA的原理和方法。
二、实验原理
酵母核酸中RNA含量较多，DNA含量则少于2%。RNA可溶于碱性溶液，当碱被中和后，可加乙醇使其沉淀，有此可得粗RNA制品。
用碱液提取的RNA有不同程度的降解。
三、实验仪器
1、离心机
2、水浴锅
3、电炉
4、烧杯
5、量筒
6、移液管
7、玻璃棒
8、滤纸
9、漏斗
10、试剂瓶
11、电子天平
12、pH试纸（pH1~14）
四、实验试剂
1、干酵母粉
2、0.2%氢氧化钠溶液：2g氢氧化钠溶于蒸馏水并稀释至1000ml。
3、乙酸（A.R.）
4、95%乙醇
5、无水乙醚（A.R.）
6、10%硫酸：浓硫酸（比重1.84）10ml，缓缓倾于水中，稀释至100ml。
7、氨水（A.R.）
8、5%硝酸银溶液：5g硝酸银溶于蒸馏水并稀释至100ml，贮于棕色瓶中。
五、实验步骤
(一)RNA的提取：
1、称取2g干酵母粉于100ml烧杯中，加入0.2%氢氧化钠溶液10ml，沸水浴加热30
分钟，经常搅拌（如沸水浴过程中溶液蒸干可再加5~8ml氢氧化钠）。冷却，然后加入乙酸数滴，使提取液呈酸性（pH试纸检验，pH5~6），离心10-15分钟（
倒取上清液，加入2倍体积的95%乙醇，边加边搅，加毕，静置，待完全沉淀，过滤。
2、滤渣先用95%乙醇洗2次，每次约5毫升，再用无水乙醚洗2次，每次也约5ml。
3、洗涤时可小心地用玻璃棒搅动沉淀。乙醚滤干后，滤渣即为粗RNA，可鉴定和测定
含量用。
（二）鉴定：
1、取上述RNA约0.5g，加10%硫酸5ml,加热至沸1~2分钟，将RNA水解。
2、水解液2ml，加入氨水2ml和5%硝酸银溶液1ml，观察是否产生絮状嘌呤银化合
物。
1、离心管回收
2、离心的时候，要两两对称放置，且离心管中溶液的量基本一样。否则会遭成离心机转子的损坏。
六、实验结果
(一)RNA的提取：
加入乙酸使溶液呈酸性，溶液呈土黄色。
进行离心后，沉淀沉于离心管的下部，上半部分上清液呈土黄色。
取上清液，加入2倍体积的95%乙醇后，溶液呈现白色浑浊状
完全浑浊后，上清液呈白色，沉淀为白色。
过滤洗涤后，得RNA粗品。
（1）水解后，溶液呈无色透明状。
加入氨水后，溶液仍澄清，溶液中似有油状物质产生。
加入硝酸银后，仍似有油状物质产生。
一段时间后，产生白色絮状沉淀。
（2）取水解液0.5ml，加苔黑酚—三氯化铁试剂1ml，加热至沸1min，观察颜色变化七、实验分析
称取干酵母粉：2.0096g
最后得到的RNA粗品：0.034 g
RNA提取率（%）=RNA质量（g）/干酵母粉质量（g）x100%
本实验中RNA提取率（%）= 0.0346 g / 2.0096g = 1.722%
（稀碱法提取的RNA为变性RNA）
本实验为定性实验，提取酵母中的RNA中，产生白色沉淀时可能因副反应产生的其他沉淀，即最终的沉淀中可能混有其他杂质，不适于进行定量测定。
依据：酵母细胞富含核酸，且核酸主要是RNA，含量为干菌体的2.67%~10.0%，而DNA 含量较少，仅为0.03%~0.516%。为此提取RNA多以酵母为原料。工业上制备RNA多选用低成本、适于大规模操作的稀碱法或浓盐法。这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备单核苷酸的原料，其工艺比较简单。
八、实验注意事项
1. 过滤时, 洗涤不能带水, 否则沉淀粘在滤纸上取不下来。
2. 有时絮状沉淀出现较慢, 可放十多分钟。
3. 利用等电点控制RNA析出时，应严格控pH。
4. 稀碱法提取的RNA为变性RNA，可用于RNA组分鉴定及单核苷酸制备，不能作为
RNA生物活性实验材料。
九、思考题
?1、简述核酸分离纯化的一般原则。
保持核算一级结构的完整性；
尽量排除其他分子的污染，保持核酸纯度。
?2、RNA提取过程中的关键步骤及注意事项有哪些？
过滤时，洗涤不能带水，否则沉淀粘在滤纸上取不下来；
有时絮状沉淀出现较慢，可放十多分钟；
利用等电点控制RNA析出时，应严格控制pH；
稀碱法提取的rna为变性rna，可用于单核苷酸制备，不能作为rna生物活性材料。
实验五酵母RNA的提取与鉴定 一、实验目的 1.掌握稀碱法分离酵母RNA的原理与操作过程。 2.了解RNA的组分并掌握定性鉴定的具体方法。 二、实验原理 1.酵母核酸中RNA含量较多，DNA含量则少于2%。 2.RNA可溶于碱性溶液，当碱被中和后，可加乙醇使其沉淀，有此可得粗RNA制品。 3.用碱液提取的RNA有不同程度的降解 三、实验仪器 1.离心机 2.水浴锅 3.电炉 4.烧杯 5.量筒 四、实验试剂 1.干酵母粉 2.0.2%氢氧化钠溶液：2g氢氧化钠溶于蒸馏水并稀释至1000ml。 3.乙酸 4.95%乙醇 5.无水乙醚
6.10%硫酸 7.氨水 9.5%硝酸银溶液：5g硝酸银溶于蒸馏水并稀释至100ml，贮于棕色瓶中。 1.苔黑酚-三氯化铁溶液： 将100mg苔黑酚溶于100ml浓盐酸中，再加入100mgFeCl 3.6H2O。 临用时配制。 五、实验步骤 1.RNA的提取： （1）称取2g干酵母粉于100ml烧杯中，加入 0.2%氢氧化钠溶液10ml，沸水浴加热30分钟，经常搅拌（如沸水浴过程中溶液蒸干可再加5~10ml氢氧化钠）。然后加入乙酸数滴，使提取液呈酸性（pH 试纸检验），离心10-15分钟（4000r.p.m）。 （2）取上清液，加入2倍体积的95%乙醇，边加边搅，加毕，静止，待完全沉淀，过滤。 （3）滤渣先用95%乙醇洗2次，每次约5毫升，再用无水乙醚洗2次，每次也约5ml。 （4）洗涤时可小心地用玻璃棒搅动沉淀。乙醚滤干后，滤渣即为粗RNA，可鉴定。 2.鉴定： （1）取上述RNA约 0.5g，加10%硫酸5ml,加热至沸1—2分钟，将RNA水解。
实验七酵母菌细胞大小的测定 一、实验目的 1.了解测量微生物大小的原理； 2.学习并掌握接目测微尺的校正方法及微生物大小的测定方法，增强微生物细胞大小的感 性认识。 二、实验材料 1.菌种：啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌悬液，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） 染色标本片。 2.仪器或其他用具：显微镜，接目测微尺，镜台测微尺，载玻片，盖玻片 三、实验原理 微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物细胞个体较小，需要在显微镜下借助于特殊的测量工具—测微尺来测定其大小。测微尺包括镜台测微尺和接目测微尺。 镜台测微尺是一张中央部分刻有精确等分线的载玻片，专门用于校定接目镜测微尺每小格的相对长度。通常，刻度的总长是1mm，被等分为100格，每格0.01mm（即10μm）。镜台测微尺不直接用来测量细胞的大小。 接目测微尺是一块可以放入接目镜的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，有等分为50小格和100小格的两种。在测量时将接目测微尺放在目镜的隔板上，即可来测量经显微镜放大后的细胞物象。也有专用的目镜，里面已经安放好了接目测微尺。 由于接目测微尺所测量的是经显微镜放大后的细胞物象，因此，在不同的显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，接目镜测微尺每一小格所代表的实际长度也不一样。所以，在用接目测微尺测量微生物大小之前，必须先用镜台测微尺校定接目镜测微尺，以确定该显微镜在特定放大倍数的目镜和物镜下，接目镜测微尺每一小格所代表的实际长度，然后根据微生物细胞相当于的接目镜测微尺格数，计算出微生物细胞的实际大小。 图7-1测微尺的安装 图7-2目镜测微尺图7-3用镜台测微尺校正接目测微尺
DNA的粗提取与鉴定 一、选择题共15小题。 1．有时候，由于实验材料用品所限而需要设法替代。下列各项中正确的是（） A. 做植物细胞有丝分裂实验时，可用蒜叶代替洋葱 B. 做植物细胞质壁分离和复原实验时，可用30%的食盐溶液代替30%的蔗糖溶液 C. 做叶绿体色素提取和分离实验时，可用乙醇代替丙酮 D. 做DNA粗提取与鉴定实验时，可用新鲜猪血代替鸡血 2．在DNA的粗提取实验过程中，两次向烧杯中加入蒸馏水的作用是 A．稀释血液，冲洗样品B．使血细胞破裂、降低NaCl浓度使DNA析出C．使血细胞破裂、增大DNA溶解量D．使血细胞破裂、提取含杂质较少的DNA 3、下列操作中，对DNA 的提取量影响较小的是 A ．使鸡血细胞在蒸馏水中充分破裂，放出DNA 等核物质 B ．搅拌时，要用玻璃棒沿一个方向轻缓搅动 C ．在析出DNA 黏稠物时，要缓缓加蒸馏水，直至溶液中黏稠物不再增加 D ．在用酒精沉淀DNA 时，要使用冷酒精，甚至再将混合液放入冰箱中冷却 4．在实验中，有两次DNA的沉淀析出，其依据的原理是 ①DNA在NaCl的物质的量浓度为0.14 mol/L时溶解度最低②DNA在冷却的体积分数为95%的酒精中能沉淀析出 A．两次都是①B．两次都是② C．第一次是①，第二次是②D．第一次是②，第二次是① 5．向溶解DNA的NaCl溶液中，不断加入蒸馏水的目的是 A．加快溶解DNA的速度B．加快溶解杂质的速度 C．减少DNA的溶解度，加快DNA析出D．减少杂质的溶解度，加快杂质的析出6．对三次过滤的叙述中，不正确的是 A．第一次过滤后，核物质存在于滤出的固体物中 B．第二次过滤后，使用多层纱布，DNA存在于纱布上的黏稠物中 C．第三次过滤后，DNA存在于滤液中，可进一步除去非DNA物质 D．上述B、C均正确 9．在此实验中，具有和蛋白水解酶相似作用的物质是 A．蒸馏水B．NaCl溶液C．NaOH溶液D．盐酸10、在DNA提取实验中有三次过滤： （１）过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液（２）过滤含粘稠物的0.14mol/LＮaCl溶液（３）过滤溶解有ＤＮＡ的２mol/LＮaCl溶液以上三次过滤分别为了获得 Ａ、含核物质的滤液、纱布上的粘稠物、含ＤＮＡ的滤液 Ｂ、含核物质的滤液、滤液中ＤＮＡ粘稠物、含ＤＮＡ的滤液 Ｃ、含核物质的滤液、滤液中ＤＮＡ粘稠物、纱布上的ＤＮＡ Ｄ、含较纯的ＤＮＡ滤液、纱布上的粘稠物、含ＤＮＡ的滤液 11 ．在“DNA 的粗提取实验”中，有两次DNA 的沉淀析出，其依据的原理是 ①DNA 在物质的量浓度为0 . 14mol / L 的氯化钠中的溶解度最低 ②DNA 在冷却的体积分数为95 ％的酒精中能沉淀析出 A ．两次都是① B ．第一次是①，第二次是② C．两次都是② D ．第一次是②，第二次是① 12. DNA 的粗提取和鉴定实验，与下列哪项原理无关 A . DNA 在0.14mol / L NaCl 溶液中的溶解度最低 B . DNA 易被龙胆紫染成紫色 C ．在DNA 溶液中加入二苯胺，加热后产生蓝色 D ．加入95 ％的冷酒精，DNA 会从溶液中析出
食品中霉菌和酵母分布、检测和鉴定 福建省疾病预防控制中心马群飞 1. 霉菌和酵母的基本特性 霉菌和酵母这种称谓仅是为了方便起见，将小型真菌有真正菌丝的称为霉菌，没有菌丝的称酵母，并没有分类学上的依据。相对于低等的细菌来说，霉菌和酵母生长缓慢，竞争能力较弱，故霉菌和酵母常在不利于细菌生长繁殖的环境中形成优势菌群。由于霉菌和酵母的细胞较大，新陈代谢能力强，故10２～10４个酵母即可引起一克食物的变质，而细菌则需要100倍于此数的细胞。 通常霉菌和酵母适合在高碳低氮有机物如植物性物质上生存。适合的pH 3～8，有些霉菌可以在pH2，酵母在pH 1.5时生活。水活度要求0.99～0.61，霉菌0.85时最适宜，某些嗜渗酵母和霉菌常引起糖果类食品的变质。一般的霉菌的生长温度为20～30℃，部分霉菌可以在不低于－7℃的温度下生长。酵母一般在0～45℃时生长。耐热能力较差，酵母细胞55～56℃几分钟就被杀死。少数霉菌的孢子（如丝衣霉）则可在90℃中耐受 几分钟。霉菌和酵母很多可以耐受防腐剂。如乳酸、醋酸、CO ２和SO ２ 等。有些酵母酯酶 活性高并能合成B族维生素。 2. 食品中酵母的常见类群 在食品中能分离出各种酵母菌，但它们很可能没有什么意义，因为其中多数来源于外界的偶然污染。仅有非常有限的几个酵母属可使经过加工并正常生产工艺包装的食品腐败。比如抗SO ２ 熏蒸的酵母，就是饮料、葡萄酒变质的常见因素。耐受保鲜剂的毕赤酵母，高度嗜氧，可以形成泡菜和酱油的表面膜。 当然，如果不按照标准的生产程序进行食品生产，那么许多外界污染的酵母都将在食品中大量繁殖，这种情况下，就谈不上优势菌群问题了，也不必进行酵母的分类鉴定。处理方法只有一个，恢复正常的生产程序。 2.1 乳制品：鲜奶易因细菌污染而腐败，酵母菌不是重要问题。当鲜奶被加工成奶油、乳酪、酸奶等制品后，由于细菌被抑制，酵母可相应地成为优势菌。它们使奶油、乳酪产生怪味和气体，使黄油产生有味物质，并可使酸奶和酸乳酪腐败。在实验室中，汉逊德巴利酵母、布提利假丝酵母、多孢丝孢酵母和红酵母均能导致固体和液体乳酪的腐败。 2.2 肉类与肉制品：通常情况下，这类制品适于细菌的生长，酵母不是引起变质的主要原因。某些德巴利酵母可使冷冻的猪、牛肉香肠和午餐肉表面出现令人不愉快的粘滑感觉。
酵母菌的死活细胞鉴别与镜检计数 一、实验目的 1.掌握鉴别酵母菌细胞死活的染色方法。 2.了解血球计数板的构造，掌握利用它进行酵母菌计数的方法。 二、实验步骤 1.酵母菌血球计数板镜检计数 1)取一块盖玻片，加盖在血球计数板中央计数室上方。 2)用滴管吸取菌悬液滴于盖玻片的边缘，通过毛细作用渗入计数室，注意不能有 气泡产生，然后放置于载物台，静止5min，使细胞全部沉降到其表面。 3)高倍镜镜检，数对角线上5个中方格中细胞的总数，再计算出菌悬液浓度。为 了减少误差，应注意对样品适当稀释，以每个小方格中平均4~6个细胞为佳； 另外，也可对同一样品重复计数，取其平均值。 附:计数板的结构及测定原理 利用血球技术板镜检技术是一种常用的计数方法。血球计数板是一块比普通载玻片厚的特质玻片，其上有四条凹槽，构成三个平台，中间比较宽，其中央又被一短横槽隔成两半，每半边各有一个计数区，其上有9个大方格，只有中央的一个大方格为计数室供计数用。这一大方格的长宽各为1mm。加盖盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的距离为0.1mm，因此计数室的容积为0.1mm3。 目前血球计数板常用的是25格×16格型，其计数室被分成25个中格，其中每个中格又分为16个小格，故计数室共有400 小格。 计数时，首先把适当浓度的菌悬液注入计数室，然后在显微镜下计数，一般数对角线上5个中方格（共80个小方格）中细胞总数再根据下式求得菌悬液的浓度 细胞个数=5000A×B 式中A---5个中方格中细胞总数 B---菌悬液的稀释倍数 三、实验结果
个数:30 37 11 25 21 24 17 27 28 25
实验二酵母菌的死活鉴定和显微镜计数 一、实验目的 学习血球计数板使用的原理与方法，学习区别死活酵母的方法。 二、原理 测定微生物数量方法很多，通常采用的有显微直接计数和平板计数法。 镜检计数法适用于各种单细胞菌体的纯培养悬浮液，菌体较大的酵母或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌采用彼得罗夫?霍泽细菌计数板，两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察，而血球计数板较厚，不能使用油镜，故细菌不易看清。 血球计数板的构造 血球计数板是一块特制厚玻片。玻片上由四道槽构成三个平台，中间的平台分成两半，其上各刻一个相同而有一定面积的小方格网。方格的刻度有两种规格。一种是25×16，称为希里格式血球计数板，分为25大格，每大格又分为16小格；另一种是16×25，称为麦氏血球计数板，分16大格，每大格分为25小格。总数都是400小格（如图所示）。 每个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，每个小方格的面积为1/400mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与计数室底部之间的高度为0.1mm，所以每个计数室（大方格）的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3，使用血球计数板直接计数时，先要测定每个小方格（或中方格）中微生物的数量，再换算成每毫升（或每克样品）中微生物细菌的数量。
三、实验材料 1、菌种：酵母菌 2、仪器：显微镜、血球计数板 3、材料：盖玻片、吸水纸、滴管 4、染料：美蓝染液 四、实验步骤和内容 1、视待测菌液浓度，加无菌水做适当稀释，以每小格菌数5-10个为宜，准确计算稀释 倍数。 2、取清洁干燥的血球计数板，加盖玻片盖住网格和两边的槽。 3、将待测菌液充分摇匀后，用无菌吸管吸少许，由盖玻片边缘或槽内加入计数板来回推压盖玻片，使其紧贴在计数板上，计数室内不能有气泡。静置5-10分钟。 4、在低倍镜下找到小方格网后更换高倍镜观察计数，上下调动细螺旋，以便看到小室内不同深度的菌体。位于分格线上的菌体，只数两条边上的，其余两边不计数。如数上线就不数下线，数左边线就不数右边线。由于菌体在计数室中处于不同的空间位置，要在不同的焦距下才能看到，因为观察时必须不断调节微调螺旋，方能数到全部菌体，防止遗漏。凡酵母菌芽体达到母细胞一半时，即可作为两个菌体计算。 5、计数时若使用刻度为25×16（大格）的计数板，则数四角的4个大格（即100小格）内的菌数。如用刻度为16×25（大格）的计数板，除数四角的4个大格外，还需数中央1个大格的菌数（即80小格）。 6、每个样品重复计数2-3次，取其平均值，按下式计算样品中的菌数。 刻度为25×16（大格）的计数板：
山东大学实验报告2009年11月日 姓名郑冲冲系年级08级生科一班组别同组者张健康于政达 学号200800140207题目酵母菌的培养、形态观察、死活鉴定和子囊孢子的观察 一、目的要求 1、掌握酵母培养基的配置和酵母菌的接种方法 2、观察酵母菌的细胞形态及出芽生殖方式。 3、学习掌握区分酵母菌死、活细胞的实验方法。 4、学习并掌握酵母菌子囊孢子的观察方法。 二、基本原理 1、培养基：酵母菌的能源主要是糖，一般用麦芽汁琼脂培养基培养。但实验要求不是很严格时，可以用由酵母膏、蛋白胨、葡萄糖配置的培养基来培养；但酵母菌子囊孢子的观察要用麦氏培养基，其有利于子囊孢子的形成。 2、酵母菌的形态：酵母菌是多形的、不运动的单细胞真核微生物，菌体比细菌大。繁殖方式也较复杂，无性繁殖主要是出芽生殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。本实验通过用美蓝染色浸片和水-碘液来观察生活的酵母形态和出芽生殖方式。 3、美蓝染色液：美蓝为无毒性染料，其氧化型为蓝色，而还原型为无色。用它对酵母菌染色时，由于活细胞的新陈代谢作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型，所以酵母的活细胞无色；对于死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，用美蓝水浸片不仅可观察酵母的形态，还可以区分死、活细胞。 4、水-碘液染色液：该染液将革兰氏染液用碘液用水稀释4倍后得到的，亦可用于酵母形态和出芽生殖的观察。 4、子囊孢子的观察：酵母菌形成子囊孢子需要一定的条件，麦氏培养基有利于酿酒酵母子囊孢子的形成，能否形成子囊孢子及其形态是酵母菌分类鉴定的重要依据之一。 三、实验器材 1.菌种：酿酒酵母培养数天的酵母-麦氏培养基斜面 2.溶液与试剂：0.1% 吕氏碱性美蓝染液，5%孔雀绿，0.5%沙黄、95%乙醇，水-碘染液 3.培养基：酵母液体培养基，麦氏培养基。 4.仪器或其他用具：显微镜，载玻片，盖玻片，酒精灯、接种环等。 四、实验步骤 1、酵母培养基的配置：蛋白质2%，酵母膏1%葡萄糖2%，加冷水100Ml，自然PH，在115℃下高压蒸汽灭菌30min。 2、接种和培养：无菌操作下，在灭菌的培养基中倒入少许酵母菌液即可。在28℃下培养48h 左右。 3、美蓝染色操作： 1>在载玻片中央加一滴吕氏碱性美蓝染色液，用接种环挑取少量酵母菌液，混合均匀； 2>用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上，避免产生气泡； 3>将制片放置约3min，先低倍镜后高倍镜观察酵母形态和出芽情况，并根据颜色区别死活细胞。 4>染色开始到过30min期间，观察死活细胞数量的变化； 4、水-碘液浸片法：滴加一滴水-碘液在载玻片的中央，无菌操作挑取少许酵母菌液至于染
实验DNA的粗提取与鉴定 目的要求 1.了解实验原理。 2.学会DNA的粗提取和鉴定的方法，观察提取出来的DNA物质。 3．通过本实验培养实验操作能力和观察能力。 实验原理 1. DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度的变化而改变的。当NaCl的物质的量浓度为0.14mOl／L时,DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。 2.DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。 3.DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。 注意事项 1.步骤3析出含DNA的黏稠物中，蒸馏水要沿烧杯内壁缓缓加入，不能一次快速倒入。 2.实验中有多个步骤都要用玻璃棒进行搅拌，但是在不同的步骤中玻璃棒的用法不同。 实验用具 鸡血细胞液（5～10mL）；体积分数为95％的冷酒精，蒸馏水，质量浓度为0．1g／mL的柠檬酸钠溶液，物质的量浓度分别为2mol／L和0．015mol／L的NaCl溶液，二苯胺试剂；烧杯（100mL，1个，50mL，500mL，各2个），漏斗，试管（20mL，2个），玻璃棒，滴管，量筒（100mL，1个），纱布，镊子，滤纸，铁架台，铁环，三角架，酒精灯，石棉网，载玻片，试管夹。 课时安排一课时 课前准备 制备鸡血细胞液，方法是：将质量浓度为0.1g／mL的柠檬酸钠溶液100mL，置于500mL烧怀中，注入新鲜的鸡血（约180mL），用玻璃棒搅拌，使其充分混合，以免凝血。静置于冰箱内一天，使血细胞自行沉淀。（也可以用离心机离心2 min（转速1000转/分）。用吸管吸去上清液。 板书（提前写好） DNA的粗提取与鉴定
7.2 用酵母菌研究一个种群 实验原理 酵母菌繁殖快，是单细胞个体，常被用来研究种群。我们将观察在试管内肉汤培养基中的酵母菌种群的生长情况。 酵母菌的种群属于封闭种群类型。在自然条件下，开放种群的大小会随着生物个体的迁入或迁出而变大变小。在开放种群中，各种物质可通过种群进行循环。但在封闭种群中，情况有些不同，测定封闭种群的增长率比开放种群的增长率要容易得多。用浊度计测定培养液的浑浊度，就能知道酵母菌种群是如何随时间而发生变化的。通过细胞计数就可以知道酵母菌细胞的数量变化与浑浊度之间的关系。 目的要求 通过实验观察，说明种群是如何随时间而发生变化的。 学习酵母菌计数的方法以及取样法。 材料用具（2人一组） 2副护目镜；2支16mm×150mm有螺旋盖的试管，每支盛有10ml无菌肉汤培养液；2支18mm×150mm试管；盖玻片；有标尺的载玻片（2mm×2mm方格）；有刻度的吸量管（1ml）;滴管；比浊计或比色计；显微镜；试管架；玻璃标记笔；米尺；4张半对数坐标纸。 实验方法 请仔细阅读实验并提出3种假设，说明种群如何随时间而发生变化。把这些假设记在你的记录本上，并用你在实验中收集的数据对它们做出评价。 本实验采用的方法叫取样法—通过对样品中的酵母菌计数以估计试管中的种群大小。还可根据试管中培养液的浑浊度获得这一估算值。 实验步骤 实验从第0天—第7天。 （一）第0天： 1、在你的记录本上画好与表2.1类似的数据表。 2、用标记笔把两支螺旋盖的试管标上A和B，并在每支试管上标上你的组别。 表2.1酵母菌细胞的数目
3、教师将把0.1ml酵母菌贮存用培养物注入试管A中，轻轻倒转试管几次使酵母细胞分布均匀。试管B不加任何东西。将试管盖稍微拧松并将两支试管放在教师指定的地方。设置试管B的目的是什么？ 4、试管A中为刚开始增长的酵母菌新种群。就下周期间你认为可能会发生的变化评论你的假设。 5、为了确定酵母菌种群的增长速率，必须在实验过程中对酵母菌进行计数。拧紧试管盖将试管A轻轻倒转几次使酵母菌细胞分布均匀，然后用滴管从试管A中取出一滴培养液移到载玻片方格上，小心盖上盖玻片，不要有气泡。在显微镜高倍镜下进行镜检。 注意：观察酵母菌细胞时光线不要太强。 6、为了计算中央方格内酵母菌细胞的数目，先将方格左上部置于高倍镜下并记下酵母菌细胞数目，接着按顺时针方向分别统计方格右上部、右下部和左下部的酵母菌数，直到把整个方格内全部酵母菌数量统计完为止。要确保你所观察到的是酵母菌细胞而不是其他的什么东西。酵母菌细胞常常粘附在一起，但可以数出任何一个分离团块中的每一个细胞，酵母菌出芽时的芽体也应算为独立的个体。 7、至少要数300个细胞，如果少于300就应在原方格周围的另一方格内进行计数，直到达到300为止。用细胞数除以方格数即可得到每方格内的平均数。 8、为了知道每立方厘米（cm3）体积(1ml)内的细胞数，可用计得的细胞数乘以2500。这是因为每方格的面积是2mm×2mm,盖玻片下的培养液厚度是0.1mm,所以每方格的体积就是 2mm×2mm×0.1mm=0.4mm3,而1cm3=1000mm3,因此：细胞数 1000mm32500×细胞数 为了知道试管A中的细胞总数，可将最终获得的细胞总数乘以10，因为试管A中含有10ml 培养液。 9、让同组的另一人对一个新样品做同样的工作，将结果写在记录本上并计算两次计数的平均值。把第0天观察到的种群大小填写在你的数据表中。 10、对试管B重复步骤5—9。 11、使用比浊计测定两试管的浑浊度。算出读数的平均值，并将第0天的平均值写入你的资料表和班长的表格中。当酵母菌种群增长时你预测会出现什么情况？把你的预测写入记录本。 （二）第1—7天 13、多次倒转试管A使酵母菌细胞分布均匀，测定浑浊度，将第1天的平均值记在你的资料表和班长的表格中，对试管B重复同样的工作。 14、分别使用试管A和试管B中的一滴培养液重复步骤5—9的计数工作，并将第1天的结果写入你的资料表和班长的表格中。
酵母菌发酵实验 一、实验在教材中所处的地位与作用 本实验位于生物学八年级上册第五单元第五章第二节人类对细菌和真菌的利用。酵母菌在日常生活中很常用，可以用来发包子、馒头和酿酒，很具有代表性。该实验属演示实验，可直观地向学生展示酵母菌发酵现象，在实验过程中观察到液体中冒气泡，同时气球胀大，说明酵母菌发酵过程中产生了气体，与生活联系紧密，还可鼓励学生自己动手实践。 二、实验原型及不足之处 实验原型：生物学八年级上册教材P71 演示实验发酵现象在一杯温开水中加入一大勺糖和一小包酵母，进行搅拌。将这个杯子中的液体倒入透明的矿泉水瓶或玻璃瓶内，再往瓶内加一些温开水。将一个小气球挤瘪套在瓶口。将瓶子放在教室内的窗台上，每天观察瓶中的情况，看看瓶中的液体会不会冒出气泡，气球会不会胀大。 不足之处：该实验观察到液体中冒气泡，同时气球胀大，说明酵母菌发酵并产生了气体，但无法测知发酵过程中产生的是何种气体，也无法深入理解酵母菌在日常生活中的应用。 三、实验创新与改进之处 1、改用一个带橡胶塞的锥形瓶。 2、瓶口插一根“Y”形玻璃导管，排气端分别连挤瘪的小气球和橡胶管，橡胶管再连一根直的玻璃导管，橡胶管用夹子夹住。（见后图）
3、另用一个玻璃杯盛半杯澄清的石灰水，用来检测气体。 4、经过改进之后，就可以检测发酵过程中产生的是何种气体了。 四、实验器材 1、锥形瓶一个，“Y”形玻璃导管一根，直玻璃管一根，橡胶管一根，夹子一个，小气球一个，捆扎带一根，玻璃杯两个。 2、一杯温开水，一大勺糖，一小包酵母，半杯澄清的石灰水。 五、实验原理及装置说明 1、实验原理：酵母菌是兼性厌氧型真菌，喜欢含糖的环境，有氧时将葡萄糖分解成 co和水，无氧时将葡萄糖分解成酒精和二氧 2 化碳，同时都释放出能量。 2、装置如下图： 六、实验过程 1、在一杯温开水中加入一大勺的糖和一小包酵母，进行搅拌。将混合液倒入锥形瓶时，再将瓶内加一些温开水。
【实验题目】 酵母菌的形态观察 【实验目的】 1.掌握酵母菌一般形态与细菌的区别 2.观察酵母菌的出芽生殖，区分酵母菌的死细胞和活细胞 3.学习酵母菌子囊孢子的观察方法 【实验器材】 1.菌种： 酿酒酵母2d麦芽汁斜面培养物 2.溶液和试剂： A) 0.1%吕氏碱性美蓝溶液、质量分数为95%的乙醇溶液、5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水 溶液、蒸馏水 B）香柏油、二甲苯 3.仪器及其它用品： 普通光学显微镜、擦镜纸、绸布、酒精灯、载玻片、接种针、培养皿、双层瓶（内装香柏油和二甲苯）等 【实验原理】 ?1、单细胞的酵母菌个体是常见细菌的几倍甚至几十倍，大部分采取出芽方式进行无性繁殖，也可以通过接合产生子囊孢子进行有性繁殖。 2、由于细胞个体大，采取涂片的方法制片有可能损伤细胞，一般采用美蓝染液水浸片法或水-碘液浸片法来观察酵母菌形态及出芽生殖方式。 3、采用美蓝染液水浸法可以对酵母菌的活细胞和死细胞进行鉴别。美蓝对细胞无毒，其氧化型呈蓝色，还原型无色，由于新陈代谢，活细胞内有较强还原能力，使美蓝由蓝色氧化型转变为无色的还原型，而死细胞或衰老细胞胞内还原性弱，染色后细胞呈蓝色或淡蓝色，因此，用美兰染色后，活细胞呈无色，死细胞呈蓝色。 【实验内容及步骤】 1、酵母菌制片与简单染色--美蓝染液水浸片法 1)滴加一滴0.1%吕氏碱性美蓝染液于载玻片中央，无菌操作用接种环由酿酒酵母麦芽汁斜面培养物挑取少许菌体置于染液中，混合均匀。 2)用镊子取一盖玻片，将盖玻片一边与菌液接触，缓慢将盖玻片倾斜并覆盖在菌液上。 3)将制片放置3min后，用低倍镜及高倍镜观察酵母菌形态和出芽情况，并根据细胞颜色区分死细胞和活细胞。 4)染色30min后，再次观察，注意死活细胞的比例是否发生变化。 2、酵母菌子囊孢子的观察 1)涂片。先在洁净载玻片上滴一滴蒸馏水，用接种环无菌操作挑取适量酵母菌菌体于蒸馏水中，混合均匀。 2)干燥固定。将载玻片在酒精灯上方来回移动，注意不要让载玻片距离火焰过近，以免烫死酵母菌细胞，可用手背反复试温度。 3)染色。孔雀绿染色 1-2min；水洗后用95%的乙醇溶液脱色30s；水洗后用番红染液复染1min；水洗后干燥。 4)镜检。将制好的装片放在显微镜下镜检，由低倍镜到高倍镜，最后用油镜观察。【实验结果】 1、酵母菌死活细胞鉴定
实验十一 DNA 的粗提取与鉴定 教学目的 1． 初步掌握DNA 粗提取和鉴定的方法。 2． 观察提取出来的DNA 物质。 实验原理 1． DNA 在NaCl 溶液中的溶解度是随NaCl 的浓度变化而改变的。DNA 在0．14mol/L 的NaCl 溶液中的溶解度最低，据此可使溶解于NaCl 溶液中的DNA 析出。 2． DNA 不溶于酒精溶液，但细胞中某些物质可以溶于酒精溶液，据此可提取杂质较少的DNA 。 3． DNA ＋二苯胺??→?沸水浴蓝色（用于DNA 的鉴定） 实验步骤 1．材料制备 0.1G/ml 柠檬酸钠100ml 500ml 烧杯→玻璃棒搅拌→1000r/min 离心2min →吸去上清液→ 活鸡血180ml 即得鸡血细胞液（也可将上述烧杯置于冰箱中，静置一天使鸡血细胞自行沉淀） 2．方法步骤 取血细胞液5-10ml ＋20ml 蒸馏水，玻璃棒沿一个方向快速搅拌 （1）提取血细胞核物质 纱布过滤，滤液中含DNA 和其他核物质，如蛋白质 原理：血细胞的细胞膜、核膜吸水胀破，玻璃棒快速搅拌机械加速血细胞破裂 （2）溶解核内DNA ：滤液＋2mol/L NaCl 溶液40ml ，玻璃棒沿一个方向搅拌 （3）析出含DNA 的粘稠物：向上述溶液中缓缓加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向搅拌，出现丝状物，当丝状物不再增加时，停止加水（此时NaCl 溶液相当于稀释到0．14mol/L ） （4）滤取含DNA 的粘稠物：用多层纱布过滤，含DNA 的粘稠物留在纱布上 （5）（纱布上的）DNA 粘稠物再溶解： 20ml2mol/L NaCl 溶液 50ml 烧杯， 上述粘稠物 缓慢搅拌3 min （6）过滤含DNA 的2mol/L NaCl 溶液：用2层纱布过滤，滤液中含DNA （7）提取含杂质较少的DNA ：上述溶液＋95%酒精，缓慢搅拌，出现乳白色丝状物，用玻璃棒将丝装物卷起。 （8）DNA 鉴定： 实验关键： 本实验成功的关键是获取较纯净的DNA ，因此应注意： 1．充分搅拌鸡血细胞液。DNA 存在于鸡血细胞核中。将鸡血细胞与蒸馏水混合以后，应用 玻璃棒沿一个方向快速搅拌，使血细胞加速破裂，并释放出DNA 2．沉淀DNA 必须用冷酒精。实验前必须准备好大量95%的酒精，并在冰箱中（5℃以下）至少存放24小时。 3．正确搅拌含有悬浮物的溶液。在第（3）、（5）步骤，玻璃棒不要直插烧杯底部，且搅拌
DNA 的粗提取与鉴定 实验目标 初步掌握DNA的粗提取和鉴定的方法，观察提取出来的DNA物质。 实验原理 DNA在氯化钠溶液中的溶解度，是随着氯化钠的浓度的变化而改变的。当氧化钠的物质的量浓度为0. 14 ml/L时DNA的容解度最低。利用这原理，可以使溶解在氧化钠溶液中的DNA析出。 DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原 理,可以进步提取出含杂质较少的DNA。 DNA遇二苯胺(沸水浴)会染成蓝色,因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。 实验器具 鸡血细胞液(5~ 10 mL)。 铁架台、铁环、镊子、三角架、酒精灯、石棉网、载玻片、玻璃棒、滤纸、滴管、量筒(100 mL,1个)、烧杯(100 mL,1个;50mL,500 mL各2个)、试管(20 mL,2个)、漏斗试管夹、纱布。 体积分数为95%的冷酒精溶液(实验前置于冰箱内冷却24 h)蒸馏水、质量浓度为 0.1 g/mL的柠檬酸钠溶液、物质的量浓度分别为2 mol/L和0.015 mol/L 的氯化钠溶液、二苯胺试剂。 实验探究与过程 实验前需要制备鸡血细胞液(由教师完成),制备的方法是:取质量依度为0.1gml 的柠檬酸钠济液(抗凝剂)100 ml,置于500 ml烧杯中。将宰杀活鸡流出的鸡血(约 180mt)注人烧杯中，同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸钠溶液充分混合，以免凝血。然后，将血液倒人离心管内,用1000 r/min(转每分)的离心机离心2 min,此时血细胞沉淀于离心管底部。实验时,用吸管除去离心管上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液。(如果没有离心机，可以将烧杯中的血液置于冰箱内，静置天,使血细胞自行沉淀。) 1.提取鸡血细胞的细胞核物质 将制备好的鸡血细胞液5~10 mL,注人到50 ml,烧杯中。向烧杯中加人燕馏水探 20 m,同时用坡璃棒沿一个方向快速搅拌5 min ，使血细胞加速破裂。然后,用放有纱布的漏斗将血细胞液过德至500ml,的烧杯中,取其滤液。 2.溶解细胞核内的DNA 将物质的量浓度为2 mol/L的氯化钠溶液40 mL加人到滤液中，并用玻璃棒沿一个方向搅拌1 min, 使其混合均匀，这时DNA在溶液中呈溶解状态。 3.析出含DNA的黏稠物
实验七酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴定 一、实验目的 1.观察酵母菌的形态特征、出芽生殖方式，并掌握酵母菌与细菌形态特征的区别。 2.学习鉴别死活细胞的实验方法。 二、实验原理 酵母菌是单细胞的真核微生物，菌体比细菌大而且不运动。酵母菌的繁殖方式分为无性繁殖和有性繁殖两种，以无性繁殖为主。芽殖是酵母菌普遍的无性繁殖方式，少数为裂殖；有性繁殖是产生子囊和子囊孢子。本实验是通过美蓝染液水浸片和水一碘液水浸片来观察酵母的形态和芽殖方式。 美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母活细胞染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，而对代谢作用微弱或死细胞，无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，不仅用此法可观察酵母细胞形态，也可用来鉴别酵母菌的死细胞和活细胞。 三、试剂与器材 1.材料酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或卡尔酵母(Saccharomyces calsbergensis)培养2天左右的麦芽汁(或豆芽汁)液体培养物。 2.试剂0.05％和O.1％吕氏碱性美蓝染色液、革兰氏染色用的碘液。 3.器材显微镜、载玻片、盖玻片、接种环、洒精灯等。 四、实验内容 1.美蓝浸片观察酵母培养→制片→染色→镜检→30分钟后再镜检 2.水-碘浸片观察 五、关键步骤及注意事项 1.染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖玻片时，菌液溢出或出现大量气泡。 2.用镊子取一块盖玻片，先将一侧与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下，使其盖在菌液上，盖玻片不宜平着放下，避免气泡产生。 六、思考题 1.吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间的不同，对酵母菌死细胞数量有何影响?试分析其原因。 2.在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区别于一般细菌? 实验七酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴定 一、实验目的 1.观察酵母菌的形态特征、出芽生殖方式，并掌握酵母菌与细菌形态特征的区别。 2.学习鉴别死活细胞的实验方法。 二、实验原理 酵母菌是单细胞的真核微生物，菌体比细菌大而且不运动。酵母菌的繁殖方式分为无性繁殖和有性繁殖两种，以无性繁殖为主。芽殖是酵母菌普遍的无性繁殖方式，少数为裂殖；有性繁殖是产生子囊和子囊孢子。本实验是通过美蓝染液水浸片和水一碘液水浸片来观察酵母的形态和芽殖方式。 美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母活细胞染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，而对代谢作用微
模块七蛋白质之间的相互作用 1.实验目的 本实验以重组质粒和酵母细胞为材料, 学习检测蛋白质相互作用的基本原理和 技术方法。主要介绍酵母双杂交的基本原理与操作技术 ; 让学生了解和掌握酵母双 杂交系统的应用 ; 掌握酵母感受态的制备的基本原理和主要的操作步骤。 2.实验原理 1989 年Fields 和Song 等人根据当时人们对真核生物转录起始过程调控的认 识(即细胞内基因转录的起始需要转录激活因子的参与,提出并建立了酵母双杂交系 统。该系统作为发现和研究活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平 台 ,近几年得到了广泛的运用和发展。 相比于其它蛋白质筛选系统,酵母双杂交系统具有以下优点:(1 检测在真核活细 胞内进行 ,在一定程度上代表细胞内的真实情况。(2 作用信号是在融合基因表达后, 在细胞内重建转录因子的作用而给出的 ,省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。(3 检测结果是基因表达产物的积累效应,因而可检测存在于蛋白质之间的微弱或暂时的相互 作用。(4 酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA 文库 ,能分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能蛋白。(5 通过mRNA 产生多种稳定的酶使信号放大。同时,酵母表型、X-Gal 及 HIS3 蛋白表达等检测方法均很敏感。 酵母双杂交系统也具有一定的局限性。首先 , 经典的双杂交系统分析蛋白间的 相互作用定位于细胞核内,因而限制了该系统对某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白 的研究。酵母双杂交系统的另一个局限性是“假阳性”。在酵母双杂交系统建立的 初期阶段 ,由于仅仅采用β-半乳糖苷酶这一单一的报告基因体系,这种报告基因的表 达往往不能十分严谨地被控制,因此容易产生假阳性。由于某些蛋白本身具有激活 转录的功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用, 使DNA 结合结构域融合蛋白在 无特异激活结构域的情况下也可被激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白
DNA的粗提取与鉴定 （2012江苏）18. 下列关于“DNA 粗提取与鉴定实验”的叙述，正确的是（） A. 洗涤剂能瓦解细胞膜并增加 DNA 在 NaCl 溶液中的溶解度 B. 将 DNA 丝状物放入二苯胺试剂中沸水浴后冷却变蓝 C. 常温下菜花匀浆中有些酶类会影响 DNA 的提取 D. 用玻棒缓慢搅拌滤液会导致 DNA 获得量减少 【答案】C 【解析】洗涤剂能够瓦解细胞膜，但不能增加DNA的溶解度，A错；将 DNA 丝状物放入二苯胺试剂中沸水浴中变蓝，不需要冷却，B错；常温下菜花匀浆中有些酶类可破坏DNA，而影响DNA的提取，C正确；用玻棒缓慢搅拌滤液并不影响DNA的含量，而在粗提取时，缓慢撑拌有利于DNA附着，D错【试题点评】本题主要是对实验内容的考查，主要是涉及“DNA 粗提取与鉴定实验”这一实验中的原理、方法和操作步骤等内容。属于实验考查中比较基础的内容。 （2011江苏）19．在利用鸡血进行“DNA的粗提取与鉴定”的实验中，相关叙述正确的是A．用蒸馏水将NaCl溶液浓度调至0.14 mol/L，滤去析出物 B．调节NaCl溶液浓度或加入木瓜蛋白酶，都可以去除部分杂质 C．将丝状物溶解在2 mol/L NaCl溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色 D．用菜花替代鸡血作为实验材料，其实验操作步骤相同 【答案】B （2010江苏）32．(7分)某生物兴趣小组开展DNA粗提取的相关探究活动。具体步骤如下： 材料处理：称取新鲜的花菜、辣椒和蒜黄各2份．每份l0 g。剪碎后分成两组，一组置于20℃、另一组置于—20℃条件下保存24 h。 DNA粗提取： 第一步：将上述材料分别放人研钵中，各加入l5 mL研磨液，充分研磨。用两层纱布过滤．取滤液备用。 第二步：先向6只小烧杯中分别注人10mL滤液，再加人20 mL体积分数为95％的冷酒精溶液，然后用玻璃棒缓缓地向一个方向搅拌，使絮状物缠绕在玻璃棒上。 第三步：取6支试管，分别加入等量的2 mol／L NaCl溶液溶解上述絮状物。 DNA检测：在上述试管中各加入4 mL二苯胺试剂。混合均匀后，置于沸水中加热5 min，待试管冷却后比较溶液的颜色深浅,结果如下表。
酵母菌生理生化试验
一、酵母菌糖发酵试验 （一）实验目的 了解鉴别酵母菌的实验方法。 （二）实验原理 酵母菌在厌氧条件下能分解糖类，产生各种有机酸、气体和其它产物。酵母菌种类不同对各种糖类的发酵能力各异。因此，这是鉴别酵母菌种类的一项重要依据。 酸的产生可根据培养基中溴甲酚紫（pH6.8-5.2由紫变黄）或溴麝香草酚蓝（PH7.6-6.0由蓝变黄）指标剂颜色的改变来确定。产气可由发酵管气泡的产生 予以证实。 （三）材料 糖发酵基础液（见附录I）, 1.6%溴甲酚紫或0.2%溴麝香草酚蓝溶液（见附 III），葡萄糖、乳糖、半乳糖和麦芽糖，啤酒酵母斜面菌种。 （四）实验内容 1、糖发酵基础液配制好后，按培养液容量的1%加入糖，分装于杜氏发酵管中 （培养液的高度约为4-5厘米），再在试管内加入倒置的小玻管（约0.4X 2.0-2.5厘米）一支。每种糖设三个重复管，121C高压灭菌15分钟。 2、将啤酒酵母分别接入上述各发酵管中，置30C下培养48-72小时，另以不接种者作
对照。 3、如产酸则培养液pH值下降而变黄色；如产气，贝U必先产酸，并在杜氏小管顶端出现气泡。 4、结果记录。以“”表示产酸，“ 0”表示产气，“ + ”表示产酸产气，“一”表示无变化，“碱”表示产碱。 二、酵母菌碳源同化试验 （一）实验目的 了解酵母菌对各种碳源的利用情况。 （二）实验原理 碳是酵母菌细胞的重要组成成分，约占酵母菌体重量的50%，为酵母菌生命活 动提供所需的能量和组成其结构的物质。酵母菌对各种碳源的利用，因种类不同而异。这是酵母菌分类鉴定的一个重要依据。 （三）材料 无碳基础培养基（见附录I），啤酒酵母斜面菌种，0.5%的葡萄糖、蔗糖、孚L 糖、半乳糖、麦芽糖溶液。 （四）实验内容
实验一酵母菌的形态观察及死活细胞鉴别 预习内容： 1. 光学显微镜的使用（参见周德庆，微生物学实验教程第3版，23-27页） 2. 酵母菌的美蓝染色观察（参见周德庆，微生物学实验教程第3版，91-95页）预习思考题： 1. 随着物镜放大倍数的增加，视野的亮度是增强还是减弱？应如何调节？视野范围是如何变化的？ 2. 制作水浸片时如何避免产生气泡？ 3. 影响活菌数目的因素有哪些？染液浓度、染色时间及染色时的pH等因素对死活细胞数目比例有什么影响？ 4. 如何测定酵母菌死亡率？简述其原理。 5. 标本片上的某一物象，第一次看到后如何再次找到它? 一、实验目的与要求 1. 了解普通光学显微镜的构造及原理，正确掌握使用显微镜的方法； 2. 观察酵母菌的形态及出芽生殖方式； 3. 学习区分酵母菌死活细胞的实验方法； 4. 掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。 二、实验原理 1. 酵母菌 酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见细菌大几倍甚至十几倍，不必染色即可用显微镜观察其形态。但由于细胞个体大，采用涂片的方法制片有可能损伤细胞，一般通过美蓝染液水浸片或水-碘液浸片法来观察酵母细胞。 大多数酵母以出芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。本实验通过美蓝染液水浸片和水一碘液水浸片来观察酵母的形态和出芽生殖方式，并对酵母细胞进行死活染色鉴别。
2. 美蓝染液 美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母活细胞染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，而对代谢作用微弱或死细胞，无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，不仅用此法可观察酵母细胞形态，也可用来鉴别酵母菌的死细胞和活细胞。 图1：酵母菌美蓝浸片观察3min（10×40）图2：酵母菌美蓝浸片观察30min（10×40） 三、实验设备及材料 1. 菌种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 或卡尔酵母(Saccharomyces calsbergensis)培养2 天左右的豆芽汁液体培养物(需稀释)。 2. 溶液或试剂：0.1%和0.05%吕氏碱性美蓝溶液(或0.01%美蓝水溶液)，革兰氏染色用碘液等。 3．器材：显微镜，擦镜纸，吸水纸，盖玻片、酒精灯、接种环、镊子、胶头滴管、小烧杯、洗瓶等等。 四、实验步骤与内容 1．美蓝浸片的观察 （1）在载玻片中央加一滴0.1%吕氏碱性美蓝染色液，然后按无菌操作接种环挑取少量酵母菌放在染液中，并用接种环将其混合均匀，酒精灯上灼烧清洗接种环。 注：染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖玻片时，菌液会溢出或出现大量气泡。用接种环将菌体与染液混合时，不要剧烈涂抹，以免破坏细胞。
ＤＮA的粗提取与鉴定实验 一、实验原理 ①DNA主要存在于细胞核 ②DNA在NaCl溶液中的溶解度,是随着NaCl的浓度的变化而改变的。当NaCl的物质的量浓度为０.１4mol/L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理,可以使溶解在NaCl溶液中的DNA 析出。 ③DNＡ不溶于酒精溶液,但是细胞中的某些蛋白质可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的ＤＮＡ。 ⑷ＤNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DＮA的试剂。 二、实验材料和用具 鸡血细胞液(５~10ｍl）;体积分数为95%的冷酒精溶液(实验前置于冰箱内冷却24ｈ）;蒸馏水；质量浓度为0．1g/ml的柠檬酸纳溶液；质量的浓度分别为2mol/L和0．015mｏｌ/L 的氯化纳溶液(新教材不要求0、015的浓度了，都是用的2mｏｌ/Ｌ)；二苯胺试剂;铁架台;镊子;水浴锅;玻璃棒;滤纸;滴管;量筒（１0０ml,一个）；烧杯；(1０0０ｍl，一个，５0ml、100 mｌ、500ｍl各二个）;试管(20ｍｌ,二个）;漏斗;试管夹;纱布。 三、课前准备鸡血细胞液 取质量浓度为０．1g／ｍl的柠檬酸纳溶液（抗凝剂）1０0ml,置于5００ml烧杯中。注入新鲜的鸡血（约180ｍｌ）,同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸纳溶液充分混合,以免凝血。将烧杯中的血液置于冰箱内，精置一天，使血细胞自行沉淀。(也可以将血液倒入离心管内,用100０r/min(转每分)的离心机离心2miｎ,血细胞沉淀于离心管底部。实验时。用吸管除去离心管上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液。 四、方法步骤 ①提取鸡血细胞的细胞核物质 将制备好的鸡血细胞液５mL～10mL,注入到５0 mL烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20ｍL，同时用玻璃棒充分搅拌5 ｍin，使血细胞加速破裂。然后，用放有1-2层纱布的漏斗将血细胞液过滤至1０0０mＬ。取其滤液。 ②溶解细胞核内的ＤNA 将氯化钠的物质的量浓度为２mol/L的溶液40ｍL加入到滤液中，并用玻璃棒沿一个方向搅拌1min，使其混合均匀,这时DＮA在溶液中呈溶解状态。